Artykuł metodologiczny

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62857

⸱

10 września 2021

 , 
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, 3Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University Hospital, 4Research Group “Cellular Polarity and Viral Infection”, German Cancer Research Center (DKFZ)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak infekować ludzkie organoidy jelitowe od ich wierzchołkowej lub podstawno-bocznej strony, aby scharakteryzować interakcje gospodarz/patogen na poziomie pojedynczej komórki za pomocą technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq).

Streszczenie

Organoidy jelitowe człowieka stanowią najlepszy model komórkowy do badania infekcji patogenów przewodu pokarmowego. Organoidy te mogą pochodzić ze wszystkich odcinków przewodu pokarmowego (żołądek, jelito czcze, dwunastnica, jelito kręte, okrężnica, odbytnica) i po różnicowaniu zawierają większość typów komórek, które naturalnie występują w każdym pojedynczym odcinku. Na przykład organoidy jelitowe zawierają enterocyty wchłaniające składniki odżywcze, komórki wydzielnicze (Czara, Paneth i enteroendokrynne), komórki macierzyste, a także wszystkie produkty pośrednie różnicowania specyficzne dla linii (np. wczesne lub niedojrzałe typy komórek). Największą zaletą stosowania organoidów pochodzących z przewodu pokarmowego do badania chorób zakaźnych jest możliwość precyzyjnego określenia, który typ komórki jest celem patogenu jelitowego i ustalenia, czy różne odcinki przewodu pokarmowego i ich specyficzne typy komórek podobnie reagują na wyzwania związane z patogenami. W ciągu ostatnich lat modele przewodu pokarmowego, a także organoidy z innych tkanek, zostały wykorzystane do badania tropizmu wirusowego i mechanizmów patogenezy. Jednak wykorzystanie wszystkich zalet stosowania organoidów w przypadku wysoce zjadliwych wirusów stanowi wyzwanie techniczne i wymaga ścisłych względów bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo, ponieważ organoidy są często hodowane w trzech wymiarach, podstawno-boczna strona komórek jest skierowana na zewnątrz organoidu, podczas gdy ich wierzchołkowa strona jest skierowana do wnętrza (światła) organoidów. Organizacja ta stanowi wyzwanie dla patogenów jelitowych, ponieważ wiele infekcji jelitowych rozpoczyna się od wierzchołkowej/luminalnej strony komórek po spożyciu. Poniższy manuskrypt zapewni kompleksowy protokół przygotowania organoidów jelitowych człowieka do zakażenia patogenami jelitowymi poprzez uwzględnienie strony infekcji (wierzchołkowej vs. podstawno-bocznej) w celu przeprowadzenia sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki w celu scharakteryzowania interakcji gospodarz/patogen specyficznych dla typu komórki. Metoda ta szczegółowo opisuje przygotowanie organoidów, jak również względy potrzebne do wykonania tej pracy w warunkach hermetyczności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3).

Wprowadzenie

Badanie tropizmu specyficznego dla typu komórki i specyficznej dla typu komórki odpowiedzi immunologicznej na ludzkie wirusy jelitowe było historycznie trudne ze względu na brak pierwotnych modeli komórkowych człowieka. To ograniczenie zostało częściowo wyeliminowane wraz z rozwojem organoidów1. W przypadku przewodu pokarmowego opracowano modele organoidów żołądka i jelit dla ludzi i kilku innych gatunków (np. myszy, bydła, kotów, nietoperzy)2,3,4,5,6. Organoidy jelitowe odtwarzają architekturę strukturalną ludzkiego nabłonka jelitowego i zawierają struktury kryptowe i kosmkowe, funkcjonalne linie jelitowe, a nawet zostały wykorzystane do identyfikacji nieznanych wcześniej linii komórkowych. Do hodowli organoidów jelitowych można zastosować dwa różne podejścia. Po pierwsze, jelitowe komórki macierzyste zawierające krypty są izolowane z resekcji tkanek lub biopsji i hodowane w określonych warunkach hodowli (np. Wnt3A, R-spondin, Noggin i EGF) w celu namnażania, a następnie różnicowania komórek macierzystych do większości linii komórek jelitowych (np. enterocytów, komórek Panetha, komórek kubkowych, komórek enteroendokrynnych)7. Metoda ta pozwala na wyizolowanie organoidów ze wszystkich odcinków przewodu pokarmowego (np. żołądka, dwunastnicy, jelita czczego, jelita krętego i jelita grubego). Druga metoda opiera się na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych lub embrionalnych komórkach macierzystych, które są następnie różnicowane w procesie stopniowym w komórki nabłonka jelitowego8. Te indukowane organoidy oparte na komórkach macierzystych są często opisywane jako mające bardziej embrionalny charakter w porównaniu z organoidami pochodzącymi od pacjentów. Chociaż wszystkie te modele organoidów miały kluczowe znaczenie dla rozwikłania wskazówek rozwojowych potrzebnych do uformowania przewodu pokarmowego, ich zastosowanie w badaniach nad chorobami zakaźnymi jest wciąż w powijakach.

Wirus jelitowy to szerokie pojęcie obejmujące wszystkie wirusy, które infekują przez przewód pokarmowy, takie jak pikornawirusy (np. EV-71), reowirusy (np. rotawirus) i kaliciwirusy (np. norowirus)9. Wirusy jelitowe inicjują swój zakaźny cykl życiowy poprzez spożycie skażonej żywności i wody, co naraża ludzi w krajach rozwijających się na wysokie ryzyko z powodu odprowadzania nieprzetworzonych odpadów do środowiska i braku opieki medycznej po wystąpieniu infekcji10. W zależności od rodzaju patogenu infekcja może prowadzić do zapalenia żołądka i jelit, wymiotów i/lub wodnistej biegunki z powodu nieszczelności błony śluzowej jelit. Ludzkie norowirusy są bardzo rozpowszechnionym i wysoce zakaźnym patogenem jelitowym, który prowadzi do ponad 600 milionów infekcji i 15 milionów hospitalizacji na całym świecie11. Organoidy odegrały kluczową rolę w badaniach nad norowirusami, ponieważ wspomagają infekcję i replikację ludzkiego norowirusa, który wcześniej nie mógł być hodowany w standardowych modelach hodowli komórkowych12.

W ciągu ostatnich dwóch dekad koronawirusy stały się kluczowymi patogenami dla ludzi13. Rodzina ta obejmuje wysoce zjadliwe MERS, SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2, które wymagają ścisłego poziomu bezpieczeństwa podczas prowadzenia badań nad tymi wirusami. Co ciekawe, podczas gdy wszystkie trzy z tych patogenów są w większości rozpoznawane ze względu na wywołane objawy ze strony układu oddechowego i niepokój, obecnie jest oczywiste, że wirusy te infekują nie tylko drogi oddechowe, ale także inne narządy. Ważną patologią indukowaną u pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 oprócz niewydolności oddechowej jest obecność objawów żołądkowo-jelitowych14. U części pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 występują takie objawy, od bardzo łagodnej do ciężkiej biegunki. Dodatkowo genomy SARS-CoV-2 można wykryć w biopsjach kału i przewodu pokarmowego zakażonych pacjentów15. Co ważne, występowanie objawów żołądkowo-jelitowych nie ogranicza się tylko do SARS-CoV-2, ponieważ obserwowano je również u pacjentów zakażonych MERS i SARS-CoV-1. Aby zrozumieć, w jaki sposób SARS-CoV-2 wywołuje zaburzenia żołądkowo-jelitowe i precyzyjnie zidentyfikować tropizm SARS-CoV-2 w przewodzie pokarmowym, ludzkim organoidem jelitowym były kluczowe narzędzie i są obecnie wykorzystywane do odkrywania specyficznych dla typu komórek odpowiedzi na ten patogen16,17.

