Artykuł metodologiczny

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62852

⸱

23 września 2021

 ,  ,  , 
1Graduate School of Genome Science & Technology, University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Streszczenie

Inżynieria metabolizmu komórkowego dla ukierunkowanej biosyntezy może wymagać rozległych cykli projektowania, budowania, testowania i uczenia się (DBTL), ponieważ inżynier pracuje nad wymaganiami dotyczącymi przetrwania komórki. Alternatywnie, przeprowadzanie cykli DBTL w środowiskach bezkomórkowych może przyspieszyć ten proces i złagodzić obawy związane z kompatybilnością hosta. Obiecujące podejście do bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) wykorzystuje metabolicznie aktywne surowe ekstrakty komórkowe jako platformy do bioprodukcji oraz szybkiego odkrywania i prototypowania zmodyfikowanych białek i szlaków. Wykorzystanie tych możliwości i optymalizacja wydajności CFME wymaga metod charakteryzujących metabolom platform bezkomórkowych opartych na lizacie. Oznacza to, że narzędzia analityczne są niezbędne do monitorowania poprawy w zakresie ukierunkowanych konwersji metabolitów oraz do wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu. W tym przypadku zastosowano analizy metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją optyczną lub spektrometryczną mas w celu scharakteryzowania produkcji i przepływu metabolitów w lizatach E. coli S30. W szczególności raport ten opisuje przygotowanie próbek z lizatów CFME do analiz HPLC z wykorzystaniem wykrywania indeksu refrakcji (RID) w celu ilościowego określenia wytwarzania centralnych produktów pośrednich przemiany materii i produktów ubocznych w procesie konwersji tanich substratów (tj. glukozy) do różnych produktów o wysokiej wartości. Przedstawiono również analizę konwersji metabolitów w reakcjach CFME podawanych glukozą znakowaną 13C za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (MS/MS), która jest potężnym narzędziem do charakteryzowania określonych wydajności metabolitów i strumienia metabolicznego lizatu z materiałów wyjściowych. Zastosowanie tych metod analitycznych do metabolizmu lizatu CFME umożliwia rozwój tych systemów jako alternatywnych platform do wykonywania szybszych lub nowatorskich zadań inżynierii metabolicznej.

Wprowadzenie

Ograniczenia w inżynierii mikrobów do produkcji chemicznej można rozwiązać poprzez rekapitulację reakcji biochemicznych in vitro, w których nie występują konkurencyjne funkcje przetrwania komórek1. Co więcej, otwarte środowisko reakcji (tj. brak błony komórkowej) jest bardziej podatne na manipulacje i łatwiejsze do monitorowania w porównaniu z żywymi komórkami. Ta fundamentalna koncepcja bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) została elegancko zademonstrowana przez odtworzenie szlaków metabolicznych w celu syntezy cennych substancji chemicznych, takich jak wodór i monoterpeny, o wskaźnikach produkcji, które są o rzędy wielkości wyższe niż prezentowane do tej pory w fabrykach komórek mikrobiologicznych1,2,3. Metody oczyszczania całych ścieżek są jednak obecnie ograniczone czasem i kosztami. Alternatywnie, bezkomórkowe systemy metaboliczne mogą być uzyskane z surowych ekstraktów komórkowych za pomocą szybkich i niedrogich metod związanych z rekonstytucją całego szlaku4. Centralny metabolizm, który jest zatrzymywany w ekstraktach komórkowych, może być uzupełniony substratami energetycznymi (np. glukozą i kofaktorami enzymatycznymi) oraz solami w roztworach buforowych w celu wytworzenia centralnych prekursorów metabolicznych przez ponad 24 h5,6. Dodanie egzogennych enzymów do reakcji CFME opartej na lizacie pozwala na bardziej złożone biotransformacje glukozy w bardziej wartościowe substancje chemiczne przy wysokich mianach4,6,7. Chociaż wydajność w tych systemach jest zwykle zagrożona ze względu na ich komórkową złożoność metaboliczną, opracowywane są i są opracowywane unikalne metody selekcji proteomów lizatu w celu uzyskania wyższej wydajności7,8.

Łatwość przeprowadzania przemian metabolicznych w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie sprawia, że te platformy są doskonałe zarówno do całkowitego przeniesienia produkcji chemicznej poza komórkę, jak i do prototypowania nowych ścieżek o wysokiej przepustowości przed zbudowaniem i przetestowaniem tych projektów in vivo2,9. W obu przypadkach narzędzia do monitorowania przemian metabolicznych lub obserwacji ogólnych zmian w strumieniu metabolicznym w lizatach są integralną częścią rozwoju CFME. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może być stosowana do rozdzielania składników chemicznych reakcji CFME z wysoką rozdzielczością i może być sprzężona z detektorami optycznymi lub spektrometrycznymi mas w celu ilościowej identyfikacji metabolitów5,10. Podstawową zasadą HPLC jest to, że anality rozpuszczone w rozpuszczalniku (tj. Faza ruchoma) i przepompowane przez kolumnę będą oddziaływać z określonym materiałem wypełniającym kolumnę (tj. Faza stacjonarna)11. W zależności od ich właściwości chemicznych, anality te wykazują różne czasy retencji, zanim ostatecznie zostaną wymyte z fazy stacjonarnej i przeniesione przez fazę ruchomą do detektora. Niniejszy raport zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania i analizy reakcji CFME opartych na lizacie E. coli za pomocą metod opartych na HPLC wykorzystujących wykrywanie RID i MS/MS.

HPLC sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji (HPLC-RID) jest ogólnie dostępną metodą szybkiej identyfikacji centralnych prekursorów metabolicznych i produktów końcowych. Krótko mówiąc, RID mierzy, w jaki sposób anality zmieniają ugięcie światła przez fazę ruchomą12. Sygnały RID odpowiadające docelowym analitom w próbkach można następnie określić ilościowo poprzez porównanie z sygnałami RID roztworów wzorcowych. W zastosowaniach CFME ten tryb wykrywania był najczęściej stosowany z kolumnami HPLC, które rozdzielają związki w oparciu o kombinację mechanizmów wykluczania wielkości i wymiany ligandów lub chromatografii partycji moderowanej jonami5,6,8,13. Ta konkretna technika jest używana do szybkiego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych, takich jak glukoza, a także tworzenia produktów fermentacji, takich jak bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w reakcjach CFME na bazie lizatu8. Rejestrowanie zmian stężeń tych związków za pomocą HPLC było przydatne zarówno do wyjaśnienia potencjału surowych ekstraktów komórkowych w celu łączenia centralnych prekursorów metabolicznych, jak i zrozumienia, w jaki sposób strumień szlaku jest przekierowywany przez szlaki fermentacyjne podczas złożonych przemian metabolicznych z glukozy w lizatach6,8,14. Przełomowe badania CFME nad ekstraktami z komórek E. coli potwierdzają, że związki fermentacyjne kumulują się jako produkty końcowe katabolizmu glukozy, a także występują jako niepożądane produkty uboczne w lizatach, które nadmiernie eksprymują enzymy egzogenne6,15. Sugeruje się, że metabolizm fermentacyjny odgrywa niezbędną rolę w regeneracji ekwiwalentów redoks kofaktorów (tj. NAD(P)H i ATP) w celu podtrzymania reakcji glikolitycznych8. W związku z tym metoda detekcji optycznej oparta na HPLC, przeznaczona do oddzielania produktów fermentacji, jest użytecznym i powszechnie stosowanym narzędziem podczas wykonywania różnych zadań CFME opartych na lizacie.

