Artykuł metodologiczny

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62872

⸱

20 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, 2Department of Urology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Streszczenie

Kompletne sekwencje genomu dostarczają cennych danych do zrozumienia różnorodności genetycznej i unikalnych czynników kolonizacji mikrobów moczowych. Dane te mogą obejmować ruchome elementy genetyczne, takie jak plazmidy i fagi pozachromosomowe, które przyczyniają się do rozprzestrzeniania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i dodatkowo komplikują leczenie infekcji dróg moczowych (ZUM). Kompletne, zamknięte genomy nie tylko zapewniają precyzyjną rozdzielczość struktury genomu, ale także pozwalają na szczegółową genomikę porównawczą i analizy ewolucyjne. Generowanie kompletnych genomów de novo od dawna jest trudnym zadaniem ze względu na ograniczenia dostępnej technologii sekwencjonowania. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zapewnia wysokiej jakości krótkie odczyty, często skutkujące dokładnymi, ale fragmentarycznymi zespołami genomu. Wręcz przeciwnie, sekwencjonowanie Nanopore zapewnia długie odczyty o niższej jakości, co zwykle prowadzi do podatnych na błędy kompletnych zespołów. Takie błędy mogą utrudniać badania asocjacyjne całego genomu lub dostarczać wprowadzających w błąd wyników analizy wariantów. W związku z tym podejścia hybrydowe łączące zarówno krótkie, jak i długie odczyty okazały się niezawodnymi metodami uzyskiwania bardzo dokładnych zamkniętych genomów bakteryjnych. W niniejszym artykule przedstawiono kompleksową metodę hodowli różnych bakterii moczowych, identyfikacji gatunków za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA, ekstrakcji genomowego DNA (gDNA) oraz generowania krótkich i długich odczytów odpowiednio przez platformy NGS i Nanopore. Ponadto metoda ta opisuje bioinformatyczny potok algorytmów kontroli jakości, składania i przewidywania genów w celu generowania adnotowanych kompletnych sekwencji genomu. Połączenie narzędzi bioinformatycznych umożliwia wybór wysokiej jakości danych odczytu do hybrydowego składania genomu i dalszej analizy. Uproszczone podejście do hybrydowego składania genomu de novo opisane w niniejszym protokole może zostać zaadaptowane do stosowania u dowolnych bakterii zdolnych do hodowli.

Wprowadzenie

Mikrobiom układu moczowego to nowy obszar badań, który obalił trwające od dziesięcioleci błędne przekonanie, że drogi moczowe są bezpłodne u zdrowych osób. Członkowie mikrobioty układu moczowego mogą służyć do równoważenia środowiska moczowego i zapobiegania zakażeniom dróg moczowych (ZUM)1,2. Bakterie urochotwórcze atakują drogi moczowe i wykorzystują różne mechanizmy wirulencji do wypierania rezydującej mikrobioty, kolonizacji nabłonka dróg moczowych, unikania odpowiedzi immunologicznych i przeciwdziałania presji środowiskowej3,4. Mocz jest pożywką o stosunkowo ograniczonej zawartości składników odżywczych, charakteryzującą się wysoką osmolarnością, ograniczoną dostępnością azotu i węglowodanów, niskim natlenieniem i niskim pH5,6,7. Mocz jest również uważany za przeciwbakteryjny, składający się z wysokich stężeń hamującego mocznika i peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak ludzka katelicydyna LL-378. Badanie mechanizmów wykorzystywanych zarówno przez bakterie, jak i uropatogeny do kolonizacji dróg moczowych ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia zdrowia dróg moczowych i opracowania nowych strategii leczenia ZUM. Ponadto, w miarę jak coraz powszechniejsze stają się niepowodzenia terapii przeciwdrobnoustrojowych pierwszego rzutu, coraz ważniejsze staje się monitorowanie rozprzestrzeniania się ruchomych elementów genetycznych przenoszących determinanty oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w populacjach bakterii moczowych9,10.

Aby zbadać genotypy i fenotypy bakterii moczowych, konieczna jest ich udana hodowla i późniejsze sekwencjonowanie całego genomu (WGS). Metody zależne od hodowli są niezbędne do wykrywania i identyfikowania żywych drobnoustrojów w próbkach moczu11. Standardowy kliniczny posiew moczu polega na posiewaniu moczu na 5% agarze z krwią owczą (BAP) i agarze MacConkey i inkubacji tlenowej w temperaturze 35 °C przez 24 godziny 12. Jednak przy progu wykrywalności wynoszącym ≥105 CFU/mL13 wielu członków mikrobioty układu moczowego nie jest zgłaszanych tą metodą. Ulepszone techniki hodowli, takie jak Enhanced Quantitative Urine Culture (EQUC)11 wykorzystują różne kombinacje różnych objętości moczu, czasów inkubacji, pożywek hodowlanych i warunków atmosferycznych w celu identyfikacji drobnoustrojów często pomijanych w standardowym posiewie moczu. W niniejszym protokole opisana jest zmodyfikowana wersja EQUC, określana tutaj jako protokół Modified Enhanced Urine Culture, która umożliwia hodowlę różnych bakterii moczowych i uropatogenów przy użyciu selektywnych pożywek i optymalnych warunków atmosferycznych, ale nie jest z natury ilościowa. Udana izolacja bakterii moczowych umożliwia ekstrakcję genomowego DNA (gDNA) do dalszego WGS i składania genomu.