Profilowanie transkrypcyjne populacji komórek (masowe sekwencjonowanie RNA) było standardową praktyką przy ocenie infekcji patogenami zarówno unieśmiertelnionych linii komórkowych, jak i organoidów. Podczas gdy pozwala nam to określić globalne zmiany w odpowiedzi na patogeny (np. regulacja w górę cytokin), masowy RNAseq nie pozwala nam określić, dlaczego określone komórki w populacji są bardziej podatne na infekcję niż inne. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) stało się potężnym narzędziem do odkrywania programów transkrypcyjnych specyficznych dla linii komórkowej i może być używane do określania, w jaki sposób programy te wspierają lub tłumią infekcję wirusową18,19. Pierwszy opis scRNAseq został opublikowany w 2009 roku i został wykorzystany do oceny profili transkrypcyjnych różnych komórek znalezionych w mysim blastomerze20. Technologie te zostały obecnie rozszerzone i mogą być wdrażane za pośrednictwem kilku różnych platform. Wczesne wersje tej technologii wykorzystywały aktywowany fluorescencją sorter komórek (FACS) do oddzielania pojedynczych komórek do sekwencjonowania, które często ograniczało się do 96- lub 384-dołkowych płytek, dając w ten sposób 300 pojedynczych komórek do analizy na próbkę21. Metody te zostały obecnie udoskonalone przez platformy sekwencjonowania pojedynczych komórek, które wykorzystują urządzenie mikroprzepływowe do hermetyzacji pojedynczych komórek w pojedyncze kropelki z kodem kreskowym zawierającym kulki. Technologia ta pozwala na pobranie do 10 000 komórek w każdym warunku próbki.

Połączenie technologii organoidów z scRNAseq pozwala nam badać, jak patogeny jelitowe wpływają na przewód pokarmowy w sposób specyficzny dla typu komórki. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kwestii technicznych i związanych z bezpieczeństwem biologicznym. Przede wszystkim klasyczne metody hodowli organoidów (organoidy trójwymiarowe (3D), osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)) eksponują podstawno-boczną stronę komórek nabłonka na zewnątrz organoidu. Ponieważ patogeny jelitowe inicjują infekcję poprzez spożycie skażonej żywności/wody, infekcja najczęściej rozpoczyna się od wierzchołkowej strony komórek, która nie jest dostępna w tych organoidach jelitowych 3D. W związku z tym organoidy muszą być przygotowane tak, aby strona wierzchołkowa była dostępna dla infekcji patogenem albo poprzez wysiew 2D, bezpośrednio odsłaniając wierzchołkową stronę komórek, albo poprzez mikroiniekcję22,23. Po drugie, aby przeprowadzić sekwencję scRNAseq zakażonych próbek biologicznych, ważne jest, aby wziąć pod uwagę ich zakaźny charakter. Chociaż zaproponowano metody naprawy komórek i inaktywacji patogenów przed izolacją pojedynczej komórki w celu późniejszego sekwencjonowania RNAseq, metody te często prowadzą do spadku jakości sekwencjonowania18. Poniższy protokół opisuje kilka podejść do infekowania organoidów jelitowych wirusami jelitowymi, biorąc pod uwagę stronę infekcji (infekcja wierzchołkowa vs. podstawno-boczna) (Rysunek 1). Dodatkowo, protokół będzie zawierał przepływ pracy w celu dysocjacji i izolacji pojedynczych komórek z organoidów zakażonych wysoce zjadliwymi wirusami dla scRNAseq. Protokół podkreśli kluczowe kroki, które należy wdrożyć podczas pracy w warunkach hermetyczności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), aby uniknąć generowania aerozoli i potencjalnego skażenia.

Protokół

Tkanka ludzka została pobrana z resekcji jelita grubego lub biopsji jelita krętego ze Szpitala Uniwersyteckiego w Heidelbergu zgodnie z następującym protokołem. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Szpitala Uniwersyteckiego w Heidelbergu za świadomą pisemną zgodą wszystkich uczestników zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszystkie próbki zostały otrzymane i przechowywane w sposób zanonimizowany. Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Heidelbergu na podstawie protokołu S-443/2017.

1. Utrzymanie i pasażowanie organoidów jelitowych i okrężnicy

UWAGA: Organoidy jelitowe ludzkie pochodzą z tkanek ludzkich lub z indukowanych pluripotencjalnych/embrionalnych komórek macierzystych, dlatego wymagana jest etyczna zgoda. Należy przestrzegać przepisów obowiązujących w danym kraju. Materiał ludzki na ogół nie jest badany i dlatego często jest uważany za materiał BSL-2. W kraju, w którym odbywa się eksperyment, muszą zostać potwierdzone odpowiednie warunki zamknięcia.

  1. Przygotuj organoidy jelit grubych i jelita grubego z izolowanych tkanek i/lub biopsji przy użyciu wcześniej opisanych metod2. Ponadto więcej szczegółów technicznych na temat przygotowania organoidów z materiału pochodzącego od pacjenta lub z iPSC można znaleźć w Lees et al. i Mahe et al.24,25.
  2. Po ustaleniu kultur organoidów należy postępować zgodnie z opisaną poniżej procedurą dzielenia, aby przygotować organoidy do przeprowadzania infekcji patogenami jelitowymi.
  3. Wysiewaj 20-100 organoidów w 50 μl 100% roztworu ECM na 24-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur nietkankowych. Dodać 500 μl pożywki wzrostowej (tabela 1) do dołka.
  4. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, usuwając 250 μl starej pożywki i dodając 250 μl świeżej pożywki do każdej studzienki. Podgrzej nośnik do temperatury pokojowej przed wymianą nośnika.
    UWAGA: Zimne podłoże spowoduje upłynnienie roztworu ECM zawierającego organoidy.
  5. Organoidy należy przepuszczać raz w tygodniu, gdy wnętrze zaczyna ciemnieć z powodu nagromadzenia martwych komórek. Przykład tego można znaleźć w Rysunek 2.
  6. W dniu rozłupywania usunąć roztwór ECM z temperatury -20 °C i rozmrozić na lodzie.
  7. Umieścić nową, pustą płytkę do hodowli komórkowej, która zostanie użyta do wysiewu organoidów po rozszczepieniu, w temperaturze 37 °C (wymaga to co najmniej 1 godziny, aby się rozgrzała i może być ogrzewana przez noc). Podgrzej pożywkę hodowlaną do temperatury pokojowej.
  8. Usunąć pożywkę wzrostową za pomocą pipety P1000 i dodać 500 μl zimnej 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do każdej studzienki na 3 minuty, aby częściowo upłynnić roztwór ECM i oddzielić od płytki.
  9. Aby zapewnić pełne zakłócenie działania roztworu ECM, należy użyć pipety P1000 (ustawionej na 450 μl). Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby ponownie zawiesić PBS, roztwór ECM i organoidy, przenieść zawieszone organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieścić je na lodzie.
  10. Zbierz wiele studzienek tych samych organoidów do tej samej stożkowej probówki.
  11. Jeśli wiele różnych organoidów (różni dawcy, różne sekcje, różna obróbka wstępna itp.) zostanie podzielonych w tym samym czasie, należy je zebrać do różnych stożkowych probówek. Podczas zbierania utrzymuj stożkowe rurki na lodzie.
  12. Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyjąć PBS za pomocą pipety, aby utrzymać osad organoidowy na dnie.
  13. Unikaj używania próżniowego systemu odpływowego z dopasowaną pipetą, ponieważ osad organoidów jest bardzo luźny i może być łatwo zaessany podczas zbyt szybkiego wyjmowania PBS.
  14. Dodać 1 ml 0,05% trypsyny do stożkowej probówki i ponownie zawiesić organoidy, pipetując w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety P1000. Inkubować stożkową probówkę zawierającą organoidy w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
  15. Dodać 2 ml pożywki DMEM/F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny, aby zatrzymać trawienie i ponownie zawiesić, aby zakłócić działanie organoidów, pipetując w górę iw dół 10 razy za pomocą pipety P1000.
  16. Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyjąć stożkowe probówki z wirówki i przechowywać je na lodzie.
  17. Ostrożnie usuń pożywkę/trypsynę za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 5 ml, aby utrzymać osad organoidowy na dnie. Pozostaw około 500 μl pożywki i usuń ją za pomocą pipety P1000.
  18. Po usunięciu pożywki/trypsyny ze wszystkich stożkowych probówek, wyjąć z inkubatora o temperaturze 37 °C 24-dołkową płytkę poddaną działaniu hodowli niekomórkowej i umieścić ją pod okapem do hodowli komórkowej.
  19. Dodać 100% roztwór ECM (utrzymywany na lodzie) do stożkowej probówki z podzielonymi organoidami w stosunku 1:3 do 1:5, w zależności od nawyków wzrostu poszczególnych organoidów dawcy. (Na przykład, jeśli jedna studzienka zawierająca 20-100 organoidów w kropli 50 μl roztworu ECM została przepasana, ponownie zawiesić osad organoidowy w 150-250 μl lodowatego roztworu ECM).
  20. Wysiew: 50 μl roztworu ECM/mieszaniny organoidów na basenik 24-dołkowej płytki poddanej działaniu hodowli niekomórkowej, podgrzanej wstępnie do temperatury 37 °C.
    UWAGA: Roztwór ECM polimeryzuje bardzo szybko po ogrzaniu. Podczas użytkowania roztwór ECM należy zawsze przechowywać w chłodnym miejscu (przechowywanym na lodzie). Po ponownym zawieszeniu organoidów należy natychmiast wysiać nasiona na nową płytkę. Dla początkujących zaleca się przechowywanie pudełka z końcówkami do pipet w temperaturze -20 °C, aby zapewnić dodatkowy czas na wysiew.
  21. Inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut, aby umożliwić polimeryzację roztworu ECM.
  22. Po polimeryzacji dodać 500 μl pożywki wzrostowej (Tabela 1)26 do każdego dołka i inkubować organoidy w temperaturze 37 °C. Codziennie sprawdzaj organoidy pod mikroskopem. Zmieniaj nośnik co 2 dni, jak w kroku 1.4.