CFME może być zaimplementowane do gromadzenia końcowych produktów przemiany materii, które nie są węglowodanami, kwasami organicznymi ani alkoholami4. Pożądany może być również pomiar produktów pośrednich, które są spożywane tak szybko, jak są syntetyzowane10. Chociaż metoda HPLC-RID jest dostępna pod względem kosztów i trudności, metoda ta jest ograniczona ze względu na jej zdolność do rozróżniania metabolitów wyłącznie na podstawie czasu retencji. Szerszy zakres metabolitów może być analizowany, gdy chromatografia cieczowa jest sprzężona z detekcją MS/MS (LC-MS/MS)16. Dzięki tej metodzie anality w fazie ruchomej są jonizowane i wykrywane w różny sposób w oparciu o właściwości masy i ładunku każdej cząsteczki. Wiedza zarówno na temat stosunku masy metabolitu do ładunku (m/z), jak i czasu retencji na kolumnie, ułatwia zatem oddzielenie większości produktów przemiany materii i produktów końcowych o wysokiej rozdzielczości16. Ta technika wykrywania może być również sprzężona z chromatografią nanocieczową, która zapewnia znacznie niższe prędkości przepływu i objętości wtryskiwanej próbki, umożliwiając bardziej czułe wykrywanie małych cząsteczek w złożonym tle17. LC-MS/MS może być dodatkowo stosowany z etykietowaniem izotopowym, ponieważ wbudowane etykiety wprowadzają zmiany w wartościach m/z analitów18. Pomiary punktów czasowych wyekstrahowane z reakcji CFME uzupełnionej substratem 13C6-glukozy mogą zatem określić produkty końcowe lub uboczne pochodzące specjalnie z uzupełnionej glukozy. Chociaż ta metoda śledzenia izotopów nie jest jeszcze powszechnie stosowana w badaniach CFME, jest potężnym narzędziem do zrozumienia przemian metabolicznych w systemach CFME opartych na lizatach, szczególnie dlatego, że przeciwjony soli (tj. octan i glutaminian) w tych reakcjach są również katabolizowane jako substraty wtórne19. Wykorzystanie tej techniki może zatem nakreślić kompleksowy obraz metabolizmu glukozy w lizatach, który do dziś nie jest w pełni zrozumiały. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje metodę chromatografii nanocieczowej sprzężonej z jonizacją nanoelektronoprysku (nano ESI) MS/MS, która może być wykorzystana do zbadania możliwego modelu metabolizmu glukozy, w szczególności w lizatach E. coli (Rysunek 1). Model opiera się na doniesieniach o szlakach fermentacyjnych i szlaku pentozofosforanowym aktywnym w lizatach E. coli pochodzących ze szczepów hodowanych w bogatych mediach5,6,8,14. Technika ta jest dodatkowo wykorzystywana do badania produkcji aminokwasów, ponieważ obecna wiedza na temat anabolizmu aminokwasów z glukozy w lizatach ogranicza się do kilku przykładów, takich jak synteza aminokwasów aromatycznych7. Biorąc pod uwagę głównie polarny charakter produktów końcowych i produktów pośrednich w tych szlakach (tj. kwasów organicznych, fosforanów cukrowych i aminokwasów), zastosowano tutaj chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. Technika ta oddziela związki polarne przez elucję od niepolarnej fazy stacjonarnej. Związki te zostały następnie zjonizowane przez nano ESI w trybie jonów ujemnych, co pozwala na wykrycie analitów z co najmniej jednym ujemnym ładunkiem elementarnym, a tym samym jest przydatne do wykrywania związków kwaśnych. Technika ta jest tutaj stosowana do analizy metabolitów zawierających 13C pochodzących z glukozy i demonstruje użyteczność LC-MS / MS do zrozumienia metabolizmu glukozy w lizatach.

Protokół

1. Rozpoczynanie, zatrzymywanie i przetwarzanie reakcji CFME w układzie czasowym do ilościowego oznaczania metodą HPLC-RID.

  1. Odmrozić wcześniej przygotowane lizaty E. coli i przygotować pozostałe składniki reakcji na lodzie.
    UWAGA: Lizaty opisane w niniejszej procedurze pochodziły z szczepu E. coli BL21DE3-Star hodowanego w pożywce 2xYPTG (1,8% glukozy) do średniej fazy logarytmicznej.
    1. Przygotować odpowiednią objętość sterylizowanego przez filtr (filtr o rozmiarze porów 0,20 µm) buforu S30 (1 M Tris-OAc z pH skorygowanym do 8,2 za pomocą lodowatego kwasu octowego, 1,4 M Mg(OAc)2 oraz 6 M KOAc).
    2. Przygotować mieszaninę energetyczną zawierającą glukozę, sole glutaminianu, ATP, koenzym A, NAD+, bufor Bis-Tris i fosforan dipotasu w buforze S30. Końcowe stężenia w pożądanej objętości reakcji użytej do przygotowania reakcji CFME w niniejszej procedurze wynosiły: 100 mM glukozy, 18 mM glutaminianu magnezu, 15 mM glutaminianu amonu, 195 mM glutaminianu potasu, 1 mM ATP, 0,2 mM koenzymu A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris oraz 10 mM fosforanu dipotasu.
  2. Połączyć składniki w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, aby przygotować końcowe reakcje z całkowitym stężeniem białka lizatu 4,5 mg/mL. W niniejszym przypadku reakcje CFME przygotowano w końcowych objętościach 50 µL w trzech powtórzeniach dla każdego punktu czasowego. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez odpowiednie odstępy czasu.
    UWAGA: Pracować szybko i dodawać lizat jako ostatni składnik mieszaniny reakcyjnej, aby zapobiec przedwczesnym reakcjom metabolicznym z glukozą i solami glutaminianu. W zależności od czasu inkubacji mieszanin reakcyjnych na lodzie może dojść do minimalnego zużycia glukozy.
  3. Zatrzymać reakcje i poddać próbki procesowi przygotowania do analizy HPLC-RID.
    1. Aby zatrzymać reakcje w trzech powtórzeniach w odpowiednich punktach czasowych, natychmiast dodać do końcowej objętości każdej reakcji taką samą objętość 5% kwasu trójchlorooctowego (np. 50 µL 5% kwasu trójchlorooctowego do 50 µL reakcji). Rozcieńczyć każdą próbkę sterylną wodą w ilości dwukrotnej objętości reakcji (tj. 100 µL).
    2. Aby uzyskać próbkę dla czasu zero, zmieszać taką samą objętość 5% kwasu trójchlorooctowego, jaka stanowi całkowitą końcową objętość reakcji (tj. 50 µL), z lizatem przed dodaniem pozostałych składników reakcji. Ten etap zakwaszania powoduje wytrącenie enzymów lizatu przed ich znaczącym zmetabolizowaniem glukozy.
    3. Wymieszać próbki w wirówce typu vortex i odwirować w mikrocentryfudze laboratoryjnej przy 11 600 x g przez 5 min, a następnie przenieść nadosady zawierające anality organiczne do czystych probówek. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli analizy HPLC mają być przeprowadzone innego dnia. Przed przejściem do następnego etapu należy odmrozić przechowywane próbki na lodzie.
    4. Przefiltrować każdą nadosadkę przez filtr o rozmiarze porów 0,22 µm. Alternatywnie do strzykawek można użyć filtrów do probówek do wirowania i odwirować nadosady przy 16 300 x g przez 1 min.
    5. Przenieść każdy filtrat do czystej szklanej fiolki HPLC. Umieścić fiolki w tacy autosamplera HPLC.
  4. Przygotować próbki do wyznaczenia krzywej wzorcowej.
    1. Przygotować roztwór zapasowy wszystkich anality docelowych rozpuszczonych w buforze S30 w ilościach ekimolarnych, przekraczających stężenie początkowe glukozy w reakcjach CFME. W niniejszym przypadku przygotowano roztwór zapasowy składający się z 150 µM glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu. Wykonać rozcieńczenia szeregowe 1:1 (v/v) z roztworu zapasowego, aby uzyskać roztwory 50 µL w trzech powtórzeniach o stężeniach końcowych w zakresie od 0 µM do stężenia zapasowego (tj. 150 µM).
    2. Rozcieńczyć każdy roztwór 50 µL 5% kwasu trójchlorooctowego i 100 µL sterylnej wody. Powtórzyć kroki 1.3.4–1.3.5.
      ​UWAGA: Roztwory do wyznaczania krzywej wzorcowej należy analizować z każdą partią próbek, aby zapewnić dokładne oznaczanie stężeń metabolitów.

