Stymulacja opony twardej i okołooczodołowe testy von Freya u myszy jako przedkliniczny model bólu głowy

Podsumowanie

Najbardziej zauważalnym objawem migreny jest silny ból głowy, a przypuszcza się, że jest on spowodowany przez neurony czuciowe unerwiające opony mózgowe. W tym miejscu przedstawiamy metodę miejscowego nakładania substancji na oponę twardą w sposób minimalnie inwazyjny, przy jednoczesnym wykorzystaniu nadwrażliwości twarzy jako wyjścia.

Streszczenie

Uważa się, że opony mózgowe czaszki, składające się z opony twardej, pajęczynówki i pia mater, pełnią przede wszystkim funkcje strukturalne układu nerwowego. Na przykład chronią mózg przed czaszką i zakotwiczają/organizują zaopatrzenie naczyniowe i neuronalne kory mózgowej. Jednak opony mózgowe są również zaangażowane w zaburzenia układu nerwowego, takie jak migrena, gdzie ból odczuwany podczas migreny przypisuje się miejscowemu sterylnemu zapaleniu i późniejszej aktywacji miejscowych nocyceptywnych aferentów. Spośród warstw opon mózgowo-rdzeniowych opona twarda jest szczególnie interesująca w patofizjologii migreny. Jest wysoce unaczyniony, zawiera lokalne neurony nocyceptywne i jest domem dla różnorodnej gamy komórek rezydentnych, takich jak komórki odpornościowe. Subtelne zmiany w lokalnym mikrośrodowisku opon mózgowo-rdzeniowych mogą prowadzić do aktywacji i uwrażliwienia nocyceptorów okołonaczyniowych opony twardej, prowadząc tym samym do bólu migrenowego. Badania miały na celu ustalenie, w jaki sposób opona twarda aferenty stają się aktywowane/uwrażliwiane za pomocą elektrofizjologii in vivo, technik obrazowania lub modeli behawioralnych, ale często wymagają one bardzo inwazyjnych operacji. Protokół ten przedstawia metodę stosunkowo nieinwazyjnego stosowania związków na oponę twardą u myszy oraz odpowiednią metodę pomiaru wrażliwości dotykowej podobnej do bólu głowy za pomocą okołooczodołowych testów von Freya po stymulacji opony twardej. Metoda ta utrzymuje integralność opony twardej i czaszki oraz zmniejsza zakłócające skutki technik inwazyjnych poprzez wstrzykiwanie substancji przez zmodyfikowaną kaniulę o średnicy 0,65 mm na styku niezrośniętych szwów strzałkowych i lambdoidalnych. Ten model przedkliniczny pozwoli naukowcom zbadać szeroki zakres bodźców opony twardej i ich rolę w patologicznej progresji migreny, takiej jak aktywacja nocyceptorów, aktywacja komórek odpornościowych, zmiany naczyniowe i zachowania bólowe, a wszystko to przy zachowaniu warunków wolnych od urazów czaszki i opon mózgowych.

Wprowadzenie

Ból migrenowy pozostaje głównym problemem zdrowia publicznego na całym świecie. Światowa Organizacja Zdrowia plasuje ją na szóstym miejscu pod względem rozpowszechnienia choroby na świecie, dotykając nieco poniżej 15% populacji Ziemi¹ i powodując znaczne obciążenie społeczno-ekonomiczne dla społeczeństwa^2,3. Opcje leczenia i ich skuteczność są nieoptymalne i zapewniają jedynie ulgę objawową i nie modyfikują znacząco zdarzeń patofizjologicznych, które leżą u podstaw występowania migreny^4,5. Brak skuteczności leczenia jest prawdopodobnie spowodowany tym, że migrena jest zaburzeniem wieloczynnikowym, którego patologia jest słabo poznana, co prowadzi do ograniczonej liczby celów terapeutycznych. Migrena jest również trudna do pełnego uchwycenia w modelach zwierzęcych, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że diagnoza migreny jest stawiana na podstawie komunikacji werbalnej z pacjentami, którzy opisują swoje doświadczenia z cechami charakterystycznymi migreny, takimi jak aura, ból głowy, światłowstręt i allodynia. Niezależnie od tego ważne jest, aby zauważyć, że ostatnie postępy w leczeniu migreny przewyższają obecnie metody leczenia wielu schorzeń neurologicznych, które zostały dobrze potwierdzone przez modele przedkliniczne. Na przykład przeciwciała monoklonalne i małe cząsteczki, które są ukierunkowane na peptyd związany z genem kalcytoniny lub jego receptor, odniosły duży sukces w poprawie jakości życia osób cierpiących na migrenę i mogą potencjalnie zmienić kliniczne leczenie migreny. Chociaż nastąpił postęp w zrozumieniu tego zaburzenia, nadal wiele pozostaje do wyjaśnienia.