Zespoły genomu, w szczególności kompletne złożenia, umożliwiają odkrycie czynników genetycznych, które mogą przyczynić się do kolonizacji, utrzymania niszy i zjadliwości zarówno wśród mikrobioty rezydentnej, jak i bakterii uropatogennych. Szkice zespołów genomu zawierają różnorodną liczbę ciągłych sekwencji (kontigów), które mogą zawierać błędy sekwencjonowania i nie mieć informacji o orientacji. W kompletnym złożeniu genomu zweryfikowano zarówno orientację, jak i dokładność każdej pary zasad14. Co więcej, uzyskanie pełnych sekwencji genomu zapewnia wgląd w strukturę genomu, różnorodność genetyczną i ruchome elementy genetyczne15. Same krótkie odczyty mogą zidentyfikować obecność lub brak ważnych genów, ale mogą nie określać ich kontekstu genomowego16. Dzięki technologiom sekwencjonowania z długim odczytem, takim jak Oxford Nanopore i PacBio, generowanie zamkniętych zespołów de novo genomów bakteryjnych nie wymaga już żmudnych metod, takich jak ręczne zamykanie zespołów de novo za pomocą multipleksowego PCR17,18. Połączenie technologii sekwencjonowania z krótkim odczytem nowej generacji i sekwencjonowania z długim odczytem Nanopore pozwala na łatwe generowanie dokładnych, kompletnych i zamkniętych zespołów genomu bakteryjnego przy stosunkowo niskich kosztach19. Sekwencjonowanie z krótkim odczytem daje dokładne, ale pofragmentowane zespoły genomu, zwykle składające się średnio z 40-100 kontigów, podczas gdy sekwencjonowanie nanoporowe generuje długie odczyty o długości około 5-100 kb, które są mniej dokładne, ale mogą służyć jako rusztowania do łączenia kontigów i rozwiązywania syntenii genomowej. Podejścia hybrydowe wykorzystujące zarówno technologie krótkiego, jak i długiego odczytu mogą tworzyć dokładne i kompletne genomy bakteryjne19.

Opisany tutaj jest kompleksowy protokół do izolacji i identyfikacji bakterii z ludzkiego moczu, ekstrakcji genomowego DNA, sekwencjonowania i kompletnego składania genomu przy użyciu hybrydowego podejścia do składania. Protokół ten kładzie szczególny nacisk na kroki niezbędne do prawidłowej modyfikacji odczytów generowanych przez sekwencjonowanie krótkiego i długiego odczytu w celu dokładnego złożenia zamkniętego chromosomu bakteryjnego i elementów pozachromosomalnych, takich jak plazmidy.

Protokół

Bakterie zostały wyhodowane z moczu pobranego od kobiet, które wyraziły na to zgodę, w ramach badań zatwierdzonych przez komisję rewizyjną 19MR0011 (UTD) i STU 032016-006 (UTSW).

1. Zmodyfikowany ulepszony posiew moczu

UWAGA: Wszystkie etapy hodowli muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach. Wysterylizuj wszystkie instrumenty, roztwory i media. Oczyść obszar roboczy 70% etanolem, a następnie ustaw palnik Bunsena i pracuj ostrożnie blisko płomienia, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Alternatywnie, komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II może być używana do utrzymania sterylnego środowiska. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), aby uniknąć narażenia na potencjalnie chorobotwórcze drobnoustroje.