2. Przygotowanie układu HPLC do detekcji metabolitów.

  1. W dygestorium przygotować wysterylizowany 5 mM roztwór kwasu siarkowego z wody dejonizowanej i sterylnej filtrowanej. Dodać ~550 µL 98% roztworu kwasu siarkowego klasy HPLC do 2 L wody, aby przygotować 5 mM kwas siarkowy.
    OSTROŻNIE: Kwas siarkowy jest substancją niebezpieczną; praca w dygestorium z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony indywidualnej (PPE) zapobiega wdychaniu oparów oraz kontaktowi z skórą i oczami. Stężony kwas siarkowy gwałtownie reaguje z wodą i należy go dodawać bezpośrednio do wody, a nie odwrotnie. Przechowywać w chłodnym, suchym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego, i stosować właściwe procedury utylizacji odpadów określone przez laboratorium.
  2. Butelkę o pojemności 2 L z 5 mM kwasem siarkowym umieścić w kąpieli wodnej obok urządzenia HPLC. Ustawić temperaturę kąpieli wodnej na 35 °C. Umieścić rurkę z filtrem rozpuszczalnika w butelce z rozpuszczalnikiem, a drugi koniec podłączyć do modułu odgazowującego w linii z modułem pompy.
    UWAGA: Płukanie systemu świeżo przygotowanym rozpuszczalnikiem przed instalacją kolumny jest dobrą praktyką obsługi instrumentu.
  3. Wyposażyć urządzenie HPLC w kolumnę HPLC w linii z modułem RID. Jeśli termostat kolumny jest niedostępny, umieścić kolumnę w kąpieli wodnej o temperaturze 35 °C.
  4. Przygotować moduł RID do analizy w temperaturze 35 °C w oprogramowaniu Chromatography Data System (CDS) zainstalowanym na komputerze systemowym.
    1. W menu View wybrać Method i uruchomić Control View. Kliknąć prawym przyciskiem myszy na Pump Module > Method. Ustawić szybkość przepływu na 0,55 mL·min-1 i wybrać przycisk On , aby uruchomić pompę.
      UWAGA: Jeśli kolumna była przechowywana przed zamontowaniem w HPLC, zwiększać szybkość przepływu do 0,55 mL·min-1 po uprzednim zrównoważeniu kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Kliknąć prawym przyciskiem myszy na panel odpowiadający RID Module > Method. Ustawić temperaturę modułu detektora RI na 35 °C i wybrać On , aby rozpocząć rozgrzewanie modułu detektora RI.
    3. Kliknąć prawym przyciskiem myszy na panel RID Module > Control. Wybrać On dla funkcji Purge Reference Cell przez co najmniej 15 min w przypadku użycia świeżego rozpuszczalnika lub przez 1 h, jeśli przed tą konfiguracją przez detektor RI przepływały różne rozpuszczalniki. Kliknąć przycisk On .
      ​UWAGA: Pozostawić pompę i detektor RI włączone (On ), aby uzyskać stabilną linię bazową na wykresie online. Wpływają na to wahania temperatury w laboratorium i proces ten może trwać do 4 h lub dłużej. Pozostawić system włączony (On ) przez noc przed wprowadzeniem próbek.

3. Tworzenie metody izokratycznego rozdziału HPLC produktów fermentacji organicznej w systemie CDS.

  1. Z paska menu wybierz Method > New Method. Wybierz Method > Save Method jako [MethodName].M. Wybierz Method > Edit Entire Method > Instrument/Acquisition
  2. W zakładce Binary Pump ustaw przepływ na 0.55 mL·min-1. W sekcji Solvents wybierz literę odpowiadającą wejściu rozpuszczalnika w module pompy i ustaw ją na 100% dla elucji izokratycznej. Ustaw Pressure Limits na 0 i 400 bar oraz wprowadź 30 min jako Stoptime.
  3. W zakładce Sampler ustaw objętość wtrysku (Injection Volume) na 50 µL. W sekcji Stoptime wybierz opcję As Pump/No Limit. W ustawieniach Advanced Auxillary Settings ustaw Draw Speed, Eject Speed oraz Draw Position odpowiednio na 200 µL·min-1, 200 µL·min-1 i -0.5 mm.
  4. W zakładce RID ustaw Optical Unit Temperature na 35 °C. W sekcji Signal wybierz Acquire dla Signal oraz >0.2 min dla Peakwidth. Dla Stoptime wybierz opcję As Pump/Injector.
  5. W sekcji Advanced w zakładce RID ustaw Analog Output na 5% Zero Offset oraz 500,000 nRIU dla Attenuation. Wybierz opcję Positive dla Signal Polarity oraz opcję On dla Automatic Zero Before Analysis.
  6. Zapisz metodę, wybierając Method > Save Method. Wczytaj metodę, wybierając Method > Load Method > [MethodName].M.

4. Tworzenie tabeli sekwencji do automatycznego pobierania próbek i uruchomienie systemu HPLC-RID w celu akwizycji danych.

  1. Z paska menu wybierz Sequence > New Sequence Template. Następnie wybierz Sequence > Save Sequence Template as [SequenceTemplateName].S.
  2. Wybierz Sequence > Sequence Table. Dodaj 'n' wierszy odpowiadających 'n' fiolkom, a następnie wprowadź pozycje fiolek oraz nazwy próbek w odpowiednio kolumnach Vial i Sample Name, zgodnie z ich rozmieszczeniem na tacy autosamplera. Z rozwijanego menu Method Name wybierz metodę utworzoną w kroku 3 i wprowadź 50 µL jako Inj/Vial (Injection per Vial) dla każdego wiersza.
  3. Kliknij Apply i zapisz szablon sekwencji, wybierając Sequence Template > Save Sequence Template. Upewnij się, że szablon sekwencji został załadowany, wybierając Sequence > Load Sequence Template > [SequenceTemplateName].S.
  4. Po uzyskaniu stabilnej linii bazowej na wykresie online, kliknij prawym przyciskiem myszy panel RID Module > Control > Off Recycling Valve, aby przekierować przepływ rozpuszczalnika z detektora RID do odpadów. Aby rozpocząć akwizycję danych, wybierz z paska menu Sequence, a następnie Sequence > Run.

5. Ekstrakcja i analiza danych po zakończeniu przebiegu.

  1. Wybierz Analiza danych widok z Widok menu. Znajdź Nazwę pliku sekwencji w Lista plików po lewej stronie ekranu. W panelu środkowym na ekranie przejdź do Wybór widoku sygnału > Sygnał RID aby wyświetlić przykładowe chromatogramy.
  2. Z górnego panelu na ekranie wybierz wiersz odpowiadający próbce wzorca o wysokim stężeniu. Odnotuj czasy retencji dla pików docelowych analitów na wyświetlonym chromatogramie. Piki odpowiadające docelowym analitom będą rozmieszczone wzdłuż osi czasu retencji w następującej kolejności: glukoza, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol (Rysunek uzupełniający 1).
    UWAGA: Pierwszy duży piki na chromatogramie odpowiada kwasowi trichlorooctowemu. Jego jednostki RI powinny być spójne we wszystkich próbkach krzywej wzorcowej. Należy zweryfikować czas retencji każdego badanego analityka, analizując każdy związek jako oddzielną próbkę.
  3. Wyznacz powierzchnie pików dla każdego analitycznego związku docelowego z chromatogramów wzorców oraz próbek reakcyjnych.
    1. Należy ocenić, czy interesujące nas piki zostały prawidłowo zintegrowane przez oprogramowanie. Dla każdego piku należy wyznaczyć czerwoną linię bazową, aby uzyskać dokładną wartość pola pod krzywą. W przypadku niepowodzenia integracji automatycznej (np. gdy czerwona linia jest ustawiona pod kątem), należy wybrać Integracja ręczna przycisk z Zestaw narzędzi do integracji or ręcznie wyznaczyć podstawę piku w celu zintegrowania pola pod pikiem.
      UWAGA: Jeśli dla danego analityka w jednej próbce konieczne jest przeprowadzenie integracji ręcznej, należy zachować spójność i ręcznie zintegrować ten sam analityk we wszystkich próbkach.
    2. Wybierz Kursor narzędzie z Podstawowy zestaw narzędzi należy kliknąć odpowiednio zintegrowane piki. Pole powierzchni piku oraz odpowiadający mu czas retencji wybranego piku zostaną wyróżnione w wierszu tabeli w dolnym panelu ekranu.
    3. Aby wyeksportować pola pików, należy wybrać Plik > Eksport > Wyniki integracji.
  4. Oznacz stężenia analizowanych substancji z wykorzystaniem krzywych wzorcowych.
    1. W arkuszu kalkulacyjnym nanieś wartości pól powierzchni piku w funkcji znanych stężeń próbek. Kliknij prawym przyciskiem myszy na naniesione dane, Dodaj linię trendu > Formatowanie linii trendu > Wyświetlanie równania na wykresie.
    2. W osobnym arkuszu kalkulacyjnym należy wykorzystać równania linii trendu krzywych wzorcowych, aby przeliczyć wartości pól powierzchni piku na stężenia dla każdego anality z każdej próbki. W celu wizualizacji danych należy obliczyć średnie wartości pól powierzchni piku oraz błąd standardowy dla pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach.

6. Rozpoczynanie, zatrzymywanie i przetwarzanie reakcji CFME z izotopowym śledzeniem przebiegu czasowego do ilościowego oznaczenia metodą LC-MS/MS.