Na podstawie przedklinicznych modeli zwierzęcych i badań na ludziach, powszechnie przyjmuje się, że migrenowe bóle głowy są inicjowane przez nieprawidłową aktywację włókien nocyceptywnych w oponach mózgowych, które sygnalizują przez zwoje nerwu trójdzielnego i górnego odcinka szyjnego korzenia grzbietowego^6,7,8,9,10. Pomimo tej teorii, wiele badań nadal stosuje ogólnoustrojowe podawanie leków, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw migreny. Podczas gdy ogólnoustrojowe dawkowanie leków znacznie poszerzyło naszą wiedzę, odkrycia te nie oceniają bezpośrednio, czy lokalne działania w tkance docelowej odgrywają rolę w migrenie. I odwrotnie, w kilku badaniach przyjęto podejście do stymulacji opony twardej; Eksperymenty te wymagają jednak implantacji kaniuli poprzez inwazyjną kraniotomię i wydłużenia czasu rekonwalescencji^11,12. Ze względu na te ograniczenia opracowaliśmy minimalnie inwazyjne podejście do miejscowej stymulacji opony twardej, w którym brak kraniotomii eliminuje rekonwalescencję po operacji i pozwala na natychmiastowe badanie na przytomnych zwierzętach^12,13,14. Iniekcje te są wykonywane w lekkim znieczuleniu izofluranem i podawane na styku szwów strzałkowych i lambdoidowych u myszy.

Opracowano kilka podejść do oceny nocyceptywnych reakcji behawioralnych u gryzoni¹⁵. Allodynia skórna została zgłoszona u około 80% osób cierpiących na migrenę^16,17 i stanowi potencjalny translacyjny punkt końcowy do stosowania u gryzoni. W modelach przedklinicznych zastosowanie włókien von Freya w okolicy podeszwowej łapy gryzonia wykorzystano do oceny zachowań bólowych w przedklinicznych modelach migreny. Podstawowym ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie testuje ono obszaru głowowego. Punktacja grymasu twarzy została wykorzystana do uchwycenia zachowań bólowych u gryzoni poprzez analizę mimiki twarzy po indukcji bodźców bólowych^18,19. Jednak jego ograniczenia obejmują tylko wychwytywanie reakcji na ostre bodźce, a nie przewlekłe stany bólu ustno-twarzowego. Pielęgnacja twarzy i zmniejszone odchowywanie są również uważane za wyniki reakcji behawioralnych w przedklinicznych modelach migreny^20,21. Ograniczenia tego pierwszego obejmują trudności w odróżnianiu reakcji bólowych od normalnej, rutynowej pielęgnacji i innych odczuć, takich jak swędzenie. W przypadku tych ostatnich zachowania hodowlane zazwyczaj szybko spadają po wprowadzeniu gryzoni do nowych środowisk. Chociaż każdy z tych behawioralnych punktów końcowych jest cenny w zrozumieniu różnych mechanizmów, które przyczyniają się do stanów bólowych, istnieje krytyczna potrzeba, aby przedkliniczne modele zaburzeń bólowych, takich jak migrena, zawierały punkty końcowe, które specyficznie rejestrują reakcje nadwrażliwości głowowej. Ocena nadwrażliwości dotykowej skóry okołooczodołowej po stymulacji opony twardej jest metodą, która może zapewnić lepszy wgląd w mechanizmy przyczyniające się do migreny, w przypadku gdy objawy czuciowe mają głównie charakter głowowy. W tym miejscu opisujemy metodę podawania substancji oponie twardej myszy jako przedkliniczny model migreny. Po aplikacji opony twardej przedstawiamy również szczegółową metodę badania okołooczodołowej nadwrażliwości dotykowej z wykorzystaniem skalibrowanych filamentów von Freya stosowanych w metodzie Dixona góra-dół.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za uprzednią zgodą instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Teksańskim w Dallas. W badaniu wykorzystano myszy ICR (CD-1) (30-35 g) i C57/BL6 (25-30 g) w wieku 6-8 tygodni.

