Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62853

⸱

19 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Streszczenie

Pomimo ostatnich postępów w charakterystyce proteomu mitochondrialnego drożdży, submitochondrialna lokalizacja znacznej liczby białek pozostaje nieuchwytna. W tym miejscu opisujemy solidną i skuteczną metodę określania suborganellarnej lokalizacji białek mitochondrialnych drożdży, która jest uważana za podstawowy krok podczas wyjaśniania funkcji białek mitochondrialnych. Ta metoda obejmuje początkowy etap, który polega na uzyskaniu wysoce czystych, nienaruszonych mitochondriów. Te preparaty mitochondrialne są następnie poddawane protokołowi subfrakcjonowania składającemu się ze wstrząsu hipotonicznego (obrzęku) i inkubacji z proteinazą K (proteazą). Podczas pęcznienia zewnętrzna błona mitochondrialna jest selektywnie przerywana, co pozwala proteinazie K trawić białka przedziału przestrzeni międzybłonowej. Równolegle, w celu uzyskania informacji o topologii białek błonowych, preparaty mitochondrialne są początkowo sonikowane, a następnie poddawane ekstrakcji alkalicznej węglanem sodu. Wreszcie, po odwirowaniu, granulki i frakcje supernatantu z tych różnych zabiegów są analizowane za pomocą SDS-PAGE i western blot. Lokalizację submitochondrialną, jak również topologię błony białka będącego przedmiotem zainteresowania, uzyskuje się poprzez porównanie jego profilu western blot ze znanymi standardami.

Wprowadzenie

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych, które odgrywają kluczową rolę w bioenergetyce, metabolizmie komórkowym i szlakach sygnałowych1. Aby prawidłowo wykonać te zadania, mitochondria opierają się na unikalnym zestawie białek i lipidów odpowiedzialnych za ich strukturę i funkcję. Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae są szeroko stosowane jako system modelowy do badań nad procesami mitochondrialnymi, a także dla innych organelli2. Genom mitochondrialny koduje tylko osiem białek drożdży; Zdecydowana większość białek mitochondrialnych (~99%) jest kodowana przez geny jądrowe, które są translowane na rybosomach cytozolowych, a następnie importowane do ich prawidłowych przedziałów submitochondrialnych przez wyrafinowane maszyny do importu białek3,4,5. Tak więc biogeneza mitochondriów zależy od skoordynowanej ekspresji zarówno genomu jądrowego, jak i mitochondrialnego6,7. Mutacje genetyczne powodujące defekty biogenezy mitochondriów są związane z chorobami ludzkimi8,9,10.

W ciągu ostatnich dwóch dekad, wysokoprzepustowe badania proteomiczne ukierunkowane na wysoko oczyszczone mitochondria zaowocowały kompleksową charakterystyką proteomu mitochondrialnego drożdży, który według szacunków składa się z co najmniej 900 białek11,12,13,14. Chociaż badania te dostarczyły cennych informacji, nadal wymagana jest suborganellarna lokalizacja każdego białka w czterech podkompartmentach mitochondrialnych, a mianowicie błonie zewnętrznej (OM), przestrzeni międzybłonowej (IMS), błonie wewnętrznej (IM) i macierzy. Na to pytanie częściowo udzielono odpowiedzi w badaniach proteomicznych dwóch mniejszych podkompartmentów mitochondrialnych (OM i IMS)15,16. Niedawno Vögtle i jego współpracownicy poczynili duży krok naprzód, generując wysokiej jakości globalną mapę dystrybucji białek submitochondrialnych w drożdżach. Korzystając ze zintegrowanego podejścia łączącego ilościową spektrometrię mas opartą na SILAC, różne protokoły frakcjonowania submitochondrialnego oraz zestaw danych z proteomów OM i IMS, autorzy przypisali 818 białek do czterech podkompartmentów mitochondrialnych13.

Pomimo postępów osiągniętych dzięki tym wysokoprzepustowym badaniom proteomicznym, nasza wiedza na temat składu proteomu submitochondrialnego jest daleka od kompletności. Rzeczywiście, spośród 986 białek zgłoszonych przez Vögtle'a i współpracowników jako zlokalizowane w mitochondriach drożdży, 168 nie można było przypisać do żadnego z czterech przedziałów submitochondrialnych13. Ponadto autorzy nie podali informacji na temat topologii błonowej białek, które zgodnie z przewidywaniami były obwodowo przyłączone do obwodu błon mitochondrialnych. Na przykład nie jest możliwe ustalenie, czy białko, które zostało przypisane jako obwodowo przyłączone do błony wewnętrznej, jest skierowane w stronę macierzy czy przestrzeni międzybłonowej. Oprócz tych brakujących danych z badań obejmujących cały proteom, istnieją sprzeczne informacje na temat lokalizacji suborganellarnej znacznej liczby białek mitochondrialnych. Jednym z przykładów jest proteaza Prd1, która została przypisana jako białko przestrzeni międzybłonowej we wspólnych bazach danych, takich jak Saccharomyces Genome Database (SGD) i Uniprot. Co zaskakujące, stosując protokół subfrakcjonowania podobny do opisanego tutaj, Vögtle i współpracownicy wyraźnie wykazali, że Prd1 jest prawdziwym białkiem macierzy13. Jak wspomniano powyżej, submitochondrialna lokalizacja wielu białek mitochondrialnych musi zostać wyjaśniona lub ponownie oceniona. Tutaj zapewniamy prosty i niezawodny protokół do określenia suborganellarnej lokalizacji białek mitochondrialnych drożdży. Protokół ten został opracowany i zoptymalizowany przez różne grupy badawcze i jest rutynowo stosowany do określania lokalizacji submitochondrialnej, a także topologii błony wielu białek mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost komórek drożdży

  1. Wyizoluj pojedyncze kolonie interesującego szczepu, umieszczając niewielką część komórek z glicerolu o temperaturze -80 °C na płytce agarowej YPD (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 2% glukoza). Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.
    UWAGA: Szczep S. cerevisiae używany w tym protokole pochodzi z BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Z wyjątkiem genów markerów auksotroficznych, szczep ten nie zawiera żadnego usuniętego genu i nie przenosi żadnego plazmidu. Dzięki temu może być z powodzeniem uprawiany w bogatym podłożu, stymulując energiczny wzrost komórek. Podczas pracy ze szczepami przekształconymi za pomocą plazmidów należy użyć odpowiedniej minimalnej pożywki do selekcji plazmidów.
  2. Przygotuj kulturę starterową, zaszczepiając 2-3 pojedyncze kolonie z płytki agarowej YPD w 10-20 ml pożywki YPGal (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% galaktozy) w 100 ml kolby Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny, energicznie wstrząsając.
    UWAGA: Wybór pożywki wzrostowej zależy od szczepu drożdży użytego w protokole. Zarówno YPD, jak i YPGal zawierają fermentujące źródła węgla, które umożliwiają wzrost szczepów, które nie wykonują oddychania mitochondrialnego. Ponieważ jednak glukoza hamuje ekspresję wielu genów mitochondrialnych, nie zaleca się stosowania tego źródła węgla, ponieważ będzie ono wytwarzać mniejsze ilości mitochondriów. Podczas pracy ze szczepami kompetentnymi do oddychania, które mogą oddychać, możliwe jest również użycie źródeł węgla, takich jak glicerol i etanol, w celu uzyskania wyższej wydajności mitochondriów.
  3. Rozcieńczyć kulturę starterową w 1 l świeżej pożywki YPGal do OD600 poniżej 0,1. Hodować komórki w temperaturze 30 °C, energicznie wstrząsając, aż OD600 osiągnie 1-1,5,
    UWAGA: Określ tempo wzrostu (czas podwojenia) dla każdego szczepu drożdży przed wykonaniem eksperymentu. Zapewni to dokładne oszacowanie czasu inkubacji wymaganego, aby kultura osiągnęła OD600 1-1,5.

2. Izolacja wysoce oczyszczonych mitochondriów

UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z17, z niewielkimi modyfikacjami.

  1. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Umyj komórki wodą destylowaną i zbierz je przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Określić mokrą masę komórek.
    UWAGA: Najłatwiejszym sposobem zmierzenia masy osadu komórkowego z kroku 2.2 jest określenie masy pustej probówki wirówkowej tuż przed pobraniem komórek. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i zmierzyć wagę tej samej probówki z komórkami. Waga komórek to różnica między tymi dwoma pomiarami.
  4. Ponownie zawiesić komórki w buforze naziemnej telewizji cyfrowej (2 ml na 1 g komórek) za pomocą pipety Pasteura lub końcówki P5000. Patrz Tabela 1 dla składu buforu DDT.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 20 minut, delikatnie wstrząsając (~70 obr./min).
  6. Wirować przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
  7. Przemyć komórki buforem zymoliazy bez enzymu (około 7 ml na 1 g komórek).
    Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem buforu zymoliazy.
  8. Wirować przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
  9. Zawiesić komórki w buforze bez zymoliazy (7 ml na 1 g komórek).
  10. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml i dodać Zymolyase-20T (3 mg na g mokrej masy).
  11. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 30-40 minut, delikatnie wstrząsając (~70 obr./min). Sprawdź skuteczność tego procesu, porównując zmętnienie zawiesiny komórkowej przed i po leczeniu zymoliazą.
    UWAGA: Na tym etapie komórki zostaną przekształcone w sferoplasty w wyniku trawienia ściany komórkowej przez Zymolyazę.
    1. W tym celu należy dodać 50 μl zawiesiny każdej komórki do oddzielnych szklanych probówek zawierających 2 ml wody. Po energicznym wymieszaniu zmętnienie zawiesiny komórkowej poddanej działaniu Zymoliazy powinno gwałtownie się zmniejszyć z powodu osmotycznego rozerwania sferoplastów. Z drugiej strony, zmętnienie zawiesiny komórek niepoddanej działaniu środka powinno pozostać niezmienione.
      UWAGA: Skutki zmętnienia można również monitorować za pomocą prostej kontroli wzrokowej lub pomiaru średnicy zewnętrznej600 obu próbek. W drugim przypadku OD600 próbki poddanej działaniu zymoliazy powinien wynosić 10%-20% próbki niepoddanej działaniu zymoliazy. Alternatywna metoda polega na zliczaniu komórek w obu próbkach za pomocą mikroskopii świetlnej.
    2. Jeśli wydajność tworzenia sferoplastów jest niska, dodaj więcej zymoliazy i inkubuj przez kolejne 15 minut.
  12. Zebrać sferoplasty przez odwirowanie w temperaturze 2500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wszystkie dalsze kroki należy wykonywać szybko i na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji białek przez enzymy hydrolityczne.
  13. Przepłukać sferoplasty dwukrotnie lodowatym buforem homogenizacyjnym (około 6,5 ml na 1 g komórek) i osadem przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się ze składem buforu homogenizacyjnego.
  14. Ponownie zawiesić sferoplasty w lodowatym buforze homogenizacyjnym (6,5 ml na 1 g komórek) i przenieść go do wstępnie schłodzonego szklanego homogenizatora Dounce. Użyj dużego szklanego homogenizatora o pojemności około 30 ml.
  15. Homogenizować sferoplasty za pomocą 15 pociągnięć za pomocą tłuczka.
    UWAGA: Liczbę uderzeń należy dostosować w zależności od dopasowania tłuczka. W przypadku ciasnego tłuczka wystarczy 15 uderzeń. Z drugiej strony, jeśli używasz luźnego tłuczka, zaleca się wykonanie do 25 uderzeń.
  16. Przenieść homogenat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 1 objętość lodowatego buforu homogenizacyjnego.
  17. Odwirować homogenat z małą prędkością, 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder, szczątków komórkowych i nieuszkodzonych komórek.