2. Przygotowanie organoidów w dwóch wymiarach (2D) do infekcji wierzchołkowej

UWAGA: Poniższy protokół opisuje, jak zasiać organoidy jelitowe jako monowarstwę komórek na płytce do hodowli komórkowej, aby infekować komórki nabłonka jelitowego od ich wierzchołkowej strony. Użyj 48-dołkowej płytki do eksperymentów sekwencjonowania i 8-dołkowej komory ze szklanym dnem do kontrolowania infekcji przy użyciu metod immunofluorescencyjnych.

  1. Hodować i utrzymywać organoidy zgodnie z opisem w sekcji 1.
  2. Przed wysiewem organoidów w 2D należy pokryć 48-dołkowe płytki i 8-dołkowe szkiełko komorowe 200 μl 2,5% ludzkiego kolagenu w wodzie na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Organoidy jelitowe najlepiej wysiewać na płytkach 48-dołkowych i w 8-dołkowym szkiełku podstawowym ze szklanym dnem. Doświadczenie pokazuje, że nie infekują one dobrze w płytkach 96-dołkowych. Wkładki Transwell mogą być również stosowane w celu umożliwienia infekcji zarówno wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej w 2D. Jeśli stosowane są transwelle, należy monitorować przeznabłonkową oporność elektryczną (TEER) przed zakażeniem, aby potwierdzić zlewającą się monowarstwę. Zwykle organoidy jelitowe mają szczelną barierę o TEER 450-600 Ohm/cm2.
  3. Wysiać 100-150 organoidów w każdym dołku na 48-dołkowej płytce lub w jednym dołku na 8-dołkowym szkiełku podstawowym ze szklanym dnem.
  4. Aby oszacować liczbę organoidów, należy policzyć liczbę organoidów obecnych w kropli 50 μl roztworu ECM na płytce 24-dołkowej przygotowanej w sekcji 1. Średnio potrzebne są 1-2 dołki, co da około 15 000-30 000 komórek.
  5. Aby zakłócić działanie roztworu ECM i trypsynizować organoidy, wykonaj kroki 1.8-1.17.
  6. Usuń ludzki kolagen z 48-dołkowych płytek i 8-dołkowego szkiełka z dnem
    7. .
  7. Zawiesić osad organoidowy w stożkowej probówce w 250 μl pożywki/studzienki wzrostowej i dodać mieszaninę do studzienek pokrytych kolagenem. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Podczas przeprowadzania eksperymentów porównuje się wiele stanów (pozorowane vs. zakażone +/- leczenie będące przedmiotem zainteresowania). Aby zminimalizować zmienność między każdym dołkiem organoidów z nasionami 2D, zbierz całkowitą liczbę niezbędnych organoidów w tej samej stożkowej probówce. Do zebrania organoidów z maksymalnie 12 dołków na 24-dołkowej płytce można użyć 1 ml trypsyny i 2 ml pożywki neutralizującej. W przypadku stosowania 12-24 dołków należy zwiększyć tę ilość do 2 ml trypsyny i 4 ml pożywki neutralizującej.
  8. Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w kapturze do hodowli komórkowych. Usunąć pożywkę wzrostową i zastąpić ją 250 μl na studzienkę pożywki różnicującej (Tabela 1). Powtórz tę zmianę nośnika 48 godzin później.
  9. Po 48 godzinach potwierdź różnicowanie (cztery dni po przełączeniu na pożywkę różnicującą) poprzez ekstrakcję RNA, wytworzenie cDNA z 250 ng RNA i wykonanie zielonego qPCR na bazie SYBR przy użyciu starterów dla komórek macierzystych (OLFM4 i / lub SMOC2), komórek kubkowych (MUC2), komórek enteroendokrynnych (CHGA) i enterocytów (SI i/lub CYP3A4) (Ryc. 3).
    UWAGA: Po przełączeniu z pożywki wzrostowej na pożywkę różnicującą, organoidy zmniejszą ekspresję markerów komórek macierzystych (OLFM4 i/lub SMOC2) i zwiększą ekspresję komórek kubkowych (MUC2), komórek enteroendokrynnych (CHGA) i markerów enterocytów (SI i/lub CYP3A4) metodą qPCR. Przygotuj dodatkową studzienkę i utrzymuj z pożywką wzrostową, aby porównać poziom ekspresji każdego markera specyficznego dla typu komórki w pożywce wzrostu i pożywki różnicującej.
  10. Po potwierdzeniu różnicowania organoidy są gotowe do infekcji wierzchołkowej. Przenieść organoidy do poziomu bezpieczeństwa biologicznego wymaganego dla wybranego czynnika chorobotwórczego.
    UWAGA: Zapoznaj się z lokalnymi przepisami i standardowymi procedurami operacyjnymi instytutu podczas obchodzenia się z patogenami w ramach BSL-2 lub BSL-3.
  11. Aby zainfekować organoidy jelitowe wyhodowane w 2D od ich wierzchołkowej strony, należy usunąć pożywkę za pomocą pipety P1000 i dodać patogen rozcieńczony przy wielokrotności infekcji wymaganej w doświadczeniu w pożywkach różnicujących (minimalna objętość mieszaniny patogen/pożywka wynosi 50 μl na studzienkę, a maksymalna objętość to 250 μl na studzienkę).
  12. Pozostawić infekcję do postępu przez 2 godziny w temperaturze 37 °C za pomocą stołu wahadłowego umieszczonego w inkubatorze do hodowli komórkowych lub ręcznie kołysząc płytką co 15-20 minut. Zoptymalizuj ten czas w oparciu o wybrany patogen.
  13. Po 2 godzinach usunąć pożywkę za pomocą pipety P1000 i zastąpić ją 250 μl na studzienkę świeżej pożywki różnicującej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C do momentu sekwencjonowania pojedynczych komórek.
  14. Aby przygotować komórki do sekwencjonowania pojedynczych komórek, przejdź do sekcji 4.