1. Zaparzacz duralowy

1. Utwórz zaparzacze/wstrzykiwacze dla myszy, modyfikując dostępną na rynku kaniulę wewnętrzną i zaparzacz do jednostronnych wstrzyknięć za pomocą niemetalowej nasadki z tworzywa sztucznego ze stopionej krzemionki, która jest regulowana i wkłada się / wysuwa poniżej kaniuli prowadzącej 28 G o średnicy wewnętrznej (ID) 0,18 mm i średnicy zewnętrznej (OD) 0,35 mm (Rysunek 1A).
2. Za pomocą suwmiarki lub innego urządzenia pomiarowego wyregulować nasadkę z tworzywa sztucznego ze stopionej krzemionki na zaparzaczu na długość 0.6 mm, mierzoną od końcówki zaparzacza do krawędzi nasadki z tworzywa krzemionkowego.
   1. Uważaj, aby nie zgiąć ani nie stępić zaparzacza podczas regulacji plastikowej nasadki.
   2. W przypadku innych szczepów myszy, które nie były wcześniej używane do wstrzykiwań opony twardej, określ optymalną długość zaparzacza, ustawiając długość na 0,6 mm i przeprowadzając wstrzyknięcia pilotażowe z tuszem lub barwnikiem, dostosowując długość zaparzacza, aż zaobserwuje, że barwnik znajduje się tylko w oponie twardej, a nie w mózgu lub czaszce.
3. Przymocuj długi koniec (lub koniec, który nie został zmierzony jako 0.6 mm) regulowanego zaparzacza do plastikowej rurki (rurka pompy, 2-stopniowa, średnica wewnętrzna 0.19 mm, długość 406 mm).
   1. Przytnij rurkę na minimalną długość 8 cali, aby upewnić się, że przewód jest wystarczający do utrzymania objętości 5 μl.
   2. Upewnij się, że rurka zakrywa metalową część i górną część plastikowego korka znajdującego się na zaparzaczu. Pomoże to zapobiec gromadzeniu się pęcherzyków powietrza w linii.
4. Ponownie przymocuj drugi koniec rurki do szklanej mikrostrzykawki o pojemności 10 μl (gazoszczelna; igła cementowa; 21 G z występem 10 mm), upewniając się, że metalowa część strzykawki jest szczelnie uszczelniona (Rysunek 1A).
5. Po podłączeniu linii napełnij strzykawkę 5 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), syntetycznym płynem śródmiąższowym (SIF) lub innymi wybranymi nośnikami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.
   1. W przypadku zaobserwowania pęcherzyków powietrza w przewodzie, należy zalać przewód pojazdem, aż pęcherzyki znikną.
      UWAGA: Pomocne może być napełnienie strzykawki wraz z pojazdem przed podłączeniem jej do przewodu, a następnie przepchnięcie płynu przez przewód po podłączeniu.
6. Po tym, jak linia zostanie wypełniona 5 μl nośnika i zacznie działać wydajnie, załaduj 5 μl leku/roztworu do strzykawki Hamiltona (tusz lub barwnik mogą być używane jako alternatywa dla leku/roztworu, jeśli uczysz się lub ćwiczysz tę technikę).
   1. Upewnij się, że wszystkie roztwory nośnika podawane na oponę twardą są utrzymywane na poziomie pH 7,4 i mierzone do osmolalności 310. Zmniejsza to potencjalną aktywację kanałów jonowych wykrywających kwasy i innych kanałów wrażliwych na osmo w oponie twardej.
7. Maksymalna objętość testowana na myszach, która nie spowodowała przecieku do mózgu, wynosi około 10 μl. Efekty behawioralne po wstrzyknięciach z tą objętością nie zostały przetestowane. Z tego powodu należy podać tylko 5 μl roztworu na oponę twardą.
   UWAGA: Obserwacje te opierają się na szczepach/wieku/wadze myszy 6-8 tygodniowych myszy CD1 / ICR.

2. Iniekcje opony twardej

1. Po przygotowaniu strzykawki i załadowaniu leku należy położyć mysz płasko na brzuchu i znieczulić ją krótkotrwałą 3% izofluranem o natężeniu przepływu tlenu 0,5-1 l/min przez nos.
   1. Po tym, jak mysz przestanie wykazywać odruch szczypania, dostosuj znieczulenie i utrzymuj je na poziomie 1,5% izofluranu.
2. Po znieczuleniu nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy i ogol głowę zwierzęcia, a następnie zdezynfekuj skórę jodonem powidonem i etanolem. Następnie należy ustawić się w pozycji sprzyjającej udanym wstrzyknięciom.
3. Jedną ręką podtrzymaj głowę zwierzęcia, a drugą przytrzymaj zaparzacz.
4. Ostrożnie zbadaj i zlokalizuj połączenie szwów strzałkowych i lambdoidalnych na czaszce myszy (Rysunek 1B, C).
   1. Aby zlokalizować to dyskretne połączenie przez skórę, skorzystaj z cech topograficznych czaszki i delikatnie zbadaj ogólne położenie połączenia za pomocą zaparzacza.
   2. Sprawdź położenie złącza, ponownie ustawiając zaparzacz wzdłuż czaszki i wyczuwając dokładne położenie.
5. Po zlokalizowaniu szwu i umieszczeniu zaparzacza na miejscu, bardzo powoli i delikatnie poruszaj zaparzaczem w przód iw tył, aż przebije się przez skórę i opadnie do złącza aż do plastikowego korka.
   UWAGA: Upewnij się, że cała końcówka zaparzacza o średnicy 0.6 mm została włożona do złącza.
6. Aby sprawdzić dokładność, użyj tuszu lub barwnika jako roztworu do wstrzykiwań, a następnie poddaj mysz eutanazji i odetnij głowę.
   1. Zdejmij nasadkę czaszki, aby uwidocznić barwnik w oponie twardej (Rysunek 1C).
      UWAGA: Nie należy obserwować barwnika na mózgu ani na zewnętrznej stronie czaszki. Podobnie, myszy w każdym eksperymencie powinny być badane pośmiertnie w celu sprawdzenia dokładności wstrzyknięcia, a także w celu upewnienia się, że integralność opony twardej nie została uszkodzona.
7. Po wstrzyknięciu wyjmij mysz ze znieczulenia, poczekaj, aż odzyska przytomność, a następnie wróć do klatki lub umieść ją w komorze testowej, aby rozpocząć pożądane testy.
   UWAGA: Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu przez co najmniej 30 minut przed wykonaniem jakichkolwiek eksperymentów behawioralnych.

3. Periorbital von Frey

1. Rozpocznij badanie od kohorty około 16-20 myszy.
2. Na dzień przed habituacją dotykaj każdej myszy przez co najmniej 5 minut.
3. Po około 24 godzinach od użycia należy przyzwyczaić myszy do warunków panujących w pomieszczeniu testowym i aparatury testowej von Freya (rysunek 2A).
   UWAGA: Akrylowa aparatura testująca składa się z indywidualnych komór z pokrywami o wymiarach około 3 cale x 3,5 cala x 5 cali (szer. x wys. x gł.) i są wsparte na aluminiowych stojakach połączonych za pomocą kwadratowego drutu stalowego ocynkowanego o wymiarach 0,25 cala 19 G.
   1. Umieść myszy w poziomo umieszczonym białym papierowym kubku o pojemności 4 uncji, który jest bezwonny i nie zawiera polietylenu ani wosku parafinowego.
      UWAGA: Tego typu kubki są preferowane, ponieważ zmniejszają zaburzenia żołądkowo-jelitowe u myszy w przypadku spożycia (Rysunek 2B).
4. Gdy zwierzęta znajdują się w swoich odpowiednich komorach, umieść granulkę normalnej diety w indywidualnej komorze każdej myszy, aby uspokoić zwierzęta i uniknąć niepotrzebnego stresu u zwierząt. Rób to przez 3 dni przed jakimkolwiek testem zachowania von Freya.
   1. Upewnij się, że za każdym razem, gdy myszy znajdują się w komorze, jest dostęp do jedzenia.
   2. Ponumeruj i przypisz każde zwierzę do tego samego miejsca w stojaku do testów. Umieść mysz w tym samym kubku każdego dnia okresu testowego, aby upewnić się, że każde zwierzę zaaklimatyzuje się w swoim środowisku testowym.
      UWAGA: Myszy będą gryźć kubki, a następnie niszczyć kubki. Jeśli tak się stanie, załóż kubek i oznacz go odpowiednim numerem myszy.
5. Po pierwszych 3 dniach przyzwyczajenia umieść myszy w ich indywidualnych komorach.
   1. Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu i komorach testowych przez co najmniej 1 godzinę przed jakimkolwiek badaniem von Freya, aby umożliwić myszom uspokojenie się, a następnie łatwiejsze do przetestowania.
6. Po zaaklimatyzowaniu się w pomieszczeniu w dniu testu, wyjmij jedną mysz znajdującą się jeszcze w kubku z odpowiedniej komory.
   1. Utrzymuj kubek w pozycji poziomej, tak aby mysz znajdowała się zarówno na przednich, jak i tylnych łapach, aby utrzymać ich ciężar równomiernie rozłożony.
      UWAGA: Nierównomierny rozkład ciężaru może zmienić reakcje zwierzęcia, a nawet uniemożliwić mu reakcję.
7. Umieść kubek z myszą w środku na stole pod stojakiem testowym na podkładce chłonnej.
8. W przypadku okołooczodołowego testu von Freya umieść włókno von Freya o wadze 0,07 g bezpośrednio na środku twarzy i między oczami.
9. Wywieraj wystarczający nacisk na włókno, aby włosy von Freya wygięły się w formację w kształcie litery "C".
   1. Utrzymuj kontakt z obszarem przez co najmniej 3 s, ale nie dłużej niż 5 s lub do momentu, gdy mysz cofnie głowę i przesunie palcem po żarniku łapą.
      UWAGA: Jeśli filament ześlizgnie się lub więcej niż końcówka filamentu dotknie zwierzęcia podczas testowania, wszelkie odpowiedzi nie powinny być liczone. Reakcje te mogą być odpowiedzią na szczoteczkę, która jest aktywowana przez różne mechanoreceptory i dlatego może nie odzwierciedlać dokładnych wyników.
   2. Zastosuj filamenty von Freya zgodnie z metodą Dixona "góra-dół"^22,23.
      1. Na początku należy zastosować filament von Frey, który ma wagę 0,07 g. Najniższym możliwym filamentem i najwyższym testowanym filamentem w tym badaniu są filamenty o gramaturze odpowiednio 0,008 g i 0,6 g.
      2. Do wykonania tego testu należy użyć filamentów o gramaturze 0.008 g, 0.02 g, 0.04 g, 0.07 g, 0.16 g, 0.4 g i 0.6 g.
      3. W tej metodzie, jeśli zwierzę nie wykazuje reakcji na filament, należy zastosować włókno o następnej większej masie grama.
      4. Jeśli mysz reaguje na filament, należy wziąć pod uwagę, że mysz reaguje na ten filament. W takim przypadku należy zastosować filament o następnej niższej gramaturze.
      5. Powtarzaj ten wzór, dopóki zwierzę nie zostanie przebadane 4 razy po początkowej reakcji lub nie zostanie stwierdzone, że zwierzę nie reaguje na żadne włókna badane w teście.
         UWAGA: Powstrzymaj się od wywierania dodatkowego nacisku na ramię lub nadgarstek. Skala może być używana do ćwiczenia stosowania filamentu.

4. Testowanie podstawowych progów wycofania

1. Przed włączeniem do eksperymentu upewnij się, że myszy osiągną wyjściowy próg wycofania między 0,5-0,6 g.
   1. Mysz osiąga linię bazową, jeśli nie reaguje na którykolwiek z badanych włókien w serii wymienionej w kroku 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g i 0,6 g).
2. Testuj myszy codziennie przy ustalaniu wyjściowych progów wycofania.
   1. Testowanie pozwala zwierzętom przyzwyczaić się do warunków testowych i ciśnienia włókien von Freya.
   2. Jeśli myszy są nadal bardzo nadwrażliwe po trzecim dniu testów, spróbuj odczekać 1 lub 2 dni przed ponownym testem.
      UWAGA: Zbyt długi czas między dniami badania może spowodować, że zwierzę nie dostosuje się do ciężaru filamentu w swoim obszarze okołooczodołowym, a tym samym nie osiągnie docelowego progu wycofania.
3. Testuj myszy przez około 7 dni przed ustaleniem, które zwierzęta nie spełniają kryteriów włączenia do eksperymentu.
   UWAGA: Około 70% myszy osiągnie docelowy poziom wyjściowy.
   1. Przed stymulacją opony twardej przeanalizuj dane wyjściowe, aby wykluczyć myszy, która nie osiągnęła wartości wyjściowej 0,5-0,6 grama lub wyższej.
   2. Po wykluczeniu losowo przydziel każdą pozostałą mysz do grupy testowej. Osiągnij to, rysując z kubka lub pisząc skrypt w arkuszu kalkulacyjnym, aby losowo dobierać liczby do grupy.

5. Analiza wyników von Freya

1. Po uzyskaniu serii odpowiedzi określ wartość delta, k, próg 50% i próg wypłaty w gramach zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami²⁴.
2. Oblicz próg wycofania za pomocą tego wzoru WT = 10(^x*F+B), gdzie WT = próg wycofania, F = próg wycofania łapy obliczony metodą Chaplana, a B = regresja liniowa logarytmu (siła zginająca) = x*Liczba filamentu + B.
3. Wykreśl dane jako 50% próg wycofania lub średni próg wycofania w gramach.

Wyniki

Niniejsza metoda iniekcji jest stosowana do wprowadzania bodźców do opony twardej myszy w celu przeprowadzenia późniejszych testów behawioralnych. Najczęściej mierzonym parametrem behawioralnym w tym modelu jest nadwrażliwość skóry twarzy oceniana za pomocą włókien von Frey^12,13,14. Poniżej pokazujemy, w jaki sposób model ten może być wykorzystany do oceny potencjalnego wpływu różnic płciowych na patologię migreny (

Dyskusja

Nieadaptacyjne zmiany w miejscowym układzie nocyceptywnym w oponie twardej są uważane za kluczowy czynnik przyczyniający się do fazy bólu głowy w atakach migreny, pomimo braku uszkodzenia tkanek^25,26. W pracy przedstawiono metodę, dzięki której małoinwazyjna stymulacja opony twardej może wywołać nadwrażliwość dotykową twarzy. Wyjaśnienie mechanizmów i zdarzeń związanych z aktywacją nocyceptora opony twardej bez powodowania uszkodzenia czaszki i tkanek może dokład...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4 uncje gorących kubków papierowych	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Podkłady chłonne	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Wewnętrzna kaniula 28 G	P1 Technologies (dawniej Plastics One)	8IC313ISPCXC	ID 18 mm, OD 35 mm
Gazoszczelne Model 1701 SN Strzykawki	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Rurka pompy Ismatec, 0,19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10
https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 Stojak z drutem z kurczaka	Niestandardowe		Wymiary drutu z kurczaka ze stali ocynkowanej wynoszą 0,25 cala. x Stojak testowy o rozmiarze 19
z indywidualnym  Komnaty	Niestandardowe		Każda komnata powinna mieć podział między każdą myszą a pokrywami, aby pomieścić mysz. Komory powinny być również wystarczająco duże, aby pomieścić papierowy kubek o pojemności 4 uncji.
von Frey Filaments	Test dotykowy/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html