Artykuł metodologiczny

Fluorescencja na żywo, odwrotne obrazowanie marszczenia komórek i makropinocytoza

DOI:

10.3791/62870

⸱

5 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje obrazowanie dekstranu w żywych komórkach za pomocą ciągłego wychwytu i odwróconych obrazów w celu optymalizacji wizualizacji marszczenia, dojrzewania makropinosomów oraz analizy znakowania dekstranu i innych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny, ale wciąż nie do końca zrozumiały proces, który jest niezbędny do pobierania i przyjmowania płynów, składników odżywczych w fazie płynnej i innych materiałów w komórkach. Dramatyczne wydłużenie falban powierzchni komórki, ich zamknięcie w celu utworzenia makropinosomów i dojrzewanie zinternalizowanych makropinosomów są kluczowymi zdarzeniami w tym szlaku, które mogą być trudne do uchwycenia przy użyciu konwencjonalnego obrazowania konfokalnego opartego na śledzeniu bolusa fluorescencyjnego ładunku. Dekstrans fluorescencyjny jest powszechnie stosowany eksperymentalnie jako markery fazy płynnej dla makropinosomów i innych szlaków endocytarnych. Metoda przyjęta przez laboratorium w celu optymalizacji obrazowania wychwytu dekstranu polega na wykorzystaniu obrazowania na żywo komórek skąpanych w wysokich stężeniach fluorescencyjnego dekstranu w pożywce, przy czym nieznakowane komórki pojawiają się w reliefie (jako czarne). Potargania komórek są podkreślone, aby uwidocznić zamknięcie falbany, a zinternalizowane makropinosomy pojawiają się jako fluorescencyjne wakuole we wnętrzu komórki. Ta metoda jest optymalna do wizualizacji cech makropinosomów i pozwala na łatwą segmentację i kwantyfikację. W artykule opisano podwójne znakowanie szlaków z dektransem o różnych rozmiarach oraz koekspresję sond lipidowych i fluorescencyjnych białek błonowych w celu oznaczenia makropinosomów i innych endosomów. Zademonstrowano również wykrywanie zinternalizowanego dekstranu na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM). Te procesy komórkowe można obrazować przy użyciu wielu modalności obrazowania na żywo, w tym w 3D. Podsumowując, podejścia te optymalizują obrazowanie makropinosomów dla wielu różnych ustawień i systemów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość typów komórek kręgowców dzieli wrodzoną zdolność do nieselektywnego pobierania płynu z poprzednikami w całej ewolucji, począwszy od jednokomórkowej ameby1. Ten wysoce konserwatywny proces wchłaniania przez makropinocytozę (duże picie) jest wykorzystywany przez ameby głównie do pozyskiwania składników odżywczych1, podczas gdy w komórkach kręgowców może podobnie być drogą dostarczania składników odżywczych w stresie i jest wykorzystywany przez komórki odpornościowe do pobierania próbek i nadzoru środowisk tkankowych2. Makropinocytoza ma cechy, które odróżniają ją od innych form endocytozy, w tym charakterystyczne, duże (>0,2 mm średnicy) makropinosomy podobne do wakuolarów, nieselektywny charakter wychwytu płynów i substancji rozpuszczonych oraz towarzyszące im obszary błony plazmatycznej, które są oportunistycznie internalizowane do makropinosomów3. Nieselektywny charakter tego wychwytu oznacza, że sortowanie i recykling muszą odbywać się szybko, aby uratować niezbędne rozpuszczalne i plazmatyczne białka błonowe poprzez recykling ich z powrotem na powierzchnię komórki. Znaczna część materiału pobranego do makropinosomów jest przeznaczona do degradacji w lizosomach i jest kierowana do szlaków endo/lizosomalnych poprzez dojrzewanie makropinosomów i fuzję z innymi endosomami. Białka błony komórkowej mogą być również zawracane z powrotem na powierzchnię komórki z makropinosomów. Istnieje duże zainteresowanie dziedziną nowotworów w celu zrozumienia procesu makropinocytozy, która jest aktywowana w komórkach rakowych i pomaga utrzymać ich odżywianie i proliferację2,4,5,6. Makropinocytoza występuje zarówno konstytutywnie, jak i może być dalej indukowana po stymulacji za pośrednictwem receptora w komórkach odpornościowych, gdzie makropinosomy sygnalizują receptor gospodarza, przyczyniają się do przetwarzania endo/lizosomalnego w celu prezentacji antygenu i stanowią portal wejściowy dla różnych wirusów, bakterii i innych patogenów3,7.