3. Przygotowanie organoidów w trzech wymiarach (3D) do infekcji wierzchołkowej i podstawno-bocznej

  1. Hodować organoidy zgodnie z opisem w sekcji 1 na 24-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli komórkowej.
  2. Dwa dni po pasażowaniu wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić w kapturze do hodowli komórkowych.
  3. Usunąć pożywkę wzrostową za pomocą pipety P1000, zastąpić ją 500 μl/studzienkę pożywki różnicującej podgrzanej do temperatury pokojowej i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  4. Po 48 godzinach zastąpić nową pożywką różnicującą (500 μl/basenik).
    UWAGA: Organoidy są utrzymywane w pożywkach różnicujących łącznie przez 4 dni przed zakażeniem.
  5. Potwierdź różnicowanie zgodnie z opisem w kroku 2.9.
  6. Po potwierdzeniu, że nastąpiło różnicowanie, organoidy są gotowe do infekcji.
  7. Rozmrozić ECM na lodzie. Podgrzać pożywkę różnicującą do temperatury pokojowej i ogrzać 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C.
  8. W celu przeprowadzenia infekcji należy usunąć organoidy z roztworu ECM.
    UWAGA: Usuń jak najwięcej roztworu ECM, ponieważ wirusy wolą trzymać się roztworu ECM niż komórek. Jeśli wokół organoidów pozostanie zbyt dużo roztworu ECM, zakaźność będzie poważnie zagrożona.
  9. Zakłócić działanie ECM, dodając 500 μl zimnego 1x PBS i inkubując przez 3 minuty. Użyj P1000 do pipetowania w górę i w dół 10x. Połącz organoidy w probówce i odwiruj przy 500 x g przez 5 min. Usuń PBS za pomocą P1000.
    UWAGA: Aby zminimalizować zmienność między każdym stanem infekcji, połącz organoidy pochodzące z kilku dołków 24-dołkowej płytki do tej samej stożkowej probówki. Na przykład, jeśli wymaganych jest osiem warunków infekcji, osiem studzienek z 24-dołkowej płytki (zawierającej ~100 organoidów każdy) zostanie połączonych, a następnie podzielonych na osiem dołków nowej 24-dołkowej płytki po przerwaniu igły (patrz krok 3.12).
  10. Zawiesić organoidy w 1 ml pożywki różnicującej. W przypadku infekcji wierzchołkowej i podstawno-bocznej należy postępować zgodnie z krokiem 3.10.1, a w przypadku infekcji podstawno-bocznej tylko krok 3.10.2.
    1. Przymocować igłę 27 G do strzykawki o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad sześć razy, aby umożliwić przerwanie organoidów i wystąpienie infekcji zarówno po stronie wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej. Przejdź do kroku 3.11.
      UWAGA: Organoidy powinny być klasycznymi organoidami wyglądającymi jak cysty i pączkami ośmiornicy z ciemnym środkiem, gdy obserwuje się je przed rozbiciem igły. Po rozerwaniu organoidy te będą wydawały się mniejsze, z mniejszym lub zerowym ciemnym wnętrzem. Podczas wykonywania infekcji zawsze będą występować co najmniej dwa warunki (pozorowanie i infekcja), co najmniej dwie studzienki z 24-dołkowej płytki zostaną początkowo połączone w stożkową probówkę o pojemności 15 ml w celu przerwania za pomocą igły (co wyjaśnia, dlaczego do ponownego wytworzenia używa się co najmniej 1 ml). Wykonując więcej niż dwa warunki, połącz do 10 dołków 24-dołkowej płytki w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i ponownie zawieś w 1 ml pożywki różnicującej w celu rozerwania igły. Po przerwaniu dodaj 500 μl pożywki różnicującej na n + 1 (na przykład, jeśli używasz 10 studzienek, uzupełnij 4,5 ml, aby uzyskać łącznie 5,5 ml). Jeśli potrzebnych jest więcej niż 10 warunków, użyj kilku stożkowych rurek. Zalecana jest strzykawka o pojemności 1 ml, ponieważ przy tej objętości strzykawki organoidy są lepiej zakłócane. Alternatywą dla strzykawki jest zastosowanie dobrze spłaszczonej końcówki P1000.
    2. Zawiesić organoidy w 500 μl pożywki różnicującej na studzienkę. Uważaj, aby nie zakłócić działania organoidów i upewnij się, że strona wierzchołkowa nie jest dostępna. Przejdź do kroku 3.11.
  11. Przenieść 500 μl zawiesin organoidów na studzienkę do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą pipety P1000 i przenieść płytkę do poziomu bezpieczeństwa biologicznego wymaganego dla wybranego patogenu.
    UWAGA: Zapoznaj się z lokalnymi przepisami i standardowymi procedurami operacyjnymi instytutu podczas obchodzenia się z patogenami objętymi zabezpieczeniem BSL-2 lub BSL-3. Zawsze wykonuj przerywanie igły organoidów poza BSL-3, aby uniknąć potencjalnych wypadków z igłą. Lokalne przepisy mogą również uniemożliwiać używanie igieł w BSL-3.
  12. Dodać patogen rozcieńczony w pożywce różnicującej, aby osiągnąć różnorodność infekcji wymaganą w eksperymencie. Nie należy przekraczać całkowitej objętości 500 μl (aby w płytce 24-dołkowej znajdował się łącznie 1 ml).
  13. Pozostawić infekcję do postępu przez 2 godziny (czas ten będzie musiał być dostosowany do wybranego patogenu) w temperaturze 37 °C za pomocą stołu wahadłowego umieszczonego w inkubatorze do hodowli komórkowych lub poprzez ręczne kołysanie płytki co 15–20 minut.
  14. Po 2 godzinach inkubacji zebrać organoidy do jednej probówki o pojemności 1,5 ml na warunek i wirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Usuń pożywkę zawierającą patogen za pomocą pipety P1000 i przechowuj ją na lodzie. Umyj osad organoidów raz za pomocą PBS.
  16. Ponownie zawiesić organoidy w 50 μl 100% roztworu ECM (który został wcześniej rozmrożony na lodzie), rozłożyć na 24-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli niekomórkowej, podgrzanej wstępnie do 37 °C i inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut, aby umożliwić polimeryzację roztworu ECM.
  17. Po polimeryzacji dodać 500 μl pożywki różnicującej w temperaturze pokojowej do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C aż do zbioru w celu sekwencjonowania pojedynczych komórek.
    UWAGA: Jeśli zbiór musi nastąpić później niż 48 godzin po wysiewie, należy zmieniać pożywkę co 2 dni, usuwając stare podłoża i zastępując je 500 μl świeżych pożywek różnicujących. Doświadczenie wykazało jednak, że ponieważ organoidy są hodowane na podłożach różnicujących, nie przetrwają znacznie dłużej niż 48 godzin.

4. Przygotowanie roztworu jednokomórkowego i przygotowanie żelowych kulek w emulsji (GEMs) w warunkach 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

UWAGA: Wykonanie następujących kroków wymaga, aby sprzęt do sekwencjonowania pojedynczych komórek (Tabela materiałów) i maszyna do PCR zdolna do obsługi 100 μL reakcji były obecne w obiekcie BSL-3. Organoidy są hodowane zgodnie z opisem w sekcji 1 i zakażone zgodnie z opisem w sekcjach 2-3, w zależności od patogenu i drogi wniknięcia. We wcześniej określonym czasie po infekcji zbiera się organoidy. Poniżej opisano metodę stosowaną do zbierania organoidów jelitowych.

  1. Przed pobraniem zakażonych organoidów należy usunąć kulki żelu jednokomórkowego (tabela materiałów) z temperatury -80 °C i ogrzać do temperatury pokojowej (co najmniej 30 minut wcześniej).
  2. Dodatkowo należy zrównoważyć odczynnik RT, środek redukujący B i enzym RT C (wszystkie przechowywane w temperaturze -20 °C) do temperatury pokojowej. Zawieś ponownie przełącznik szablonu oligo zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
    UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy wykonać z poszanowaniem lokalnych przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego, postępując zgodnie z ustaloną standardową procedurą operacyjną dla rozważanego patogenu. Z reguły w przypadku pracy BSL-3 należy upewnić się, że zewnętrzna strona wszystkich naczyń (płytek, probówek itp.) wychodzących z okapu do hodowli komórkowej jest odpowiednio zdezynfekowana. To samo dotyczy rąk/rękawic osoby przeprowadzającej eksperymenty.
  3. Aby przeprowadzić infekcje na organoidach wysianych w 2D (sekcja 2), przejdź do kroku 4.4. Aby przeprowadzić infekcje na organoidach 3D (sekcja 3), przejdź do sekcji 4.5.
  4. W przypadku zakażeń organoidami 2D należy umieścić płytkę do hodowli komórkowej w kapturze i usunąć pożywkę różnicującą za pomocą pipety P1000.
    1. Dodaj 250 μl 1x PBS w temperaturze pokojowej do każdej studzienki.
    2. Usunąć PBS za pomocą pipety P1000 i dodać 250 μl enzymu dysocjującego w temperaturze pokojowej (np. TrypLE Express) do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Zmienić rękawiczki, oczyścić płytkę i umieścić płytkę z enzymem dysocjacyjnym w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Obserwuj dysocjację komórek pod mikroskopem co 5 minut
      UWAGA: W przybliżeniu dysocjacja organoidów jelitowych hodowanych w 2D na pojedyncze komórki zajmuje 15 minut. Czas ten będzie musiał zostać dostosowany, ponieważ będzie zależał od tego, ile organoidów zostało początkowo wysianych i zakażonych, a także od patogenu, ponieważ niektóre patogeny są bardziej cytopatyczne i powodują dysocjację organoidów znacznie szybciej niż inne.
    4. Po potwierdzeniu pozornej zawiesiny pojedynczej komórki, należy umieścić płytkę z powrotem w okapie do hodowli komórkowej i zatrzymać trawienie, dodając 250 μl pożywki DMEM/F12 zawierającej 10% FBS na dołek z płytki 48-dołkowej.
    5. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000.
    6. Zmienić rękawiczki, oczyścić probówkę i wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Ostrożnie usuń pożywkę/enzym dysocjacyjny za pomocą P1000, aby utrzymać osad komórkowy na dole. Ponownie zawiesić pojedyncze komórki w minimalnej objętości PBS zawierającej 0,1% BSA. W przypadku organoidów jelitowych zawiesić ponownie w 250 μl na każdy studzienek płytki 48-dołkowej.
    8. Przełóż zawiesiny komórek do probówki FACS z filtrem w celu usunięcia wszelkich dużych grudek i umieść probówkę FACS zawierającą komórki na lodzie.
    9. Przejdź do kroku 4.6, aby kontynuować liczenie komórek i przygotowanie mieszanki wzorcowej.
  5. W przypadku zakażeń organoidami 3D należy wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w kapturze do hodowli komórkowej.
    1. Usunąć pożywkę różnicującą z każdego dołka płytki 24-dołkowej za pomocą pipety P1000. Dodaj 500 μl lodowatego 1x PBS do każdej studzienki i inkubuj przez 3 minuty na lodzie.
    2. Aby zapewnić całkowite zakłócenie roztworu ECM, należy użyć pipety P1000 (ustawionej na 450 μl). Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby ponownie zawiesić PBS, roztwór ECM i organoidy; przenieść zawieszone organoidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i umieścić na lodzie. Zbierz każdy stan infekcji we własnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Użycie stożkowej probówki o pojemności 15 ml daje lepsze, bardziej wyraźne osadki komórkowe niż probówka stożkowa o pojemności 50 ml lub probówka o pojemności 1,5 ml.
    3. Zmień rękawiczki i wyjmij probówkę z kaptura do hodowli komórkowych. Oczyść zewnętrzną część rury.
    4. Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieś probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowej i usuń PBS za pomocą pipety P1000, aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu organoidów z dna probówki.
    6. Zawiesić osad w 1 ml enzymu dysocjującego (np. TrypLE Express). Zmienić rękawice, oczyścić probówkę i inkubować próbki w temperaturze 37 °C.
    7. Co 10 minut przez 30 minut przesuwać probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowych i ponownie zawiesić organoidy, pipetując w górę iw dół pipetą P1000 10 razy.
      UWAGA: Zwykle organoidy jelitowe potrzebują około 30 minut, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki po zakażeniu w 3D.
    8. Aby określić, kiedy organoidy są dysocjowane na pojedyncze komórki, należy pobrać 10 μl zawiesiny organoidów za pomocą pipety p10.
    9. Umieścić zawiesinę w jednorazowym szkiełku z licznikiem komórek z tworzywa sztucznego. Uszczelnij port wejściowy próbki przezroczystą taśmą.
    10. Zmień rękawiczki i wyczyść zewnętrzną część lady komórki. Użyj mikroskopu jasnego pola, aby określić, czy powstaje zawiesina pojedynczej komórki.
    11. Po potwierdzeniu zawiesiny pojedynczej komórki należy zatrzymać trawienie, dodając 1 ml pożywki DMEM/F12 zawierającej 10% FBS i pipetować w górę i w dół 10 razy pipetą P1000.
    12. Zmienić rękawiczki, oczyścić probówkę i wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Ostrożnie usuń pożywkę/enzym dysocjacyjny za pomocą pipety P1000, aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu komórkowego z dna probówki.
    14. Ponownie zawiesić pojedyncze komórki w minimalnej objętości PBS zawierającej 0,1% BSA. W przypadku organoidów jelitowych zawiesić w 250 μl.
    15. Przełóż zawiesiny komórek do probówki FACS z filtrem w celu usunięcia wszelkich dużych grudek i umieść probówkę FACS zawierającą komórki na lodzie.
    16. Przejdź do kroku 4.6, aby kontynuować liczenie komórek i przygotowanie mieszanki wzorcowej.
  6. Określić liczbę komórek na μl, dodając 10 μl zawiesiny komórek do jednorazowej plastikowej komory do liczenia komórek.
  7. Przed wyjęciem próbki z kaptura hodowli komórkowej należy uszczelnić port wejściowy próbki przezroczystą taśmą, ponieważ na tym etapie zawiesina komórek jest nadal zakaźna.
  8. Zmień rękawiczki, wyczyść komorę zliczania komórek i policz liczbę komórek za pomocą mikroskopu jasnego pola.
  9. Wewnątrz kaptura do hodowli komórkowych przygotuj główną mieszankę odczynnika RT, oligo przełącznika matrycy, środka redukującego B i enzymu RT C w probówce o pojemności 1,5 ml zgodnie z instrukcjami producenta, w zależności od liczby próbek w eksperymencie. Dla każdej próbki należy podsycić 33,4 μl roztworu wzorcowego w probówce do PCR i przechowywać na lodzie.
  10. Dodaj komórki i wodę do mieszanki wzorcowej zgodnie z numerem komórki docelowej, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta.
    UWAGA: 50%-60% komórek jest zwykle odzyskiwanych (tj. podczas ładowania 10 000 komórek na chip, do analizy używa się 5 000-6 000 komórek). Dlatego zawsze ładuj 10 000 komórek. Jeśli gęstość komórek na to nie pozwala, odwiruj komórki i ponownie zawieś w mniejszej objętości. Uważaj, aby nie przeciążyć chipa, ponieważ spowoduje to jego zatkanie. Dodatkowo, jeśli komórki nie zostaną prawidłowo zdysocjowane, wzrośnie ryzyko uzyskania wielu komórek na kulkę, która będzie musiała zostać usunięta w dalszym przetwarzaniu bioinformatycznym.
  11. Zmień rękawice, przenieś kontroler jednokomórkowy do kaptura hodowli komórkowej i przygotuj chip, ponieważ chip jest pokryty tylko uszczelką, która nie jest uszczelniona.
    UWAGA: Maszyna musi znajdować się wewnątrz maski, aby zapobiec narażeniu na zainfekowane zawiesiny komórek i potencjalne aerozole.
  12. Dodaj jednokomórkowy chip do uchwytu na wióry i wypełnij nieużywane pasy 50% glicerolu.
  13. Dodaj mieszankę główną, kulki i olej do rozdzielania do pasów używanych do próbek zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. Przykryj chip uszczelką, załaduj chip do sterownika i uruchom program.
    UWAGA: Zaleca się załadowanie tylko sześciu z ośmiu pasów ruchu. Problemy z niewłaściwymi emulsjami często występują na pierwszym i ósmym pasie. Firma twierdzi, że wszystkie pasy ruchu są niezależne i nie powinno to mieć miejsca; Jeśli jednak to możliwe, omijaj te dwa pasy i uruchom dwa wióry, jeśli potrzebnych jest osiem próbek.
  15. Po zakończeniu programu usuń chip i uszczelkę.
  16. Użyj pipety wielokanałowej i przenieś 100 μl emulsji do czystej probówki PCR. Upewnij się, że każda studzienka ma jednolity biały kolor, co wskazuje, że wystąpiła pełna emulsja.
  17. Zmień rękawiczki, wyczyść probówki i przenieś probówkę do PCR do maszyny do PCR, która może obsługiwać reakcje 100 μl. Uruchom program: 53 °C przez 45 min; 85 °C przez 5 min.
  18. Po zakończeniu przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. W tym momencie przetworzyć reakcję zgodnie z instrukcjami producenta lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3 dni lub -20 °C przez 1 tydzień.
  19. Po 5 minutach w temperaturze 85 °C większość wirusów otoczkowych zostanie zdezaktywowana, należy usunąć cDNA z BSL-3 zgodnie z normalną procedurą operacyjną i przeprowadzić przygotowania biblioteczne w laboratorium BSL-1.
    UWAGA: Ten eksperyment musi być przeprowadzony jako trzy powtórzenia biologiczne (np. w trzech różnych dniach), ponieważ zakres zróżnicowania każdego typu komórki może się nieznacznie różnić między każdym eksperymentem. Wynikowe biblioteki sekwencjonowania mogą być różnie indeksowane i sekwencjonowane razem w jednym przebiegu sekwencjonowania.