  18. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety Pasteura lub końcówki P5000, uważając, aby nie uszkodzić osadu.
  19. Wirować przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  20. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej o dużej prędkości i odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia surowej frakcji mitochondriów.
  21. Odrzucić supernatant i delikatnie przemyć surowe osady mitochondrialne w 20-30 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego przez delikatne pipetowanie za pomocą końcówki P5000.
  22. Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pozostałych resztek komórek.
  23. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej o dużej prędkości i odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia surowej frakcji mitochondriów.
  24. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić surowy osad mitochondrialny w małej objętości (zwykle 1000 μl) lodowatego buforu SEM, delikatnie pipetując za pomocą końcówki P1000. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem bufora SEM.
    UWAGA: Chociaż ta surowa frakcja mitochondrialna może być używana bezpośrednio w niektórych zastosowaniach, takich jak testy importu białek organello, zawiera znaczne ilości innych składników komórkowych. Zanieczyszczenia te mogą prowadzić do błędnej interpretacji wyników podczas określania submitochondrialnej lokalizacji białka. Dlatego wymagane są dalsze etapy oczyszczania, aby uzyskać wysoce oczyszczony preparat mitochondrialny, jak opisano poniżej.
  25. Przygotować roztwory sacharozy w buforze EM o stężeniach 60%, 32%, 23% i 15% (w/v). Roztwory te są stabilne do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C. Patrz tabela 1 dla składu bufora EM.
  26. Przygotować 4-stopniowy gradient sacharozy w probówce do ultrawirówki w następujący sposób: Umieścić 1,5 ml 60% (w/v) sacharozy na dnie probówki wirówkowej. Następnie ostrożnie pipetuj krok po kroku: 4 ml 32%, 1,5 ml 23% i 1,5 ml 15% sacharozy (w/v). Uważaj, aby nie przerywać faz.
  27. Ostrożnie załaduj surową frakcję mitochondrialną na wierzch gradientu sacharozy.
  28. Wirować przez 1 godzinę przy 134 000 x g w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.
  29. Ostrożnie usuwaj roztwór sacharozy, aż zostanie osiągnięta wysoce oczyszczona frakcja mitochondriów, która jest reprezentowana przez brązowy pasek na granicy faz 60%/32% sacharozy.
  30. Odzyskaj oczyszczone mitochondria za pomocą końcówki do cięcia P1000 i umieść ją we wstępnie schłodzonej probówce wirówkowej o dużej prędkości.
  31. Rozcieńczyć odzyskane mitochondria 5-10 objętościami lodowatego buforu SEM.
  32. Wirować przez 30 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
  33. Zawiesić czyste mitochondria w 500 μl lodowatego buforu SEM, delikatnie pipetując za pomocą końcówki do cięcia P1000.
  34. Oznaczyć stężenie białka w wysoce oczyszczonym preparacie mitochondrialnym za pomocą procedury Bradforda, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosuj stężenie białka do 10 mg białka/ml za pomocą lodowatego buforu SEM.
    UWAGA: W opisanym poniżej protokole frakcjonowania submitochondrialnego zaleca się stosowanie świeżo przygotowanych mitochondriów. Jednak Vögtle i współpracownicy przeprowadzili szczegółową analizę kontroli jakości nienaruszonego mitochondriów i wykazali, że zamrożone organelle mogą być również używane w tym protokole13. W tym celu przygotuj porcje 40 μl i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Protokół frakcjonowania submitochondrialnego

UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z reference18 i składa się z dwóch etapów: (1) hipotonicznego pęcznienia w obecności lub braku proteinazy K oraz (2) sonikacji, po której następuje ekstrakcja węglanowa. Wykonaj wszystkie kroki obu protokołów na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji białka.

