Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.
Artykuł metodologiczny
Protokoły opisują metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z indeksem załamania światła lub detekcją spektrometryczną mas do badania reakcji metabolicznych w złożonych systemach bezkomórkowych opartych na lizacie.
Inżynieria metabolizmu komórkowego dla ukierunkowanej biosyntezy może wymagać rozległych cykli projektowania, budowania, testowania i uczenia się (DBTL), ponieważ inżynier pracuje nad wymaganiami dotyczącymi przetrwania komórki. Alternatywnie, przeprowadzanie cykli DBTL w środowiskach bezkomórkowych może przyspieszyć ten proces i złagodzić obawy związane z kompatybilnością hosta. Obiecujące podejście do bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) wykorzystuje metabolicznie aktywne surowe ekstrakty komórkowe jako platformy do bioprodukcji oraz szybkiego odkrywania i prototypowania zmodyfikowanych białek i szlaków. Wykorzystanie tych możliwości i optymalizacja wydajności CFME wymaga metod charakteryzujących metabolom platform bezkomórkowych opartych na lizacie. Oznacza to, że narzędzia analityczne są niezbędne do monitorowania poprawy w zakresie ukierunkowanych konwersji metabolitów oraz do wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu. W tym przypadku zastosowano analizy metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w połączeniu z detekcją optyczną lub spektrometryczną mas w celu scharakteryzowania produkcji i przepływu metabolitów w lizatach E. coli S30. W szczególności raport ten opisuje przygotowanie próbek z lizatów CFME do analiz HPLC z wykorzystaniem wykrywania indeksu refrakcji (RID) w celu ilościowego określenia wytwarzania centralnych produktów pośrednich przemiany materii i produktów ubocznych w procesie konwersji tanich substratów (tj. glukozy) do różnych produktów o wysokiej wartości. Przedstawiono również analizę konwersji metabolitów w reakcjach CFME podawanych glukozą znakowaną 13C za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami sprzężoną z tandemową spektrometrią mas (MS/MS), która jest potężnym narzędziem do charakteryzowania określonych wydajności metabolitów i strumienia metabolicznego lizatu z materiałów wyjściowych. Zastosowanie tych metod analitycznych do metabolizmu lizatu CFME umożliwia rozwój tych systemów jako alternatywnych platform do wykonywania szybszych lub nowatorskich zadań inżynierii metabolicznej.
Ograniczenia w inżynierii mikrobów do produkcji chemicznej można rozwiązać poprzez rekapitulację reakcji biochemicznych in vitro, w których nie występują konkurencyjne funkcje przetrwania komórek1. Co więcej, otwarte środowisko reakcji (tj. brak błony komórkowej) jest bardziej podatne na manipulacje i łatwiejsze do monitorowania w porównaniu z żywymi komórkami. Ta fundamentalna koncepcja bezkomórkowej inżynierii metabolicznej (CFME) została elegancko zademonstrowana przez odtworzenie szlaków metabolicznych w celu syntezy cennych substancji chemicznych, takich jak wodór i monoterpeny, o wskaźnikach produkcji, które są o rzędy wielkości wyższe niż prezentowane do tej pory w fabrykach komórek mikrobiologicznych1,2,3. Metody oczyszczania całych ścieżek są jednak obecnie ograniczone czasem i kosztami. Alternatywnie, bezkomórkowe systemy metaboliczne mogą być uzyskane z surowych ekstraktów komórkowych za pomocą szybkich i niedrogich metod związanych z rekonstytucją całego szlaku4. Centralny metabolizm, który jest zatrzymywany w ekstraktach komórkowych, może być uzupełniony substratami energetycznymi (np. glukozą i kofaktorami enzymatycznymi) oraz solami w roztworach buforowych w celu wytworzenia centralnych prekursorów metabolicznych przez ponad 24 h5,6. Dodanie egzogennych enzymów do reakcji CFME opartej na lizacie pozwala na bardziej złożone biotransformacje glukozy w bardziej wartościowe substancje chemiczne przy wysokich mianach4,6,7. Chociaż wydajność w tych systemach jest zwykle zagrożona ze względu na ich komórkową złożoność metaboliczną, opracowywane są i są opracowywane unikalne metody selekcji proteomów lizatu w celu uzyskania wyższej wydajności7,8.
Łatwość przeprowadzania przemian metabolicznych w systemach bezkomórkowych opartych na lizacie sprawia, że te platformy są doskonałe zarówno do całkowitego przeniesienia produkcji chemicznej poza komórkę, jak i do prototypowania nowych ścieżek o wysokiej przepustowości przed zbudowaniem i przetestowaniem tych projektów in vivo2,9. W obu przypadkach narzędzia do monitorowania przemian metabolicznych lub obserwacji ogólnych zmian w strumieniu metabolicznym w lizatach są integralną częścią rozwoju CFME. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) może być stosowana do rozdzielania składników chemicznych reakcji CFME z wysoką rozdzielczością i może być sprzężona z detektorami optycznymi lub spektrometrycznymi mas w celu ilościowej identyfikacji metabolitów5,10. Podstawową zasadą HPLC jest to, że anality rozpuszczone w rozpuszczalniku (tj. Faza ruchoma) i przepompowane przez kolumnę będą oddziaływać z określonym materiałem wypełniającym kolumnę (tj. Faza stacjonarna)11. W zależności od ich właściwości chemicznych, anality te wykazują różne czasy retencji, zanim ostatecznie zostaną wymyte z fazy stacjonarnej i przeniesione przez fazę ruchomą do detektora. Niniejszy raport zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania i analizy reakcji CFME opartych na lizacie E. coli za pomocą metod opartych na HPLC wykorzystujących wykrywanie RID i MS/MS.
HPLC sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji (HPLC-RID) jest ogólnie dostępną metodą szybkiej identyfikacji centralnych prekursorów metabolicznych i produktów końcowych. Krótko mówiąc, RID mierzy, w jaki sposób anality zmieniają ugięcie światła przez fazę ruchomą12. Sygnały RID odpowiadające docelowym analitom w próbkach można następnie określić ilościowo poprzez porównanie z sygnałami RID roztworów wzorcowych. W zastosowaniach CFME ten tryb wykrywania był najczęściej stosowany z kolumnami HPLC, które rozdzielają związki w oparciu o kombinację mechanizmów wykluczania wielkości i wymiany ligandów lub chromatografii partycji moderowanej jonami5,6,8,13. Ta konkretna technika jest używana do szybkiego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych, takich jak glukoza, a także tworzenia produktów fermentacji, takich jak bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol w reakcjach CFME na bazie lizatu8. Rejestrowanie zmian stężeń tych związków za pomocą HPLC było przydatne zarówno do wyjaśnienia potencjału surowych ekstraktów komórkowych w celu łączenia centralnych prekursorów metabolicznych, jak i zrozumienia, w jaki sposób strumień szlaku jest przekierowywany przez szlaki fermentacyjne podczas złożonych przemian metabolicznych z glukozy w lizatach6,8,14. Przełomowe badania CFME nad ekstraktami z komórek E. coli potwierdzają, że związki fermentacyjne kumulują się jako produkty końcowe katabolizmu glukozy, a także występują jako niepożądane produkty uboczne w lizatach, które nadmiernie eksprymują enzymy egzogenne6,15. Sugeruje się, że metabolizm fermentacyjny odgrywa niezbędną rolę w regeneracji ekwiwalentów redoks kofaktorów (tj. NAD(P)H i ATP) w celu podtrzymania reakcji glikolitycznych8. W związku z tym metoda detekcji optycznej oparta na HPLC, przeznaczona do oddzielania produktów fermentacji, jest użytecznym i powszechnie stosowanym narzędziem podczas wykonywania różnych zadań CFME opartych na lizacie.
CFME może być zaimplementowane do gromadzenia końcowych produktów przemiany materii, które nie są węglowodanami, kwasami organicznymi ani alkoholami4. Pożądany może być również pomiar produktów pośrednich, które są spożywane tak szybko, jak są syntetyzowane10. Chociaż metoda HPLC-RID jest dostępna pod względem kosztów i trudności, metoda ta jest ograniczona ze względu na jej zdolność do rozróżniania metabolitów wyłącznie na podstawie czasu retencji. Szerszy zakres metabolitów może być analizowany, gdy chromatografia cieczowa jest sprzężona z detekcją MS/MS (LC-MS/MS)16. Dzięki tej metodzie anality w fazie ruchomej są jonizowane i wykrywane w różny sposób w oparciu o właściwości masy i ładunku każdej cząsteczki. Wiedza zarówno na temat stosunku masy metabolitu do ładunku (m/z), jak i czasu retencji na kolumnie, ułatwia zatem oddzielenie większości produktów przemiany materii i produktów końcowych o wysokiej rozdzielczości16. Ta technika wykrywania może być również sprzężona z chromatografią nanocieczową, która zapewnia znacznie niższe prędkości przepływu i objętości wtryskiwanej próbki, umożliwiając bardziej czułe wykrywanie małych cząsteczek w złożonym tle17. LC-MS/MS może być dodatkowo stosowany z etykietowaniem izotopowym, ponieważ wbudowane etykiety wprowadzają zmiany w wartościach m/z analitów18. Pomiary punktów czasowych wyekstrahowane z reakcji CFME uzupełnionej substratem 13C6-glukozy mogą zatem określić produkty końcowe lub uboczne pochodzące specjalnie z uzupełnionej glukozy. Chociaż ta metoda śledzenia izotopów nie jest jeszcze powszechnie stosowana w badaniach CFME, jest potężnym narzędziem do zrozumienia przemian metabolicznych w systemach CFME opartych na lizatach, szczególnie dlatego, że przeciwjony soli (tj. octan i glutaminian) w tych reakcjach są również katabolizowane jako substraty wtórne19. Wykorzystanie tej techniki może zatem nakreślić kompleksowy obraz metabolizmu glukozy w lizatach, który do dziś nie jest w pełni zrozumiały. W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje metodę chromatografii nanocieczowej sprzężonej z jonizacją nanoelektronoprysku (nano ESI) MS/MS, która może być wykorzystana do zbadania możliwego modelu metabolizmu glukozy, w szczególności w lizatach E. coli (Rysunek 1). Model opiera się na doniesieniach o szlakach fermentacyjnych i szlaku pentozofosforanowym aktywnym w lizatach E. coli pochodzących ze szczepów hodowanych w bogatych mediach5,6,8,14. Technika ta jest dodatkowo wykorzystywana do badania produkcji aminokwasów, ponieważ obecna wiedza na temat anabolizmu aminokwasów z glukozy w lizatach ogranicza się do kilku przykładów, takich jak synteza aminokwasów aromatycznych7. Biorąc pod uwagę głównie polarny charakter produktów końcowych i produktów pośrednich w tych szlakach (tj. kwasów organicznych, fosforanów cukrowych i aminokwasów), zastosowano tutaj chromatografię cieczową z odwróconymi fazami. Technika ta oddziela związki polarne przez elucję od niepolarnej fazy stacjonarnej. Związki te zostały następnie zjonizowane przez nano ESI w trybie jonów ujemnych, co pozwala na wykrycie analitów z co najmniej jednym ujemnym ładunkiem elementarnym, a tym samym jest przydatne do wykrywania związków kwaśnych. Technika ta jest tutaj stosowana do analizy metabolitów zawierających 13C pochodzących z glukozy i demonstruje użyteczność LC-MS / MS do zrozumienia metabolizmu glukozy w lizatach.
1. Rozpoczynanie, zatrzymywanie i przetwarzanie reakcji CFME w układzie czasowym do ilościowego oznaczania metodą HPLC-RID.
2. Przygotowanie układu HPLC do detekcji metabolitów.
3. Tworzenie metody izokratycznego rozdziału HPLC produktów fermentacji organicznej w systemie CDS.
4. Tworzenie tabeli sekwencji do automatycznego pobierania próbek i uruchomienie systemu HPLC-RID w celu akwizycji danych.
5. Ekstrakcja i analiza danych po zakończeniu przebiegu.
6. Rozpoczynanie, zatrzymywanie i przetwarzanie reakcji CFME z izotopowym śledzeniem przebiegu czasowego do ilościowego oznaczenia metodą LC-MS/MS.
7. Konfiguracja systemu LC do analizy LC-MS/MS.
8. Tworzenie metody w oprogramowaniu do akwizycji i interpretacji danych LC-MS/MS dla systemu LC połączonego ze spektrometrami mas typu Fourier Transform oraz pułapki jonowej.
9. Konfiguracja sekwencji pomiarowej i rozpoczęcie analizy LC-MS/MS.
10. Konsolidacja plików i wyszukiwanie wstępnych adnotacji w programie MZmine 2.53.
11. Obliczanie mas metabolitów pochodnych glukozy znakowanej 13C w trybie ujemnym oraz wyszukiwanie cech m/z tych analitów w przefiltrowanych danych.

Aby określić ilościowo bezkomórkową syntezę powszechnych produktów fermentacji z glukozy w układzie opartym na lizatach, lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych w pośrodku 2xYPTG zasilano 100 µM glukozy jako podstawowego źródła węgla8. Reakcje zatrzymywano w ciągu 24 h poprzez zakwaszenie białek. Przefiltrowane nadsączniki zawierające pirogronian, bursztynian, mleczan, mrówczan, octan i etanol powstałe w wyniku katabolizmu glukozy wprowadzano do modułu aut sampler systemu HPLC wyposażonego w moduł RID. Jako wzorce do urządzenia wprowadzano fiolki z przefiltrowanymi mieszaninami produktów końcowych fermentacji i glukozy w stężeniach 1,17 µM, 2,34 µM, 4,69 µM, 9,38 µM, 18,75 µM, 37,50 µM, 75 µM i 150 µM w buforze S30. Anality eluoowano izokratycznie z kolumny HPLC do detektora RID. Za pomocą RID udało się rozdzielić piki dla glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu w zakresie od 1 do 150 µM. Powierzchnie pików dla glukozy wyznaczono poprzez ręczną integrację danych z RID dla próbek z przebiegu czasowego oraz próbek krzywej wzorcowej. Wyekstrahowane powierzchnie pików dla bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu pobrano z automatycznie zintegrowanych sygnałów. Wszystkie krzywe wzorcowe (powierzchnia piku względem znanego stężenia) miały wartości R2 >0,99 i były liniowe w całym zakresie zastosowanych tutaj stężeń.
Stężenia molowe wszystkich analizowanych substancji obliczono na podstawie ich odpowiednich krzywych wzorcowych. Glukoza została zużyta w ciągu pierwszych 3 h reakcji i uległa głównie fermentacji do mleczanu (Rycina 2A,B). Akumulacja etanolu również wystąpiła w znacznym stopniu w ciągu pierwszych 3 h reakcji, a następnie ustała (Rycina 2C). Obserwacja znacznej produkcji mleczanu i etanolu przy jednoczesnym znacznym zużyciu glukozy po 3 h nie była bezprecedensowa, ponieważ szlaki produkcji mleczanu i etanolu umożliwiają regenerację 1 mola netto NAD+ z glikolitycznego NADH, który jest niezbędny do dalszego zużycia glukozy w procesie glikolizy (Rycina 1). Mleczan i etanol można zatem uznać za główne produkty końcowe fermentacji w bezkomórkowym metabolizmie glukozy opartym na lizatach. Octan był początkowo obecny w reakcjach jako składnik buforu S30 i niespodziewanie zaczął kumulować się w wyniku metabolizmu dopiero po 6 h, gdy zużycie glukozy spowolniło (Rycina 2D). Wynik ten sugeruje, że fermentacja octanowa niekoniecznie umożliwia szybki strumień glikolityczny we wcześniejszych punktach czasowych. W międzyczasie mrówczan i bursztynian były syntetyzowane jako drugorzędne produkty fermentacji (Rycina 2E,F). Podsumowując, opracowana metoda umożliwiła bezwzględne oznaczanie ilościowe ubytku substratu cukrowego oraz powstawania produktów fermentacyjnych w lizatach S30 E. coli .
Zastosowano tutaj detekcję MS w celu profilowania metabolizmu glukozy konkretnie w lizatach. Lizaty pochodzące ze szczepów hodowanych w podłożu 2xYPTG zostały poddane podkarmianiu 13C6-glukozy jako źródła węgla. Reakcje CFME przeprowadzano w trzech powtórzeniach dla czasu 0 h, 1 h, 2 h i 3 h. Próbki z każdego punktu czasowego wprowadzano do układu LC wyposażonego w kolumnę w fazie odwróconej, sprzężonego ze spektrometrami mas z transformacją Fouriera oraz pułapką jonową. Uzyskano widma w trybie jonów ujemnych, które następnie poddano obróbce w celu analizy kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. Obliczone masy teoretyczne 13Poszukiwano gatunków znakowanych węglem C w celu zidentyfikowania związków pochodzących konkretnie z glukozy. W oparciu o zastosowane warunki hodowli szczepu źródłowego oraz wcześniejsze doniesienia dotyczące aktywnych szlaków w E. coli W przypadku CFME przyjmuje się tutaj, że proteom lizatu obejmuje sieć metaboliczną, w której glukoza jest kierowana do fermentacji glikolitycznej, szlaku pentozofosforanowego oraz prawdopodobnie do anabolizmu aminokwasów5,6,7,8,14 (Rycina 1). W związku z tym zakres poszukiwań ograniczono do elementów tych szlaków, spośród których 16 metabolitów zawierających pochodne glukozy 13Etykiety C zostały jednoznacznie przypisane (Tabela uzupełniająca 1).
13C6odnotowano wyraźne zużycie glukozy w procesie glikolizy, o czym świadczyły wahania zawartości produktów pośrednich glikolizy (Rysunek 3A-E). Zgodnie z danymi z HPLC-RID, glukoza akumulowała się do 13C3-mleczan i był również fermentowany do 13C3-bursztynian w ciągu pierwszych 3 h reakcji (Rycina 4A,B). Powstawanie 13C3izotopolog bursztynianu wspiera zaproponowany model metabolizmu glukozy w lizacie (Rycina 1), gdzie bursztynian jest prawdopodobnie generowany w wyniku karboksylacji 3-węglowej cząsteczki fosfoenolopirogronianu (PEP), a nie z entry 2-węglowej cząsteczki acetylo-CoA do cyklu TCA. W poprzednich badaniach nad CFME zakładano aktywację cyklu TCA, ale inne 13Nie wykryto tutaj produktów pośrednich cyklu TCA znakowanych węglem C.8,19,21. 13C3-synteza aspartanu nastąpiła jednak w ciągu pierwszej godziny i została zużyta, co potwierdza tezę, że PEP jest bezpośrednio przekształcane w szczawiooctan (Rycina 1, Rycina 6C). Dane odzwierciedlają proteom lizatu szczepów źródłowych pozyskanych podczas wzrostu fermentacyjnego na mediach bogatych w glukozę (2xYPTG). Sugerowałoby to ponadto, że pozostałe enzymy cyklu TCA nieuczestniczące w produkcji bursztynianu tworzą oksydacyjną gałąź cyklu TCA (Rycina 1). Żaden z metabolitów w tej ścieżce nie został jednak wykryty, co może wynikać z faktu, że wysokie stężenia glutaminianu dodawanego do reakcji CFME jako przeciwjon soli hamują przebieg tej gałęzi.
Dane z HPLC-RID są dodatkowo uzupełnione brakiem detekcji 13C2-octanu w 3-godzinnym czasie reakcji, co sugeruje brak gromadzenia się octanu z glukozy do 3 h (Ryc. 2B). Jednak bezpośredni prekursor octanu, acetylofosforan (acetylo-P), uległ akumulacji, co wskazuje na aktywność ramienia Pta szlaku Pta-AckA odpowiedzialnego za syntezę octanu z acetylo-CoA (Ryc. 4C,D). Dephosphorylacja 13C2-acetylo-P do 13C2-octanu katalizowana przez AckA prawdopodobnie nie zachodzi w tym przedziale czasowym, ponieważ octan jest głównym składnikiem buforu S30 stosowanego w reakcjach (Ryc. 1, Ryc. 2B).
Zaobserwowano również wbudowywanie węgla pochodzącego z 13C6-glukozy do fosforanów cukrów: 6-fosfoglukonolaktonu (6PGL), 6-fosfoglukonianu (6PG), rybulozą-5-fosforanu (Ru5P) oraz sedoheptulozą-7-fosforanem (S7P) (Rycina 5). Wyniki te potwierdzają udział szlaku pentozofosforanowego w metabolizmie glukozy w lizacie i prawdopodobnie zasila on syntezę 13C9-tyrozyny, co sugerowano wcześniej w badaniu proteomicznym, zapewniając jednocześnie prekursor do produkcji 13C5-histydyny (Rycina 6A,B)7. Nie zaobserwowano tutaj znakowanej fenyloalaniny ani tryptofanu, podobnie jak większości aminokwasów egzogennych. Nie jest to jednak całkowicie zaskakujące, ponieważ anabolizm aminokwasów jest prawdopodobnie wzmocniony w lizatach pochodzących z komórek hodowanych w warunkach głodu nutrientowego lub w fazie stacjonarnej7,22. Co więcej, dotychczasowe dane sugerują, że produkty pośrednie glikolizy i fermentacji są kierowane do końcowych reakcji regeneracji kofaktorów, co musi wykluczać syntezę wielu aminokwasów pochodzących z gliceraldehydu-3-fosforanu, pirogronianu i acetylo-CoA (tj. glicyny, cysteiny, seryny, alaniny, waliny, leucyny i lizyny) (Rycina 1). Jak wspomniano, 13C3-asparaginian był produkowany w ciągu pierwszej godziny, natomiast nie zaobserwowano aminokwasów pochodzących z asparaginianu zawierających wbudowany 13C (tj. treoniny, izoleucyny, metioniny i asparaginy), co może wynikać z faktu, że asparaginian pochodzący z glukozy bierze udział w fermentacji (Rycina 1, Rycina 6C). Na koniec, strumień w kierunku znakowanego glutaminianu i aminokwasów pochodnych glutaminianu mógł zostać zahamowany przez wysoki poziom glutaminianu w środowisku reakcyjnym (Rycina 1).

Rysunek 1: Putatywny model metaboliczny lizatów pochodzących z E. coli BL21DE3-Star rosnących wykładniczo w wysokich stężeniach glukozy. Pośredniki i produkty końcowe glikolizy (zielony), szlaku pentozofosforanowego (ciemnopomarańczowy) oraz szlaków fermentacyjnych (niebieski) z acetylo-CoA zostały zgłoszone w CFME opartym na lizatach. Obecność fermentacji bursztynianowej sugeruje aktywację oksydacyjnej gałęzi cyklu TCA (szary). Anabolizm aminokwasów (złoty) w lizatach nie jest dobrze zdefiniowany i jest tutaj badany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Dane HPLC-RID dotyczące zużycia glukozy i syntezy produktów końcowych fermentacji w reakcjach CFME przygotowanych z ekstraktów surowych E. coli. (A) Zużycie glukozy oraz (B) produkcja mleczanu, (C) etanolu, (D) octanu, (E) mrówczanu i (F) bursztynianu w reakcjach CFME były monitorowane przez 24 h. Przedstawiono średnie stężenia w mM oraz słupki błędów (SE) wyznaczone za pomocą krzywych wzorcowych (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Trendy przebiegu czasowego 13C6-glukozy i znakowanych 13C produktów pośrednich glikolizy w CFME na bazie lizatu E. coli . Względna zawartość (A) 13C6-glukozy, (B) 13C6-glukozo-6-fosforanu/fruktozo-6-fosforanu, (C) 13C6-fruktozo-1,6-bisfosforanu, (D) 13C3-gliceraldehyd-3-fosforanu/dihydroksyacetonofosforanu oraz (E) 13C6-pirogronianu w reakcjach CFME w czasie 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały użyte do obliczenia średnich i słupków błędu (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Trendy czasowe produktów pośrednich i końcowych w fermentacji 13C6-glukozy w lizacie CFME E. coli .Względna obfitość (A) 13C3-mleczanu, (B) 13C3-bursztynianu, (C) 13C2-acetylofosforanu oraz (D) 13C2-acetylu-CoA w reakcjach CFME w ciągu 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyodrębnione za pomocą oprogramowania mzMINE posłużyły do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Trendy czasowe produktów pośrednich szlaku pentozofosforanowego pochodzących z 13C6-glukozy w lizacie CFME E. coli . Względna obfitość (A) 13C6-6-fosfoglukonolaktonu, (B) 13C6-6-fosfoglukonianu, (C) 13C5-rybulozofosforanu-5 oraz (D) 13C7-sedoheptulozofosforanu-7 w czasie 3 h. Surowe pola powierzchni piku wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały użyte do obliczenia średnich i słupków błędów (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Trendy czasowe wykrytych aminokwasów pochodzących z 13C6-glukozy w CFME lizatu E. coli. Względna obfitość (A) 13C9-tyrozyny, (B) 13C5-histydyny oraz (C) 13C3-asparaginianu w ciągu 3 h. Surowe pola powierzchni pików wyekstrahowane za pomocą oprogramowania mzMINE zostały wykorzystane do obliczenia średnich i słupków błędu (SE) dla pozytywnych adnotacji (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina uzupełniająca 1: Reprezentatywny chromatogram HPLC-RID przedstawiający piki głównych produktów fermentacyjnych w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 24 h. Piki glukozy, bursztynianu, mleczanu, mrówczanu, octanu i etanolu są wystarczająco rozróżnialne na podstawie ich czasów retencji na kolumnie HPLC podczas elucji izokratycznej z zastosowaniem rozpuszczalnika w postaci 5 mM kwasu siarkowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 2: Reprezentatywne widma mas dla metabolitów znakowanych 13C, a konkretnie (A) mleczanu, (B) glukozy i (C) 6-fosfoglukonianu (6PG) w reakcji CFME inkubowanej w 37 °C przez 1 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Lista wykrytych metabolitów znakowanych 13C, czasów retencji (wyrównanych w próbkach za pomocą MZmine), teoretycznych wartości m/z dla pełnego znakowania 13C w trybie ujemnym, wartości m/z wykrytych cech oraz obliczonych błędów masy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Przedstawione podejście HPLC-RID może być wykorzystane do pomyślnego ilościowego określenia zużycia substratów cukrowych i późniejszej konwersji do głównych kwasów organicznych i produktów alkoholowych centralnego metabolizmu lizatu w czasie. Co więcej, protokół ten wykorzystuje prostą metodę izokratyczną wykorzystującą pojedynczą fazę ruchomą, wymaga minimalnego przygotowania próbki i umożliwia prostą, ukierunkowaną analizę na dalszym etapie. Anality mierzone metodą HPLC-RID wyróżniają się wyłącznie czasem retencji, a co za tym idzie oddziaływaniami z wybraną żywicą kolumnową. Zastosowana tutaj kolumna HPLC została specjalnie zaprojektowana do oddzielania węglowodanów, kwasów organicznych i alkoholi poprzez połączenie wykluczenia wielkości i wymiany ligandów (tj. chromatografii partycji moderowanej jonami). Opisana metoda jest zatem przydatna do bardziej ukierunkowanej analizy substratów węglowodanowych i wybranych produktów końcowych szlaków fermentacji glukozy, które mają przede wszystkim ułatwić i zenergetyzować biotransformacje oparte na lizacie 8,15,21. Jednak protokół ten nie uwzględnia aktywacji innych szlaków metabolicznych w ekstraktach komórkowych. Rurociągi wykorzystujące inne techniki rozdzielania chromatograficznego (tj. chromatografię oddziaływań hydrofilowych), metody elucji gradientowej, bardziej skomplikowane przygotowanie próbki (tj. derywatyzacja) i różne detektory optyczne (np. detektory rozpraszania światła ultrafioletowego lub światła wyparnego) mogą być stosowane do wykrywania innych metabolitów, takich jak aminokwasy i fosforany cukru23,24. Alternatywnie, globalne podejście do badania metabolizmu lizatu można przyjąć przy użyciu LC-MS/MS.
Opisana metoda LC-MS/MS to pojedynczy proces pomiaru i identyfikacji szerszego zakresu metabolitów. LC-MS/MS jest najnowocześniejszym narzędziem analitycznym do profilowania metabolomu ze względu na swoją czułość i zdolność do rozróżniania metabolitów na podstawie czasu retencji i współczynników m/z z wysoką rozdzielczością16. Koncentrując się na centralnych szlakach metabolicznych węgla i anabolizmie aminokwasów, wdrożono tryb ujemny MS/MS w celu specyficznego wykrywania polarnych kwasów organicznych, fosforanów cukrów i aminokwasów. W połączeniu z techniką chromatografii nanocieczowej, metoda ta zapewnia wysoką czułość wykrywania małych cząsteczek w złożonym tle lizatu17. Jeśli jednak chodzi o profilowanie metabolizmu CFME opartego na lizatach, ograniczeniem opisanego protokołu LC-MS/MS jest jego dolna granica wykrywalności wynosząca 50 m/z, co wyklucza pomiar etanolu, głównego produktu metabolizmu glukozy w lizacie, a także mrówczanu, które w przeciwnym razie można łatwo określić ilościowo za pomocą szczegółowej metody HPLC-RID. W porównaniu z LC-MS/MS, HPLC-RID ma dodatkową zaletę w postaci względnej dostępności pod względem kosztów i trudności. Do tego ostatniego punktu, rozwiązywanie problemów z opisaną tutaj metodą LC-MS/MS może wymagać pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej w zakresie spektrometrii mas. Niemniej jednak, wykrywanie stwardnienia rozsianego ma wyjątkowo atrakcyjne zastosowania w porównaniu z RID, ponieważ może dodatkowo rozróżniać znakowane izotopy w metabolomach, co jest doskonałą techniką zrozumienia ruchu węgla z uzupełnionych substratów przez złożoną sieć metaboliczną lizatu18. Takie podejście zastosowano w tym przypadku poprzez uzupełnienie reakcji 13C6-glukozą i analizę względnych wartości obfitości dalszych metabolitów zawierających 13C. Analiza pozwoliła na zdefiniowanie aktywnych i nieaktywnych szlaków, wspierając wcześniej zgłoszone założenia i dostarczając nowych informacji na temat przepływu metabolicznego w lizatach. W ramach metody można również wprowadzać modyfikacje dla konkretnych analiz. Na przykład roztwory wzorcowe 13związków docelowych znakowanych znakiem C można analizować wraz z próbkami, aby uzyskać bezwzględne pomiary ilościowe cząsteczek pochodzących z glukozy w czasie i wyciągnąć wnioski na temat rozkładu strumienia. Lepsze wykrywanie dodatnio naładowanych związków można również włączyć w ramach bieżącego przepływu pracy, uruchamiając sekwencje z plikami .meth dostosowanymi do wykrywania w trybie dodatnim.
