Artykuł metodologiczny

Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas w celu profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62852

⸱

23 września 2021

 ,  ,  , 
1Graduate School of Genome Science & Technology, University of Tennessee Knoxville, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee Knoxville, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.

Streszczenie

Inżynieria metabolizmu komórkowego dla ukierunkowanej biosyntezy może wymagać rozległych cykli projektowania, budowania, testowania i uczenia się (DBTL), ponieważ inżynier pracuje nad wymaganiami dotyczącymi przetrwania komórki. Alternatywnie, przeprowadzanie cykli DBTL w środowiskach bezkomórkowych może przyspieszyć ten proces i złagodzić obawy związane z kompatybilnością hosta. Obiecujące podejście do bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) wykorzystuje metabolicznie aktywne surowe ekstrakty komórkowe jako platformy do bioprodukcji oraz szybkiego odkrywania i prototypowania zmodyfikowanych białek i szlaków. Wykorzystanie tych możliwości i optymalizacja wydajności CFME wymaga metod charakteryzujących metabolom platform bezkomórkowych opartych na lizacie. Oznacza to, że narzędzia analityczne są niezbędne do monitorowania poprawy w zakresie ukierunkowanych konwersji metabolitów oraz do wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu. W tym przypadku zastosowano analizy metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją optyczną lub spektrometryczną mas w celu scharakteryzowania produkcji i przepływu metabolitów w lizatach E. coli S30. W szczególności raport ten opisuje przygotowanie próbek z lizatów CFME do analiz HPLC z wykorzystaniem wykrywania indeksu refrakcji (RID) w celu ilościowego określenia wytwarzania centralnych produktów pośrednich przemiany materii i produktów ubocznych w procesie konwersji tanich substratów (tj. glukozy) do różnych produktów o wysokiej wartości. Przedstawiono również analizę konwersji metabolitów w reakcjach CFME podawanych glukozą znakowaną 13C za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (MS/MS), która jest potężnym narzędziem do charakteryzowania określonych wydajności metabolitów i strumienia metabolicznego lizatu z materiałów wyjściowych. Zastosowanie tych metod analitycznych do metabolizmu lizatu CFME umożliwia rozwój tych systemów jako alternatywnych platform do wykonywania szybszych lub nowatorskich zadań inżynierii metabolicznej.

Wprowadzenie

Ograniczenia w inżynierii mikrobów do produkcji chemicznej można rozwiązać poprzez rekapitulację reakcji biochemicznych in vitro, w których nie występują konkurencyjne funkcje przetrwania komórek1. Co więcej, otwarte środowisko reakcji (tj. brak błony komórkowej) jest bardziej podatne na manipulacje i łatwiejsze do monitorowania w porównaniu z żywymi komórkami. Ta fundamentalna koncepcja bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) została elegancko zademonstrowana przez odtworzenie szlaków metabolicznych w celu syntezy cennych substancji chemicznych, takich jak wodór i monoterpeny, o wskaźnikach produkcji, które są o rzędy wielkości wyższe niż prezentowane do tej pory w fabrykach komórek mikrobiologicznych1,2,3. Metody oczyszczania całych ścieżek są jednak obecnie ograniczone czasem i kosztami. Alternatywnie, bezkomórkowe systemy metaboliczne mogą być uzyskane z surowych ekstraktów komórkowych za pomocą szybkich i niedrogich metod związanych z rekonstytucją całego szlaku4. Centralny metabolizm, który jest zatrzymywany w ekstraktach komórkowych, może być uzupełniony substratami energetycznymi (np. glukozą i kofaktorami enzymatycznymi) oraz solami w roztworach buforowych w celu wytworzenia centralnych prekursorów metabolicznych przez ponad 24 h5,6. Dodanie egzogennych enzymów do reakcji CFME opartej na lizacie pozwala na bardziej złożone biotransformacje glukozy w bardziej wartościowe substancje chemiczne przy wysokich mianach4,6,7. Chociaż wydajność w tych systemach jest zwykle zagrożona ze względu na ich komórkową złożoność metaboliczną, opracowywane są i są opracowywane unikalne metody selekcji proteomów lizatu w celu uzyskania wyższej wydajności7,8.

Łatwość przeprowadzania przemian metabolicznych w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie sprawia, że te platformy są doskonałe zarówno do całkowitego przeniesienia produkcji chemicznej poza komórkę, jak i do prototypowania nowych ścieżek o wysokiej przepustowości przed zbudowaniem i przetestowaniem tych projektów in vivo2,9. W obu przypadkach narzędzia do monitorowania przemian metabolicznych lub obserwacji ogólnych zmian w strumieniu metabolicznym w lizatach są integralną częścią rozwoju CFME. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może być stosowana do rozdzielania składników chemicznych reakcji CFME z wysoką rozdzielczością i może być sprzężona z detektorami optycznymi lub spektrometrycznymi mas w celu ilościowej identyfikacji metabolitów5,10. Podstawową zasadą HPLC jest to, że anality rozpuszczone w rozpuszczalniku (tj. Faza ruchoma) i przepompowane przez kolumnę będą oddziaływać z określonym materiałem wypełniającym kolumnę (tj. Faza stacjonarna)11. W zależności od ich właściwości chemicznych, anality te wykazują różne czasy retencji, zanim ostatecznie zostaną wymyte z fazy stacjonarnej i przeniesione przez fazę ruchomą do detektora. Niniejszy raport zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania i analizy reakcji CFME opartych na lizacie E. coli za pomocą metod opartych na HPLC wykorzystujących wykrywanie RID i MS/MS.

HPLC sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji (HPLC-RID) jest ogólnie dostępną metodą szybkiej identyfikacji centralnych prekursorów metabolicznych i produktów końcowych. Krótko mówiąc, RID mierzy, w jaki sposób anality zmieniają ugięcie światła przez fazę ruchomą12. Sygnały RID odpowiadające docelowym analitom w próbkach można następnie określić ilościowo poprzez porównanie z sygnałami RID roztworów wzorcowych. W zastosowaniach CFME ten tryb wykrywania był najczęściej stosowany z kolumnami HPLC, które rozdzielają związki w oparciu o kombinację mechanizmów wykluczania wielkości i wymiany ligandów lub chromatografii partycji moderowanej jonami5,6,8,13. Ta konkretna technika jest używana do szybkiego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych, takich jak glukoza, a także tworzenia produktów fermentacji, takich jak bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w reakcjach CFME na bazie lizatu8. Rejestrowanie zmian stężeń tych związków za pomocą HPLC było przydatne zarówno do wyjaśnienia potencjału surowych ekstraktów komórkowych w celu łączenia centralnych prekursorów metabolicznych, jak i zrozumienia, w jaki sposób strumień szlaku jest przekierowywany przez szlaki fermentacyjne podczas złożonych przemian metabolicznych z glukozy w lizatach6,8,14. Przełomowe badania CFME nad ekstraktami z komórek E. coli potwierdzają, że związki fermentacyjne kumulują się jako produkty końcowe katabolizmu glukozy, a także występują jako niepożądane produkty uboczne w lizatach, które nadmiernie eksprymują enzymy egzogenne6,15. Sugeruje się, że metabolizm fermentacyjny odgrywa niezbędną rolę w regeneracji ekwiwalentów redoks kofaktorów (tj. NAD(P)H i ATP) w celu podtrzymania reakcji glikolitycznych8. W związku z tym metoda detekcji optycznej oparta na HPLC, przeznaczona do oddzielania produktów fermentacji, jest użytecznym i powszechnie stosowanym narzędziem podczas wykonywania różnych zadań CFME opartych na lizacie.

CFME może być zaimplementowane do gromadzenia końcowych produktów przemiany materii, które nie są węglowodanami, kwasami organicznymi ani alkoholami4. Pożądany może być również pomiar produktów pośrednich, które są spożywane tak szybko, jak są syntetyzowane10. Chociaż metoda HPLC-RID jest dostępna pod względem kosztów i trudności, metoda ta jest ograniczona ze względu na jej zdolność do rozróżniania metabolitów wyłącznie na podstawie czasu retencji. Szerszy zakres metabolitów może być analizowany, gdy chromatografia cieczowa jest sprzężona z detekcją MS/MS (LC-MS/MS)16. Dzięki tej metodzie anality w fazie ruchomej są jonizowane i wykrywane w różny sposób w oparciu o właściwości masy i ładunku każdej cząsteczki. Wiedza zarówno na temat stosunku masy metabolitu do ładunku (m/z), jak i czasu retencji na kolumnie, ułatwia zatem oddzielenie większości produktów przemiany materii i produktów końcowych o wysokiej rozdzielczości16. Ta technika wykrywania może być również sprzężona z chromatografią nanocieczową, która zapewnia znacznie niższe prędkości przepływu i objętości wtryskiwanej próbki, umożliwiając bardziej czułe wykrywanie małych cząsteczek w złożonym tle17. LC-MS/MS może być dodatkowo stosowany z etykietowaniem izotopowym, ponieważ wbudowane etykiety wprowadzają zmiany w wartościach m/z analitów18. Pomiary punktów czasowych wyekstrahowane z reakcji CFME uzupełnionej substratem 13C6-glukozy mogą zatem określić produkty końcowe lub uboczne pochodzące specjalnie z uzupełnionej glukozy. Chociaż ta metoda śledzenia izotopów nie jest jeszcze powszechnie stosowana w badaniach CFME, jest potężnym narzędziem do zrozumienia przemian metabolicznych w systemach CFME opartych na lizatach, szczególnie dlatego, że przeciwjony soli (tj. octan i glutaminian) w tych reakcjach są również katabolizowane jako substraty wtórne19. Wykorzystanie tej techniki może zatem nakreślić kompleksowy obraz metabolizmu glukozy w lizatach, który do dziś nie jest w pełni zrozumiały. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje metodę chromatografii nanocieczowej sprzężonej z jonizacją nanoelektronoprysku (nano ESI) MS/MS, która może być wykorzystana do zbadania możliwego modelu metabolizmu glukozy, w szczególności w lizatach E. coli (Rysunek 1). Model opiera się na doniesieniach o szlakach fermentacyjnych i szlaku pentozofosforanowym aktywnym w lizatach E. coli pochodzących ze szczepów hodowanych w bogatych mediach5,6,8,14. Technika ta jest dodatkowo wykorzystywana do badania produkcji aminokwasów, ponieważ obecna wiedza na temat anabolizmu aminokwasów z glukozy w lizatach ogranicza się do kilku przykładów, takich jak synteza aminokwasów aromatycznych7. Biorąc pod uwagę głównie polarny charakter produktów końcowych i produktów pośrednich w tych szlakach (tj. kwasów organicznych, fosforanów cukrowych i aminokwasów), zastosowano tutaj chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. Technika ta oddziela związki polarne przez elucję od niepolarnej fazy stacjonarnej. Związki te zostały następnie zjonizowane przez nano ESI w trybie jonów ujemnych, co pozwala na wykrycie analitów z co najmniej jednym ujemnym ładunkiem elementarnym, a tym samym jest przydatne do wykrywania związków kwaśnych. Technika ta jest tutaj stosowana do analizy metabolitów zawierających 13C pochodzących z glukozy i demonstruje użyteczność LC-MS / MS do zrozumienia metabolizmu glukozy w lizatach.

Protokół

1. Czas rozpoczęcia, zatrzymania i przetwarzania przebiegu reakcji CFME dla kwantyfikacji HPLC-RID.

  1. Rozmrozić wcześniej przygotowane lizaty E. coli i przygotować pozostałe składniki reakcji na lodzie.
    UWAGA: Opisane tutaj lizaty pochodziły z E. coli BL21DE3-Star uprawianych w pożywkach 2xYPTG (1,8 % glukozy) do połowy fazy logarytmicznej.
    1. Przygotować odpowiednią objętość wysterylizowanego filtrem (filtr porowy 0,20 μm) buforu S30 (1 M Tris-OAc dostosowany do pH 8,2 z lodowatym kwasem octowym, 1,4 M Mg(OAc)2 i 6 M KOAc).
    2. Przygotuj miks energetyczny zawierający glukozę, sole glutaminianu, ATP, koenzym A, NAD+, bufor Bis-Tris i fosforan dipotasowy w buforze S30. Końcowe stężenia w pożądanej objętości reakcyjnej użytej do przygotowania reakcji CFME wynosiły tutaj 100 mM glukozy, 18 mM glutaminianu magnezu, 15 mM glutaminianu amonu, 195 mM glutaminianu potasu, 1 mM ATP, 0,2 mM Koenzymu A, 1 mM NAD+, 150 mM Bis-Tris i 10 mM fosforanu dipotasowego.
  2. Połącz składniki w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, aby przygotować końcowe reakcje z 4,5 mg/ml całkowitego białka lizy. W tym przypadku reakcje CFME przygotowano z końcowymi objętościami 50 μl w trzech egzemplarzach na punkt czasowy. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C dla odpowiednich ram czasowych.
    UWAGA: Pracuj szybko i dodaj lizat jako końcowy składnik mieszanki reakcyjnej, aby zapobiec przedwczesnym reakcjom metabolicznym z solami glukozy i glutaminianu. Minimalne zużycie glukozy może wystąpić w zależności od tego, jak długo mieszaniny reakcyjne są inkubowane na lodzie.
  3. Zakończyć reakcje i przetworzyć próbki do analizy HPLC-RID.
    1. Aby zakończyć potrójne reakcje w odpowiednich punktach czasowych, należy natychmiast dodać równą objętość 5% kwasu trichlorooctowego do końcowej objętości reakcji każdej próbki (tj. 50 μl 5% kwasu trichlorooctowego do 50 μl reakcji). Rozcieńczyć każdą próbkę sterylną wodą o stężeniu 2-krotności objętości reakcyjnej (tj. 100 μl).
    2. Aby podsumować czas zerowy, należy zmieszać tę samą objętość 5% kwasu trichlorooctowego, co całkowita końcowa objętość reakcji (tj. 50 μl) z lizatem przed dodaniem pozostałych składników reakcji. Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę.
    3. Wirować próbki i odwirować na stołowej mikrowirówce o sile 11 600 x g przez 5 minut, a następnie przenieść supernatanty zawierające anality organiczne do czystych probówek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C, jeżeli analizy HPLC mają być przeprowadzone w innym dniu. Upewnij się, że przechowywane próbki zostały rozmrożone na lodzie przed przejściem do następnego kroku.
    4. Przefiltrować każdy supernatant za pomocą filtra porowego 0,22 μm. Jako alternatywę dla strzykawek należy użyć filtrów probówkowych wirówkowych i odwirować supernatanty w stężeniu 16 300 x g przez 1 min.
    5. Przenieść każdy filtrat do czystej szklanej fiolki HPLC. Załaduj fiolki na tacę automatycznego podajnika próbek HPLC.
  4. Przygotuj próbki do generowania krzywej standardowej.
    1. Przygotować roztwór podstawowy wszystkich docelowych analitów rozpuszczonych w buforze S30 w ilościach równomolowych powyżej początkowego stężenia glukozy w reakcjach CFME. Tutaj przygotowano roztwór podstawowy składający się ze 150 μM glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:1 (v/v) z roztworu podstawowego, aby otrzymać trzykrotnie 50 μl roztworów o stężeniach końcowych w zakresie od 0 μM do stężenia podstawowego (tj. 150 μM).
    2. Rozcieńczyć każdy roztwór 50 μl 5% kwasu trichlorooctowego i 100 μl sterylnej wody. Powtórz kroki 1.3.4-1.3.5.
      UWAGA: Uruchom roztwory do generowania krzywej wzorcowej dla każdej partii próbek, aby zapewnić dokładną kwantyfikację stężeń metabolitów.

2. Przygotowanie systemu HPLC do wykrywania metabolitów.

  1. Pod wyciągiem przygotuj wysterylizowany 5 mM roztwór kwasu siarkowego z wody dejonizowanej i sterylizowanej filtrem. Dodaj ~550 μL 98% roztworu kwasu siarkowego klasy HPLC do 2 l wody, aby przygotować 5 mM kwasu siarkowego.
    UWAGA: Kwas siarkowy jest niebezpieczną substancją chemiczną, a praca pod wyciągiem z odpowiednimi laboratoryjnymi środkami ochrony osobistej zapobiega wdychaniu, kontaktowi ze skórą i kontaktowi z oczami. Stężony kwas siarkowy wchodzi w energiczną reakcję z wodą i powinien być dodawany bezpośrednio do wody, a nie na odwrót. Przechowywać w chłodnym, suchym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego i postępować zgodnie z odpowiednimi środkami usuwania odpadów ustalonymi przez laboratorium.
  2. Przechowywać 2-litrową butelkę z 5 mM kwasem siarkowym inkubowaną w łaźni wodnej obok przyrządu do HPLC. Ustawić łaźnię wodną na temperaturę 35 °C. Umieścić rurkę z filtrem rozpuszczalnika w butelce z rozpuszczalnikiem, a drugi koniec podłączyć do modułu odgazowującego w jednej linii z modułem pompy.
    UWAGA: Przedmuchiwanie systemu świeżo przygotowanym rozpuszczalnikiem przed zainstalowaniem kolumny jest dobrą praktyką obchodzenia się z instrumentami.
  3. Wyposaż instrument HPLC w kolumnę HPLC w linii z modułem RID. Umieść kolumnę w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C, jeśli termostat kolumny nie jest dostępny.
  4. Przygotować moduł RID do analizy w temperaturze 35 °C w oprogramowaniu Chromatography Data System (CDS) zainstalowanym na komputerze systemowym.
    1. W menu Widok wybierz metodę i uruchom widok kontrolny. Kliknij prawym przyciskiem myszy moduł pompy > metodę. Ustaw natężenie przepływu na 0,55 ml·min-1 i wybierz przycisk On, aby uruchomić pompę.
      UWAGA: Jeśli kolumna była przechowywana przed wyposażeniem w HPLC, zwiększ natężenie przepływu do 0,55 ml·min-1 po wyrównaniu kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy panel odpowiadający metodzie > modułu RID. Ustaw temperaturę modułu detektora RI na 35 °C i wybierz Włączone, aby rozpocząć nagrzewanie modułu detektora RI.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy panel RID Module > Control. Wybierz Włączone dla celi referencyjnej Purge na co najmniej 15 minut w przypadku korzystania ze świeżego rozpuszczalnika lub 1 godzinę, jeśli różne rozpuszczalniki przepływały przez detektor RI przed tą konfiguracją. Kliknij przycisk Włącz.
      UWAGA: Pozostaw pompę i detektor RI w pozycji włączonej, aby uzyskać stabilną linię bazową na wykresie online. Mają na to wpływ wahania temperatury w laboratorium i mogą trwać do 4 godzin lub dłużej. Pozostaw system włączony przez noc przed załadowaniem próbki.

3. Tworzenie metody izokratycznego rozdzielania produktów fermentacji organicznej metodą HPLC w CDS.

  1. Na pasku menu wybierz pozycję Metoda > Nowa metoda. Wybierz metodę > Zapisz metodę jako [NazwaMetody].M. Wybierz metodę > edytuj całą metodę > instrumentu/akwizycji
  2. Na karcie Binary Pump (Pompa binarna) ustaw przepływ na 0.55 mL·min-1. W obszarze Rozpuszczalniki wybierz literę odpowiadającą wejściu rozpuszczalnika na module pompy i ustaw ją na 100% dla elucji izokratycznej. Ustaw limity ciśnienia na 0 i 400 bar i wprowadź 30 minut jako czas zatrzymania.
  3. Na karcie Sampler (Próbnik) ustaw Volume (Objętość wtrysku) na 50 μL. Wybierz opcję As Pump/No Limit (Jako pompa/Bez limitu) w obszarze Stoptime (Czas zatrzymania). Ustaw zaawansowane ustawienia pomocnicze dla prędkości ciągnięcia, prędkości wysuwania i pozycji pobierania na 200 μL·min-1, 200 μL·min-1 i -0.5 mm.
  4. Na karcie RID ustaw temperaturę jednostki optycznej na 35 °C. W obszarze Sygnał wybierz opcję Acquire (Uzyskaj) dla opcji Signal (Sygnał) i >0,2 min (0,2 min dla pola Peakwidth. Wybierz opcję As Pump/Injector (Jako pompa/wtryskiwacz) dla opcji Stoptime (Czas zatrzymania).
  5. W obszarze Zaawansowane na karcie RID ustaw opcję Analog Output (Wyjście analogowe) na 5% Zero Offset (Przesunięcie zera) i 500 000 nRIU dla tłumienia. Wybierz opcję Dodatnia dla opcji Polaryzacja sygnału i opcję Włączone dla opcji Automatyczne zerowanie przed analizą.
  6. Zapisz metodę, wybierając pozycję Metoda > Zapisz metodę. Załaduj metodę, wybierając pozycję Method > Load Method > [MethodName]. M.

4. Tworzenie tabeli sekwencji do automatycznego próbkowania i uruchamiania systemu HPLC-RID do akwizycji danych.

  1. Na pasku menu wybierz pozycję Sekwencja > Nowy szablon sekwencji. Wybierz pozycję Sekwencja > Zapisz szablon sekwencji jako [SequenceTemplateName]. S.
  2. Wybierz opcję Sekwencja > Tabela sekwencji. Dodać "n" wierszy odpowiadających "n" fiolkom, a następnie wprowadzić pozycje fiolek i nazwy próbek odpowiednio w polach Fiolka i Nazwa próbki, zgodnie z ich rozmieszczeniem na tacy automatycznego podajnika próbek. Wybierz metodę wygenerowaną w kroku 3 z menu rozwijanego Nazwa metody i wprowadź 50 μl jako Inj/fiolkę (wstrzyknięcie na fiolkę) dla każdego wiersza.
  3. Kliknij przycisk Zastosuj i zapisz szablon sekwencji, wybierając opcję Szablon sekwencji > Zapisz szablon sekwencji. Upewnij się, że szablon sekwencji został załadowany, wybierając pozycję Sekwencja > Załaduj szablon sekwencji > [SequenceTemplateName]. S.
  4. Po osiągnięciu stabilnej linii bazowej na wykresie online kliknij prawym przyciskiem myszy panel Moduł RID > Zawór sterujący > wyłączający recykling, aby skierować przepływ rozpuszczalnika przez detektor RID do odpadów. Aby rozpocząć pobieranie danych, wybierz Sekwencja z paska menu, Sekwencja > Uruchom.

5. Ekstrakcja i analiza danych po uruchomieniu.

  1. Wybierz pozycję Widok Analiza danych z menu Widok. Znajdź nazwę pliku sekwencji na liście plików po lewej stronie ekranu. Na środkowym panelu ekranu przejdź do opcji Signal View Selection (Wybór widoku sygnału) > RID Signal, aby wyświetlić chromatogramy próbki.
  2. Z górnego panelu ekranu należy wybrać wiersz odpowiadający próbce wzorcowej o wysokim stężeniu. Należy zwrócić uwagę na czasy retencji docelowych pików analitu na wyświetlonym chromatogramie. Piki odpowiadające docelowym analitom zostaną ułożone wzdłuż osi czasu retencji jako glukoza, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol (rysunek uzupełniający 1).
    UWAGA: Pierwszy duży pik na chromatogramie odpowiada kwasowi trichlorooctowemu. Jego jednostki RI powinny być spójne we wszystkich próbkach krzywej standardowej. Zwaliduj czas retencji każdego docelowego analitu, uruchamiając każdy związek jako oddzielną próbkę.
  3. Wyodrębnić powierzchnie pików dla każdego analitu docelowego z chromatogramów wzorców i próbek reakcyjnych.
    1. Sprawdź, czy szczyty zainteresowania są dobrze zintegrowane przez oprogramowanie. Narysuj czerwoną linię jako podstawę każdego szczytu, aby uzyskać dokładnie zintegrowany obszar pod krzywą. Jeśli automatyczna integracja nie powiedzie się (np. czerwona linia jest przekrzywiona), wybierz przycisk Ręczna integracja z zestawu narzędzi do integracji i ręcznie narysuj podstawę piku, aby zintegrować obszar piku.
      UWAGA: Jeśli konieczne jest przeprowadzenie ręcznej integracji dla docelowego analitu w jednej próbce, należy zachować spójność i ręcznie zintegrować ten sam analit we wszystkich próbkach.
    2. Wybierz narzędzie Kursor ze wspólnego zestawu narzędzi, aby kliknąć prawidłowo zintegrowane szczyty. Obszar piku i odpowiadający mu czas retencji wybranego piku zostaną podświetlone jako wiersz tabeli w dolnym panelu ekranu.
    3. Aby wyeksportować obszary szczytów, wybierz opcję Plik > Eksportuj > Wyniki integracji.
  4. Określić ilościowo docelowe stężenia analitu za pomocą krzywych wzorcowych.
    1. Wykreśl wartości powierzchni pików w porównaniu ze znanymi stężeniami próbek w arkuszu kalkulacyjnym. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykreślone dane, dodaj linię trendu > Formatuj linię trendu > Wyświetl równanie na wykresie.
    2. W osobnym arkuszu kalkulacyjnym użyj równań linii trendu krzywej standardowej, aby przekonwertować wartości powierzchni piku na stężenia dla każdego analitu z każdej próbki. Obliczanie średnich obszarów pików i wartości błędów standardowych w trzech powtórzeniach w celu wizualizacji danych.

6. Uruchamianie, zatrzymywanie i przetwarzanie przebiegu śledzenia izotopów reakcji CFME dla kwantyfikacji LC-MS/MS.

  1. Ustawić potrójne reakcje na punkt czasowy (z wyjątkiem czasu zero) na lodzie, jak opisano w ppkt 1.1-1.2. Jednak zamiast glukozy należy użyć końcowego stężenia 100 mM 13C 6-glukozy w reakcjach. Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 1 h, 2 h i 3 h.
  2. Aby zakończyć, należy błyskawicznie zamrozić reakcje w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Pomiń ten etap przechowywania w przypadku analizy tego samego dnia.
    UWAGA: Kwas trichlorooctowy nie był używany do zatrzymywania reakcji z powodu zakłóceń powodowanych przez kwas podczas wykrywania niektórych centralnych metabolitów węgla za pomocą LC-MS/MS. Zamiast tego do wytrącenia białek metabolicznych użyto rozpuszczalnika ekstrakcyjnego zawierającego kwas mrówkowy (etap 6.3), ponieważ masa kwasu mrówkowego jest poniżej granicy wykrywalności zgłoszonej metody MS/MS.
  3. Przygotować 50 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Połącz i zmieszaj 20 ml acetonitrylu, 20 ml metanolu i 10 ml wody (wszystkie klasy LC-MS) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wraz z 0,199 ml kwasu mrówkowego, aby uzyskać 0,1 M roztwór. Schłodzić rozpuszczalnik do temperatury 4 °C podczas ekstrakcji i przechowywać rozpuszczalnik w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany.
  4. Przetwarzanie próbek do analizy LC-MS/MS
    1. W dniu analizy odpipetować równoważną objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (tj. 50 μl) do każdej próbki. Jeśli próbki zostały zamrożone, dodaj rozpuszczalnik ekstrakcyjny przed całkowitym rozmrożeniem próbek, aby zapobiec ponownej aktywacji metabolizmu glukozy. Wszystkie etapy przetwarzania próbki należy wykonać na lodzie.
    2. Aby podsumować czas zerowy, należy odpipetować końcową objętość rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (tj. 50 μl) do odpowiedniej objętości lizatu dla pożądanego stężenia końcowego w reakcji (tj. 4,5 mg/ml w 50 μl objętości reakcyjnej). Dodać pozostałe składniki reakcji, jak w kroku 1.2. Ten etap zakwaszania wytrąca enzymy lizatu, zanim w znacznym stopniu zmetabolizują glukozę.
    3. Próbki inkubować w rozpuszczalniku ekstrakcyjnym na lodzie przez 30 minut, delikatnie wstrząsając, a następnie odwirować próbki w temperaturze 21 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia supernatantu od wytrąconego białka. Przenieść 50 μl supernatantu do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek i umieścić fiolki na tacy w podajniku próbek o temperaturze 4 °C. Pozostałą część supernatantu przechowywać w temperaturze -20 °C do przyszłych analiz.

7. Konfiguracja systemu LC do analizy LC-MS/MS.

  1. Przygotować 1 l rozpuszczalnika A, całkowicie rozpuszczając 77,08 mg octanu amonu w 950 ml wody i 50 ml izopropanolu. Przygotuj 1 l rozpuszczalnika B z 650 ml acetonitrylu, 300 ml wody i 50 ml izopropanolu wraz z 77,08 mg octanu amonu. Upewnij się, że wszystkie rozpuszczalniki są klasy LC-MS.
  2. Podłącz butelki z rozpuszczalnikiem zawierające rozpuszczalniki A i B do modułu pompy. Przedmuchnąć system przy dużym natężeniu przepływu, aby usunąć/ograniczyć wszelkie zanieczyszczenia powietrza, które mogły wystąpić podczas dostarczania rozpuszczalników do układu LC.
  3. Wyposaż system w kolumnę C18 z odwróconymi fazami (długość kolumny 30 cm, średnica wewnętrzna 75 μm i średnica cząstek 5 μm). Kondycjonuj kolumnę do systemu LC-MS, przepływając 100% rozpuszczalnik B i powoli płynąc w górę rozpuszczalnika A do 100%.
    UWAGA: Końcówki kolumn zostały przygotowane we własnym zakresie przy użyciu ściągacza do mikropipet i wypełnione kuwetami ciśnieniowymi i helem.

8. Tworzenie metody na oprogramowaniu do akwizycji i interpretacji danych LC-MS/MS dla systemu LC połączonego ze spektrometrami mas z transformacją Fouriera i pułapką jonową.

  1. Otwórz oprogramowanie Tune Plus, aby edytować plik strojenia dla metody MS.
    1. Z Plik na pasku menu otwórz wstępnie zainstalowany plik strojenia w trybie ujemnym.
    2. Wybierz opcję ScanMode na pasku menu, a następnie wybierz opcję Define Scan Window (Definiuj okno skanowania). Ustaw ustawienie czasu mikroskopowania dla MSn na 1 zarówno dla pułapki jonowej, jak i FT.
    3. Przejdź do ustawień źródła Nano-ESI i ustaw napięcie natrysku na 4 kV. Modulować to, aż zostanie wygenerowany akceptowalny elektrorozpylacz; zazwyczaj dopuszczalne elektrorozpylanie można osiągnąć w zakresie 2-5 kV.
    4. Zapisz plik strojenia.
  2. Wygeneruj nową metodę LC za pomocą Kreatora konfiguracji oprogramowania do akwizycji i interpretacji danych instrumentu. Otwórz Kreatora > konfiguracji sekwencji > mapy drogowej. Ponieważ te metody nie wymagają użycia grzejnika kolumnowego, pomiń krok Temp Control.
    1. W obszarze Opcje pompy gradientu przepływu wybierz opcję Wieloetapowy. W następnym oknie wstaw 7 linii i ustaw natężenie przepływu dla każdego rzędu na 0,1 ml·min-1. Wprowadź następujące parametry dla każdego rzędu: od 0-3 minut, dostarczyć 100% rozpuszczalnika A; od 3-9 min wprowadzić gradient od 100% rozpuszczalnika A do 20% rozpuszczalnika B; od 9-19 min wprowadzić nowy gradient od 20% rozpuszczalnika B do 100% rozpuszczalnika B; od 19-27 min utrzymywać w 100% rozpuszczalniku B; od 27-28 min ustawić gradient z powrotem na 100% rozpuszczalnika A; od 28 do 44 minut, płukać i regenerować kolumnę do kolejnych cykli, utrzymując w 100% rozpuszczalniku A. Uwzględnij ostatni krok, aby obniżyć natężenie przepływu do 0,03 ml·min-1 po zakończeniu serii, aby zachować rozpuszczalnik, gdy LC nie jest używany.
    2. Zastosuj ustawienia domyślne dla opcji próbnika > ciśnienia pompy jako opcji akwizycji i użyj opcji Domyślny czas pobierania i użyj opcji domyślnego ciśnienia pompy.
  3. Utwórz metodę MS/MS, wybierając ikonę Orbitrap Velos Pro MS z paska bocznego w oknie Konfiguracja instrumentu.
    1. Kliknij Nowa metoda > Zależne od danych MS/MS. Ustaw Czas pobierania na długość przebiegu LC (tj. 44 minuty), Segment na 1, a Zdarzenia skanowania na 11. W polu Dostrój plik wybierz edytowany plik z kroku 8.1.
      UWAGA: Pierwszym zdarzeniem jest skanowanie prekursora MS1 przy użyciu transformaty Fouriera MS (FTMS). Kolejne 10 zdarzeń będzie skanami MS2 wybierającymi 10 najbardziej intensywnych i unikalnych jonów w każdym skanowaniu prekursorowym pod kątem fragmentacji MS2.
    2. Dla zdarzenia 1 w obszarze Opis skanowania ustaw Analyzer na FTMS i Polarity na Negative. W obszarze MSn Settings (Ustawienia MSn) użyj rozdzielczości 30 000 i znormalizowanej energii zderzenia 35 V. Ustaw zakresy skanowania na 50 m/z dla pierwszej masy i 1800 m/z dla ostatniej masy, aby wychwycić małe cząsteczki.
    3. W przypadku zdarzeń od 2 do 11 w obszarze Opis skanowania ustaw Analyzer (Analizator) na Ion Trap (Pułapka jonowa). Wybierz Skanowanie zależne i kliknij Ustawienia > Globalne wykluczenie dynamiczne > i wybierz Włącz; Ustaw czas powtarzania 30 s i czas trwania wykluczenia 120 s, aby wyeliminować powtórne skanowanie w pobliżu.
    4. Przejdź do ustawień Scan Event (Zdarzenie skanowania) i ustaw wartość Mass Determined from Scan Event (Zdarzenie skanowania) na wartość 1 dla wszystkich zdarzeń MS2 (od 2 do 11). Aby wyszukać 10 najbardziej intensywnych jonów, ustaw każde zdarzenie skanowania MS2 tak, aby wykryłon-ty najbardziej intensywny jon od 1do 10tysięcy. Dlatego ustaw zdarzenie 2 na wykrycie 1 jakon-ty najintensywniejszy jon, zdarzenie 3 na wykrycie 2 i tak dalej.
    5. Zamknij okno konfiguracji i przejdź do Plik > Zapisz jako [Method_Name].meth.
      UWAGA: W przypadku ogólnego użytkowania, konserwacji i kalibracji przyrządu LC i spektrometru masowego należy zapoznać się z instrukcją obsługi i podręcznikami dostarczonymi przez producenta.

9. Ustawianie sekwencji uruchamiania i uruchamianie przebiegu LC-MS/MS.

  1. Skonfiguruj sekwencję uruchamiania za pomocą oprogramowania do akwizycji i interpretacji danych systemu LC-MS/MS. W Roadmap > Sequence Setup kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę, aby wstawić tyle wierszy, ile próbek. Dla każdego rzędu ustaw objętość Inj na 5 μl, a pozycję na odpowiednią pozycję fiolki na tacy automatycznego podajnika próbników. Wprowadź nazwy plików jako nazwy próbek i ustaw żądaną ścieżkę pliku dla wyników uruchamiania.
    UWAGA: Ślepe fiolki zawierające rozpuszczalnik A można uruchomić na początku sekwencji i między każdym zestawem trzech próbek (każdy zestaw punktów czasowych) w celu przepłukania kolumny.
  2. Aby rozpocząć uruchamianie, podświetl wszystkie nazwy plików w sekwencji. Na pasku menu wybierz Akcje > Uruchom sekwencję > OK.

10. Konsolidacja plików i wyszukiwanie wstępnych adnotacji w MZmine 2.53.

  1. Otwórz MZmine i zaimportuj pliki wyjściowe ".raw" z kroku 9.1. Na pasku menu wybierz Metody nieprzetworzonych danych > Import nieprzetworzonych danych. Wybierz pliki odpowiadające przykładom.
  2. Skonstruuj listę pików z rozróżnieniem między skanami MS1 i MS2. Na pasku menu Metody surowych danych > Wykrywanie funkcji > MS/MS Peaklist Builder. Odpowiednie ustawienia obejmują okno m/z ustawione na 0,01 i okno czasowe ustawione na długość przebiegu. W obszarze ustaw filtry wybierz opcję Ujemny jako Polaryzacja i Centroidalny jako Typ widma.
  3. Z paska menu przejdź do pozycji Feature List Methods (Metody listy funkcji) > Feature Detection > Peak Extender (Wykrywanie funkcji Peak Extender). Ustaw tolerancję m/z na 0,005 m/z lub 10 ppm, a minimalną wysokość na 1E3. Ten krok stworzy w pełni rozwinięte szczyty.
  4. Usuń zduplikowane szczyty. Wróć do sekcji Metody listy funkcji > Filtrowanie > Filtr zduplikowanego szczytu. Odpowiednie ustawienia obejmują tolerancję m/z ustawioną na 0,005 m/z lub 10 ppm oraz tolerancję RT ustawioną na 5 min.
  5. Aby wyrównać piki w podobnych plikach danych (tj. te z potrójnych reakcji), wróć do Metody listy funkcji > Normalizacja > Kalibracja czasu przechowywania. Pamiętaj, aby przetworzyć trzy próbki razem i pominąć puste miejsca. Odpowiednie ustawienia obejmują tolerancję m/z ustawioną na 0,005 m/z lub 10 ppm, tolerancję RT ustawioną na 3 min bezwzględną (min) i minimalną normalną intensywność ustawioną na 1E3.
  6. Wyrównaj wartości szczytowe ze wszystkich plików według m/z i czasu przechowywania za pomocą metod listy funkcji > wyrównania > RANSAC Aligner. Ustaw tolerancję m/z na 0,005 m/z lub 10 ppm, tolerancję RT i tolerancję RT po korekcie odpowiednio na 44 i 39 min, iteracje RANSAC na 0, minimalną liczbę punktów na 10%, a wartość progową na 1. Zaznacz opcję Wymagaj tego samego stanu naładowania.
  7. Popraw wszystkie punkty danych, które mogły zostać utracone w poprzednich krokach w temacie Metody listy funkcji > Wypełnianie luk > Wyszukiwarka szczytów. Odpowiednie ustawienia obejmują tolerancję intensywności ustawioną na 50%, tolerancję m/z ustawioną na 0,005 m/z lub 10 ppm oraz tolerancję RT ustawioną na 3 min. Włącz korekcję RT.

11. Obliczanie ujemnych mas modowych 13znakowanych C metabolitów pochodzących z glukozy i poszukiwanie cech m/z tych analitów w filtrowanych danych.

  1. Oblicz masy 13metabolitów znakowanych znakiem C z metabolizmu glukozy dla ukierunkowanego wyszukiwania.
    1. Oblicz masę monoizotopową każdego związku docelowego na podstawie liczby atomów we wzorze cząsteczkowym związku i mas monoizotopowych każdego pierwiastka20.
    2. Oblicz masę w trybie ujemnym związku [M-H]- odejmując masę 1 protonu (1,007276 Da) od masy monoizotopowej. Jest to masa wykryta przez detekcję MS w trybie ujemnym po tym, jak cząsteczki są pozbawione jonu wodorowego podczas jonu.
    3. Na podstawie masy w postaci ujemnej obliczyć masę metabolitu zawierającego 13C. Tutaj obliczono masy izotopologów, które maksymalnie zawierają 13znaczników C pochodzących z glukozy.
  2. Użyj obliczonych mas 13metabolitów znakowanych C, aby wyszukać i oznaczyć cechy m/z na podstawie wyników MZmine. Dla każdego możliwego trafienia oblicz błąd masy (ppm), korzystając z następującego równania:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Eksperymentalne wartości m/z z błędem masy <15 ppm zostały uznane za przypuszczalne adnotacje w bieżącej analizie.
  3. Ręcznie sprawdź widma domniemanych adnotacji w przeglądarce jakości, aby potwierdzić adnotacje.
    1. Otwórz mapę drogową > przeglądarce Qual. Na pasku narzędzi otwórz plik Raw, aby zaimportować nieprzetworzone dane MS każdej próbki.
    2. Narysuj linię poniżej żądanego zakresu czasów retencji (tj. odpowiadającą przypuszczalnej adnotacji) na chromatogramie jonów całkowitych (górny panel), aby wyświetlić widmo masowe (dolny panel). Kliknij widmo prawym przyciskiem myszy i wprowadź zakres mas, które obejmują m/z docelowego analitu. Sprawdź, czy przypuszczalne adnotacje mają wyraźne sygnały szczytowe, które są znacznie powyżej szumu (rysunek uzupełniający 2).
  4. Obliczyć średnie powierzchnie pików i błędy standardowe dodatnich adnotacji w kontrpróbach biologicznych dla każdego punktu czasowego. Wizualizuj dane (np. na wykresie słupkowym), aby obserwować trendy w metabolizmie glukozy.

Wyniki

Aby określić ilościowo opartą na lizacie bezkomórkową syntezę typowych produktów fermentacji z glukozy, lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych na pożywkach 2xYPTG były karmione 100 μM glukozą jako głównym źródłem węgla8. Reakcje zostały zatrzymane w ciągu 24 godzin przez zakwaszenie białek. Przefiltrowane supernatanty zawierające pirogronian, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol wytwarzany w wyniku katabolizmu glukozy załadowano do modułu autosamplera systemu HPLC wyposażonego w moduł RID. Fiolki z przefiltrowanymi mieszaninami fermentacyjnych produktów końcowych i glukozy o stężeniach 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM i 150 μM w buforze S30 zostały załadowane do urządzenia jako wzorce. Anality eluowano izokratycznie z kolumny HPLC do RID. Piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu w zakresie od 1 do 150 μM można określić za pomocą RID. Obszary pików dla glukozy wyprowadzono przez ręczną integrację z danych RID dla próbek przebiegu w czasie i krzywej standardowej. Wyekstrahowane obszary pików dla bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu pobrano z automatycznie zintegrowanych sygnałów. Wszystkie krzywe wzorcowe (powierzchnia piku w funkcji znanego stężenia) miały wartości R2 >0,99 i były liniowe w całym zakresie zastosowanych tutaj stężeń.

Stężenia molowe dla wszystkich docelowych analitów zostały obliczone na podstawie odpowiednich krzywych standardowych. Glukoza została zużyta w ciągu pierwszych 3 godzin reakcji i głównie sfermentowana do mleczanu (Rysunek 2A, B). Akumulacja etanolu nastąpiła również znacząco w ciągu pierwszych 3 godzin reakcji, a następnie ustała (Rysunek 2C). Obserwacja znacznej produkcji mleczanu i etanolu przy znacznym zużyciu glukozy po 3 godzinach nie była bezprecedensowa, ponieważ szlaki produkcji mleczanu i etanolu umożliwiają regenerację 1 mola netto NAD+ z glikolitycznego NADH wymaganego do dalszego zużycia glukozy poprzez glikolizę (Rysunek 1). Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w bezkomórkowym metabolizmie glukozy opartym na lizacie. Octan był początkowo obecny w reakcjach jako składnik buforu S30 i nieoczekiwanie kumulował się w wyniku metabolizmu dopiero po 6 godzinach, gdy zużycie glukozy uległo spowolnieniu (Rysunek 2D). Wynik ten sugeruje, że fermentacja octanowa niekoniecznie umożliwia szybki przepływ glikolityczny we wcześniejszych punktach czasowych. Tymczasem mrówczan i bursztynian zostały zsyntetyzowane jako drobne produkty fermentacji (Rysunek 2E,F). Podsumowując, metoda ta umożliwiła bezwzględne ilościowe określenie zubożenia substratów cukrowych i tworzenia produktów fermentacji w lizatach E. coli S30.

Wykrywanie MS do profilowania metabolizmu glukozy w lizatorze zostało tutaj zastosowane. Lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych na pożywkach 2xYPTG podawano 13C6-glukozą jako źródłem węgla. Reakcje CFME prowadzono w trzech egzemplarzach przez 0 h, 1 h, 2 h i 3 h. Próbki z każdego punktu czasowego załadowano do układu LC wyposażonego w kolumnę z odwróconą fazą i sprzężono ze spektrometrami masowymi z transformacją Fouriera i pułapką jonową. Widma modów jonów ujemnych uzyskano i przetworzono w celu analizy kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. Obliczone masy teoretyczne 13znakowanych znakiem C gatunków należących do centralnego metabolizmu węgla przeszukano w celu zidentyfikowania specyficznie związków pochodnych glukozy. Opierając się na wykorzystanych warunkach uprawy szczepu źródłowego i wcześniejszych doniesieniach o aktywnych szlakach w E. coli CFME, zakłada się, że proteom lizatu obejmuje sieć metaboliczną, która dostarcza glukozę do fermentacji glikolitycznej, szlaku pentozofosforanowego i prawdopodobnie anabolizmu aminokwasowego5,6,7,8,14 ( Rysunek 1). W związku z tym poszukiwania zostały zawężone do członków tych szlaków, z których 16 metabolitów zawierających znaczniki 13C pochodzących z glukozy zostało jednoznacznie oznaczonych (Tabela uzupełniająca 1).

13C6-glukoza była obserwowanie spożywana przez glikolizę, o czym świadczą wahania w pośrednich ilościach glikolitycznych (Rysunek 3A-E). Zgodnie z danymi HPLC-RID, glukoza zgromadziła się do 13C 3-mleczanu, a także została sfermentowana do 13C3-bursztynianu w ciągu pierwszych 3 godzin reakcji (Rysunek 4A, B). Powstanie izotopologu 13C 3-bursztynianu wspiera proponowany model metabolizmu glukozy w lizacie (Rysunek 1), w którym bursztynian prawdopodobnie jest wytwarzany przez karboksylację cząsteczki 3-węglowego fosfoenolopirogronianu (PEP), a nie przez wejście cząsteczki 2-węglowej acetylo-CoA do cyklu TCA. W poprzednich badaniach CFME zakładano, że aktywacja cyklu TCA jest aktywna, ale nie wykryto tutaj innych 13produktów pośrednich TCA znakowanych C8,19,21. 13Synteza C-3-asparaginianu nastąpiła jednak w ciągu pierwszej godziny i została zużyta, wzmacniając ideę, że PEP jest bezpośrednio przekształcany w szczawiooctan (Rysunek 1, Figura 6C). Dane odzwierciedlają proteom lizatu ze szczepów źródłowych zebranych podczas wzrostu fermentacyjnego na pożywkach bogatych w glukozę (2xYPTG). Oznaczałoby to ponadto, że pozostałe enzymy TCA nieuczestniczące w produkcji bursztynianu tworzą oksydacyjną gałąź TCA (Rysunek 1). Żaden z metabolitów w tym szlaku nie został jednak wykryty, prawdopodobnie dlatego, że wysokie stężenia glutaminianu dodane do reakcji CFME jako przeciwjon soli uniemożliwiają postęp tej gałęzi.

Dane HPLC-RID są dodatkowo uzupełnione o brak detekcji 13C2-octanu w ciągu 3 godzin reakcji, co sugeruje brak nagromadzenia octanu z glukozy do 3 godzin (Rysunek 2B). Jednak bezpośredni prekursor octanu, acetylo-fosforan (acetyl-P), nagromadził się, co sugeruje, że ramię Pta szlaku Pta-AckA do syntezy octanu z acetylo-CoA jest aktywne (Rysunek 4C,D). Katalizowana przez AckA defosforylacja 13C 2-acetylo-P do 13C2-octanu prawdopodobnie nie wystąpi w tym czasie, ponieważ octan jest głównym składnikiem buforu S30 stosowanego w reakcjach (Rysunek 1, Figura 2B).

Zaobserwowano również włączenie 13C6-glukozowych atomów węgla do fosforanów cukru 6-fosfoglukonolaktonu (6PGL), 6-fosfoglukonianu (6PG), rybulozy-5-fosforanu (Ru5P) i sedoheptulozy-7-fosforanu (S7P) (Rysunek 5). Wyniki te potwierdzają udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy lizatu i prawdopodobnie odżywiają syntezę 13C 9-tyrozyny, co zostało wcześniej zasugerowane przez badanie proteomiczne, jednocześnie dostarczając prekursora do produkcji 13C5-histydyny (Rysunek 6A,B)7 . Nie zaobserwowano tu znakowanej fenyloalaniny i tryptofanu, podobnie jak większości niezbędnych aminokwasów. Nie jest to jednak do końca zaskakujące, ponieważ anabolizm aminokwasów prawdopodobnie zostanie wzbogacony w lizaty pochodzące z komórek hodowanych w warunkach niedoboru składników odżywczych lub w fazie stacjonarnej7,22. Co więcej, dotychczasowe dane sugerują, że produkty pośrednie glikolizy i fermentacji są kierowane do reakcji końcowych regenerujących kofaktory, co musi wykluczać syntezę wielu aminokwasów pochodzących z gliceraldehydo-3-fosforanu, pirogronianu i acetylo-CoA (tj. glicyny, cysteiny, seryny, alaniny, waliny, leucyny i lizyny) (Rysunek 1). Jak wspomniano, 13C 3-asparaginian został wyprodukowany w ciągu pierwszej godziny, podczas gdy asparaginian pochodzący z 13aminokwasów zawierających C (tj. treoniny, izoleucyny, metioniny i asparaginy) nie został zaobserwowany, prawdopodobnie dlatego, że asparaginian pochodzący z glukozy uczestniczy w fermentacji (Rysunek 1, Rysunek 6C). Wreszcie, przepływ w kierunku znakowanego glutaminianu i aminokwasów pochodzących z glutaminianu mógł być utrudniony przez wysoki poziom glutaminianu w środowisku reakcji (Rysunek 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Przypuszczalny model metaboliczny lizatów pochodzących z E. coli BL21DE3-Star rosnących wykładniczo w wysokich stężeniach glukozy. Zgłaszano produkty pośrednie i produkty końcowe glikolizy (kolor zielony), szlak pentozofosforanowy (ciemnopomarańczowy) i szlaki fermentacyjne (niebieski) z acetylo-CoA w CFME na bazie lizatów. Obecność fermentacji bursztynianowej implikuje aktywację oksydacyjnej gałęzi TCA (szarej). Anabolizm aminokwasów (złoto) w lizatach nie jest dobrze zdefiniowany i jest tutaj badany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dane HPLC-RID dotyczące zużycia glukozy i syntezy fermentacyjnego produktu końcowego w reakcjach CFME przygotowanych z użyciem surowych ekstraktów E. coli. (A) zużycie glukozy i (B) mleczan, (C) etanol, (D) octan, (E) mrówczan i (F) wytwarzanie bursztynianu w reakcjach CFME monitorowano przez 24 godziny. Przedstawiono średnie stężenia mM i słupki błędu (SE) określone ilościowo za pomocą krzywych standardowych (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Trendy w czasie 13C,6-glukozy i 13C-znakowanych glikolitów w E. coli lysate CFME. Względna obfitość (A) 13C 6-glukozy, (B) 13C6-glukozo-6-fosforan/fruktozo-6-fosforan, (C) 13C 6-fruktozo-1,6-bisfosforan, (D) 13 C 3-gliceraldehydo-3-fosforan/dihydroksyaceton fosforan i (E) 13C6-pirogronian w reakcjach CFME trwających ponad 3 godziny. Surowe obszary pików wyodrębnione przez oprogramowanie mzMINE wykorzystano do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji dodatnich (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Trendy przebiegu w czasie produktów pośrednich i końcowych w fermentacji 13C6-glukozy w lizacie E. coli CFME. Względna obfitość (A) 13C 3-mleczanu, (B) 13C3-bursztynianu, (C) 13C2-acetylo-fosforanu i (D) 13C2-acetylo-CoA w reakcjach CFME w ciągu 3 godzin. Surowe obszary pików wyodrębnione przez oprogramowanie mzMINE wykorzystano do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji dodatnich (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Trendy w czasie pośrednich szlaków pentozofosforanowych pochodzących z 13C6-glukozy w E. coli lysate CFME. Względna obfitość (A) 13C 6-6-fosfoglukonolaktonu, (B) 13C6-6-fosfoglukonianu, (C) 13C5-rybulozo-5-fosforanu i (D) 13C7-sedoheptulozo-7-fosforanu w ciągu 3 godzin. Surowe obszary pików wyodrębnione przez oprogramowanie mzMINE wykorzystano do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji dodatnich (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Trendy w czasie wykrytych aminokwasówpochodzących z13 C 6-glukozy w lizacie E. coli CFME. Względna obfitość (A) 13C 9-tyrozyny, (B) 13C5-histydyny i (C) 13C3-asparaginianu w ciągu 3 godzin. Surowe obszary pików wyodrębnione przez oprogramowanie mzMINE wykorzystano do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla adnotacji dodatnich (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywny chromatogram HPLC-RID pokazujący piki dla głównych produktów fermentacji w reakcji CFME inkubowanej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu są wystarczająco rozróżnialne na podstawie ich czasów retencji na kolumnie HPLC podczas izokratycznego elucji rozpuszczalnikiem kwasu siarkowego 5 mM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywne widma masowe dla metabolitów znakowanych 13C, w szczególności (A) mleczanu, (B) glukozy i (C) 6-fosfoglukonianu (6PG) w reakcji CFME inkubowanej w temperaturze 37 °C przez 1 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Lista wykrytych 13metabolitów znakowanych C, czasy retencji (wyrównane między próbkami za pomocą MZmine), teoretyczne w pełni 13wartości m/z w trybie ujemnym znakowanego C, wartości m/z wykrytych cech i obliczone błędy masy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przedstawione podejście HPLC-RID może być wykorzystane do pomyślnego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych i późniejszej konwersji do głównych kwasów organicznych i produktów alkoholowych centralnego metabolizmu lizatu w czasie. Co więcej, protokół ten wykorzystuje prostą metodę izokratyczną wykorzystującą pojedynczą fazę ruchomą, wymaga minimalnego przygotowania próbki i umożliwia prostą, ukierunkowaną analizę na dalszym etapie. Anality mierzone metodą HPLC-RID wyróżniają się wyłącznie czasem retencji, a co za tym idzie oddziaływaniami z wybraną żywicą kolumnową. Zastosowana tutaj kolumna HPLC została specjalnie zaprojektowana do oddzielania węglowodanów, kwasów organicznych i alkoholi poprzez połączenie wykluczenia wielkości i wymiany ligandów (tj. chromatografii partycji moderowanej jonami). Opisana metoda jest zatem przydatna do bardziej ukierunkowanej analizy substratów węglowodanowych i wybranych produktów końcowych szlaków fermentacji glukozy, które mają przede wszystkim ułatwić i zenergetyzować biotransformacje oparte na lizacie 8,15,21. Jednak protokół ten nie uwzględnia aktywacji innych szlaków metabolicznych w ekstraktach komórkowych. Rurociągi wykorzystujące inne techniki rozdzielania chromatograficznego (tj. chromatografię oddziaływań hydrofilowych), metody elucji gradientowej, bardziej skomplikowane przygotowanie próbki (tj. derywatyzacja) i różne detektory optyczne (np. detektory rozpraszania światła ultrafioletowego lub światła wyparnego) mogą być stosowane do wykrywania innych metabolitów, takich jak aminokwasy i fosforany cukru23,24. Alternatywnie, globalne podejście do badania metabolizmu lizatu można przyjąć przy użyciu LC-MS/MS.

Opisana metoda LC-MS/MS to pojedynczy proces pomiaru i identyfikacji szerszego zakresu metabolitów. LC-MS/MS jest najnowocześniejszym narzędziem analitycznym do profilowania metabolomu ze względu na swoją czułość i zdolność do rozróżniania metabolitów na podstawie czasu retencji i współczynników m/z z wysoką rozdzielczością16. Koncentrując się na centralnych szlakach metabolicznych węgla i anabolizmie aminokwasów, wdrożono tryb ujemny MS/MS w celu specyficznego wykrywania polarnych kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. W połączeniu z techniką chromatografii nanocieczowej, metoda ta zapewnia wysoką czułość wykrywania małych cząsteczek w złożonym tle lizatu17. Jeśli jednak chodzi o profilowanie metabolizmu CFME opartego na lizatach, ograniczeniem opisanego protokołu LC-MS/MS jest jego dolna granica wykrywalności wynosząca 50 m/z, co wyklucza pomiar etanolu, głównego produktu metabolizmu glukozy w lizacie, a także mrówczanu, które w przeciwnym razie można łatwo określić ilościowo za pomocą szczegółowej metody HPLC-RID. W porównaniu z LC-MS/MS, HPLC-RID ma dodatkową zaletę w postaci względnej dostępności pod względem kosztów i trudności. Do tego ostatniego punktu, rozwiązywanie problemów z opisaną tutaj metodą LC-MS/MS może wymagać pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej w zakresie spektrometrii mas. Niemniej jednak, wykrywanie stwardnienia rozsianego ma wyjątkowo atrakcyjne zastosowania w porównaniu z RID, ponieważ może dodatkowo rozróżniać znakowane izotopy w metabolomach, co jest doskonałą techniką zrozumienia ruchu węgla z uzupełnionych substratów przez złożoną sieć metaboliczną lizatu18. Takie podejście zastosowano w tym przypadku poprzez uzupełnienie reakcji 13C6-glukozą i analizę względnych wartości obfitości dalszych metabolitów zawierających 13C. Analiza pozwoliła na zdefiniowanie aktywnych i nieaktywnych szlaków, wspierając wcześniej zgłoszone założenia i dostarczając nowych informacji na temat przepływu metabolicznego w lizatach. W ramach metody można również wprowadzać modyfikacje dla konkretnych analiz. Na przykład roztwory wzorcowe 13związków docelowych znakowanych znakiem C można analizować wraz z próbkami, aby uzyskać bezwzględne pomiary ilościowe cząsteczek pochodzących z glukozy w czasie i wyciągnąć wnioski na temat rozkładu strumienia. Lepsze wykrywanie dodatnio naładowanych związków można również włączyć w ramach bieżącego przepływu pracy, uruchamiając sekwencje z plikami .meth dostosowanymi do wykrywania w trybie dodatnim.

Pobieranie próbek analitycznych w obu opisanych metodach jest wygodnie zautomatyzowane, co zapewnia wysoką odtwarzalność. Co więcej, można oczekiwać płynnych przebiegów analitycznych, o ile przestrzegane są właściwe praktyki obsługi i konserwacji instrumentów. Korzystając z tych narzędzi do analizy reakcji CFME, należy wziąć pod uwagę bardziej krytyczne kwestie przed i po pobraniu próbki. Podczas przygotowywania próbki ważne jest, aby kontrole przebiegu w czasie były reprezentatywne dla czasu zerowego. W tym przypadku białka zostały wytrącone w lizatach przez zakwaszenie w celu zatrzymania reakcji metabolicznych. W przypadku próbek o czasie zerowym rozpuszczalnik kwasowy połączono z lizatem przed dodaniem mieszaniny reakcyjnej zawierającej glukozę. Zakwaszenie kwasem trójchlorooctowym skutecznie zapewniło, że glukoza nie jest metabolizowana w czasie zero, jak pokazano w danych HPLC-RID (ryc. 2). Podczas gdy podobną procedurę wygaszania metabolizmu glukozy przeprowadzono w zgłoszonej analizie LC-MS/MS, wykryto 13metabolitów znakowanych C w próbkach z czasem zerowy, aczkolwiek przy znacznie niskich wartościach liczebności w stosunku do próbek wyekstrahowanych w późniejszych punktach czasowych. Co więcej, obserwacje te ograniczały się do produktów pośrednich glikolizy. Dane sugerują, że reakcje zachowują pewien stopień aktywności glikolitycznej po zakwaszeniu rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, który jest wykrywany za pomocą tej bardzo czułej metody. Zakres tej działalności powinien jednak zostać określony ilościowo. Poprzednie badanie wykazało, że kwaśne rozpuszczalniki ekstrakcyjne mogą nie wygaszać w wystarczającym stopniu pośrednich reakcji glikolitowych, ale mogą zatrzymać znaczne zużycie glukozy10. Chociaż pozostaje to do dalszego zbadania w zastosowanym tutaj systemie, drastyczne zmiany w względnych wartościach obfitości między próbkami o czasie zerowym a późniejszymi punktami czasowymi mogą być interpretowane jako trendy w metabolizmie glukozy. W podobnych zastosowaniach zaleca się jednak zbadanie alternatywnych metod hartowania, w szczególności w celu uzyskania bezwzględnych ilości pośrednich produktów metabolicznych10. Ponadto należy również przestrzegać dobrych praktyk podczas dalszych analiz oprogramowania. Spójność jest niezbędna podczas ręcznej integracji obszarów szczytowych z sygnałów RID w celu zmniejszenia błędu ludzkiego. Ręczna integracja powinna być również stosowana do obszarów pików wzorców w każdym przypadku, gdy ręcznie zintegrowane obszary pików są wykorzystywane do ilościowego określania stężeń metabolitów w próbkach. W trakcie ukierunkowanej analizy LC-MS/MS wstępne adnotacje z analizy MZmine powinny być walidowane poprzez ręczne sprawdzanie pików za pomocą przeglądarki jakości MS, a cechy m/z powinny być opisywane tylko wtedy, gdy obliczone błędy masy są dopuszczalne. W tym przypadku analizy te zostały przeprowadzone ręcznie dla ograniczonego zestawu celów, ponieważ kompleksowe i solidne oprogramowanie do wyszukiwania izotopów nie jest jeszcze stworzone. Jednak obecnie pojawiają się takie zautomatyzowane metody wyszukiwania metabolitów znakowanych izotopem węgla 13C, które usprawniłyby również bardziej skomplikowane analizy, takie jak profilowanie lizatów poza centralnym metabolizmem węgla25.

Zaawansowana chromatografia cieczowa jest solidną i szeroko stosowaną metodą rozdzielania małych cząsteczek w złożonych mieszaninach metabolicznych11. Opisane metody łączą tę technikę separacji z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas, aby skutecznie analizować konwersje metabolitów w reakcjach CFME opartych na lizatach. HPLC-RID i LC-MS/MS są indywidualnie potężnymi narzędziami do profilowania aktywnego metabolizmu lizatów, a ich komplementarność może być dodatkowo wykorzystana do rozwiązania nieodłącznych ograniczeń każdej techniki. Przedstawione metody umożliwiają zastosowanie i rozwój CFME, ponieważ można je wykorzystać do zrozumienia metabolizmu lizatu, monitorowania ulepszeń w docelowych konwersjach metabolitów oraz wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani inne konflikty interesów.

Podziękowania

To badanie było sponsorowane przez Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, jako część Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725. Niniejszy manuskrypt został napisany przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów Rządu Stanów Zjednoczonych. Departament Energii zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m Filtry probówkowe wirówkowe (kolumny wirowe)Corning Costar8160
1,5 ml probówki mikrowirówkoweVWR87003-294
1260 Infinity Binary LCSystem AgilentG1312BHPLC-RID
1260 Wysokowydajny odgazowywacz InfinitySystem AgilentG4225ASystem HPLC-RID
1260 Detektor nieskończoności indeksu refrakcjiAgilentG7162ASystem HPLC-RID
1260 Infinity Standardowy automatyczny podajnik próbekAgilentG1329BSystem HPLC-RID
13C6-glukozaSkładnik mieszaniny reakcyjnej Sigma-Aldrich 389374 CPM (LC-MS/MS)
500 ml 0,20 μ m filtr porowy (membrana PES)VWR10040-436
Acetonitryl (klasa LC/MS)Fisher ScientificA955Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
AdenozynotrifosforanSigma-AldrichA7699Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Kolumna Aminex HPX 87-HBio-rad1250140Kolumna chromatograficzna do HPLC-RID
Octan amonu (klasa LC/MS)Fisher ScientificA11450Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
Glutaminian amonuSigma-AldrichG1376CFME Składnik mieszanki reakcyjnej
Nasadki na fiolki automatycznego podajnika próbek (żółte, zatrzask)Thermo ScientificC4011-50YPrzechowywanie/dostarczanie próbek do
fiolek z automatycznym samplerem LC-MS/MS (0,30 ml, polipropylen)WheatonW225181Przechowywanie/dostarczanie próbek do LC-MS/MS
Mikrowirówka laboratoryjnaFisher Scientific13-100-675
Bis-TrisSigma-AldrichB9754Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Koenzym A (CoA)Sigma-AldrichC4282Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
D-dekstroza (glukoza)VWRBDH9230Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Fosforan dipotasuSigma-AldrichP8281Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
EtanolFisher ScientificBP2818100Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu krzywej wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas mrówkowy (klasa LC/MS)Thermo Scientific85178Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS
Topiona krzemionka (średnica wewnętrzna 100 μ m, średnica zewnętrzna 375 μ m)Polymicro TechnologiesWM22005-NDKolumna chromatograficzna do LC-MS / MS
Lodowaty kwas octowySigma-AldrichA6283S30 składnik buforowy
Izopropanol (klasa LC / MS)Fisher ScientificA461Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS
Kinetex 5 i mu; m C18 faza stacjonarna (100 Å)PhenomenexN/A; na specjalne zamówienieKolumna chromatograficzna do spektrometru mas LC-MS/MS
LTQ Orbitrap Velos ProThermoFisher ScientificN/A; na specjalne zamówienieSpektrometr masowy do LC-MS/MS
Octan magnezu Składnik buforowySigma-AldrichM5661S30
Glutaminian magnezuSigma-Aldrich49605CFME
Metanol (klasa LC / MS)Fisher ScientificA456Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS
NAD+Sigma-AldrichN0632Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME
Źródło jonizacji Nanospray Źródło ThermoFisherScientific/ProxeonES071 (najnowszy model)Spektrometr masowy do LC-MS/MS
OpenLab CDS (online) OprogramowanieAgilentWersja 2.15.26System danych chromatograficznych do pozyskiwania i analizy danych HPLC
Oprogramowanie Orbitrap Velos Pro LTQ Tune PlusThermoVersion 2.7Oprogramowanie do strojenia systemu LC-MS/MS
Octan potasuSigma-AldrichP1190S30
Glutaminian potasuSigma-AldrichG1501CFME Składnik mieszaniny reakcyjnej
Wirówka z chłodzeniemEppendorf5415 C
Zakrętki (z przegrodą, 9 mm)Supelco29315-UPrzechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID
Fiolki ze szkła gwintowanego (2 ml)Supelco29376-UPrzechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID
Octan soduSigma-Aldrich241245Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
MrówczansoduSigma-Aldrich247596Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Mleczan soduSigma-Aldrich71716Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas bursztynowySigma-Aldrich398055Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID)
Kwas siarkowySigma-Aldrich258105Preparat rozpuszczalnikowy do HPLC-RID
Kwas trichlorooctowySigma-AldrichT6399
Tris-octanGoldBioT-090-100S30 składnik buforowy
Ultimate 3000 LC z autosampleremIonex: SRD-3600System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS
Ultimate 3000 LC z automatycznym podajnikiem próbekDionexRapid Separation Pompa binarna: HPG-3400RSSystem chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS
Ultimate 3000 LC z autosampleremAutomatyczny podajnik próbek płytek Dionex do szybkiej separacji: WPS-3000TRSSystem chromatografii cieczowej do analizy LC-MS / MS
(klasa LC / MS)Fisher ScientificW6500Przygotowanie rozpuszczalnika do LC-MS/MS
Xcalibur SoftwareThermo Wersja 3.0.63Oprogramowanie do akwizycji i interpretacji danych dla LC-MS/MS
Składnik buforowy Stojak na rozpuszczalnik

Bibliografia

  1. Rollin, J. A., et al. High-yield hydrogen production from biomass by in vitro metabolic engineering: Mixed sugars coutilization and kinetic modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4964-4969 (2015).
  2. Bowie, J. U., et al. Synthetic biochemistry: The bio-inspired cell-free approach to commodity chemical production. Trends in Biotechnology. 38 (7), 766-778 (2020).
  3. Korman, T. P., Opgenorth, P. H., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose. Nature Communications. 8, 1-8 (2017).
  4. Dudley, Q. M., Nash, C. J., Jewett, M. C. Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia coli lysates. Synthetic Biology. 4 (1), 003(2019).
  5. Garcia, D. C., et al. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3, (2018).
  6. Kay, J. E., Jewett, M. C. Lysate of engineered Escherichia coli supports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol. Metabolic Engineering. 32, 133-142 (2015).
  7. Mohr, B., Giannone, R. J., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Targeted growth medium dropouts promote aromatic compound synthesis in crude E. coli cell-free systems. ACS Synthetic Biology. 9, 2986-2997 (2020).
  8. Garcia, D. C., et al. A lysate proteome engineering strategy for enhancing cell-free metabolite production. Metabolic Engineering Communications. 12, 00162(2021).
  9. Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods in Enzymology. 608, 31-57 (2018).
  10. Cui, J., et al. Developing a cell-free extract reaction (CFER) system in Clostridium thermocellum to identify metabolic limitations to ethanol production. Frontiers in Energy Research. 8, 72(2020).
  11. Coskun, O. Separation Tecniques: Chromatography. 3, Kare Publishing. Istanbul. (2016).
  12. Bernardes, A. N., et al. Organic acids and alcohols quantification by HPLC/RID in sugarcane vinasse: analytical method validation and matrix effect assessment. International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 101, 325-336 (2021).
  13. Garcia, D. C., et al. Computationally guided discovery and experimental validation of indole-3-acetic acid synthesis pathways. ACS Chemical Biology. 14, 2867-2875 (2019).
  14. Karim, A. S., Rasor, B. J., Jewett, M. C. Enhancing control of cell-free metabolism through pH modulation. Synthetic Biology. 5, (2020).
  15. Bujara, M., Schümperli, M., Billerbeck, S., Heinemann, M., Panke, S. Exploiting cell-free systems: Implementation and debugging of a system of biotransformations. Biotechnology and Bioengineering. 106, 376-389 (2010).
  16. Xiao, J. F., Zhou, B., Ressom, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-MS/MS-based metabolomics. TrAC - Trends in Analytical Chemistry. 32, 1-14 (2012).
  17. Asensio-Ramos, M., Fanali, C., D'Orazio, G., Fanali, S. Nano-liquid chromatography. Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation: Second Edition. 1, 637-695 (2017).
  18. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  19. O'Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C., Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Science Advances. 5, (2019).
  20. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  21. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-free mixing of Escherichia coli crude extracts to prototype and rationally engineer high-titer mevalonate synthesis. ACS Synth Biol. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  22. Jaishankar, J., Srivastava, P. Molecular basis of stationary phase survival and applications. Frontiers in Microbiology. 8, 2000(2017).
  23. Bartolomeo, M. P., Maisano, F. Validation of a reversed-phase HPLC method for quantitative amino acid analysis. Journal of Biomolecular Techniques. 17, 131-137 (2006).
  24. Hauck, T., Landmann, C., Brühlmann, F., Schwab, W. Formation of 5-methyl-4-hydroxy-3[2H]-furanone in cytosolic extracts obtained from Zygosaccharomyces rouxii. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51, 1410-1414 (2003).
  25. Huang, H., Yuan, M., Seitzer, P., Ludwigsen, S., Asara, J. M. IsoSearch: An untargeted and unbiased metabolite and lipid isotopomer tracing strategy from HR-LC-MS/MS datasets. Methods and Protocols. 3 (3), 54(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezkom rkowa in ynieria metabolicznasystemy oparte na lizatachdetekcja za pomoc wsp czynnika za amania wiat aanaliza HPLCmetabolizm glukozymetabolity centralneprodukty fermentacji

Powiązane artykuły