  1. Posiewanie moczu z glicerolem i izolacja kolonii
    1. Rozmrażanie moczu zawierającego glicerol w temperaturze pokojowej (RT). Po rozmrożeniu należy wirować próbkę przez 5 sekund, aby wymieszać. W sterylnych probówkach do mikrowirówek przygotować rozcieńczenia moczu w stosunku 1:3 i 1:30 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do końcowej objętości 100 μl.
      UWAGA: Mocz z glicerolem przygotowuje się przez zmieszanie 500 μl nierozcieńczonego moczu i 500 μl 50% sterylnego glicerolu w kriowiałach i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
    2. Przed użyciem podgrzej płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Zobacz Rysunek 1 dla typów pożywek i warunków hodowli odpowiednich dla powszechnych rodzajów bakterii moczowych. Dobrze wymieszać rozcieńczony mocz przez pipetowanie przed posiewem, rozlać 100 μl rozcieńczonego moczu na żądaną płytkę agarową i rozprowadzić próbkę za pomocą sterylnych kulek szklanych. Umieść 100 μl 1x rozcieńczalnika PBS na osobnej płytce jako środek do kontroli wzrostu.
      UWAGA: W przypadku próby hodowli pospolitych gatunków uropatogennych (np. Escherichia coli, Klebsiella spp., Enterococcus faecalis itp.), zaleca się użycie agaru chromogennego (Tabela materiałów), ponieważ umożliwia on łatwą identyfikację gatunków bakterii uropatogennych (Rysunek 1). Kolistyna, kwas nalidyksowy (CNA) lub agar MRS są przydatne do izolowania wybrednych gatunków Gram-dodatnich (np. Lactobacillus spp.) z moczu, o którym wiadomo, że zawiera uropatogeny Gram-ujemne, które mogą konkurować z wybrednymi gatunkami w nieselektywnych agarach.
    3. Inkubować odwróconą płytkę w pożądanych warunkach atmosferycznych w temperaturze 35 °C przez okres 24 godzin dla uropatogenów i 3-5 dni dla wybrednych bakterii (Rysunek 1).
    4. Po okresie inkubacji wyjąć płytki z inkubatora. Z każdej płytki wybierz kolonie, które wykazują unikalny kolor, morfologię lub wzory hemolityczne.
    5. Ponownie narysuj kolonię bakteryjną za pomocą sterylnej pętli na odpowiednim agarze i inkubuj odwróconą płytkę przez 2-5 dni w pożądanej atmosferze, aby uzyskać dobrze izolowane kolonie.
      UWAGA: W przypadku wykorzystania BAP do hodowli pierwotnej, łatanie kolonii na agarze chromogennym może dostarczyć przydatnych informacji na temat niejednorodności populacji bakterii w próbce.
  2. Hodowla w płynnym bulionie i izolatach bakteryjnych zawierających glicerol
    1. Po uzyskaniu izolowanych kolonii, które pasują do morfologii kolonii rodzicielskiej, wybierz pojedynczą kolonię i zaszczepij w 3 ml płynnego bulionu za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej. Zapoznaj się z Rysunek 1 dla bulionu zdolnego do wspierania wzrostu powszechnych rodzajów mikroflory układu moczowego. Uszczelnić płytki agarowe parafilmem i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez 2-4 dni. Inkubuj płynne kultury w pożądanych warunkach atmosferycznych przez 1-5 dni, aż kultura będzie widocznie mętna.
    2. Po zaobserwowaniu wzrostu należy zawirować hodowlę, a następnie dodać 1 ml kultury przez noc do 500 μl sterylnego 50% glicerolu w kriowiale o pojemności 2 ml; zamknąć i delikatnie wymieszać przez inwersję. Przygotować dwa zapasy glicerolu dla każdej kolonii (jeden służy jako zapasowy) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Identyfikacja gatunków bakterii za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA Sanger

UWAGA: Tożsamość mikrobiologiczna może być alternatywnie potwierdzona za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)20.

  1. Reakcja łańcuchowa kolonia-polimeraza (PCR)
    1. Przygotuj 25 μl reakcji PCR w probówkach PCR, dodając 12,5 μl 2x Taq Polymerase Master Mix, 0,5 μl 10 μM startera 8F, 0,5 μL startera 10 μM 1492R (tabela materiałów) i 11,5 μl wody wolnej od nukleaz class<=sup class="xref">21.
      UWAGA: Jeśli wykonujesz PCR dla wielu próbek, przygotuj główną mieszankę reakcji składającą się z mieszanki polimerazy Taq, starterów i sterylnej wody wolnej od nukleaz. Następnie podwielokrotność 25 μl do każdej probówki PCR.
    2. Aby wykonać colony-PCR, należy przeciągnąć dobrze odizolowaną kolonię z ponownego pasma za pomocą sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety. Zawiesić kolonię w mieszaninie reakcyjnej PCR przygotowanej w kroku 2.1.1. Delikatnie wymieszaj. Zebrać płyn na dnie tuby, szybko obracając przy 2000 x g.
      UWAGA: Upewnij się, że próbka jest wolna od pęcherzyków powietrza. Dołączyć próbkę kontrolną bez matrycy (NTC) zawierającą samą mieszaninę reakcyjną PCR.
    3. Umieścić probówki z próbkami w termocyklerze i uruchomić następujący program: 95 °C przez 3 minuty; 40 cykli: 95 °C przez 30 s, 51 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min 30 s; 72 °C przez 10 min; trzymaj w temperaturze 10 °C.
  2. Ekstrakcja żelu i identyfikacja gatunków
    1. Po zakończeniu serii PCR sprawdź produkt PCR na 1% żelu agarozowym przygotowanym w 0,5x buforze Tris-Borate-EDTA (TBE). Przed odlaniem żelu dodać bromek etydyny (EtBr). Następnie odlewać żel za pomocą grzebieni do studzienek, które zawierają co najmniej 20 μl próbki o objętości.
      UWAGA: EtBr jest czynnikiem interkalacyjnym, co do którego podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Podczas obchodzenia się z nim należy zawsze nosić rękawice i środki ochrony osobistej, a materiały zawierające EtBr należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji.
    2. Po stężeniu żelu umieść żel w zbiorniku do elektroforezy wypełnionym buforem 0,5x TBE i wyjmij grzebień. Załaduj drabinkę o wielkości 1 kb do pierwszego dołka i 10-20 μl reakcji PCR do kolejnych studzienek. Uruchom przy 100-140 V, aż do rozwiązania. Wizualizuj żel w świetle UV i potwierdź obecność wyraźnie zdefiniowanego pasma na ~1,5 kb, którego nie ma w studzience NTC.
      UWAGA: Promienie UV są szkodliwe dla skóry i oczu, podczas wizualizacji żelu należy używać odpowiedniej osłony i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
      UWAGA: Colony PCR może być nieskuteczny w przypadku niektórych bakterii; Alternatywną opcją jest przeprowadzenie PCR z wyizolowanego gDNA22.
    3. Wytnij pasma ~1,5 kb za pomocą brzytwy i przenieś ścinki żelu do czystych probówek do mikrowirówek. Postępuj zgodnie z protokołem ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
      UWAGA: Pożądane jest stężenie >10 ng/μl, a dopuszczalne jest A260/280 między 1,7-2,0.
    4. Przygotować dwie reakcje sekwencjonowania Sangera dla każdej próbki, jedną przy użyciu 8F, a drugą przy użyciu startera 1492R w wodzie wolnej od nukleaz zgodnie z wytycznymi dowolnie wybranej usługi sekwencjonowania Sangera.
    5. Po otrzymaniu danych sekwencjonowania prześlij sekwencje DNA na stronę NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), wybierz Nucleotide BLAST (blastn), wybierz bazę danych rRNA/ITS 16S rybosomalne sekwencje RNA (bakterie i archeony) i uruchom program Megablast. Izolat można zidentyfikować na podstawie trafienia najwyższej jakości do referencji z bazy danych.
      UWAGA: Niektóre gatunki bakterii wykazują wysoką tożsamość w swoich sekwencjach 16S rRNA i mogą być nie do odróżnienia tylko tą metodą. Specjacja będzie wymagała homologii DNA i analiz biochemicznych, aby z pewnością odróżnić członków tego samego rodzaju23.

3. Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA)

UWAGA: Ta sekcja wykorzystuje odczynniki i kolumny wirowe dostarczone w zestawie do ekstrakcji gDNA, o którym mowa w Tabeli Materiałów, do wysokowydajnej ekstrakcji wysokiej jakości genomowego DNA z różnych gatunków bakterii. Poniżej znajdują się zalecane modyfikacje i instrukcje.

  1. Przygotuj odczynniki w zestawie zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotuj 3-10 ml kultur w odpowiednim sterylnym bulionie (Rysunek 1), zaszczepiając bakterie z dobrze izolowanych kolonii do pożywki i inkubując w temperaturze i ciśnieniu atmosferycznym zanotowanym w Rysunek 1, aż do zaobserwowania wystarczającego wzrostu.
  3. Po inkubacji zmierzyć gęstość optyczną kultury przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru24.
    1. Przygotować próbkę do oznaczania ilościowego, rozcieńczając kultury przez noc w stosunku 1:10. Dołącz również ślepą część sterylnej pożywki hodowlanej do pomiaru. Obliczyć gęstość optyczną, odejmując odczyt ślepej próby od odczytu próbki i mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia równy dziesięć.
  4. Korzystając z pomiaru OD600 i wstępnie ustalonego stosunku OD600 do CFU/ml dla gatunku, oblicz, ile mililitrów kultury jest potrzebnych do uzyskania 2 x 109 komórek.
  5. Odwirować wymaganą objętość kultury przez 5 minut przy 5000 x g do osadzania. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl zimnego buforu TE (wstępnie schłodzić na lodzie na początku procedury).
  6. Odwirowywać próbkę przez 2 minuty przy 5000 x g. Usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 180 μl enzymatycznego buforu do lizy (ELB) i dodać 20 μl wstępnie przegotowanej RNazy A (10 mg/ml). Aby uzyskać skuteczną lizę bakterii Gram-dodatnich, dodaj 18 μl mutanolizyny (25 kU/ml). Dobrze przetworzyć wir, a następnie inkubować próbki w temperaturze 37 °C na rotatorze przez 2 godziny
    UWAGA: Zaleca się stosowanie ELB opisanego w protokole producenta zarówno dla bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych.
  7. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Powtórz etapy elucji jeszcze jeden lub dwa razy, aby w razie potrzeby uzyskać dodatkowy plon gDNA.
  8. Ocenić jakość wyekstrahowanego gDNA zgodnie z instrukcją w punkcie 4 i przechowywać gDNA w temperaturze 4 °C, jeśli zostanie zużyte w ciągu 1 tygodnia. Alternatywnie, utrzymuj gDNA w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Ocena jakości wyekstrahowanego gDNA

  1. Aby ocenić jakość za pomocą elektroforezy żelowej, należy przygotować 1% żel agarozowy zgodnie z opisem w podpunkcie 2.2. Przygotuj próbkę w czystej probówce: wymieszaj 1-2 μl wyekstrahowanego gDNA i 3 μl 2x obciążającego barwnika na parafilm. Po załadowaniu żelu uruchom go, a następnie zwizualizuj go w świetle UV.
    UWAGA: Udana ekstrakcja gDNA będzie widoczna po dyskretnym prążku na górze żelu i minimalnym rozmazywaniu (Rysunek 2A). Rozmazywanie wskazuje na ścinanie. Jeśli nie jest widoczne prążek gDNA i/lub rozmazywanie jest znaczne, powtórz ekstrakcję gDNA. Rozważ skrócenie czasu inkubacji RNazy A i proteinazy K. Jeśli zaobserwuje się dwa prążki o wielkości około 1,5-3 kb, sugeruje to zanieczyszczenie RNA (Rysunek 2B). Przygotuj świeżą RNazę A i powtórz ekstrakcję.
  2. Aby ocenić jakość za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego, zmierz stężenie gDNA i współczynnik absorbancji A260/280 za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Dopuszczalne są stężenia >50 ng/μL i A260/280 w zakresie 1,7-2,0.
    UWAGA: Niska wydajność gDNA może być spowodowana niskim wkładem, wysokim wkładem, zanieczyszczeniem nukleaz, niewystarczającą lizą. Współczynniki absorbancji powyżej zakresu wskazują na zanieczyszczenie RNA. Powtórz ekstrakcję, jeśli jakość gDNA jest słaba.
  3. Aby ocenić jakość za pomocą fluorometru, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi ilościowego określenia stężenia gDNA za pomocą zestawu do testów o wysokiej czułości i przyrządu fluorometrycznego (tabela materiałów). Pożądane jest stężenie >50 ng/μL.

5. Sekwencjonowanie krótkich odczytów nowej generacji i przygotowanie biblioteki na sparowanym końcu

UWAGA: Sekwencjonowanie krótkich odczytów może być wykonywane na różnych instrumentach o różnych długościach i orientacjach. Sekwencjonowanie parowanych końców 150 pz (300 cykli) jest zalecane dla bakteryjnych WGS. Zarówno przygotowanie, jak i sekwencjonowanie bibliotek można zlecić podstawowym placówkom lub laboratoriom komercyjnym.

  1. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela Materiałów). Postępuj zgodnie z zalecanym przez producenta końcowym stężeniem biblioteki ładowania; jednak zalecaną modyfikacją jest załadowanie biblioteki w puli z prędkością 1,8 pM w celu optymalnego generowania odczytu na instrumentach NextSeq.
  2. Chociaż jest to opcjonalne, użyj bioanalizatora (Tabela materiałów), aby ocenić rozkład fragmentów biblioteki zbiorczej i upewnić się, że średni rozmiar fragmentu wynosi 600 pz.

6. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania Nanopore MinION

  1. Przygotuj bibliotekę sekwencjonowania zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów). Użycie dwóch zestawów rozszerzeń kodów kreskowych pozwala na multipleksowanie do 24 próbek na jednej celi przepływowej. Zaleca się przygotowanie biblioteki w dwóch częściach, po 12 próbek na raz przy multipleksowaniu 24 próbek. Wszystkie 24 próbki można połączyć w sposób opisany poniżej.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc po zakończeniu natywnej ligacji kodów kreskowych - w razie potrzeby zapewnia to punkt zatrzymania w protokole. Na końcu sekcji Natywna ligacja kodów kreskowych w protokole przygotowania biblioteki zaleca się zebranie równomolowych ilości każdej próbki do maksymalnej możliwej masy DNA (ng).
    1. W tym celu należy określić ilościowo wszystkie próbki po ligacji kodami kreskowymi za pomocą fluorometru (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Oszacuj objętość próbki o najniższym stężeniu dsDNA, a następnie oblicz całkowitą wartość dsDNA znajdującą się w tej próbce. Użyj tej liczby, aby określić równomolowe ilości wszystkich pozostałych próbek, które zostaną połączone razem.
      UWAGA: Ponieważ obliczenia równomolowe zmaksymalizują ilość połączonego dsDNA, a tym samym dadzą pulę o dużej objętości (>65 μL), konieczne jest oczyszczenie w celu skoncentrowania puli.
  2. Oczyszczanie i koncentracja basenu dsDNA
    1. Dodaj 2,5 razy większą objętość kulek paramagnetycznych (Tabela Materiałów) do puli DNA, a następnie delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość. Umieść probówkę w rotatorze na 5 minut w temperaturze pokojowej. Odkręć próbkę przy 2000 x g i osadź na magnesie.
    2. Dodaj 250 μl świeżo przygotowanego 70% etanolu (w wodzie wolnej od nukleaz), uważając, aby nie naruszyć osadu. Odessać etanol i powtórzyć płukanie etanolem jeden raz.
    3. Po drugim zasysaniu odwirować próbkę o wymiarach 2000 x g i umieścić ją z powrotem na magnesie. Odpipetować resztki etanolu i pozostawić próbkę do wyschnięcia przez około 30 s.
    4. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś granulat w 60-70 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść próbkę na magnesie, aż elucja będzie klarowna, a następnie usuń elucję i przenieś do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    5. Określić ilościowo zagęszczoną pulę za pomocą fluorometru, a następnie przygotować podwielokrotność, aby przejść do etapu ligacji adaptera: przygotować 700 ng próbki w końcowej objętości 65 μl. Pozostałą część basenu należy zachować w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia drugiego cyklu po zakończeniu pierwszego cyklu.
    6. Kontynuuj ligację adaptera zgodnie z instrukcją producenta i załaduj próbkę do celi przepływowej. Rozpocznij sekwencjonowanie run.
      UWAGA: Przed załadowaniem próbki należy zassać powietrze i ~200 μl bufora magazynowego z portu zalewania komory przepływowej. Ma to kluczowe znaczenie dla pomyślnego zalewania komory przepływowej i ładowania próbki. Używaj pipety i końcówek p1000 do pobierania i nakładania roztworów przez port zalewowy celi przepływowej.
  3. Ułóż bibliotekę zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Otwórz oprogramowanie operacyjne do sekwencjonowania i kliknij Start. Wprowadź nazwę eksperymentu, zalecana nomenklatura zawiera datę uruchomienia i nazwę użytkownika. Kliknij Przejdź do wyboru zestawu, wybierz odpowiedni zestaw do przygotowania biblioteki i używane pakiety rozszerzeń kodów kreskowych, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj do opcji uruchamiania.
    2. Dostosuj długość serii do 48 godzin, jeśli planujesz przygotować wystarczającą ilość biblioteki na drugi przebieg (w przeciwnym razie pozostaw domyślne 72 godziny). Kliknij Przejdź do połączenia bazowego.
    3. Zaznacz opcję basecalling Config: Fast Basecalling i upewnij się, że Barcoding jest ustawiony na Enabled, aby wyjściowe pliki FASTQ zostały przycięte z sekwencji kodów kreskowych i zdemultipleksowane do oddzielnych katalogów na podstawie kodu kreskowego. Kliknij Kontynuuj do wyjścia.
    4. Wybierz, gdzie chcesz zapisać wyjściowe dane sekwencjonowania. Spodziewaj się około 30-50 GB danych, jeśli oszczędzasz tylko wyjście FASTQ i >500 GB danych, jeśli oszczędzasz również wyjście FAST5. Odznacz opcję Filtrowanie Qscore: 7 | Readlength: Niefiltrowany, jeśli planujesz kontynuować filtrowanie opisane w sekcji 7.2, w przeciwnym razie pozostaw zaznaczone i dostosuj Readlength do 200.
    5. Kliknij Kontynuuj, aby uruchomić konfigurację i przejrzyj wszystkie ustawienia. Jeśli ustawienia są poprawne, kliknij Start, w przeciwnym razie kliknij Wstecz i dokonaj niezbędnych zmian.
    6. W razie potrzeby komorę przepływową można umyć zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie załadować pozostałą pulą. Powtórz kroki opisane w ppkt 6.2 dla pozostałej puli po zakończeniu pierwszego uruchomienia i umyciu komory przepływowej.
      UWAGA: Podczas ustawiania drugiego przebiegu należy dostosować napięcie polaryzacji na -250 mV zgodnie z zaleceniami producenta dla ogniw przepływowych używanych wcześniej w przebiegach powyżej 48 godzin.

7. Ocenianie i przygotowywanie odczytów

UWAGA: Zalecana struktura katalogów jest przedstawiona w Rysunek 4. Utwórz katalogi znajdujące się na pulpicie, a mianowicie Long_Reads, Short_Reads i Trimmed_Reads, przed przystąpieniem do poniższych kroków obliczeniowych.

  1. Krótkie odczyty (Rysunek 3)
    UWAGA: Krótkie odczyty są generowane w formacie FASTQ. Pliki zawierają maksymalnie 4000 odczytów na FASTQ. Są one często spakowane (.gz archiwum) i zorganizowane w wiele plików. W zależności od platformy, kody kreskowe są zazwyczaj przycinane. Niektóre programy akceptują pliki w formacie spakowanym, inne mogą wymagać ich rozpakowania przed zaimportowaniem. Odczyty muszą przejść etapy kontroli jakości (QC), aby zapewnić dokładność danych podczas składania genomu. Jeśli CLC Genomics Workbench nie jest dostępny, można użyć alternatywnych programów do przycinania i krótkich odczytów QC, takich jak Trimmomatic25 lub Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) do przycinania i FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) do oceny jakości odczytu. Zaleca się, aby średni zasięg krótkiego odczytu, oszacowany przez pomnożenie liczby odczytów przez średnią długość odczytu i podzielenie przez rozmiar genomu, wynosił >100x.
    1. Otwórz oprogramowanie Genomics Workbench (tabela materiałów) i zaimportuj wszystkie sparowane pliki FASTQ z krótkim odczytem. Sparowane pliki zostaną wygenerowane automatycznie.
      1. Utwórz nowy folder pod CLC_Data, klikając Nowy na górnym pasku narzędzi i wybierając Folder... , aby przechowywać pliki. Nazwij folder zgodnie z potrzebami, zalecaną konwencją jest użycie przykładowego identyfikatora. Zapisz wszystkie dane wyjściowe z poniższych kroków w tym folderze.
      2. Na górnym pasku narzędzi kliknij przycisk Importuj i wybierz Illumina... Przejdź do wszystkich plików krótkiego odczytu, które odpowiadają przykładowi, i zaznacz je. Upewnij się, że opcja sparowanych odczytów jest zaznaczona i odznacz opcję Usuń nieudane odczyty. Kliknij Dalej, wybierz Zapisz i ponownie kliknij Dalej. Wybierz, aby zapisać zaimportowane pliki w nowym folderze utworzonym w poprzednim kroku i kliknij Zakończ.
    2. Utwórz sekwencję wszystkich sparowanych plików dla izolatu; spowoduje to połączenie odczytanych danych w jeden plik dla uproszczenia analizy.
      1. Na górnym pasku narzędzi kliknij przycisk Nowy i wybierz Lista sekwencji... Na liście katalogów po lewej stronie wybierz pliki, które chcesz połączyć, i użyj strzałek, aby przenieść je na listę wybranych plików po prawej stronie. Kliknij Dalej, wybierz Zapisz i ponownie kliknij Dalej. Wybierz, aby zapisać listę sekwencji i kliknij Zakończ.
      2. Po wygenerowaniu listy sekwencji natychmiast zmień jej nazwę na identyfikator próbki.
    3. Uruchom narzędzie QC for Sequencing Reads (Kontrola jakości odczytów sekwencjonowania) na liście sekwencji: Ta procedura oceni ogólne parametry jakości odczytów generowanych przez NGS z krótkim odczytem.
      1. Wyszukaj narzędzie QC for Sequencing Reads w menu przybornika (okno w lewym dolnym rogu). Kliknij dwukrotnie narzędzie, a następnie wybierz listę sekwencji do analizy i kliknij Dalej.
      2. Upewnij się, że wszystkie opcje wyjściowe są zaznaczone i wybierz pozycję Zapisz w obszarze Obsługa wyników. Kliknij Dalej i określ, aby zapisać pliki wyjściowe, a następnie kliknij Zakończ.
    4. Uruchom narzędzie Przytnij odczyty na liście sekwencji: Przycinanie zostanie wykonane na podstawie jakości, długości i niejednoznaczności. W tym procesie zakłada się, że kody kreskowe używane w sekwencjonowaniu zostały przycięte przed tym krokiem.
      1. Wyszukaj narzędzie Przytnij odczyty w przyborniku (okno w lewym dolnym rogu). Kliknij dwukrotnie Trim Reads, a następnie wybierz listę sekwencji do analizy i kliknij Dalej.
      2. Przycinanie jakości: ustaw limit wyniku jakości na 0,01 i pozostaw niejednoznaczne nukleotydy na poziomie 2. Kliknij Next.
        UWAGA: Parametry mogą być dostosowywane według uznania użytkownika; To są zalecane ustawienia.
      3. Usuń zaznaczenie opcji Automatic Read-Through Adapter Trimming (Automatyczne przycinanie adapterów do odczytu (należy to zrobić tylko wtedy, gdy adaptery zostały przycięte z odczytów przed zaimportowaniem do CLC). Kliknij Dalej i zaznacz opcję Odrzuć odczyty poniżej długości, użyj domyślnej wartości 15.
      4. Kliknij Dalej, zaznacz Utwórz raport, a następnie wybierz Zapisz. Kliknij Dalej i określ, gdzie chcesz zapisać pliki wyjściowe. Kliknij Zakończ.
    5. Eksportuj listę przyciętych sekwencji: późniejszy montaż i analiza hybrydowa zostaną zakończone poza CLC i wymagają wyeksportowania przyciętych plików krótkiego odczytu.
      1. Z nawigacji po katalogu w lewym górnym rogu wybierz przycięty plik wygenerowany w kroku 7.1.4, a następnie kliknij Eksportuj na górnym pasku narzędzi. Wybierz Fastq jako typ pliku eksportu i kliknij Dalej. Zaznacz opcję Eksportuj listę sparowanych sekwencji do dwóch plików. Następnie kliknij Dalej i wybierz katalog Trimmed_Reads, do którego chcesz wyeksportować pliki. Kliknij Zakończ. Upewnij się, że przycięte pliki krótkiego odczytu zostały pomyślnie wyeksportowane jako dwa pliki (R1 i R2) z rozszerzeniem .fastq.
        UWAGA: Lista przyciętych sekwencji musi zostać wyeksportowana do dwóch plików, zwykle oznaczonych przez CLC jako R1 i R2. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ podrzędny zestaw hybrydowy wymaga skonfigurowania danych wejściowych z krótkim odczytem w taki sposób.
      2. Zmień nazwy eksportowanych plików, powstrzymaj się od używania spacji i znaków specjalnych w nazwach plików. Dla uproszczenia zalecanym formatem jest trimmed_short_file. R1.fastq.
  2. Długa (MinION) odczytuje (Rysunek 3)
    UWAGA: Następujący potok do przygotowania odczytów sekwencjonowania Long (MinION) dla montażu hybrydowego wykorzystuje programy NanoFilt i Nanostat26 wykonywane przez wiersz poleceń. Zainstaluj narzędzia przed kontynuowaniem i zapoznaj się z podstawami systemu UNIX, aby wykonać te polecenia. Zalecane są terminale domyślne i powłoka Bash. Przewodnik po typowych poleceniach terminala i jego użyciu znajduje się na stronie Software Carpentry27. W poniższych instrukcjach założono, że wygenerowane pliki będą nazwane zgodnie z nomenklaturą kodów kreskowych (NB01, NB02 itd.) i zostaną zapisane w katalogu Long_Reads. Alternatywnie filtrowanie odczytu można wykonać przy użyciu MinKNOW podczas konfigurowania przebiegu sekwencjonowania. Zaleca się, aby średni zasięg długiego odczytu wynosił >100x. Zalecana średnia długość odczytu to >2000 bp; W związku z tym liczba potrzebnych długich odczytów jest mniejsza niż liczba krótkich odczytów.
    1. Utwórz nowe katalogi dla każdego kodu kreskowego użytego w przebiegu (kod kreskowy01, kod kreskowy02 itd.) w katalogu Long_Reads (Rysunek 4). Skopiuj wszystkie pliki .fastq, które odpowiadają każdemu kodowi kreskowemu, do odpowiedniego folderu. Połącz wszystkie pliki .fastq dla każdego kodu kreskowego z każdego przebiegu.
    2. Otwórz Terminal i przejdź do katalogów kodów kreskowych w katalogu Long_Reads za pomocą polecenia cd: cd Desktop/Long_Reads/barcode01
    3. Połącz wszystkie pliki .fastq z kodem kreskowym w jeden plik .fastq, wykonując następujące polecenie: cat *.fastq > NB01.fastq
      UWAGA: To polecenie łączy wszystkie odczyty z każdego z plików FASTQ w jeden duży, pojedynczy plik FASTQ o nazwie NB01.fastq.
    4. Użyj NanoStat, aby ocenić jakość odczytu próbki, wykonując następujące polecenie: NanoStat --fastq NB01.fastq
    5. Zapisz wyniki, kopiując dane wyjściowe do pliku tekstowego lub Word do wykorzystania w przyszłości.
    6. Użyj NanoFilt do filtrowania odczytów MinION, odrzucając odczyty z Q < 7 i długością < 200, wykonując polecenie: NanoFilt -q 7 -l 200 bp NB01.fastq | gzip > NB01 _trimmed.fastq.gz
    7. Uruchom NanoStat na przyciętym pliku wygenerowanym w kroku 7.2.6, wykonując polecenie: NanoStat --fastq NB01 _trimmed.fastq.gz
    8. Zapisz wyniki, kopiując dane wyjściowe do pliku tekstowego lub Word i porównaj je z wynikami z kroku 7.2.4, aby upewnić się, że filtrowanie zakończyło się powodzeniem (Tabela 1).
    9. Powtórz kroki od 7.2.2 do 7.2.8 dla każdego kodu kreskowego używanego w sekwencjonowaniu run.
      UWAGA: Plik NB01_trimmed.fastq.gz wygenerowany w kroku 7.2.6 będzie używany do montażu hybrydowego.