Wyniki

Przygotowanie organoidów do sekwencjonowania pojedynczych komórek
Wyniki sekwencjonowania pojedynczych komórek są w wysokim stopniu zależne od zastosowania komórek dobrej jakości. Aby zapewnić wysoką jakość organoidów, należy je odpowiednio prowadzić i codziennie obserwować, aby określić moment, w którym są gotowe do pasażowania (Rysunek 2). Moment pasażowania organoidów zależy od dawcy; u niektórych dawców rosną one szybciej i wymagają pasażowania co 5 dni, podczas gdy inne rosną wolniej i wymagają pasażowania co 10 dni. Średnio organoidy pasażuje się raz w tygodniu, gdy ich centra stają się ciemne (Rysunek 2B). Jeśli organoidy urosną zbyt duże i w ich centrum nagromadzi się zbyt wiele martwych komórek, organoid obumrze.

Organoidy utrzymuje się w pożywce zawierającej wysoką ilość Wnt3A. Wspiera to niszę komórek macierzystych i stymuluje organoidy do dalszego wzrostu oraz proliferacji. W takich warunkach wzrostu organoidy zawierają dużą liczbę komórek macierzystych i komórek tranzycyjnie amplifikujących oraz mniejszą liczbę zróżnicowanych populacji komórek, takich jak dojrzałe enterocyty, komórki kubkowe i komórki enteroendokrynne. Jednak aby naśladować złożoność komórkową występującą w jelicie człowieka, istotne jest pobudzenie różnicowania komórek i zwiększenie produkcji tych typów komórek. Osiąga się to poprzez zmianę warunków pożywki, usunięcie Wnt3A oraz zmniejszenie ilości R-Spondiny i Noggina (Tabela 1). Zazwyczaj różnicowanie komórkowe w kierunku enterocytów, komórek kubkowych i komórek enteroendokrynnych wymaga 4 dni inkubacji w pożywce do różnicowania (Rysunek 3). Uzyskanie prawidłowego różnicowania jest kluczowe; w przeciwnym razie ocena tropizmu patogenów i odpowiedzi specyficznych dla danego typu komórek stanie się utrudniona.

Potwierdzenie inaktywacji patogenu BSL-3
Pełną inaktywację należy potwierdzić dla wybranego patogenu i zwalidować, że usunięcie cDNA z laboratorium BSL-3 jest bezpieczne. W przypadku SARS-CoV-2 pełną inaktywację wirusa zwalidowano, inkubując 100 μL SARS-CoV-2 w termocyklerze przez 5 min w temperaturze 85 °C. Następnie wirusa dodano do naiwnych komórek Vero, a infekcję wirusową porównano z wirusem niepoddanym obróbce termicznej za pomocą immunofluorescencji oraz testów plackowych po 24 h, 48 h i 72 h od infekcji, aby upewnić się, że wszystkie cząsteczki nie są już zakaźne. Wyniki te przekazano do lokalnego organu regulacyjnego, a po uzyskaniu jego zgody przeprowadzono eksperyment jednokomórkowy oraz przetwarzanie cDNA.

Wyniki sekwencjonowania pojedynczych komórek
Aby ocenić, w jaki sposób SARS-CoV-2 infekuje organoidy ludzkiego jelita grubego i jelita cienkiego, przeprowadzono sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Organoidy przygotowano zgodnie z powyższym opisem i zainfekowano w formacie 2D, aby umożliwić infekcję od strony apikalnej przez SARS-CoV-2. Zainfekowane komórki zebrano 12 h i 24 h po infekcji, a następnie poddano je procedurze sekwencjonowania pojedynczych komórek, zgodnie z powyższym opisem. Analiza danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek pozwoliła ustalić, że tylko subpopulacja (niedojrzałe enterocyty 2) ludzkich komórek nabłonka jelitowego sprzyjała infekcji SARS-CoV-2 (Rysunek 4). Ponadto, ponieważ nie wszystkie komórki w populacji zostały zainfekowane, przeanalizowano zarówno komórki zainfekowane, jak i niezainfekowane komórki sąsiednie (Rysunek 5). Wyniki te wykazały, że SARS-CoV-2 wywołał prozapalną kaskadę sygnałową w komórkach zainfekowanych, podczas gdy niezainfekowane komórki sąsiednie wykazywały odpowiedź immunologiczną zapśredniczoną przez interferon. Dodatkowo scRNA-Seq wykazało, że komórki zainfekowane nie były w stanie wykrywać interferonów z powodu blokady szlaku wywołanej przez wirusa (Rysunek 5). Nie było możliwości uzyskania tych informacji przy zastosowaniu sekwencjonowania bulk RNA.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający trzy różne metody przygotowania ludzkich organoidów jelitowych do zakażenia patogenami jelitowymi. Zakażenie apikalne można przeprowadzić poprzez wysiew organoidów jelitowych w 2D. Zakażenie apikalne i basolateralne można zrealizować poprzez rozbicie organoidu 3D. Wreszcie, zakażenie wyłącznie basolateralne można przeprowadzić poprzez zakażenie nienaruszonych organoidów jelitowych 3D. Każda z tych metod może być wykorzystana do generowania próbek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat utrzymania organoidów i reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym. (A) Schemat utrzymania i pasażowania ludzkich organoidów jelitowych. (B). Reprezentatywne obrazy w świetle przechodzącym z dni 1, 3, 5 i 7 po rozdzieleniu. Do 7 dnia organoidy stają się duże i ciemne z powodu gromadzenia się martwych komórek i są gotowe do rozdzielenia. Pasek skali wskazuje 25 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki qPCR ludzkich organoidów jelitowych 4 dni po przełączeniu na podłoże różnicujące. Organoidy jelitowe utrzymywano w podłożu wzrostowym lub przełączono na podłoże różnicujące na 4 dni. Wyizolowano RNA i przeprowadzono qPCR dla markerów komórek macierzystych (OLFM4), komórek Panetha (LYZ), komórek kubkowych (MUC2) oraz enterocytów (SI). N = 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Identyfikacja populacji komórek zainfekowanych SARS-CoV-2. Organoidy pochodzące z ludzkiego jelita grubego i jelita cienkiego (ileum) zostały zainfekowane wirusem SARS-CoV-2. Po 12 i 24 h od infekcji komórki pobrano i poddano sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek w celu zidentyfikowania populacji komórkowych wspierających infekcję SARS-CoV-2. Stwierdzono, że infekcja wirusowa narastała w czasie i dotyczyła głównie niedojrzałych enterocytów 2. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Triana i wsp.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Określenie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Organoidy pochodzące z ludzkiego jelita grubego zostały zainfekowane SARS-CoV-2. Po 12 i 24 h od infekcji komórki pobrano i poddano sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek w celu określenia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej zarówno w komórkach zainfekowanych wirusem, jak i w niezinfekowanych komórkach sąsiednich. Komórki zainfekowane SARS-CoV-2 wykazały silną odpowiedź prozapalną, podczas gdy niezinfekowane komórki sąsiednie wykazały odpowiedź zależną od interferonów. Rysunek zmodyfikowany z Triana et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pożywka wzrostowa
SkładnikStężenie końcowe
Ad DMEM/F12GlutaMAX (1X)
+GlutaMAXHEPES 1 mM
+HEPESPen 10 U/mL
+P/SStrep 10 µg/mL
L-WRN50% objętościowo
B2701:50
N-acetylocysteina1 mM
EGF50 ng/mL
A83-01500 nM
IGF-1100 ng/mL
FGF basic50 ng/mL
Gastryna10 mM
Pożywka różnicująca
SkładnikStężenie końcowe
Ad DMEM/F12GlutaMAX (1x)
+GlutaMAXHEPES 1 mM
+HEPESPen 10 U/mL
+P/SStrep 10 µg/mL
B2701:50
N-acetylocysteina1 mM
R-spondina5% objętościowo
Noggin50 ng/mL
EGF50 ng/mL
Gastryna10 mM
A83-01500 nM

Tabela 1: Skład pożywek do wzrostu i różnicowania.

Dyskusja

Patogeny jelitowe najczęściej rozpoczynają swój cykl życiowy poprzez zakażenie komórek nabłonka jelitowego od strony wierzchołkowej skierowanej w stronę światła jelita. Chociaż organoidy są dobrze uznawane za dobry model do odtwarzania złożoności komórkowej i organizacji nabłonka jelitowego, ich organizacja jako trójwymiarowych, zamkniętych struktur sprawia, że ich błona wierzchołkowa jest niedostępna dla patogenu. W protokole tym opisano metody infekowania organoidów jelitowych od strony wierzchołkowej, podstawno-bocznej lub obu patogenami BLS-3. Protokoły te można łatwo dostosować do badania dowolnego patogenu jelitowego w ramach hermetyzacji BSL-2 lub BLS-3 lub dowolnego innego modelu organoidowego, wykonując kilka krytycznych kroków, które przedstawiono poniżej. Opisana powyżej metoda służy do izolacji i przygotowania kropelek jednokomórkowych zgodnie z przepisami obowiązującymi w Niemczech. Jako zastrzeżenie, protokół ten nie opisuje środków postępowania z bezpieczeństwem biologicznym (standardowe procedury operacyjne), które należy podjąć podczas pracy w warunkach BSL-3. Ważne jest również, aby nalegać, aby pamiętać, że przepisy mogą się różnić w innych krajach i że należy skontaktować się z lokalnymi władzami, aby upewnić się, że wszystkie lokalne przepisy są przestrzegane.

Jednym z kluczowych etapów sadzenia organoidów w dwóch wymiarach dla infekcji wierzchołkowej jest kontrolowanie, czy komórki będą się podobnie różnicować w porównaniu z tymi, gdy są hodowane jako klasyczne organoidy trójwymiarowe. W zależności od patogenu jelitowego, tropizm może być ograniczony do bardzo rzadkich komórek lub do komórek, które muszą być wysoce zróżnicowane. W tym przypadku użycie dwuwymiarowego organoidu, który nie jest w pełni zróżnicowany, może prowadzić do błędnego wniosku, że ten patogen jelitowy nie może infekować organoidów jelitowych. Sugeruje się, jeśli to możliwe, przeprowadzanie infekcji przy użyciu trzech konfiguracji tego protokołu: organoid 2D tylko do infekcji wierzchołkowej (sekcja 2), pęknięte otwarte organoidy 3D do infekcji wierzchołkowej i podstawno-bocznej (sekcja 3) oraz pełne organoidy 3D tylko do infekcji podstawno-bocznej (sekcja 3). Takie podejście pomoże dostrzec drogę wejścia patogenu (wierzchołkowa lub podstawno-boczna), a także będzie kontrolować, czy osiągnięto podobny poziom zróżnicowania. Alternatywą dla infekcji wierzchołkowej 2D jest mikroiniekcja, która wykorzystuje organoid 3D, ale dostarcza patogen bezpośrednio do strony wierzchołkowej (szczegóły w Bartfeld i wsp.27 ). Ta metoda wymaga wykwalifikowanego wstrzykiwacza, aby upewnić się, że patogen jest prawidłowo umieszczony, a organoidy pozostają nienaruszone. Mikroiniekcja jest powszechnie stosowana w hermetyzacji BSL-2 i może nie być odpowiednia do hermetyzacji BSL-3.

Dodatkową ważną kwestią podczas przeprowadzania eksperymentów z infekcją w organoidach zasiewanych 2D jest ostateczna gęstość komórek. Jak wspomniano w kroku 2.3, 100-150 organoidów zostanie wysianych w jednym dołku na 48-dołkowej płytce lub w jednym dołku 8-dołkowego szkiełka komorowego ze szklanym dnem. W zależności od linii organoidów i osoby zajmującej się organoidami, rozmiar tych organoidów może się znacznie różnić. Może to skutkować bardzo różną gęstością komórek w 48-dołkowej płytce lub 8-dołkowym szkiełku ze szklanym dnem. W zależności od wirusa jelitowego, niektóre wirusy preferują rzadsze komórki, podczas gdy inne będą również w stanie infekować zbiegające się komórki. Molekularne pochodzenie takich różnic w zakaźności dla różnych zbiegów komórek nie jest jasne; W związku z tym przed przeprowadzeniem dalszej charakterystyki należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe mające na celu znalezienie najlepszej gęstości komórek dla wybranego patogenu jelitowego.

Często sortowanie FACS przeprowadza się przed wykonaniem emulsji kropelkowej z jednej komórki. Ten krok jest często używany do oddzielania martwych komórek od żywych i pojedynczych komórek od dubletów. Podczas pracy z patogenami BSL-3 wymaga to wyposażenia obiektu w odpowiedni sorter FACS, co nie zdarza się często. Co więcej, nie wszystkie komórki w organoidzie mają ten sam rozmiar i często trudno jest odróżnić dublet od większej komórki, co powoduje ryzyko negatywnej selekcji przeciwko określonemu typowi komórki. Wciąż toczy się również dyskusja w tej dziedzinie, czy czas potrzebny na sortowanie między 5 000-10 000 dla każdej próbki może skutkować znaczącą modyfikacją profilu transkryptu poszczególnych komórek. Chociaż opisano metody utrwalania komórek zgodne z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek (np. metanol i RNAassist), zaobserwowano, że prowadzi to do obniżenia jakości sekwencjonowania18. Wreszcie, podejrzewa się, że sortowanie komórek za pomocą markerów śmierci komórki może również prowadzić do stronniczości. Biorąc pod uwagę kierunkową proliferację i różnicowanie komórek przez oś krypta-kosmki, najbardziej zróżnicowane komórki, które zostaną zrzucone i uwolnione, znajdują się na końcu kosmków. Komórki te są często dodatnie dla różnych markerów szlaków śmierci komórkowej (np. apoptozy, nekrozy i nekroptozy); Jednak patrząc na zakażenie rotawirusem jelita myszy, czubek kosmków jest najbardziej zainfekowanym obszarem28. Tak więc odfiltrowanie komórek, które mogą wyglądać na pozytywne pod kątem markerów śmierci, skutkowałoby negatywną selekcją zainfekowanych komórek, które mogą reprezentować infekcję fizjologiczną. Obecnie nie ma dobrego rozwiązania do sortowania i utrwalania organoidów przed sekwencjonowaniem pojedynczych komórek. Zaleca się stosowanie żywych, nieposortowanych komórek, ponieważ potrzebne są dalsze badania w celu znalezienia odpowiednich alternatywnych protokołów.

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek zrewolucjonizowało sposób oceny odpowiedzi komórkowych. Technika ta pozwala na identyfikację odpowiedzi specyficznych dla linii komórkowej zarówno w warunkach podstawowych, jak i w przypadku infekcji patogennych. Ta metoda otworzyła drzwi w wielu dziedzinach, które wcześniej były ograniczone przez odczyty masowe. Chociaż ta metoda jest bardzo potężna, ma swoje ograniczenia. Kluczowym ograniczeniem jest obszerna analiza bioinformatyczna, która jest wymagana po sekwencjonowaniu. Jest to szczególnie ważne podczas analizy tkanek i przypisywania typów komórek, w przypadku których obecnie nie ma adnotacji. Posiadanie wykwalifikowanego bioinformatyka jest wymagane do wspierania wszystkich badań nad pojedynczymi komórkami.

Protokół ten opisuje, jak wysiewać i obchodzić się z ludzkimi organoidami jelitowymi, infekować je patogenami jelitowymi i wykonywać sekwencję scRNAseq. Adaptacja tego podejścia do innych narządów jest obecnie możliwa, ponieważ dla większości narządów opracowano systemy modeli organoidów. Organoidy płuc i wątroby są podobnie zorganizowane w porównaniu z organoidami jelitowymi i jako takie, stosując analogiczne podejście, można je przetransponować do tych organoidów. Krytyczna kontrola będzie polegała na sprawdzeniu, czy po wyhodowaniu w dwóch wymiarach lub pęknięciu, organoidy te osiągają podobne zróżnicowanie, jak ich odpowiedniki organoidowe 3D. Specyficzne cechy i geny, które definiują zróżnicowany status, są specyficzne dla każdego modelu narządu. Inne modele organoidów, takie jak organoidy nerkowe i naczyniowe, duże gęste struktury, będą wymagały dodatkowych metod seryjnej dysocjacji tych struktur na pojedyncze komórki.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Megan Stanifer i Steeve Boulant byli wspierani przez granty badawcze z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Numer projektu 240245660, 278001972, 415089553 i 272983813 Steeve Boulant i 416072091 dla Megan Stanifer), kraju związkowego Badenia-Wirtembergia oraz Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B do MS i 01KI20198A oraz (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) do SB. Schematy zostały stworzone w BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Rekombinowana mysia nogginPeprotechCat#250-38
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichCat# G9145
0,05% Trypsin-EDTAThermo Fischer ScientificCat#25300054
24-dołkowa płytka niepoddana hodowli komórkowejCorningCat#3738
8-dołkowa szklana zjeżdżalnia z dolną komorąWózek iBIDI#80827
A83-01TocrisCat#2939
Advanced DMEM/F12Thermo Fischer Scientific Cat# 12634010
B27Thermo Fischer Scientific Cat#17504-044
Kontroler chromu i Następny GEM Accessory Kit10X GenomicsCat#1000202Stosowany do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania Gel beads-in-emulsion (GEM)
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit10X GenomicsCat #1000127Stosowany do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania Żel perełkowy w emulsji (GEM)
Chrom Next GEM Single Cell 3′ Zestaw v3.110X GenomicsCat#1000268Służy do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania żelu perełek w emulsji (GEM)
Kolagenu z ludzkiego łożyskaSigma AldrichCat#C5533-5MG
CYP34A forwardEurofinsGATGGCTCTCATCCCAGACTTStartery używane do sprawdzania różnicowania
CYP3A4 odwróconyEurofinsAGTCCATGTGAATGGGTTCCStartery używane do sprawdzania zróżnicowania
DMEM/F12Thermo Fischer ScientificCat#11320074
EDTASigma AldrichCar#E9884
Fast Read 102 szkiełki licząceBiosigmaCat# BVS100
Płodowa surowica Bovein Serum (FBS)KoziorożecKot#FBS-12A
GlutaMAXThermo Fischer ScientificCat# 35050061
Ogniwa HEPESThermo Fischer ScientificCat3 15630080
L-WRNATCCCRL-3276Ta linia komórkowa służy do wytwarzania kondycjonowanych pożywek zawierających Wnt 3A, R-Spondynę i Noggin. Protokół produkcji kondycjonowanych pożywek można znaleźć na stronie producenta.
MatriGel. GFR, LDEV freeCorningCat#354230
MUC-2 forwardEurofinsTGTAGGCATCCTCTTCTCAStartery używane do sprawdzania różnicowania
MUC-2 reverseEurofinsGACACCATCTACCTCACCCGStartery używane do sprawdzania różnicowania
N-acetylo-cysteinaSigma AldrichCat# A9165
OLMF4 forwardEurofinsACCTTTCCCGTGGACAGAGTStartery używane do sprawdzania różnicowania
OLMF4 reverseEurofinsTGGACATATTCCCTCACTTTGGAStartery używane do sprawdzania różnicowania
Penicylina/StreptomycynaThermo Fischer ScientificCat#15140122
Rekombinowany ludzki FGF basicPeprotechCat#100-18B
Rekombinowany ludzki IGF-1BioLegend Cat#590904
Rekombinowana mysz EGFThermo Fischer ScientificCat# PMG8043
SI forwardEurofinsAATCCTTTTGGCATCCAGATTStartery używane do sprawdzania różnicowania
SI reverseEurofinsGCAGCCAAGAATCCCAATStartery używane do sprawdzania różnicowania
TrypLE ExpressThermo Fischer ScientificCat#12605036
Y-27632Caymann ChemicalsCat#10005583

Bibliografia

  1. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
  5. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
  6. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
  7. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  9. de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
  10. Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).
  11. Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
  12. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
  13. de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
  14. Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
  15. Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
  16. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
  17. Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863(2020).
  18. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
  19. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232(2021).
  20. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
  21. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
  22. García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288(2020).
  23. Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
  24. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  25. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483(2015).
  26. Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  27. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359(2015).
  28. Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy jelitowetropizm wirusowyr nicowanie organoid winfekcja apikalno bazolateralnazawiesina pojedynczych kom rekwrodzona odpowied immunologiczna

Powiązane artykuły