Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia wykrywanie przetwarzania kaspazy-8 bezpośrednio w wywołującym śmierć kompleksie sygnalizacyjnym (DISC) i określa skład tego kompleksu. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie, od odkrywania mechanizmów molekularnych szlaków śmierci komórkowej po dynamiczne modelowanie sieci apoptozy.

Streszczenie

Zewnętrzna apoptoza jest pośredniczona przez aktywację receptorów śmierci (DR), takich jak CD95/Fas/APO-1 lub ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stymulacja tych receptorów za pomocą pokrewnych ligandów prowadzi do powstania kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć (DISC). DISC zawiera DR, białko adaptorowe białka związanego z Fas z domeną śmierci (FADD), prokaspazy-8/-10 i komórkowe białka hamujące konwertazy interleukiny (IL)-1β podobne do FADD (c-FLIPs). DISC służy jako platforma do przetwarzania i aktywacji prokaspazy-8. Ta ostatnia zachodzi poprzez jego dimeryzację/oligomeryzację we włóknach domeny efektora śmierci (DED) zmontowanych na DISC.

Aktywacja prokaspazy-8 następuje po jej przetwarzaniu, które odbywa się w kilku krokach. W niniejszej pracy opisano ustalony eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia pomiar powstawania DISC i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie. Przebieg pracy opiera się na technikach immunoprecypitacji wspieranych przez analizę western blot. Ten przepływ pracy pozwala na dokładne monitorowanie różnych etapów rekrutacji prokaspazy-8 do DISC i jej przetwarzania oraz jest bardzo istotny dla badania molekularnych mechanizmów apoptozy zewnętrznej.

Wprowadzenie

Jednym z najlepiej zbadanych receptorów śmierci (DR) jest CD95 (Fas, APO-1). Zewnętrzny szlak apoptotyczny rozpoczyna się od interakcji DR z pokrewnym ligandem, tj. CD95L oddziałuje z CD95 lub TRAIL wiąże się z TRAIL-Rs. Powoduje to powstanie DISC w odpowiednim DR. DISC składa się z białek CD95, FADD, prokaspazy-8/-10 i c-FLIP^1,2. Ponadto DISC jest składany w wyniku interakcji między białkami zawierającymi domenę śmierci (DD), takimi jak CD95 i FADD, a białkami zawierającymi DED, takimi jak FADD, prokaspaza-8/-10 i c-FLIP (Figura 1). Prokaspaza-8 ulega oligomeryzacji

Protokół

Eksperymenty z komórkami T zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną 42502-2-1273 Uni MD.

1. Przygotowanie komórek do eksperymentu

UWAGA: Średnia liczba komórek dla tej immunoprecypitacji wynosi 1 × 10⁷_. Komórki przylegające muszą zostać wysiane na jeden dzień przed eksperymentem, tak aby w dniu eksperymentu było 1 ×^{10 7} komórek.

1. Przygotowanie komórek adherentnych do eksperymentu
   1. Wysiew 5-8 × 10⁶ przylegających komórek w 20 ml pożywki (patrz Tabela materiałów dla składu) dla każdego stanu w 14,5 cm szalkach na dzień przed ro....

Wyniki

Aby przeanalizować rekrutację kaspazy-8 do kompleksu DISC oraz jej procesowanie w obrębie DISC CD95, w niniejszej pracy opisano klasyczny schemat postępowania, który łączy immunoprecypitację (IP) kompleksu DISC CD95 z analizą western blot. Pozwala to na wykrycie kilku kluczowych cech aktywacji kaspazy-8 w DISC: montaż makromolekularnej platformy aktywującej kaspazę-8, rekrutację prokaspazy-8 do DISC oraz procesowanie tej kaspazy inicjującej (Rysunek 1 oraz Rysunek 2

Dyskusja

Podejście to zostało po raz pierwszy opisane przez Kischkela i ^wsp.27 i od tego czasu z powodzeniem rozwijane przez kilka grup. Należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii w celu skutecznego immunoprecypitacji DISC i monitorowania przetwarzania kaspazy-8 w tym kompleksie.

Po pierwsze, konieczne jest przestrzeganie wszystkich etapów mycia podczas immunoprecypitacji. Szczególnie ważne są końcowe etapy mycia kulek sefarozy i suszenia kulek sefarozy. Musi to być wykonane p.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12,5% SDS żel	własnej produkcji		dla dwóch żeli separujących: 3,28 ml destylowany H2O 2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 ml akrylamid 100 &mikro; L 10% SDS 100 i mikro; L 10% APS 7,5 i mikro; L TEMED dla dwóch żeli zbiorczych: 3,1 ml destylowany H2O 1,25 mL Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 ml akryloamidu 50 &mikro; L 10% SDS 25 i mikro; L 10% APS 7,5 i mikro; L TEMED
14,5 cm naczynia komórkowe	Greiner	639160
akryloamid	Carl Roth	A124.1
Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym z filtrem o wysokim odzysku i szerokim otworem	VWR	46620-664 (Ameryka Północna) lub 732-0559 (Europa)	Służy do pipetowania kulek do
antyaktyny	Sigma Aldrich	A2103	rozcieńczenie: 1:4000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-APO-1 Ab	dostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez Enzo	ALX-805-038-C100	stosowany wyłącznie do immunoprecypitacji
anty-kaspazy-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
antykaspaza-3	Sygnalizacja	komórkowa Ab 9662	Rozcieńczenie S: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-kaspaza-8 Ab C15	dostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez ENZO	ALX-804-242-C100	rozcieńczenie: 1:20 w PBST + 1:100 NaN3
anty-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	rozcieńczenie: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZO	ALX-804-961-0100	rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	dostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można je kupić przez ENZO	ADI-AAM-212-E	rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anty-PARP	Sygnalizacja komórkowa	9542	rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
APS	Carl Roth	9592.3
β-merkaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Roztwór Bradforda Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikowego 450ml	Bio Rad	500-0006	stosowany zgodnie z instrukcjami producenta
CD95L	dostarczonymi w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można go kupić przez ENZO	ALX-522-020-C005
detektor chemoluminescencji Chem Doc XRS+	Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail ()	Sigma Aldrich	11 836 145 001	przygotowany zgodnie z instrukcją producenta
DPBS (10x) bez Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	rozcieńczenie 1:10 z H2O, przechowywanie w lodówce
bufor eletroforezy	własnej produkcji		10x bufor do elektroforezy: 60,6 g Tris 288 g glicyny 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 rozcieńczenie przed użyciem
glicyna	Carl Roth	3908.3
Koza Anty-Mysia IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleko
Koza Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	rozcieńczenie 1:10.000 in PBST + 5% mleko
kozie Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka
Interleukina-2 Human(hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	do aktywacji limfocytów T
KCl	Carl Roth	6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
Bufor załadowczy 4x Laemmli Bufor do próbek, 10 ml	Bio Rad	161-0747	przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta
Luminata Forte Western HRP	substrate Millipore	WBLUFO500
liza bufor	produkcji		13,3 ml Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 ml NaCl; 5 M 10 ml EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 dodać 960 ml H2O
podłoże dla komórek adhaerentowych DMEM F12 (1:1) w stabilnej glutaminy,  2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	dodając 10% FCS, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,0001% Puromycyny do pożywki
dla pierwotnych limfocytów T	gibco firmy Life Technologie	21875034	dodanie 10% FCS i 1% penicyliny-streptomycyny do podłoża
mleka w proszku	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	własnej roboty		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 ml Tween-20 ad 2 L H2O rozcieńczenie 1:20 przed użyciem
PBST + 5% mleko	własnej produkcji		50 g mleka w proszku + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	do aktywacji limfocytów T
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	stosować od 3-5 do mikro; L
Białko A Sefaroza Koraliki CL-4B	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	kulki z żywicy powinowactwa przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
skrobak	VWR	734-2602
SDS Carl	Roth	4360.2
wytrząsarka	Heidolph
azydek sodu	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Mini-size stosy transferowe Trans Blot Turbo	Bio Rad	170-4270	używane zgodnie z instrukcją producenta
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
TransBlot Turbo Membrana niktrocelulozowa w rozmiarze mini	Bio Rad	170-4270	używany zgodnie z instrukcjami producenta
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli	Chem A4974,1000

lizatu Ab Ab własnej