  1. Przygotować reakcje w trzech powtórzeniach dla każdego punktu czasowego (z wyjątkiem czasu zero) w lodzie, zgodnie z opisem w punktach 1.1-1.2. Jednak zamiast glukozy, w reakcjach należy zastosować końcowe stężenie 100 mM 13C6-glucose. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 h, 2 h i 3 h.
  2. Aby zatrzymać reakcje, należy je gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Pominąć ten etap przechowywania w przypadku analizy w tym samym dniu.
    UWAGA: Do zatrzymania reakcji nie użyto kwasu trójchlorooctowego ze względu na interferencje kwasu podczas detekcji niektórych centralnych metabolitów węgla za pomocą LC-MS/MS. Zamiast tego, w celu wytrącenia białek metabolicznych, zastosowano rozpuszczalnik do ekstrakcji zawierający kwas mrówkowy (krok 6.3), ponieważ masa kwasu mrówkowego znajduje się poniżej granicy detekcji zgłoszonej metody MS/MS.
  3. Przygotować 50 mL rozpuszczalnika do ekstrakcji. Połączyć i wymieszać w wirówce (vortex) 20 mL acetonitrylu, 20 mL metanolu i 10 mL wody (wszystkie klasy LC-MS) w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL wraz z 0,199 mL kwasu mrówkowego, aby otrzymać roztwór 0,1 M. Schłodzić rozpuszczalnik do 4 °C podczas ekstrakcji i przechowywać go w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany.
  4. Przetwarzanie próbek do analizy LC-MS/MS
    1. W dniu analizy do każdej próbki pipetować równą objętość rozpuszczalnika do ekstrakcji (tj. 50 µL). Jeśli próbki były zamrożone, dodać rozpuszczalnik do ekstrakcji przed całkowitym rozmrożeniem próbek, aby zapobiec reaktywacji metabolizmu glukozy. Wszystkie etapy przetwarzania próbek należy wykonywać w lodzie.
    2. Aby odtworzyć stan w czasie zero, pipetować końcową objętość rozpuszczalnika do ekstrakcji (tj. 50 µL) do odpowiedniej objętości lizatu dla pożądanego stężenia końcowego w reakcji (tj. 4,5 mg/mL w objętości reakcji 50 µL). Dodać pozostałe składniki reakcji zgodnie z krokiem 1.2. Ten etap zakwaszania powoduje wytrącanie enzymów lizatu, zanim znacząco zmetabolizują one glukozę.
    3. Inkubować próbki w rozpuszczalniku do ekstrakcji w lodzie przez 30 min przy delikatnym mieszaniu, a następnie wirować próbki przy 21,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu od wytrąconych białek. Przenieść 50 µL supernatantu do fiolek autosamplera i umieścić fiolki na tacy w autosamplerze w temperaturze 4 °C. Resztę supernatantu przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłych analiz.

7. Konfiguracja systemu LC do analizy LC-MS/MS.

  1. Przygotować 1 L rozpuszczalnika A, całkowicie rozpuszczając 77,08 mg octanu amonu w 950 mL wody i 50 mL izopropanolu. Przygotować 1 L rozpuszczalnika B, mieszając 650 mL acetonitrylu, 300 mL wody i 50 mL izopropanolu oraz dodając 77,08 mg octanu amonu. Należy upewnić się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy LC-MS.
  2. Podłączyć butelki z rozpuszczalnikami A i B do modułu pompy. Przepłukać system przy wysokim przepływie, aby usunąć lub ograniczyć zanieczyszczenia powietrzem, które mogły wystąpić podczas podłączania rozpuszczalników do systemu LC.
  3. Wyposażyć system w kolumnę C18 w fazie odwróconej (długość kolumny 30 cm, średnica wewnętrzna 75 µm i średnica cząstek 5 µm). Kondycjonować kolumnę w systemie LC-MS, przepływając 100% rozpuszczalnika B, a następnie powoli zwiększając udział rozpuszczalnika A do 100%.
    ​UWAGA: Końcówki kolumn zostały przygotowane wewnętrznie przy użyciu wyciągarki do mikrokapilar i upakowane za pomocą ogniw ciśnieniowych i helu.

8. Tworzenie metody w oprogramowaniu do akwizycji i interpretacji danych LC-MS/MS dla systemu LC połączonego ze spektrometrami mas typu Fourier Transform oraz pułapki jonowej.

  1. Otwórz oprogramowanie Tune Plus, aby edytować plik dostrojenia dla metody MS.
    1. Z Plik na pasku menu otwórz preinstalowany plik strojenia dla trybu ujemnego.
    2. Wybierz Tryb Skanowania na pasku menu, a następnie wybierz Definicja okna skanowaniaUstaw czas skanowania mikroskanu dla MSn na 1 zarówno dla pułapki jonowej (Ion Trap), jak i dla FT.
    3. Przejdź do ustawień źródła Nano-ESI i ustaw Napięcie rozpylania do 4 kV. Modulować tę wartość do momentu uzyskania odpowiedniego elektrosprayu; zazwyczaj odpowiedni elektrospray jest osiągalny w zakresie od 2 do 5 kV.
    4. Zapisz plik z melodią.
  2. Opracuj nową metodę LC przy użyciu Kreator konfiguracji oprogramowania instrumentu do akwizycji i interpretacji danych. Otwórz Harmonogram działań > Konfiguracja sekwencji > KreatorPonieważ metody te nie wymagają zastosowania grzałki kolumny, należy pominąć krok kontroli temperatury.
    1. Pod Opcje pompy gradientowej przepływuwybierz WieloetapowyW następnym oknie wstaw 7 wierszy i ustaw przepływ dla każdego z nich na 0,1 ml.·min-1Wprowadź następujące parametry dla każdego wiersza: od 0 do 3 min podawaj 100% rozpuszczalnika A; od 3 do 9 min wprowadź gradient od 100% rozpuszczalnika A do 20% rozpuszczalnika B; od 9 do 19 min wprowadź nowy gradient od 20% rozpuszczalnika B do 100% rozpuszczalnika B; od 19 do 27 min utrzymuj 100% rozpuszczalnika B; od 27 do 28 min przywróć gradient do 100% rozpuszczalnika A; od 28 do 44 min przeprowadź płukanie i rekondycjonowanie kolumny przed kolejnymi analizami, utrzymując 100% rozpuszczalnika A. Dodaj końcowy krok w celu obniżenia szybkości przepływu do 0,03 mL·min-1 po zakończeniu analizy, aby oszczędzać rozpuszczalnik, gdy układ LC nie jest używany.
    2. Zastosuj ustawienia domyślne dla Opcje próbnika > Ciśnienie pompy jako Opcja pozyskiwania oraz zastosowanie Domyślny czas akwizycji oraz zastosowanie Domyślne ciśnienie pompy opcje
  3. Utwórz metodę MS/MS, wybierając ikonę Orbitrap Velos Pro MS z paska bocznego w oknie Instrument Setup.
    1. Kliknij w Nowa metoda > MS/MS zależna od danychUstawić Czas akwizycji do czasu trwania analizy LC (tj. 44 min), Segment do 1, i Zdarzenia skanowania 11. W polu Tune File (Plik strojenia) należy wybrać plik edytowany w kroku 8.1.
      UWAGA: Pierwszym zdarzeniem jest skanowanie prekursorów MS1 z wykorzystaniem spektrometrii mas z transformatą Fouriera (FTMS). Kolejne 10 zdarzeń to skanowania MS2, w których do fragmentacji MS2 wybieranych jest 10 najbardziej intensywnych i unikalnych jonów z każdego skanowania prekursorów.
    2. Dla Zdarzenia 1, w sekcji Opis skanowania zestaw Analizator Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. FTMS i Polarność do UjemnyW ustawieniach MSn wybierz Rozdzielczość 30 000 i Znormalizowana energia kolizji do 35 V. Ustawić Zakresy skanowania do 50 m/z dla pierwszej masy i 1800 m/z dla ostatniej masy, aby uchwycić małe cząsteczki.
    3. W przypadku zdarzeń od 2 do 11, pod Opis skanowania zestaw Analizator do Pułapka jonowaWybierz Skanowanie zależne i kliknij w Ustawienia > Globalny > Dynamiczne wykluczanie i wybierz Włączustaw 30-sekundowy czas powtórzenia oraz 120-sekundowy czas wykluczenia, aby wyeliminować powtórne skanowania w bliskim sąsiedztwie.
    4. Przejdź do Zdarzenie skanowania ustawienia i zestaw Masa wyznaczona na podstawie zdarzenia skanowania do 1 dla wszystkich zdarzeń MS2 (od 2 do 11). Aby przeskanować 10 najintensywniejszych jonów, ustaw każde zdarzenie skanowania MS2 tak, aby wykrywało nth Najintensywniejszy jon z 1st do 10thZatem należy ustawić Zdarzenie 2 aby wykryć 1 jako nth Najintensywniejszy jon, zdarzenie 3 do wykrycia 2 i tak dalej.
    5. Zamknij okno konfiguracji i przejdź do Plik > Zapisz jako [Nazwa_Metody].meth.
      ​UWAGA: W zakresie ogólnego użytkowania, konserwacji i kalibracji urządzenia LC oraz spektrometru mas należy zapoznać się z instrukcjami obsługi i podręcznikami dostarczonymi przez producenta.

9. Konfiguracja sekwencji pomiarowej i rozpoczęcie analizy LC-MS/MS.

  1. Skonfiguruj sekwencję pomiarową przy użyciu oprogramowania do akwizycji i interpretacji danych systemu LC-MS/MS. W sekcji Roadmap > Sequence Setup kliknij prawym przyciskiem myszy w tabeli, aby wstawić tyle wierszy, ile jest próbek. Dla każdego wiersza ustaw wartość Inj Vol na 5 µL, a Position na odpowiednią pozycję fiolki na tacy autosamplera. Wpisz nazwy plików jako nazwy próbek i określ żądaną ścieżkę zapisu wyników pomiarów.
    UWAGA: W celu przepłukania kolumny, na początku sekwencji oraz pomiędzy każdym zestawem próbek powtórzonych trzykrotnie (każdym zestawem punktów czasowych) można uruchomić pomiar pustych fiolek zawierających rozpuszczalnik A.
  2. Aby rozpocząć pomiar, zaznacz wszystkie nazwy plików (File Names) w sekwencji. Z paska menu wybierz Actions > Run Sequence > OK.

10. Konsolidacja plików i wyszukiwanie wstępnych adnotacji w programie MZmine 2.53.

  1. Otwórz program MZmine i zaimportuj pliki wyjściowe '.raw' z kroku 9.1. Z paska menu wybierz Raw Data Methods > Raw Data Import. Wybierz pliki odpowiadające próbkom.
  2. Utwórz listę pików, rozróżniając skany MS1 i MS2. Z paska menu wybierz Raw Data Methods > Feature Detection > MS/MS Peaklist Builder. Istotne ustawienia to m/z Window ustawione na 0.01 oraz Time Window ustawione zgodnie z długością przebiegu. W sekcji filtrów wybierz Negative jako Polarity oraz Centroided jako Spectrum Type.
  3. Z paska menu przejdź do Feature List Methods > Feature Detection > Peak Extender. Ustaw m/z Tolerance na 0.005 m/z lub 10 ppm oraz Minimum Height na 1E3. Ten krok pozwoli na utworzenie w pełni zdefiniowanych pików.
  4. Usuń powielone piki. Wróć do Feature List Methods > Filtering > Duplicate Peak Filter. Istotne ustawienia to m/z Tolerance ustawione na 0.005 m/z lub 10 ppm oraz RT Tolerance ustawione na 5 min.
  5. Aby wyrównać piki w podobnych plikach danych (np. z reakcji przeprowadzonych w trzech powtórzeniach), wróć do Feature List Methods > Normalization > Retention Time Calibration. Pamiętaj, aby przetwarzać próbki z powtórzeniami razem i pominąć próbki ślepe. Istotne ustawienia to m/z Tolerance ustawione na 0.005 m/z lub 10 ppm, RT Tolerance ustawione na 3 min bezwzględnie (min) oraz Minimum Standard Intensity ustawione na 1E3.
  6. Wyrównaj piki ze wszystkich plików według m/z i czasu retencji za pomocą Feature List Methods > Alignment > RANSAC Aligner. Ustaw m/z Tolerance na 0.005 m/z lub 10 ppm, RT Tolerance oraz RT Tolerance After Correction odpowiednio na 44 i 39 min, RANSAC Iterations na 0, Minimum Number of Points na 10% oraz Threshold Value na 1. Zaznacz opcję Require Same Charge State.
  7. Koryguj punkty danych, które mogły zostać utracone w poprzednich krokach, w Feature List Methods > Gap Filling > Peak Finder. Istotne ustawienia to Intensity Tolerance ustawione na 50%, m/z Tolerance set na 0.005 m/z lub 10 ppm oraz RT Tolerance ustawione na 3 min. Włącz korekcję RT.

11. Obliczanie mas metabolitów pochodnych glukozy znakowanej 13C w trybie ujemnym oraz wyszukiwanie cech m/z tych analitów w przefiltrowanych danych.

  1. Oblicz masy metabolitów znakowanych 13C pochodzących z metabolizmu glukozy na potrzeby ukierunkowanego wyszukiwania.
    1. Oblicz masę monoizotopową każdego związku docelowego na podstawie liczby atomów w formule cząsteczkowej związku oraz mas monoizotopowych poszczególnych pierwiastków20.
    2. Oblicz masę związku w trybie ujemnym [M-H]- poprzez odjęcie masy 1 protonu (1.007276 Da) od masy monoizotopowej. Jest to masa wykrywana przez detekcję MS w trybie ujemnym po odebraniu cząsteczkom jonu wodoru podczas jonizacji.
    3. Na podstawie masy w trybie ujemnym oblicz masę metabolitu z wbudowanym 13C. W tym przypadku obliczono masy izotopologów z maksymalnym wbudowaniem znaczników 13C pochodzących z glukozy.
  2. Wykorzystaj obliczone masy metabolitów znakowanych 13C do wyszukiwania i adnotacji cech m/z z wyników MZmine. Dla każdego potencjalnego dopasowania oblicz błąd masy (ppm), korzystając z następującego równania:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Eksperymentalne wartości m/z z błędem masy <15 ppm zostały uznane za przypuszczalne adnotacje w niniejszej analizie.
  3. Ręcznie sprawdź widma przypuszczalnych adnotacji w przeglądarce jakości, aby potwierdzić adnotacje.
    1. Otwórz Roadmap > Qual Browser. Z paska narzędzi wybierz Raw File, aby zaimportować surowe dane MS z każdej próbki.
    2. Narysuj linię pod pożądanym zakresem czasów retencji (tj. odpowiadającym przypuszczalnej adnotacji) na całkowitym chromatogramie jonowym (górny panel), aby wyświetlić widmo masowe (dolny panel). Kliknij prawym przyciskiem myszy na widmie i wprowadź zakres mas obejmujący m/z anality białka docelowego. Sprawdź, czy przypuszczalne adnotacje posiadają wyraźne sygnały pików, które znajdują się znacząco powyżej szumu (Supplemental Figure 2).
  4. Oblicz średnie powierzchnie pików i błędy standardowe potwierdzonych adnotacji w powtórzeniach biologicznych dla każdego punktu czasowego. Zwizualizuj dane (np. na wykresie słupkowym), aby zaobserwować trendy w metabolizmie glukozy.

Wyniki

Aby określić ilościowo bezkomórkową syntezę powszechnych produktów fermentacji z glukozy w układzie opartym na lizatach, lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych w pośrodku 2xYPTG zasilano 100 µM glukozy jako podstawowego źródła węgla8. Reakcje zatrzymywano w ciągu 24 h poprzez zakwaszenie białek. Przefiltrowane nadsączniki zawierające pirogronian, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol powstałe w wyniku katabolizmu glukozy wprowadzano do modułu aut sampler systemu HPLC wyposażonego w moduł RID. Jako wzorce do urządzenia wprowadzano fiolki z przefiltrowanymi mieszaninami produktów końcowych fermentacji i glukozy w stężeniach 1,17 µM, 2,34 µM, 4,69 µM, 9,38 µM, 18,75 µM, 37,50 µM, 75 µM i 150 µM w buforze S30. Anality eluoowano izokratycznie z kolumny HPLC do detektora RID. Za pomocą RID udało się rozdzielić piki dla glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu w zakresie od 1 do 150 µM. Powierzchnie pików dla glukozy wyznaczono poprzez ręczną integrację danych z RID dla próbek z przebiegu czasowego oraz próbek krzywej wzorcowej. Wyekstrahowane powierzchnie pików dla bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu pobrano z automatycznie zintegrowanych sygnałów. Wszystkie krzywe wzorcowe (powierzchnia piku względem znanego stężenia) miały wartości R2 >0,99 i były liniowe w całym zakresie zastosowanych tutaj stężeń.

Stężenia molowe wszystkich analizowanych substancji obliczono na podstawie ich odpowiednich krzywych wzorcowych. Glukoza została zużyta w ciągu pierwszych 3 h reakcji i uległa głównie fermentacji do mleczanu (Rycina 2A,B). Akumulacja etanolu również wystąpiła w znacznym stopniu w ciągu pierwszych 3 h reakcji, a następnie ustała (Rycina 2C). Obserwacja znacznej produkcji mleczanu i etanolu przy jednoczesnym znacznym zużyciu glukozy po 3 h nie była bezprecedensowa, ponieważ szlaki produkcji mleczanu i etanolu umożliwiają regenerację 1 mola netto NAD+ z glikolitycznego NADH, który jest niezbędny do dalszego zużycia glukozy w procesie glikolizy (Rycina 1). Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w bezkomórkowym metabolizmie glukozy opartym na lizatach. Octan był początkowo obecny w reakcjach jako składnik buforu S30 i niespodziewanie zaczął kumulować się w wyniku metabolizmu dopiero po 6 h, gdy zużycie glukozy spowolniło (Rycina 2D). Wynik ten sugeruje, że fermentacja octanowa niekoniecznie umożliwia szybki strumień glikolityczny we wcześniejszych punktach czasowych. W międzyczasie mrówczan i bursztynian były syntetyzowane jako drugorzędne produkty fermentacji (Rycina 2E,F). Podsumowując, opracowana metoda umożliwiła bezwzględne oznaczanie ilościowe ubytku substratu cukrowego oraz powstawania produktów fermentacyjnych w lizatach S30 E. coli .

Zastosowano tutaj detekcję MS w celu profilowania metabolizmu glukozy konkretnie w lizatach. Lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych w podłożu 2xYPTG zostały poddane podkarmianiu 13C6-glukozy jako źródła węgla. Reakcje CFME przeprowadzano w trzech powtórzeniach dla czasu 0 h, 1 h, 2 h i 3 h. Próbki z każdego punktu czasowego wprowadzano do układu LC wyposażonego w kolumnę w fazie odwróconej, sprzężonego ze spektrometrami mas z transformacją Fouriera oraz pułapką jonową. Uzyskano widma w trybie jonów ujemnych, które następnie poddano obróbce w celu analizy kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. Obliczone masy teoretyczne 13Poszukiwano gatunków znakowanych węglem C w celu zidentyfikowania związków pochodzących konkretnie z glukozy. W oparciu o zastosowane warunki hodowli szczepu źródłowego oraz wcześniejsze doniesienia dotyczące aktywnych szlaków w E. coli W przypadku CFME przyjmuje się tutaj, że proteom lizatu obejmuje sieć metaboliczną, w której glukoza jest kierowana do fermentacji glikolitycznej, szlaku pentozofosforanowego oraz prawdopodobnie do anabolizmu aminokwasów5,6,7,8,14 (Rycina 1). W związku z tym zakres poszukiwań ograniczono do elementów tych szlaków, spośród których 16 metabolitów zawierających pochodne glukozy 13Etykiety C zostały jednoznacznie przypisane (Tabela uzupełniająca 1).

13C6odnotowano wyraźne zużycie glukozy w procesie glikolizy, o czym świadczyły wahania zawartości produktów pośrednich glikolizy (Rysunek 3A-E). Zgodnie z danymi z HPLC-RID, glukoza akumulowała się do 13C3-mleczan i był również fermentowany do 13C3-bursztynian w ciągu pierwszych 3 h reakcji (Rycina 4A,B). Powstawanie 13C3izotopolog bursztynianu wspiera zaproponowany model metabolizmu glukozy w lizacie (Rycina 1), gdzie bursztynian jest prawdopodobnie generowany w wyniku karboksylacji 3-węglowej cząsteczki fosfoenolopirogronianu (PEP), a nie z entry 2-węglowej cząsteczki acetylo-CoA do cyklu TCA. W poprzednich badaniach nad CFME zakładano aktywację cyklu TCA, ale inne 13Nie wykryto tutaj produktów pośrednich cyklu TCA znakowanych węglem C.8,19,21. 13C3-synteza aspartanu nastąpiła jednak w ciągu pierwszej godziny i została zużyta, co potwierdza tezę, że PEP jest bezpośrednio przekształcane w szczawiooctan (Rycina 1, Rycina 6C). Dane odzwierciedlają proteom lizatu szczepów źródłowych pozyskanych podczas wzrostu fermentacyjnego na mediach bogatych w glukozę (2xYPTG). Sugerowałoby to ponadto, że pozostałe enzymy cyklu TCA nieuczestniczące w produkcji bursztynianu tworzą oksydacyjną gałąź cyklu TCA (Rycina 1). Żaden z metabolitów w tej ścieżce nie został jednak wykryty, co może wynikać z faktu, że wysokie stężenia glutaminianu dodawanego do reakcji CFME jako przeciwjon soli hamują przebieg tej gałęzi.

Dane z HPLC-RID są dodatkowo uzupełnione brakiem detekcji 13C2-octanu w 3-godzinnym czasie reakcji, co sugeruje brak gromadzenia się octanu z glukozy do 3 h (Ryc. 2B). Jednak bezpośredni prekursor octanu, acetylofosforan (acetylo-P), uległ akumulacji, co wskazuje na aktywność ramienia Pta szlaku Pta-AckA odpowiedzialnego za syntezę octanu z acetylo-CoA (Ryc. 4C,D). Dephosphorylacja 13C2-acetylo-P do 13C2-octanu katalizowana przez AckA prawdopodobnie nie zachodzi w tym przedziale czasowym, ponieważ octan jest głównym składnikiem buforu S30 stosowanego w reakcjach (Ryc. 1, Ryc. 2B).

Zaobserwowano również wbudowywanie węgla pochodzącego z 13C6-glukozy do fosforanów cukrów: 6-fosfoglukonolaktonu (6PGL), 6-fosfoglukonianu (6PG), rybulozą-5-fosforanu (Ru5P) oraz sedoheptulozą-7-fosforanem (S7P) (Rycina 5). Wyniki te potwierdzają udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy w lizacie i prawdopodobnie zasila on syntezę 13C9-tyrozyny, co sugerowano wcześniej w badaniu proteomicznym, zapewniając jednocześnie prekursor do produkcji 13C5-histydyny (Rycina 6A,B)7. Nie zaobserwowano tutaj znakowanej fenyloalaniny ani tryptofanu, podobnie jak większości aminokwasów egzogennych. Nie jest to jednak całkowicie zaskakujące, ponieważ anabolizm aminokwasów jest prawdopodobnie wzmocniony w lizatach pochodzących z komórek hodowanych w warunkach głodu nutrientowego lub w fazie stacjonarnej7,22. Co więcej, dotychczasowe dane sugerują, że produkty pośrednie glikolizy i fermentacji są kierowane do końcowych reakcji regeneracji kofaktorów, co musi wykluczać syntezę wielu aminokwasów pochodzących z gliceraldehydu-3-fosforanu, pirogronianu i acetylo-CoA (tj. glicyny, cysteiny, seryny, alaniny, waliny, leucyny i lizyny) (Rycina 1). Jak wspomniano, 13C3-asparaginian był produkowany w ciągu pierwszej godziny, natomiast nie zaobserwowano aminokwasów pochodzących z asparaginianu zawierających wbudowany 13C (tj. treoniny, izoleucyny, metioniny i asparaginy), co może wynikać z faktu, że asparaginian pochodzący z glukozy bierze udział w fermentacji (Rycina 1, Rycina 6C). Na koniec, strumień w kierunku znakowanego glutaminianu i aminokwasów pochodnych glutaminianu mógł zostać zahamowany przez wysoki poziom glutaminianu w środowisku reakcyjnym (Rycina 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Putatywny model metaboliczny lizatów pochodzących z E. coli BL21DE3-Star rosnących wykładniczo w wysokich stężeniach glukozy. Pośredniki i produkty końcowe glikolizy (zielony), szlaku pentozofosforanowego (ciemnopomarańczowy) oraz szlaków fermentacyjnych (niebieski) z acetylo-CoA zostały zgłoszone w CFME opartym na lizatach. Obecność fermentacji bursztynianowej sugeruje aktywację oksydacyjnej gałęzi cyklu TCA (szary). Anabolizm aminokwasów (złoty) w lizatach nie jest dobrze zdefiniowany i jest tutaj badany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dane HPLC-RID dotyczące zużycia glukozy i syntezy produktów końcowych fermentacji w reakcjach CFME przygotowanych z ekstraktów surowych E. coli. (A) Zużycie glukozy oraz (B) produkcja mleczanu, (C) etanolu, (D) octanu, (E) mrówczanu i (F) bursztynianu w reakcjach CFME były monitorowane przez 24 h. Przedstawiono średnie stężenia w mM oraz słupki błędów (SE) wyznaczone za pomocą krzywych wzorcowych (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Trendy przebiegu czasowego 13C6-glukozy i znakowanych 13C produktów pośrednich glikolizy w CFME na bazie lizatu E. coli  . Względna zawartość (A) 13C6-glukozy, (B) 13C6-glukozo-6-fosforanu/fruktozo-6-fosforanu, (C) 13C6-fruktozo-1,6-bisfosforanu, (D) 13C3-gliceraldehyd-3-fosforanu/dihydroksyacetonofosforanu oraz (E) 13C6-pirogronianu w reakcjach CFME w czasie 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały użyte do obliczenia średnich i słupków błędu (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Trendy czasowe produktów pośrednich i końcowych w fermentacji 13C6-glukozy w lizacie CFME E. coli .Względna obfitość (A) 13C3-mleczanu, (B) 13C3-bursztynianu, (C) 13C2-acetylofosforanu oraz (D) 13C2-acetylu-CoA w reakcjach CFME w ciągu 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyodrębnione za pomocą oprogramowania mzMINE posłużyły do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Trendy czasowe produktów pośrednich szlaku pentozofosforanowego pochodzących z 13C6-glukozy w lizacie CFME E. coli . Względna obfitość (A) 13C6-6-fosfoglukonolaktonu, (B) 13C6-6-fosfoglukonianu, (C) 13C5-rybulozofosforanu-5 oraz (D) 13C7-sedoheptulozofosforanu-7 w czasie 3 h. Surowe pola powierzchni piku wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały użyte do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6: Trendy czasowe wykrytych aminokwasów pochodzących z 13C6-glukozy w CFME lizatu E. coli. Względna obfitość (A) 13C9-tyrozyny, (B) 13C5-histydyny oraz (C) 13C3-asparaginianu w ciągu 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały wykorzystane do obliczenia średnich i słupków błędu (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Reprezentatywny chromatogram HPLC-RID przedstawiający piki głównych produktów fermentacyjnych w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 24 h. Piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu są wystarczająco rozróżnialne na podstawie ich czasów retencji na kolumnie HPLC podczas elucji izokratycznej z zastosowaniem rozpuszczalnika w postaci 5 mM kwasu siarkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywne widma mas dla metabolitów znakowanych 13C, a konkretnie (A) mleczanu, (B) glukozy i (C) 6-fosfoglukonianu (6PG) w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 1 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Lista wykrytych metabolitów znakowanych 13C, czasów retencji (wyrównanych w próbkach za pomocą MZmine), teoretycznych wartości m/z dla pełnego znakowania 13C w trybie ujemnym, wartości m/z wykrytych cech oraz obliczonych błędów masy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przedstawione podejście HPLC-RID może być wykorzystane do pomyślnego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych i późniejszej konwersji do głównych kwasów organicznych i produktów alkoholowych centralnego metabolizmu lizatu w czasie. Co więcej, protokół ten wykorzystuje prostą metodę izokratyczną wykorzystującą pojedynczą fazę ruchomą, wymaga minimalnego przygotowania próbki i umożliwia prostą, ukierunkowaną analizę na dalszym etapie. Anality mierzone metodą HPLC-RID wyróżniają się wyłącznie czasem retencji, a co za tym idzie oddziaływaniami z wybraną żywicą kolumnową. Zastosowana tutaj kolumna HPLC została specjalnie zaprojektowana do oddzielania węglowodanów, kwasów organicznych i alkoholi poprzez połączenie wykluczenia wielkości i wymiany ligandów (tj. chromatografii partycji moderowanej jonami). Opisana metoda jest zatem przydatna do bardziej ukierunkowanej analizy substratów węglowodanowych i wybranych produktów końcowych szlaków fermentacji glukozy, które mają przede wszystkim ułatwić i zenergetyzować biotransformacje oparte na lizacie 8,15,21. Jednak protokół ten nie uwzględnia aktywacji innych szlaków metabolicznych w ekstraktach komórkowych. Rurociągi wykorzystujące inne techniki rozdzielania chromatograficznego (tj. chromatografię oddziaływań hydrofilowych), metody elucji gradientowej, bardziej skomplikowane przygotowanie próbki (tj. derywatyzacja) i różne detektory optyczne (np. detektory rozpraszania światła ultrafioletowego lub światła wyparnego) mogą być stosowane do wykrywania innych metabolitów, takich jak aminokwasy i fosforany cukru23,24. Alternatywnie, globalne podejście do badania metabolizmu lizatu można przyjąć przy użyciu LC-MS/MS.

Opisana metoda LC-MS/MS to pojedynczy proces pomiaru i identyfikacji szerszego zakresu metabolitów. LC-MS/MS jest najnowocześniejszym narzędziem analitycznym do profilowania metabolomu ze względu na swoją czułość i zdolność do rozróżniania metabolitów na podstawie czasu retencji i współczynników m/z z wysoką rozdzielczością16. Koncentrując się na centralnych szlakach metabolicznych węgla i anabolizmie aminokwasów, wdrożono tryb ujemny MS/MS w celu specyficznego wykrywania polarnych kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. W połączeniu z techniką chromatografii nanocieczowej, metoda ta zapewnia wysoką czułość wykrywania małych cząsteczek w złożonym tle lizatu17. Jeśli jednak chodzi o profilowanie metabolizmu CFME opartego na lizatach, ograniczeniem opisanego protokołu LC-MS/MS jest jego dolna granica wykrywalności wynosząca 50 m/z, co wyklucza pomiar etanolu, głównego produktu metabolizmu glukozy w lizacie, a także mrówczanu, które w przeciwnym razie można łatwo określić ilościowo za pomocą szczegółowej metody HPLC-RID. W porównaniu z LC-MS/MS, HPLC-RID ma dodatkową zaletę w postaci względnej dostępności pod względem kosztów i trudności. Do tego ostatniego punktu, rozwiązywanie problemów z opisaną tutaj metodą LC-MS/MS może wymagać pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej w zakresie spektrometrii mas. Niemniej jednak, wykrywanie stwardnienia rozsianego ma wyjątkowo atrakcyjne zastosowania w porównaniu z RID, ponieważ może dodatkowo rozróżniać znakowane izotopy w metabolomach, co jest doskonałą techniką zrozumienia ruchu węgla z uzupełnionych substratów przez złożoną sieć metaboliczną lizatu18. Takie podejście zastosowano w tym przypadku poprzez uzupełnienie reakcji 13C6-glukozą i analizę względnych wartości obfitości dalszych metabolitów zawierających 13C. Analiza pozwoliła na zdefiniowanie aktywnych i nieaktywnych szlaków, wspierając wcześniej zgłoszone założenia i dostarczając nowych informacji na temat przepływu metabolicznego w lizatach. W ramach metody można również wprowadzać modyfikacje dla konkretnych analiz. Na przykład roztwory wzorcowe 13związków docelowych znakowanych znakiem C można analizować wraz z próbkami, aby uzyskać bezwzględne pomiary ilościowe cząsteczek pochodzących z glukozy w czasie i wyciągnąć wnioski na temat rozkładu strumienia. Lepsze wykrywanie dodatnio naładowanych związków można również włączyć w ramach bieżącego przepływu pracy, uruchamiając sekwencje z plikami .meth dostosowanymi do wykrywania w trybie dodatnim.

Pobieranie próbek analitycznych w obu opisanych metodach jest wygodnie zautomatyzowane, co zapewnia wysoką odtwarzalność. Co więcej, można oczekiwać płynnych przebiegów analitycznych, o ile przestrzegane są właściwe praktyki obsługi i konserwacji instrumentów. Korzystając z tych narzędzi do analizy reakcji CFME, należy wziąć pod uwagę bardziej krytyczne kwestie przed i po pobraniu próbki. Podczas przygotowywania próbki ważne jest, aby kontrole przebiegu w czasie były reprezentatywne dla czasu zerowego. W tym przypadku białka zostały wytrącone w lizatach przez zakwaszenie w celu zatrzymania reakcji metabolicznych. W przypadku próbek o czasie zerowym rozpuszczalnik kwasowy połączono z lizatem przed dodaniem mieszaniny reakcyjnej zawierającej glukozę. Zakwaszenie kwasem trójchlorooctowym skutecznie zapewniło, że glukoza nie jest metabolizowana w czasie zero, jak pokazano w danych HPLC-RID (ryc. 2). Podczas gdy podobną procedurę wygaszania metabolizmu glukozy przeprowadzono w zgłoszonej analizie LC-MS/MS, wykryto 13metabolitów znakowanych C w próbkach z czasem zerowy, aczkolwiek przy znacznie niskich wartościach liczebności w stosunku do próbek wyekstrahowanych w późniejszych punktach czasowych. Co więcej, obserwacje te ograniczały się do produktów pośrednich glikolizy. Dane sugerują, że reakcje zachowują pewien stopień aktywności glikolitycznej po zakwaszeniu rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, który jest wykrywany za pomocą tej bardzo czułej metody. Zakres tej działalności powinien jednak zostać określony ilościowo. Poprzednie badanie wykazało, że kwaśne rozpuszczalniki ekstrakcyjne mogą nie wygaszać w wystarczającym stopniu pośrednich reakcji glikolitowych, ale mogą zatrzymać znaczne zużycie glukozy10. Chociaż pozostaje to do dalszego zbadania w zastosowanym tutaj systemie, drastyczne zmiany w względnych wartościach obfitości między próbkami o czasie zerowym a późniejszymi punktami czasowymi mogą być interpretowane jako trendy w metabolizmie glukozy. W podobnych zastosowaniach zaleca się jednak zbadanie alternatywnych metod hartowania, w szczególności w celu uzyskania bezwzględnych ilości pośrednich produktów metabolicznych10. Ponadto należy również przestrzegać dobrych praktyk podczas dalszych analiz oprogramowania. Spójność jest niezbędna podczas ręcznej integracji obszarów szczytowych z sygnałów RID w celu zmniejszenia błędu ludzkiego. Ręczna integracja powinna być również stosowana do obszarów pików wzorców w każdym przypadku, gdy ręcznie zintegrowane obszary pików są wykorzystywane do ilościowego określania stężeń metabolitów w próbkach. W trakcie ukierunkowanej analizy LC-MS/MS wstępne adnotacje z analizy MZmine powinny być walidowane poprzez ręczne sprawdzanie pików za pomocą przeglądarki jakości MS, a cechy m/z powinny być opisywane tylko wtedy, gdy obliczone błędy masy są dopuszczalne. W tym przypadku analizy te zostały przeprowadzone ręcznie dla ograniczonego zestawu celów, ponieważ kompleksowe i solidne oprogramowanie do wyszukiwania izotopów nie jest jeszcze stworzone. Jednak obecnie pojawiają się takie zautomatyzowane metody wyszukiwania metabolitów znakowanych izotopem węgla 13C, które usprawniłyby również bardziej skomplikowane analizy, takie jak profilowanie lizatów poza centralnym metabolizmem węgla25.

Zaawansowana chromatografia cieczowa jest solidną i szeroko stosowaną metodą rozdzielania małych cząsteczek w złożonych mieszaninach metabolicznych11. Opisane metody łączą tę technikę separacji z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas, aby skutecznie analizować konwersje metabolitów w reakcjach CFME opartych na lizatach. HPLC-RID i LC-MS/MS są indywidualnie potężnymi narzędziami do profilowania aktywnego metabolizmu lizatów, a ich komplementarność może być dodatkowo wykorzystana do rozwiązania nieodłącznych ograniczeń każdej techniki. Przedstawione metody umożliwiają zastosowanie i rozwój CFME, ponieważ można je wykorzystać do zrozumienia metabolizmu lizatu, monitorowania ulepszeń w docelowych konwersjach metabolitów oraz wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani inne konflikty interesów.

Podziękowania

To badanie było sponsorowane przez Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, jako część Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725. Niniejszy manuskrypt został napisany przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów Rządu Stanów Zjednoczonych. Departament Energii zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtry probówkowe wirówkowe (kolumny wirowe)Corning Costar8160
1,5 ml probówki mikrowirówkoweVWR87003-294
1260 Infinity Binary LCSystem AgilentG1312BHPLC-RID
1260 Wysokowydajny odgazowywacz InfinitySystem AgilentG4225ASystem HPLC-RID
1260 Detektor nieskończoności indeksu refrakcjiAgilentG7162ASystem HPLC-RID
1260 Infinity Standardowy automatyczny podajnik próbekAgilentG1329BSystem HPLC-RID
13C6-glukozaSkładnik mieszaniny reakcyjnej Sigma-Aldrich 389374 CPM (LC-MS/MS)
500 ml 0,20 μ m filtr porowy (membrana PES)VWR10040-436
Acetonitryl (klasa LC/MS)Fisher ScientificA955Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
AdenozynotrifosforanSigma-AldrichA7699Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Kolumna Aminex HPX 87-HBio-rad1250140Kolumna chromatograficzna do HPLC-RID
Octan amonu (klasa LC/MS)Fisher ScientificA11450Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
Glutaminian amonuSigma-AldrichG1376CFME Składnik mieszanki reakcyjnej
Nasadki na fiolki automatycznego podajnika próbek (żółte, zatrzask)Thermo ScientificC4011-50YPrzechowywanie/dostarczanie próbek do
fiolek z automatycznym samplerem LC-MS/MS (0,30 ml, polipropylen)WheatonW225181Przechowywanie/dostarczanie próbek do LC-MS/MS
Mikrowirówka laboratoryjnaFisher Scientific13-100-675
Bis-TrisSigma-AldrichB9754Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Koenzym A (CoA)Sigma-AldrichC4282Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
D-dekstroza (glukoza)VWRBDH9230Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Fosforan dipotasuSigma-AldrichP8281Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
EtanolFisher ScientificBP2818100Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu krzywej wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas mrówkowy (klasa LC/MS)Thermo Scientific85178Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
Topiona krzemionka (średnica wewnętrzna 100 μ m, średnica zewnętrzna 375 μ m)Polymicro TechnologiesWM22005-NDKolumna chromatograficzna do LC-MS / MS
Lodowaty kwas octowySigma-AldrichA6283S30 składnik buforowy
Izopropanol (klasa LC / MS)Fisher ScientificA461Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS
Kinetex 5 i mu; m C18 faza stacjonarna (100 Å)PhenomenexN/A; na specjalne zamówienieKolumna chromatograficzna do spektrometru mas LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos ProThermoFisher ScientificN/A; na specjalne zamówienieSpektrometr masowy do LC-MS/MS
Octan magnezu Składnik buforowySigma-AldrichM5661S30
Glutaminian magnezuSigma-Aldrich49605CFME
Metanol (klasa LC / MS)Fisher ScientificA456Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS
NAD+Sigma-AldrichN0632Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Źródło jonizacji Nanospray Źródło ThermoFisherScientific/ProxeonES071 (najnowszy model)Spektrometr masowy do LC-MS/MS
OpenLab CDS (online) OprogramowanieAgilentWersja 2.15.26System danych chromatograficznych do pozyskiwania i analizy danych HPLC
Oprogramowanie Orbitrap Velos Pro LTQ Tune PlusThermoVersion 2.7Oprogramowanie do strojenia systemu LC-MS/MS
Octan potasuSigma-AldrichP1190S30
Glutaminian potasuSigma-AldrichG1501CFME Składnik mieszaniny reakcyjnej
Wirówka z chłodzeniemEppendorf5415 C
Zakrętki (z przegrodą, 9 mm)Supelco29315-UPrzechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID
Fiolki ze szkła gwintowanego (2 ml)Supelco29376-UPrzechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID
Octan soduSigma-Aldrich241245Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
MrówczansoduSigma-Aldrich247596Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Mleczan soduSigma-Aldrich71716Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas bursztynowySigma-Aldrich398055Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas siarkowySigma-Aldrich258105Preparat rozpuszczalnikowy do HPLC-RID
Kwas trichlorooctowySigma-AldrichT6399
Tris-octanGoldBioT-090-100S30 składnik buforowy
Ultimate 3000 LC z autosampleremIonex: SRD-3600System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS
Ultimate 3000 LC z automatycznym podajnikiem próbekDionexRapid Separation Pompa binarna: HPG-3400RSSystem chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS
Ultimate 3000 LC z autosampleremAutomatyczny podajnik próbek płytek Dionex do szybkiej separacji: WPS-3000TRSSystem chromatografii cieczowej do analizy LC-MS / MS
(klasa LC / MS)Fisher ScientificW6500Przygotowanie rozpuszczalnika do LC-MS/MS
Xcalibur SoftwareThermo Wersja 3.0.63Oprogramowanie do akwizycji i interpretacji danych dla LC-MS/MS
Składnik buforowy Stojak na rozpuszczalnik

Bibliografia

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
  2. Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
  3. Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
  4. Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003(2019).
  5. Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
  6. Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
  7. Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
  8. Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162(2021).
  9. Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
  10. Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72(2020).
  11. Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
  12. Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
  13. Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
  14. Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
  15. Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
  16. Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
  17. Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
  18. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  19. O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
  20. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  21. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  22. Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000(2017).
  23. Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
  24. Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
  25. Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezkom rkowa in ynieria metabolicznasystemy oparte na lizatachdetekcja za pomoc wsp czynnika za amania wiat aanaliza HPLCmetabolizm glukozymetabolity centralneprodukty fermentacji

Powiązane artykuły