Makropinosomy mają niewiele charakterystycznych lub unikalnych markerów. Najłatwiej je zidentyfikować podczas ich tworzenia u podstawy dramatycznych, bogatych w aktynę zmarszczek powierzchni komórek, które zbliżają się do pochłonięcia płynu8. Natychmiast po zamknięciu F-aktyna wokół makropinosomów ulega depolimeryzacji, a same makropinosomy ulegają dynamicznym zmianom związanym z homo- i heterotypową fuzją, kanalikami i skurczem9. Makropinosomy są również trudne do zidentyfikowania na poziomie ultrastrukturalnym, ponieważ nie mają charakterystycznych powłok ani innych cech i wyglądają po prostu jako wakuole o różnych rozmiarach. Bez ostatecznych markerów błonowych, makropinosomy są najłatwiej i najbardziej tradycyjnie definiowane przez ich płynny ładunek, który eksperymentalnie odbywa się poprzez użycie dekstranu fluorescencyjnego. Dekstran jest złożonym polisacharydem pochodzącym z glukozy, który może być sprzężony z dużą gamą markerów fluorescencyjnych lub gęstych elektronów i dodawany do pożywki w celu wychwytu przez komórki lub perfundowany w celu wychwytu w tkankach. Co więcej, dekstran o dużej masie cząsteczkowej (MW) (70 kDa) jest obecnie uważany za ładunek selektywny pod względem wielkości dla makropinosomów, ponieważ nie dostaje się do innych, mniejszych pęcherzyków endocytarnych i stał się najczęstszą etykietą makropinocytozy10,11. Obserwowanie makropinocytozy zazwyczaj polega na inkubacji komórek za pomocą impulsu fluorescencyjnego dekstranu i użyciu stałych lub żywych komórek do obrazowania fluorescencyjnego w celu wyświetlenia bolusa znakowania dekstranu wewnątrz komórek w makropinosomach. Ze względu na ich duży rozmiar, nieznakowane makropinosomy można również oglądać w niektórych typach komórek za pomocą kontrastu fazowego lub mikroskopii jasnego pola, w której makropinosomy pojawiają się jako duże białe puste wakuole. Pewne informacje kontekstowe są uzyskiwane z obrazów kontrastu fazowego komórek, a obrazy te można następnie dodatkowo nałożyć na obrazy fluorescencyjne, aby zobrazować fluorescencyjny wychwyt dekstranu12,13. Dextrans o różnych rozmiarach i różnych etykietach może być używany do monitorowania wchłaniania płynów do wielu szlaków komórkowych i endocytarnych10,14,15 i dekstran mogą być stosowane do hodowli komórkowych lub perfundowane myszom w celu obrazowania przyżyciowego16 lub nawet wstrzykiwane do embrionów much17 do obrazowania na żywo.

Niektóre z trudności związanych z używaniem dekstranu do śledzenia makropinosomów obejmują jego wyciek z makropinosomów po utrwaleniu lub przepuszczalności komórek, jego rozcieńczony lub trudny do wykrycia poziom w komórkach, które nie wykonują agresywnej makropinocytozy, oraz jego dynamiczne rozmieszczenie i dyspersję wewnątrz komórek podczas dojrzewania makropinosomów3. Problemy te nasilają się w większości eksperymentów, które mają na celu śledzenie wychwytu pojedynczego impulsu dekstranu dodanego do komórek, a następnie zmytego.

Zamiast tego, ten artykuł opisuje zalety stosowania fluorescencyjnego dekstranu do komórek i pozostawiania go w pożywce podczas obrazowania na żywo, aby rejestrować ciągły pobór do komórek. Wzmacnia to sygnał dekstranu w makropinosomach i kolejnych endosomach, pokazując cały szlak dojrzewania. Oglądanie znakowanych makropinosomów na tle nieznakowanego (czarnego) wnętrza komórek, jako odwrotnego ustawienia o wysokim kontraście, ujawnia wszystkie cechy makropinosomów i odwrotnie, na zewnątrz komórek, wysoce fluorescencyjne podłoże podkreśla dynamiczne marszczenie powierzchni komórki. Metoda ta opisuje obrazowanie dekstranu na żywo w mikroskopowym obrazowaniu konfokalnym oraz w celu jego wykrycia po utrwaleniu komórki za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM). Zawarte tutaj obrazowanie przeprowadzono na różnych typach komórek, aby wykazać szerokie zastosowanie tych podejść, w tym aktywowanych makrofagów i komórek mikrogleju, gdzie makropinocytoza jest bardzo aktywna i szybka, oraz w komórkach nowotworowych, w których makropinocytoza jest stosunkowo mniej obfita.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek na naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (Dzień 0)

  1. Utrzymuj i pasażuj linie komórkowe w kompletnym pożywce uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie (dla RAW264.7) lub zwykłą płodową surowicą cielęcą i 1% L-glutaminą, w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 .
  2. Na płytkach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm umieścić odpowiednią liczbę komórek, aby osiągnąć 60% zbieżności, na szalkach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
    UWAGA: Zalecana gęstość komórek wynosi od 2 ml 0,15 x 106 komórek/ml do 0,25 x 106 komórek/ml dla opisanych tutaj komórek mikrogleju RAW264.7, BV2 i MDA-MB 231.

2. Transfekcja plazmidu fluorescencji DNA (Dzień 1) - Opcjonalnie

UWAGA: Różne fluorescencyjnie znakowane białka i sondy mogą być wyrażane przejściowo lub stabilnie w sklonowanych liniach komórkowych, aby specyficznie oznaczyć falbany aktynowe i kompartmenty w szlaku endocytarnym, takie jak wczesne endosomy, późne endosomy lub lizosomy.

  1. Transfekcję komórek za pomocą zestawu do transfekcji na bazie lipidów zgodnie z instrukcją producenta, 1 dzień po posiewie w kapturze do hodowli tkankowych.
  2. Rozcieńczyć 2 μg oczyszczonego plazmidu DNA wolnego od endotoksyn w 125 μl minimalnej ilości niezbędnej pożywki (zredukowana surowica). Delikatnie wymieszaj i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Rozcieńczyć 5 μl środka do transfekcji w 125 μl minimalnej ilości niezbędnej pożywki (zredukowana surowica). Delikatnie wymieszaj i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Połączyć rozcieńczony plazmid DNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez kolejne 10 minut przed dodaniem kroplami do komórek.
  5. Inkubować komórki z kompleksem transfekcji w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez 3-4 godziny, a następnie zastąpić je świeżą, pełną pożywką hodowlaną.
  6. Następnego dnia należy użyć transfekowanych komórek do eksperymentów lub poddać klonowaniu w ograniczonym rozcieńczeniu, aby uzyskać linie komórkowe o stabilnej ekspresji.

3. Wizualizacja pęcherzyków endocytarnych i makropinosomów (Dzień 2)

UWAGA: Fluorescencyjny dektrans (Dextran Alexa Fluor 488/647 przy 10 kDa MW, i Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine przy 70 kDa MW, anionowy, utrwalany lizyną) o różnych masach cząsteczkowych są używane do monitorowania wychwytu fazy płynnej do szeregu szlaków endocytarnych14. 70 kDa dekstran dla makropinosomów i 10 kDa dla wszystkich szlaków.

  1. Przygotować dekstran (detrany) jako 2x skoncentrowaną zawiesinę o stężeniu 200-500 ng/ml we wstępnie ogrzanej pożywce hodowlanej w celu dodania do komórek.
  2. OPCJONALNIE: Eksperymenty mogą wymagać wcześniejszego lub jednoczesnego dodania suplementów lub leków wpływających na aktywność endocytarną. Na przykład należy wstępnie potraktować makrofagi i komórki mikrogleju czynnikami wzrostu (np. 200 ng / ml CSF-1) lub ligandami aktywującymi (np. LPS 100 ng / ml lub 300 ng / ml CpG) w celu zwiększenia zmarszczenia i makropinocytozy. Hodować komórki rakowe w odpowiedniej pożywce bez surowicy przez 12-16 godzin przed wychwytem dekstranu w kompletnej pożywce. Zapoznaj się z krokiem 1.2, aby uzyskać informacje o zalecanej gęstości komórek.
  3. Aby przygotować się do obrazowania na żywo, umieść komórki wyhodowane w naczyniach ze szklanym dnem na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C i inkubator z wilgotnością 5% CO2 .
  4. Odessać nadmiar pożywki, pozostawiając 500 μl kompletnej pożywki w naczyniu ze szklanym dnem.
  5. Znajdź odpowiedni obszar komórek i ustaw fokus. W przypadku obrazowania poklatkowego przed akwizycją należy wstępnie wybrać odpowiednie lasery fluorescencyjne, filtry i ustawienia. Użyj następujących ustawień, aby rozpoznać poszczególne komórki i makropinosomy.
    1. Zobrazuj obszar zainteresowania na odwróconym mikroskopie konfokalnym za pomocą obiektywu Plan Apochromat 63x 1,4 NA, zanurzonego w olejku.
    2. Wybierz 512 x 512 dla rozmiaru obrazu, skanowanie dwukierunkowe dla szybkiego obrazowania.
    3. Skoncentruj się na indywidualnej płaszczyźnie ogniskowej komórek. Ustaw przechwytywanie jako pojedynczy plasterek lub ustaw grubość warstwy optycznej (Nyquist) około 0,3 μm, aby połączyć je jako stosy Z.
    4. Wybierz film poklatkowy z interwałem 5 s, trwający od 20 do 45 minut, w zależności od określonych typów komórek.
    5. Wybierz sprzętowe automatyczne ustawianie ostrości/śledzenie ostrości, aby wspomóc stabilizację obrazu podczas przechwytywania przez odpowiedni czas, zgodnie z określonymi typami komórek.
    6. Dodaj równą objętość pożywki z dodatkiem dekstranu i natychmiast rozpocznij przechwytywanie obrazu na żywo dla makrofagów. Odczekaj 20 minut przed obrazowaniem wolniejszego wychwytu w komórkach MDA-MB 231.
      UWAGA: Dzięki tej metodzie, komórki BV2 z dwoma kanałami fluoroforowymi zostały z powodzeniem zobrazowane w jednej płaszczyźnie ze śledzeniem maksymalnej prędkości, nieprzerwanie przez 45 minut po dodaniu mieszaniny dekstranu. Aby wykryć wczesne makropinosomy w komórkach RAW 264.7, gdzie makropinocytoza zachodzi bardzo szybko, należy pobrać pojedynczy plasterek (do szybkiego obrazowania) lub stos Z składający się z 4-6 warstw (do przechwytywania 3D) i poklatkowy w odstępie 5 s przez 20 minut po dodaniu dekstranu. W przypadku komórek MDA-MB 231 należy uzyskać optymalne stosy Z między 10-15 warstwami, w odstępach 5 s przez 40 minut.

4. Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa (CLEM) (Dzień 3) - Opcjonalnie

  1. Przygotuj komórki zgodnie z krokami 1, 2 i 3 protokołu z adaptacjami. Krótko mówiąc, hoduj 0,2 x 106 komórek/ml komórek RAW264,7 na kratkach ze szklanym dnem (szalka 35 mm, szkiełko nakrywkowe z kratką nr 1,5, średnica szkła 14 mm, niepowlekane), transfekować plazmidem fluorescencyjnym (np. mCherry-2xFYVE) i pozostawić na noc przed dodaniem dekstranu-488 (70 kDa) na 20 minut w temperaturze 37 °C, 5% inkubator nawilżany CO2
    2. .
  2. Szybko umyj komórki 1 ml lodowatego PBS i utrwal 0,1% aldehydu glutarowego.
  3. Uzyskaj obrazy stałych komórek dekstranu-488 i mCherry-2xFYVE pod mikroskopem konfokalnym.
  4. Przechwytuj obrazy w jasnym polu, aby zidentyfikować pozycje siatki przed przetworzeniem szalek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (EM), jak opisano wcześniej18. Krótko mówiąc, dalej utrwal komórki w 2,5% aldehydzie glutarowym, postfix w 1% zredukowanym tetratlenku osmu, zabarwić en bloc 2% octanem uranylu, a następnie odwodnić przez szereg etanolu przed zatopieniem w żywicy LX112. Wytnij miejsca z siatką z bloku i zbierz ultracienkie skrawki za pomocą ultramikrotomu. Rejestruj obrazy pod mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV przy użyciu odpowiedniego oprogramowania systemu obrazowania.

5. Przetwarzanie i wizualizacja danych (Dzień 4)

UWAGA: FIDŻI - pakiet do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym - jest używany do wizualizacji i analizy33.

  1. Zduplikuj surowe dane do przetworzenia, aby zachować zgodność z zasadami danych F.A.I.R., tj. że dane badawcze są możliwe do znalezienia, dostępne, interoperacyjne i wielokrotnego użytku.
  2. Dostosuj jasność i kontrast dla zestawów obrazów w równym stopniu, korzystając z danych histogramu.
  3. Wyświetlaj obrazy jako projekcje maksymalnej intensywności z uzyskanych obrazów ze stosu Z.
  4. Wstawianie podziałki liniowej dla zestawów obrazów.
  5. Przytnij/Obróć dane FOV (opcjonalnie). Utwórz reprezentatywne panele dla danych szeregów czasowych.
  6. W celu dalszej analizy i kwantyfikacji należy określić ilościowo intensywność fluorescencji dekstranu pobranego do komórek jako miarę aktywności makropinocytozy. Aby ograniczyć analizę do pojedynczych komórek, należy użyć opisanej tutaj metody obrazowania.
    1. Odwróć tablicę LUT, aby odwrócić kolor obszarów komórek pozbawionych fluorescencji w celu wykonania progowania.
    2. Podziel obiekt na segmenty i utwórz maskę komórki, aby zidentyfikować poszczególne komórki.
    3. Użyj maski komórki w połączeniu z wcześniej opublikowaną metodą19, która identyfikuje i mierzy poszczególne makropinosomy. Użyj tych wskaźników, aby określić ilościowo makropinocytozę, w tym wielkość, liczbę i całkowity wychwyt na komórkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście polegające na obrazowaniu nieoznakowanych żywych komórek zanurzonych w wysokim stężeniu fluorescencyjnego dekstranu ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania do śledzenia makropinocytozy. Prezentując obrazy w reliefie, ciała komórek wydają się czarne i pozwalają na lepszą wizualizację dramatycznej powierzchni komórki marszczącej się na jasnym, fluorescencyjnym tle, po której następuje internalizacja w fazie płynnej makropinosomów wypełnionych dekstranem TMR (70 kDa), jak pokazano na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano warianty bardziej tradycyjnych sposobów znakowania dekstranem do śledzenia makropinocytozy, w oparciu o obrazowanie na żywo komórek zanurzonych w sposób ciągły w fluorescencyjnym dekstranie (dekstranach) i wizualizację wychwytu na czarnym tle nieznakowanych komórek. Zoptymalizowany protokół zapewnia środki do rozróżniania różnych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych i umożliwia przestrzenno-czasowe śledzenie wielu makropinocytotycznych i endocytarnych ładunków i białek. Metoda zanurzania komórek w pożywce z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Tatianie Khromykh za jej fachową pomoc techniczną. Obrazowanie fluorescencyjne przeprowadzono w mikroskopii IMB z wykorzystaniem Cancer Ultrastructure and Function Facility finansowanego przez Australian Cancer Research Foundation; Mikroskopię elektronową przeprowadzono w Centrum Mikroskopii i Mikroanalizy Uniwersytetu Kalifornijskiego. Finansowanie uzyskano od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii (JLS APP1176209) oraz Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (DP180101910). NDC jest wspierany jako CZI Imaging Scientist przez grant o numerze 2020-225648 z Chan Zuckerberg Initiative DAF, funduszu doradczego Silicon Valley Community Foundation. YH był wspierany przez stypendium doktoranckie rządu australijskiego i finansowanie z Yulgilbar Alzheimer Research Program. Z-JX był wspierany przez stypendium Chińskiej Akademii Nauk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% Sondy molekularne tetratlenku osmuProSciTechEMS19192
647-transferyny, Invitrogen  Komórki T23366
BV2Prezent uprzejmie przekazany nam przez dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (klasa B) BZintegrowane technologie DNANa zamówienie
Dekstran Alexa Fluor 488  przy 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dekstran Alexa Fluor 647  przy 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 przy 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dekstran Tetrametylorodamina przy 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
Pożywka DMEM z pirogronianem sodu i L-glutaminąGibco Invitrogen#11995
Surowica cielęca płoduInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Wodny roztwór aldehydu glutarowego, klasa EM 25%ProSciTechC002
Jeol 1011
Gibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Naczynie szklane z dnem 35 mm, siatka niepowlekanaMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
Naczynia szklane MatTek 35 mm niepowlekaneMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 ogniwATCCHTB-26
Opti-MEM o obniżonej surowicyThermo Fisher Scientific31985088
Plazmid mCherry-2XFYVEPrezent uprzejmie przekazany nam przez dr Frederica Meuniera (University of Queensland)-
Plazmid mCherry-PLCδ-PHPrezent uprzejmie przekazany nam przez dr Frederica Meuniera (University of Queensland)-
Raw264.7 komórkiATCCTIB-71
RPMI medium 1640, bez L-glutaminyGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Octan uranyluProSciTechC079
Odwrócony mikroskop konfokalny LSM880Zeiss Zeiss-
niestandardoweMikroskop elektronowy JEOL-L-Glutamina

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie fluorescencyjne na ywotworzenie makropinosom wfluorescencyjny dekstranpobieranie fazy ciek ejkorelatywna mikroskopia wietlna i elektronowaznakowanie bia ek b onowychszlaki endocytyczne
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły