Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje potrzeba praktycznych testów do wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) przez komórki. Wychwyt EV odgrywa rolę w komunikacji międzykomórkowej w różnych dziedzinach badań; biologia raka, neurobiologia i dostarczanie leków. W literaturze opisano wiele testów wychwytu EV; Brakuje jednak praktycznej, szczegółowej metodologii eksperymentalnej. Wychwyt EV można ocenić poprzez fluorescencyjne znakowanie EV w celu wykrycia ich lokalizacji w komórkach. Rozróżnienie między zinternalizowanymi pojazdami elektrycznymi w komórkach a powierzchownymi pojazdami elektrycznymi w ogniwach jest trudne, ale kluczowe, aby dokładnie określić wykorzystanie pojazdów elektrycznych. W związku z tym w niniejszej pracy zaproponowano test, który skutecznie określa ilościowo wychwyt EV za pomocą trójwymiarowej (3D) fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Znakowane fluorescencyjnie EV przygotowano za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji, zwizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D, a następnie przeanalizowano za pomocą zaawansowanego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Protokół zapewnia solidną metodologię analizy pojazdów elektrycznych na poziomie komórkowym oraz praktyczne podejście do efektywnej analizy.
Wprowadzenie
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to nanocząsteczki związane z błoną lipidową, które są podzielone według ich rozmiarów: ektosomy (100-500 nm) i egzosomy (50-150 nm)1. EV zawierają różne biomolekuły, takie jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy. Te biomolekuły pochodzą z komórek, zanim zostaną zamknięte w kapsułkach jako ładunek i uwolnione do przestrzeni zewnątrzkomórkowej za pośrednictwem EVs1,2,3.
Ze względu na różnorodność ich ładunku, uważa się, że pojazdy elektryczne odgrywają aktywną rolę w komunikacji między....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Izolacja EV i immunofluorescencyjne znakowanie EV na chipie
- Pobieranie pożywek do hodowli komórkowych (CCM) i wstępne przetwarzanie CCM w celu izolacji EV
- Zasiewaj komórki PC3 przy 30% zbiegu w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2. Pozwól komórkom kontrolnym rosnąć do 90% zbiegu (~48 godzin) w standardowych pożywkach i suplementach specyficznych dla linii komórkowych.
UWAGA: Aby składniki zawierające EV nie wpływały na wychwyt komórkowy (tj. płodową surowicę bydlęcą), należy stosować pożywki i suplementy zubożone w egzosomy. - Zbierz CCM.
- Odwirować CCM przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze....
- Zasiewaj komórki PC3 przy 30% zbiegu w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2. Pozwól komórkom kontrolnym rosnąć do 90% zbiegu (~48 godzin) w standardowych pożywkach i suplementach specyficznych dla linii komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Za pomocą mikrofluidycznego urządzenia opartego na nanofiltracji wyizolowano EV z PC3 CCM i oznakowano je swoistym dla EV przeciwciałem (CD63) sprzężonym z fluorophorem (Rycina 1). Oznakowane EV zostały pomyślnie zwizualizowane za pomocą konfokalnej mikroskopii 3D (Rycina 2). Oznakowane EV inkubowano z komórkami przez kilka godzin w pośrodku pozbawionym egzosomów. Po inkubacji komórki przemyto pośrodkiem pozbawionym egzosomów. Pozostałe EV zostały zinternalizowa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test wychwytu EV oparty na obrazowaniu fluorescencyjnym 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej zapewnia wydajną metodologię i czułą analizę. To fluorescencyjne oznakowanie EV ułatwia wizualizację EV i z powodzeniem przeprowadza precyzyjny test wychwytu EV. Poprzednie metody etykietowania pojazdów elektrycznych i usuwania pozostałości barwnika zostały opisane poprzez usuwanie wytrącania za pomocą ultrawirowania (UC); jednak UC może współstrącać EV, a unieruchomiony barwnik może prowadzić do fałszywie dodatniego syg.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Y.-K. Cho jest wynalazcą patentów na urządzenie mikroprzepływowe Exodisc oparte na nanofiltracji, które są licencjonowane przez Labspinner (Ulsan, Korea). Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NCI nr U54CA143803, CA163124, CA093900 i CA143055 dla K. J. P. Badania te zostały wsparte grantem Korea Health Technology R&D Project za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowotnego (KHIDI), finansowanym przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI19C1122). Praca J. Kima i Y.-K. Cho był wspierany przez Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansowany przez rząd koreański. Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom Instytutu Urologicznego Brady'ego, a zwłaszcza członkom laboratorium Pienta-Amendment, za krytyczną lekturę manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD63 | Biolegend | 353038 | Fluorescencyjne przeciwciało swoiste specyficzne dla EV z barwnikiem fluorescencyjnym |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Odczynnik do znakowania fluorescencyjnego żywych komórek (cytoplazmy) |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=1,25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Obiektyw do obrazowania konfokalnego, NA=0,75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | Urządzenie mikroprzepływowe oparte na nanofiltracji do izolacji EV |
| ExoDiscovery | Labspinner, Inc. | EX-R1001 | Urządzenie operacyjne do Exodisc |
| FBS zubożonego w egzosomy | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Składnik odżywczy pożywki do hodowli komórkowych do pobierania EV pochodzącego z linii komórkowej PC3 |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | VWR | 1500-500 | Odżywka do hodowli komórek |
| Kozia anty-mysia IgG H& L wstępnie zaabsorbowany | abcam | ab7063 | Mysie przeciwciało IgG do negatywnej kontroli znakowania EV |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Naczynie hodowlane do obrazowania konfokalnego |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Oprogramowanie do przetwarzania obrazu |
| końcowego System inkubatora+ CO2/O2/N2 mieszalnik gazów | Cell Instrument | TU-O-20 | Inkubator do obrazowania żywych komórek |
| Aparat Nikon A1 HD25 / A1R HD25 | Nikon | NA | Aparat do obrazowania konfokalnego |
| Mikroskop Nikon Eclipse Ti | Nikon | NA | Mikroskop odwrócony do obrazowania konfokalnego |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Oprogramowanie do przetwarzania obrazu do mikroskopu Nikon |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Urządzenie do pomiaru stężenia EV |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Oprogramowanie do tworzenia wykresów |
| Penicylina-Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antybiotyki do hodowli komórek |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Pożywka do hodowli komórek PC3 |
| SYTO RNASelect Green Fluorescencyjny barwnik komórkowy - 5 mM roztwór w DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | Barwnik fluorescencyjny barwiony RNA do znakowania EV |
Bibliografia
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular ve....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Analiza poboru pęcherzyków zewnątrzkomórkowychmikroskopia konfokalnafluorescencyjne znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowychurządzenie mikroprzepływoweanaliza obrazowania 3Dinternalizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowychoprogramowanie do przetwarzania obrazówkomunikacja międzykomórkowaśledzenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