  1. Hipotoniczny obrzęk w obecności proteinazy K
    1. Przenieść 40 μl wysoce oczyszczonych mitochondriów w stężeniu 10 mg/ml (400 μg) do czterech wstępnie schłodzonych, znakowanych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 360 μl buforu SEM w probówkach 1 i 2.
    3. Dodać 360 μl buforu EM do probówek 3 i 4.
    4. Dodać 4 μl proteinazy K (10 mg/ml) do probówek 2 i 4. Aby uniknąć błędów, należy postępować zgodnie ze schematem pipetowania podanym w Tabeli 2.
      UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować 10 mg/ml roztworu proteinazy K w wodzie. Końcowe stężenie proteinazy K w eksperymencie powinno wynosić około 50-100 μg/ml. Więcej informacji można znaleźć w sekcji Dyskusja.
    5. Delikatnie wymieszaj wszystkie probówki i inkubuj na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu mieszając.
    6. Dodaj 4 μl 200 mM PMSF do wszystkich czterech probówek, aby zatrzymać aktywność proteinazy K.
      UWAGA: PMSF jest wysoce toksyczny. Podczas pracy z roztworami zawierającymi PMSF należy nosić rękawice.
    7. Wirować przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej, wstępnie schłodzonej, znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby nie zakłócić działania pelletu.
      UWAGA: Osad można bezpośrednio zawiesić w buforze próbki w celu dalszej analizy SDS-PAGE i western blot. Jednak śladowe ilości proteinazy K mogą pozostać aktywne nawet po leczeniu PMSF i ostatecznie mogą trawić niektóre białka po rozpuszczeniu osadu w buforze próbki zawierającym SDS. Aby uniknąć tego problemu, proteinaza K może być całkowicie inaktywowana przez traktowanie próbek kwasem trichlorooctowym (TCA), jak opisano poniżej.
      UWAGA: TCA jest wysoce toksyczny. Podczas pracy z roztworami zawierającymi TCA należy nosić rękawice.
    9. Zawiesić osad z kroku 3.1.8 w 400 μl lodowatego buforu SEM.
    10. Wytrącić supernatant (od etapu 3.1.8) i zawieszony osad (od etapu 3.1.9) za pomocą TCA do końcowego stężenia 10% (w/v).
    11. Inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 10 minut.
    12. Próbki poddane działaniu TCA należy odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    13. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do próbki.
      UWAGA: Możliwe, że wskaźnik pH błękitu bromofenolowego zmieni kolor na żółty z powodu leczenia kwasem. Jeśli tak się stanie, dodaj małe porcje (1-5 μl) zasady 1 M Tris, aż zmieni kolor na niebieski.
    14. Dodać 4 μl 200 mM PMSF do wszystkich probówek.
    15. Przechowywać wszystkie próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy za pomocą SDS-PAGE i western blot.
  2. Sonikacja i ekstrakcja węglanowa
    UWAGA: W tym protokole nie jest konieczne używanie świeżo przygotowanych mitochondriów, gdy sonikacja powoduje pęknięcie błon mitochondrialnych.
    1. Przenieś 200 μl wysoko oczyszczonych mitochondriów w stężeniu 10 mg/ml (2 mg białka) do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Rozcieńczyć mitochondria jednorazowo lodowatym buforem SEM.
    3. Sonizacja mitochondriów przez 3 x 30 s na lodzie. Użyj sonikatora kompatybilnego z małymi objętościami.
    4. Odwirowywać próbkę przez 30 minut przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj go na lodzie. Ta próbka będzie nazywana rozpuszczalną frakcją białkową (S).
    6. Zawiesić osad z kroku 3.2.4 w 400 μl lodowatego buforu SEM.
    7. Pobrać 100 μl zawieszonego osadu z kroku 3.2.6 i przenieść go do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj go na lodzie. Ta próbka będzie nazywana frakcją cząstek submitochondrialnych (SMP).
    8. Rozcieńczyć jednokrotnie pozostałe 300 μl z kroku 3.2.6 świeżo przygotowanym 200 mM węglanem sodu.
    9. Inkubować próbkę z etapu 3.2.8 na lodzie przez 30 minut.
    10. Odwirowywać próbkę przez 30 minut przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C.
    11. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Trzymaj go na lodzie. Próbka ta będzie nosiła nazwę frakcja supernatantu węglanowego (CS).
    12. Zawiesić osad z kroku 3.2.10 w 400 μl lodowatego buforu SEM. Próbka ta będzie nosiła nazwę frakcja wytrącona węglanami (CP).
    13. Wytrącić wszystkie próbki (S, SMP, CS i CP) za pomocą TCA do końcowego stężenia 10% (w/v).
    14. Inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 10 minut.
    15. Próbki poddane działaniu TCA należy odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    16. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w buforze próbki. Jeśli bufor próbki zmieni kolor na żółty, dodać małe porcje (1-5 μl) 1 M zasady Tris, aż zmieni kolor na niebieski.
    17. Dodać 1 μl 200 mM PMSF do wszystkich probówek.
    18. Przechowywać wszystkie próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy za pomocą SDS-PAGE i western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sukces protokołu frakcjonowania submitochondrialnego zależy od uzyskania wysokiej czystości nienaruszonych mitochondriów. W tym celu kluczowe jest, aby podczas lizy komórek drożdży integralność organelli została niemal całkowicie zachowana. Osiąga się to poprzez zastosowanie protokołu lizy komórek, który łączy enzymatyczne trawienie ściany komórkowej z następującym po nim fizycznym rozbiciem błony plazmatycznej za pomocą homogenizatora Dounce'a. Zawartość mitochondrialna jest następnie zbierana metodą wirowania różnicowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół jest z powodzeniem stosowany i stale optymalizowany od dłuższego czasu w celu określenia lokalizacji białka w przedziałach submitochondrialnych 13,14,18,21,22,23. Wiarygodność i odtwarzalność tego protokołu są silnie uzależnione od czystości i integralności preparatów mitochondrialnych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. A. Tzagoloffowi (Columbia University) za dostarczenie przeciwciał przeciwko submitochondrialnym białkom markerowym Cyt. b2, αKGD oraz Sco1. Dziękujemy również dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) za pomocną dyskusję i komentarze podczas tworzenia tego protokołu.

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (grant 2013/07937-8).

Fernando Gomes i Helena Turano są również wspierani przez FAPESP, granty odpowiednio 2017/09443-3 i 2017/23839-7. Angélica Ramos jest również wspierana przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacto PeptoneBD211677
Ekstrakt z drożdży BactoBD212750
Probówki wirówkowe Beckman Ultra-Clear, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059
Albumina surowicy bydlęcej (bez kwasów tłuszczowych BSA)Sigma-AldrichA7030Składnik buforu homogenizacyjnego
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43815Składnik buforu DDT
D-SorbitolSigma-AldrichS1876
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE9884
GalaktozaSigma-AldrichG0625
GlukozaSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
Fenylometylosulfonyl fluorek (PMSF)Sigma-AldrichP7626Służy do inaktywacji proteinazy K
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-AldrichP3786
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP0662
Proteinaza KSigma-Aldrich
SacharozaSigma-AldrichS8501
Kwas trichlorooctowy (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T od Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA320921Służy do lizy żywych ścian komórkowych drożdży w celu wytworzenia sferoplastu

Bibliografia

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359(2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417(2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463(2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484(2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja submitochondrialnabiałka mitochondrialnetraktowanie proteinazą Kobrzęk hipotonicznyekstrakcja alkalicznaSDS-PAGEWestern blotsubfrakcjonowanie mitochondriów
Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.