Pobieranie próbek analitycznych w obu opisanych metodach jest wygodnie zautomatyzowane, co zapewnia wysoką odtwarzalność. Co więcej, można oczekiwać płynnych przebiegów analitycznych, o ile przestrzegane są właściwe praktyki obsługi i konserwacji instrumentów. Korzystając z tych narzędzi do analizy reakcji CFME, należy wziąć pod uwagę bardziej krytyczne kwestie przed i po pobraniu próbki. Podczas przygotowywania próbki ważne jest, aby kontrole przebiegu w czasie były reprezentatywne dla czasu zerowego. W tym przypadku białka zostały wytrącone w lizatach przez zakwaszenie w celu zatrzymania reakcji metabolicznych. W przypadku próbek o czasie zerowym rozpuszczalnik kwasowy połączono z lizatem przed dodaniem mieszaniny reakcyjnej zawierającej glukozę. Zakwaszenie kwasem trójchlorooctowym skutecznie zapewniło, że glukoza nie jest metabolizowana w czasie zero, jak pokazano w danych HPLC-RID (ryc. 2). Podczas gdy podobną procedurę wygaszania metabolizmu glukozy przeprowadzono w zgłoszonej analizie LC-MS/MS, wykryto 13metabolitów znakowanych C w próbkach z czasem zerowy, aczkolwiek przy znacznie niskich wartościach liczebności w stosunku do próbek wyekstrahowanych w późniejszych punktach czasowych. Co więcej, obserwacje te ograniczały się do produktów pośrednich glikolizy. Dane sugerują, że reakcje zachowują pewien stopień aktywności glikolitycznej po zakwaszeniu rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, który jest wykrywany za pomocą tej bardzo czułej metody. Zakres tej działalności powinien jednak zostać określony ilościowo. Poprzednie badanie wykazało, że kwaśne rozpuszczalniki ekstrakcyjne mogą nie wygaszać w wystarczającym stopniu pośrednich reakcji glikolitowych, ale mogą zatrzymać znaczne zużycie glukozy10. Chociaż pozostaje to do dalszego zbadania w zastosowanym tutaj systemie, drastyczne zmiany w względnych wartościach obfitości między próbkami o czasie zerowym a późniejszymi punktami czasowymi mogą być interpretowane jako trendy w metabolizmie glukozy. W podobnych zastosowaniach zaleca się jednak zbadanie alternatywnych metod hartowania, w szczególności w celu uzyskania bezwzględnych ilości pośrednich produktów metabolicznych10. Ponadto należy również przestrzegać dobrych praktyk podczas dalszych analiz oprogramowania. Spójność jest niezbędna podczas ręcznej integracji obszarów szczytowych z sygnałów RID w celu zmniejszenia błędu ludzkiego. Ręczna integracja powinna być również stosowana do obszarów pików wzorców w każdym przypadku, gdy ręcznie zintegrowane obszary pików są wykorzystywane do ilościowego określania stężeń metabolitów w próbkach. W trakcie ukierunkowanej analizy LC-MS/MS wstępne adnotacje z analizy MZmine powinny być walidowane poprzez ręczne sprawdzanie pików za pomocą przeglądarki jakości MS, a cechy m/z powinny być opisywane tylko wtedy, gdy obliczone błędy masy są dopuszczalne. W tym przypadku analizy te zostały przeprowadzone ręcznie dla ograniczonego zestawu celów, ponieważ kompleksowe i solidne oprogramowanie do wyszukiwania izotopów nie jest jeszcze stworzone. Jednak obecnie pojawiają się takie zautomatyzowane metody wyszukiwania metabolitów znakowanych izotopem węgla 13C, które usprawniłyby również bardziej skomplikowane analizy, takie jak profilowanie lizatów poza centralnym metabolizmem węgla25.
Zaawansowana chromatografia cieczowa jest solidną i szeroko stosowaną metodą rozdzielania małych cząsteczek w złożonych mieszaninach metabolicznych11. Opisane metody łączą tę technikę separacji z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas, aby skutecznie analizować konwersje metabolitów w reakcjach CFME opartych na lizatach. HPLC-RID i LC-MS/MS są indywidualnie potężnymi narzędziami do profilowania aktywnego metabolizmu lizatów, a ich komplementarność może być dodatkowo wykorzystana do rozwiązania nieodłącznych ograniczeń każdej techniki. Przedstawione metody umożliwiają zastosowanie i rozwój CFME, ponieważ można je wykorzystać do zrozumienia metabolizmu lizatu, monitorowania ulepszeń w docelowych konwersjach metabolitów oraz wyjaśniania zmian w strumieniu metabolitów podczas manipulowania metabolizmem lizatu.
Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani inne konflikty interesów.
To badanie było sponsorowane przez Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, jako część Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov). Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725. Niniejszy manuskrypt został napisany przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów Rządu Stanów Zjednoczonych. Departament Energii zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &m; m Filtry probówkowe wirówkowe (kolumny wirowe) | Corning Costar | 8160 | |
| 1,5 ml probówki mikrowirówkowe | VWR | 87003-294 | |
| 1260 Infinity Binary LC | System Agilent | G1312B | HPLC-RID |
| 1260 Wysokowydajny odgazowywacz Infinity | System Agilent | G4225A | System HPLC-RID |
| 1260 Detektor nieskończoności indeksu refrakcji | Agilent | G7162A | System HPLC-RID |
| 1260 Infinity Standardowy automatyczny podajnik próbek | Agilent | G1329B | System HPLC-RID |
| 13C6-glukoza | Składnik mieszaniny reakcyjnej Sigma-Aldrich 389374 CPM (LC-MS/MS) | ||
| 500 ml 0,20 μ m filtr porowy (membrana PES) | VWR | 10040-436 | |
| Acetonitryl (klasa LC/MS) | Fisher Scientific | A955 | Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS |
| Adenozynotrifosforan | Sigma-Aldrich | A7699 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| Kolumna Aminex HPX 87-H | Bio-rad | 1250140 | Kolumna chromatograficzna do HPLC-RID |
| Octan amonu (klasa LC/MS) | Fisher Scientific | A11450 | Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS |
| Glutaminian amonu | Sigma-Aldrich | G1376 | CFME Składnik mieszanki reakcyjnej |
| Nasadki na fiolki automatycznego podajnika próbek (żółte, zatrzask) | Thermo Scientific | C4011-50Y | Przechowywanie/dostarczanie próbek do |
| fiolek z automatycznym samplerem LC-MS/MS (0,30 ml, polipropylen) | Wheaton | W225181 | Przechowywanie/dostarczanie próbek do LC-MS/MS |
| Mikrowirówka laboratoryjna | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Bis-Tris | Sigma-Aldrich | B9754 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| Koenzym A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| D-dekstroza (glukoza) | VWR | BDH9230 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| Fosforan dipotasu | Sigma-Aldrich | P8281 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| Etanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu krzywej wzorcowej (HPLC-RID) |
| Kwas mrówkowy (klasa LC/MS) | Thermo Scientific | 85178 | Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS/MS |
| Topiona krzemionka (średnica wewnętrzna 100 μ m, średnica zewnętrzna 375 μ m) | Polymicro Technologies | WM22005-ND | Kolumna chromatograficzna do LC-MS / MS |
| Lodowaty kwas octowy | Sigma-Aldrich | A6283 | S30 składnik buforowy |
| Izopropanol (klasa LC / MS) | Fisher Scientific | A461 | Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS |
| Kinetex 5 i mu; m C18 faza stacjonarna (100 Å) | Phenomenex | N/A; na specjalne zamówienie | Kolumna chromatograficzna do spektrometru mas LC-MS/MS |
| LTQ Orbitrap Velos Pro | ThermoFisher Scientific | N/A; na specjalne zamówienie | Spektrometr masowy do LC-MS/MS |
| Octan magnezu Składnik buforowy | Sigma-Aldrich | M5661 | S30 |
| Glutaminian magnezu | Sigma-Aldrich | 49605 | CFME |
| Metanol (klasa LC / MS) | Fisher Scientific | A456 | Preparat rozpuszczalnikowy do LC-MS / MS |
| NAD+ | Sigma-Aldrich | N0632 | Składnik mieszaniny reakcyjnej CFME |
| Źródło jonizacji Nanospray Źródło ThermoFisher | Scientific/Proxeon | ES071 (najnowszy model) | Spektrometr masowy do LC-MS/MS |
| OpenLab CDS (online) Oprogramowanie | Agilent | Wersja 2.15.26 | System danych chromatograficznych do pozyskiwania i analizy danych HPLC |
| Oprogramowanie Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus | Thermo | Version 2.7 | Oprogramowanie do strojenia systemu LC-MS/MS |
| Octan potasu | Sigma-Aldrich | P1190 | S30 |
| Glutaminian potasu | Sigma-Aldrich | G1501 | CFME Składnik mieszaniny reakcyjnej |
| Wirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 5415 C | |
| Zakrętki (z przegrodą, 9 mm) | Supelco | 29315-U | Przechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID |
| Fiolki ze szkła gwintowanego (2 ml) | Supelco | 29376-U | Przechowywanie/dostarczanie próbek do HPLC-RID |
| Octan sodu | Sigma-Aldrich | 241245 | Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID) |
| Mrówczan | soduSigma-Aldrich | 247596 | Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID) |
| Mleczan sodu | Sigma-Aldrich | 71716 | Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID) |
| Kwas bursztynowy | Sigma-Aldrich | 398055 | Rozpuszczony w buforze S30 do przygotowania roztworu wzorcowej (HPLC-RID) |
| Kwas siarkowy | Sigma-Aldrich | 258105 | Preparat rozpuszczalnikowy do HPLC-RID |
| Kwas trichlorooctowy | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Tris-octan | GoldBio | T-090-100 | S30 składnik buforowy |
| Ultimate 3000 LC z autosamplerem | Ionex | : SRD-3600 | System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS |
| Ultimate 3000 LC z automatycznym podajnikiem próbek | Dionex | Rapid Separation Pompa binarna: HPG-3400RS | System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS/MS |
| Ultimate 3000 LC z autosamplerem | Automatyczny podajnik próbek płytek Dionex do szybkiej separacji: WPS-3000TRS | System chromatografii cieczowej do analizy LC-MS / MS | |
| (klasa LC / MS) | Fisher Scientific | W6500 | Przygotowanie rozpuszczalnika do LC-MS/MS |
| Xcalibur Software | Thermo Wersja 3.0.63 | Oprogramowanie do akwizycji i interpretacji danych dla LC-MS/MS |
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie