Method Article

Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentowany jest eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia wykrywanie przetwarzania kaspazy-8 bezpośrednio w wywołującym śmierć kompleksie sygnalizacyjnym (DISC) i określa skład tego kompleksu. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie, od odkrywania mechanizmów molekularnych szlaków śmierci komórkowej po dynamiczne modelowanie sieci apoptozy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnętrzna apoptoza jest pośredniczona przez aktywację receptorów śmierci (DR), takich jak CD95/Fas/APO-1 lub ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL)-receptor 1/receptor 2 (TRAIL-R1/R2). Stymulacja tych receptorów za pomocą pokrewnych ligandów prowadzi do powstania kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć (DISC). DISC zawiera DR, białko adaptorowe białka związanego z Fas z domeną śmierci (FADD), prokaspazy-8/-10 i komórkowe białka hamujące konwertazy interleukiny (IL)-1β podobne do FADD (c-FLIPs). DISC służy jako platforma do przetwarzania i aktywacji prokaspazy-8. Ta ostatnia zachodzi poprzez jego dimeryzację/oligomeryzację we włóknach domeny efektora śmierci (DED) zmontowanych na DISC.

Aktywacja prokaspazy-8 następuje po jej przetwarzaniu, które odbywa się w kilku krokach. W niniejszej pracy opisano ustalony eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia pomiar powstawania DISC i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie. Przebieg pracy opiera się na technikach immunoprecypitacji wspieranych przez analizę western blot. Ten przepływ pracy pozwala na dokładne monitorowanie różnych etapów rekrutacji prokaspazy-8 do DISC i jej przetwarzania oraz jest bardzo istotny dla badania molekularnych mechanizmów apoptozy zewnętrznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najlepiej zbadanych receptorów śmierci (DR) jest CD95 (Fas, APO-1). Zewnętrzny szlak apoptotyczny rozpoczyna się od interakcji DR z pokrewnym ligandem, tj. CD95L oddziałuje z CD95 lub TRAIL wiąże się z TRAIL-Rs. Powoduje to powstanie DISC w odpowiednim DR. DISC składa się z białek CD95, FADD, prokaspazy-8/-10 i c-FLIP1,2. Ponadto DISC jest składany w wyniku interakcji między białkami zawierającymi domenę śmierci (DD), takimi jak CD95 i FADD, a białkami zawierającymi DED, takimi jak FADD, prokaspaza-8/-10 i c-FLIP (Figura 1). Prokaspaza-8 ulega oligomeryzacji poprzez asocjację jej SED, w wyniku czego powstają włókna DD, a następnie aktywacja i przetwarzanie prokaspazy-8. To uruchamia kaskadę kaspazy, która prowadzi do śmierci komórki (Rysunek 1)3,4. Tak więc prokaspaza-8 jest centralną kaspazą inicjującą zewnętrzny szlak apoptozy, w którym pośredniczy CD95 lub TRAIL-R, aktywowany na odpowiedniej platformie makromolekularnej, DISC.

Wiadomo, że dwie izoformy prokaspazy-8, a mianowicie prokaspaza-8a (p55) i -8b (p53), są rekrutowane do klasy DISC5. Obie izoformy składają się z dwóch DEDów. DED1 i DED2 znajdują się w N-końcowej części prokaspazy-8a/b, a następnie w katalitycznych domenach p18 i p10. Szczegółowa analiza DED prokaspazy-8 za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) ujawniła składanie się białek prokaspazy-8 w nitkowate struktury zwane włóknami DED4,6. Co ciekawe, początkowo sugerowano, że liniowe łańcuchy prokaspazy-8 są zaangażowane w dimeryzację, po której następuje aktywacja prokaspazy-8 w DISC. Teraz wiadomo, że te łańcuchy są tylko podstrukturą włókna DED prokaspazy-8, przy czym ten ostatni składa się z trzech łańcuchów połączonych w potrójną helisę3,4,6,7.

Po dimeryzacji na włóknie DED, zmiany konformacyjne w prokaspazie-8a/b prowadzą do powstania aktywnego centrum prokaspazy-8 i jego aktywacji3,8. Następnie następuje przetwarzanie prokaspazy-8, w którym pośredniczą dwie ścieżki: pierwsza przebiega przez wytwarzanie produktu rozszczepienia p43 / p41, a druga przez początkową generację produktu rozszczepienia p30. Szlak p43 / p41 jest inicjowany przez rozszczepienie prokaspazy-8a / b w Asp374, w wyniku czego powstają produkty rozszczepienia p43 / p41 i p12 (Rysunek 2). Ponadto fragmenty te są automatycznie katalitycznie rozszczepiane w Asp384 i Asp210/216, co powoduje powstanie aktywnego heterotetrameru kaspazy-8, p102/p1829,10,11. Ponadto wykazano, że równolegle do szlaku przetwarzania p43/p41, prokaspaza-8a/b jest również rozszczepiana w Asp216, co prowadzi do powstania C-końcowego produktu rozszczepienia p30, a następnie jego proteolizy do p10 i p1810 (Rysunek 2).

Aktywacja prokaspazy-8a/b w filamentu DED jest ściśle regulowana przez białka o nazwie c-FLIPs12. Białka c-FLIP występują w trzech izoformach: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) i c-FLIPRaji (c-FLIPR). Wszystkie trzy izoformy zawierają dwa DED w swoim N-końcowym regionie. c-FLIPL ma również C-końcową, katalitycznie nieaktywną domenę podobną do kaspazy12,13. Obie krótkie izoformy c-FLIP-c-FLIPS i c-FLIPR-działają w sposób antyapoptozowy, zakłócając tworzenie się włókien DED w klasie DISC6,14,15. Ponadto c-FLIPL może regulować aktywację kaspazy-8 w sposób zależny od stężenia. Może to skutkować zarówno efektami pro-, jak i antyapoptozą16,17,18. Tworząc katalitycznie aktywny heterodimer prokaspazy-8/c-FLIPL, c-FLIPL prowadzi do stabilizacji aktywnego centrum prokaspazy-8 i jego aktywacji. Pro- lub antyapoptotyczna funkcja c-FLIPL jest bezpośrednio zależna od jego ilości w włóknach DED i późniejszej ilości złożonych heterodimerów prokaspazy-8/c-FLIPL19. Niskie lub pośrednie stężenia c-FLIPL w DISC powodują wystarczającą ilość heterodimerów prokaspazy-8 / c-FLIPL na włóknie DET, co wspomaga aktywację kaspazy-8. W przeciwieństwie do tego, zwiększone ilości c-FLIPL bezpośrednio prowadzą do jego działania antyapoptotycznego w klasie DISC20.

Razem wzięte, aktywacja i przetwarzanie prokaspazy-8a/b w DISC to wysoce regulowany proces, składający się z kilku etapów. W pracy omówiono pomiar przetwarzania prokaspazy-8 bezpośrednio w DISC, a także analizę składu tego kompleksu. Zostanie to zaprezentowane przy użyciu CD95 DISC jako przykładowego kompleksu DR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z komórkami T zostały przeprowadzone zgodnie z umową etyczną 42502-2-1273 Uni MD.

1. Przygotowanie komórek do eksperymentu

UWAGA: Średnia liczba komórek dla tej immunoprecypitacji wynosi 1 × 107. Komórki przylegające muszą zostać wysiane na jeden dzień przed eksperymentem, tak aby w dniu eksperymentu było 1 ×10 7 komórek.

  1. Przygotowanie komórek adherentnych do eksperymentu
    1. Wysiew 5-8 × 106 przylegających komórek w 20 ml pożywki (patrz Tabela materiałów dla składu) dla każdego stanu w 14,5 cm szalkach na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. W dniu eksperymentu upewnij się, że komórki zlewają się w 80-90% i przylegają do naczynia. Wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do przylegających komórek.
  2. Przygotowanie komórek zawiesinowych do eksperymentu
    1. Ostrożnie umieść 1 × 107 komórek zawiesinowych w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów dla składu) na warunki w 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Jeśli używasz komórek pierwotnych, wyizoluj pierwotne limfocyty T zgodnie z wcześniej opisaną procedurą21. Traktuj pierwotne limfocyty T 1 μg / ml fitohemaglutyniny przez 24 godziny, a następnie 25 U / ml IL2 przez 6 dni.
    3. Ostrożnie umieścić 1 × 108 pierwszorzędowych limfocytów T w 10 ml pożywki hodowlanej (patrz Tabela materiałów dla składu) w każdym stanie na 14,5 cm szalkach bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu.
      UWAGA: Ta większa liczba pierwotnych limfocytów T jest zalecana, ponieważ komórki te są mniejsze.

2. Stymulacja CD95L

  1. Stymuluj komórki za pomocą CD95L (produkowanego zgodnie z wcześniejszym opisem20 lub dostępnego w handlu (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Stężenie CD95L i czas stymulacji są zależne od typu komórki13,15,22,23,24,25. Przygotuj jeden warunek stymulacji dwukrotnie, aby równolegle wygenerować próbkę "kontroli kulek".
    1. Stymuluj przylegające komórki wybranym stężeniem CD95L. Trzymać płytkę pod kątem i odpipetować ligand do pożywki, nie dotykając przylegających komórek.
    2. Stymuluj komórki zawiesinowe za pomocą CD95L, pipetując roztwór liganda do zawiesiny komórki.

3. Pobieranie i liza komórek

  1. Umieść naczynia komórkowe na lodzie.
    UWAGA: Nie wyrzucaj nośnika. Umierające komórki unoszą się w pożywce i są ważne dla analizy.
  2. Dodać 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zawiesiny komórek i zeskrobać przyłączone komórki z płytki. Zebrać zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml.
  3. Umyj naczynie z komórkami dwukrotnie 10 ml zimnego PBS i umieść roztwór myjący w tej samej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 × g przez 5 minut, 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml zimnego PBS. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego PBS.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu do lizy (zawierającego 4% koktajlu inhibitorów proteazy). Inkubuj go przez 30 minut na lodzie.
  7. Odwirować lizat z maksymalną prędkością (~17 000 × g) przez 15 minut, 4 °C.
  8. Przenieść supernatant (lizat) do czystej probówki. Wyrzuć granulkę. Weź 50 μl lizatu do innej probówki. Przeanalizować stężenie białka za pomocą testu Bradforda i pobrać ilość lizatu odpowiadającą 25 μg białka w fiolce. Dodać bufor ładujący (patrz Tabela Materiałów dla składu) do fiolki. Przechowywać w temperaturze -20 °C jako kontrolę lizatu.

4. Immunoprecypitacja (IP)

  1. Do lizatu dodać 2 μl przeciwciał anty-APO-1 i 10 μl kulek sefarozy białka A (przygotowanych zgodnie z zaleceniami producenta). Dodać tylko 10 μl kulek do oddzielnej probówki zawierającej lizat (próbka stymulowana), aby wytworzyć "kontrolę kulek".
    UWAGA: Używaj końcówek do pipet z szerokimi otworami, przecinając końcówki lub kupując specjalne końcówki do IP podczas obchodzenia się z kulkami sefarozy białkowej A.
  2. Inkubować mieszaninę lizatu z przeciwciałami/kulkami sefarozy A z delikatnym mieszaniem przez noc w temperaturze 4 °C. Odwirować lizaty z przeciwciałami/białkiem A sefarozy w kulkach 500 × g przez 4 minuty, 4 °C. Wyrzucić supernatant, dodać 1 ml zimnego PBS do kulek i powtórzyć ten etap co najmniej trzy razy.
  3. Odrzucić supernatant. Zassać kulki, najlepiej za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl.

5. Western blot

  1. Dodać 20 μl 4x buforu ładującego (patrz Tabela Materiałów dla składu) do kulek i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 min. Podgrzewać kontrole lizatu w temperaturze 95 °C przez 5 min.
  2. Załaduj lizaty, IP i wzorzec białka do 12,5% żelu z dodecylosiarczanu sodu (SDS) (patrz Tabela materiałów dla preparatu żelu) i pracuj ze stałym napięciem 80 V.
  3. Przenieść białka z żelu SDS do membrany nitrocelulozowej.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano technikę półsuchą, zoptymalizowaną pod kątem interesujących białek, do transferu w ciągu 12 minut (25 V; 2,5 A = stała). Namocz membranę nitrocelulozową i dwa mini-size stosy transferowe w buforze do elektroforezy (patrz Tabela materiałów dla składu, przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta) na kilka minut przed western blot.
  4. Umieść osuszoną błonę w pudełku i zablokuj ją na 1 godzinę w roztworze blokującym (0,1% Tween-20 w PBS (PBST) + 5% mleka). Inkubować błonę z roztworem blokującym pod delikatnym mieszaniem.
  5. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.

6. Wykrywanie Western blot

  1. Dodać pierwsze przeciwciało pierwszorzędowe we wskazanym rozcieńczeniu (patrz tabela materiałów) do błony i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
  2. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.
  3. Inkubować błonę z 20 ml przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w stosunku 1:10 000 w PBST + 5% mleka) delikatnie wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj membranę trzykrotnie PBST przez 5 minut przy każdym praniu.
  5. Odrzucić PBST i dodać około 1 ml substratu peroksydazy chrzanowej do membrany.
  6. Wykryj sygnał chemoluminescencyjny (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Czas ekspozycji i liczba przechwyconych obrazów zależą od ilości białka w komórce i swoistości zastosowanych przeciwciał. Należy ją ustalić empirycznie dla każdego przeciwciała użytego do wykrywania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować rekrutację kaspazy-8 do DISC i jej przetwarzanie na CD95 DISC, ten artykuł opisuje klasyczny przepływ pracy, który łączy IP CD95 DISC z analizą western blot. Pozwala to na wykrycie kilku kluczowych cech aktywacji kaspazy-8 w DISC: złożenie platformy makromolekularnej aktywującej kaspazę-8, rekrutacja prokaspazy-8 do DISC i przetwarzanie tej kaspazy inicjującej (Rysunek 1 i Rysunek 2). Ten przepływ pracy obejmuje traktowanie wrażliwych komórek CD95L w sposób zale...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście to zostało po raz pierwszy opisane przez Kischkela i wsp.27 i od tego czasu z powodzeniem rozwijane przez kilka grup. Należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii w celu skutecznego immunoprecypitacji DISC i monitorowania przetwarzania kaspazy-8 w tym kompleksie.

Po pierwsze, konieczne jest przestrzeganie wszystkich etapów mycia podczas immunoprecypitacji. Szczególnie ważne są końcowe etapy mycia kulek sefarozy i suszenia kulek sefarozy. Musi to być wykonane p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Fundacji Wilhelma Sandera (2017.008.02), Centrum Systemów Dynamicznych (CDS), finansowanemu przez program UE EFRR (Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego) i DFG (LA 2386) za wsparcie naszej pracy. Dziękujemy Karinie Guttek za wsparcie naszych eksperymentów. Dziękujemy prof. Dirkowi Reinholdowi (OvGU, Magdeburg) za dostarczenie nam pierwotnych limfocytów T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12,5% SDS żelwłasnej produkcjidla dwóch żeli separujących:
3,28 ml destylowany H2O
2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 ml akrylamid
100 &mikro; L 10% SDS
100 i mikro; L 10% APS
7,5 i mikro; L TEMED

dla dwóch żeli zbiorczych:
3,1 ml destylowany H2O
1,25 mL Tris; pH 6,8; 1,5 M
0,5 ml akryloamidu
50 &mikro; L 10% SDS
25 i mikro; L 10% APS
7,5 i mikro; L TEMED
14,5 cm naczynia komórkoweGreiner639160
akryloamidCarl RothA124.1
Końcówki do pipet z filtrem aerozolowym z filtrem o wysokim odzysku i szerokim otworemVWR46620-664 (Ameryka Północna) lub 732-0559 (Europa)Służy do pipetowania kulek do
antyaktynySigma AldrichA2103rozcieńczenie: 1:4000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-APO-1 Abdostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez EnzoALX-805-038-C100stosowany wyłącznie do immunoprecypitacji
anty-kaspazy-10 AbBiozolMBL-M059-3rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
antykaspaza-3Sygnalizacjakomórkowa Ab 9662Rozcieńczenie S: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anty-kaspaza-8 Ab C15dostarczony w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub może być zakupiony przez ENZOALX-804-242-C100rozcieńczenie: 1:20 w PBST + 1:100 NaN3
anty-CD95 AbSanta Cruzsc-715rozcieńczenie: 1:2000 w PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abdostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub mogą być zakupione przez ENZOALX-804-961-0100rozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abdostarczone w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można je kupić przez ENZOADI-AAM-212-Erozcieńczenie: 1:10 w PBST + 1:100 NaN3
anty-PARPSygnalizacja komórkowa9542rozcieńczenie: 1:1000 w PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-merkaptoetanolCarl Roth4227.2
Roztwór Bradforda
Test białkowy Koncentrat odczynnika barwnikowego 450ml		Bio Rad500-0006stosowany zgodnie z instrukcjami producenta
CD95Ldostarczonymi w tych eksperymentach przez prof. P. Krammera lub można go kupić przez ENZOALX-522-020-C005
detektor chemoluminescencji
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail ()Sigma Aldrich11 836 145 001przygotowany zgodnie z instrukcją producenta
DPBS (10x) bez Ca, MgPAN BiotechP04-53500rozcieńczenie 1:10 z H2O, przechowywanie w lodówce
bufor eletroforezywłasnej produkcji10x bufor do elektroforezy:
60,6 g Tris
288 g glicyny
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 rozcieńczenie przed użyciem
glicynaCarl Roth3908.3
Koza Anty-Mysia IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleko
Koza Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05rozcieńczenie 1:10.000 in PBST + 5% mleko
kozie Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05rozcieńczenie 1:10.000 w PBST + 5% mleka
Interleukina-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001do aktywacji limfocytów T
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
Bufor załadowczy
4x Laemmli Bufor do próbek, 10 ml		Bio Rad161-0747przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta
Luminata Forte Western HRPsubstrate MilliporeWBLUFO500
liza buforprodukcji13,3 ml Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 ml NaCl; 5 M
10 ml EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
dodać 960 ml H2O
podłoże dla komórek adhaerentowych DMEM F12 (1:1) w stabilnej glutaminy,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154dodając 10% FCS, 1% penicyliny-streptomycyny i 0,0001% Puromycyny do pożywki
dla pierwotnych limfocytów Tgibco firmy Life Technologie21875034dodanie 10% FCS i 1% penicyliny-streptomycyny do podłoża
mleka w proszkuCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTwłasnej roboty20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 ml Tween-20
ad 2 L H2O
rozcieńczenie 1:20 przed użyciem
PBST + 5% mlekowłasnej produkcji50 g mleka w proszku + 1 L PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801do aktywacji limfocytów T
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373stosować od 3-5 do mikro; L
Białko A Sefaroza Koraliki CL-4BNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01kulki z żywicy powinowactwa przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
skrobakVWR734-2602
SDS CarlRoth4360.2
wytrząsarkaHeidolph
azydek soduCarl RothK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Mini-size stosy transferowe Trans Blot TurboBio Rad170-4270używane zgodnie z instrukcją producenta
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta
TransBlot Turbo Membrana niktrocelulozowa w rozmiarze miniBio Rad170-4270używany zgodnie z instrukcjami producenta
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac AppliChem A4974,1000
lizatu Ab Ab własnej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Death Inducing Signaling ComplexProcaspase 8 ProcessingCD95 DISC FormationExtrinsic ApoptosisImmunoprecipitation TechniqueWestern BlotCaspase 8 ActivationFADD Recruitmentc FLIP ProteinsCaspase 8 Activity Assay

Related Articles