8. Generowanie hybrydowego składania genomu

UWAGA: Poniższy potok montażowy wykorzystuje Unicycler19,28,29,30 do łączenia krótkich i długich odczytów przygotowanych w sekcjach 7.1 i 7.2 (Rysunek 3). Zainstaluj Unicycler i jego zależności, a następnie wykonaj poniższe polecenia. Zakłada się, że pliki o krótkim odczycie wyeksportowane w kroku 7.1.5 mają nazwę trimmed_short_file. R1.fastq i trimmed_short_file. R2.fastq dla uproszczenia.

  1. Uporządkuj pliki z krótkimi i długimi odczytami w jednym katalogu o nazwie Trimmed_Reads. Katalog musi zawierać następujące informacje:
    1. Plik .fastq.gz dla przyciętych długich odczytów (wygenerowany w kroku 7.2.6).
    2. Dwa pliki .fastq (R1 i R2) dla przyciętych krótkich odczytów (wygenerowane w kroku 7.1.5).
  2. Przejdź do katalogu Trimmed_Reads, w którym przechowywane są odczytane pliki, za pomocą polecenia cd w Terminalu: cd Desktop/Trimmed_Reads
    1. Po znalezieniu się w odpowiednim katalogu spakuj dwa krótkie pliki do odczytu, aby były również w formacie .fastq.gz, wykonując następujące polecenie: gzip trimmed_short_file. R1.fastq
  3. Powtórz krok 8.2 zarówno dla R1, jak i R2. Sprawdź, czy wszystkie odczytane pliki są teraz w formacie .fastq.gz i sprawdź, czy wszystkie pliki pasują do tego samego izolatu.
  4. Rozpocznij montaż hybrydowy za pomocą monocyklera, uruchamiając następujące polecenie:
    monocykler -1 trimmed_short_file. R1.fastq.gz -2 trimmed_short_file. R2.fastq.gz -l NB01 _trimmed.fastq.gz -o unicycler_output_directory
    UWAGA: -o określa katalog, w którym zostaną zapisane dane wyjściowe Unicycler, Unicycler utworzy ten katalog po wykonaniu polecenia; Nie generuj katalogu wcześniej. Czas działania różni się w zależności od mocy obliczeniowej używanego komputera, a także rozmiaru genomu i liczby odczytów. Może to potrwać od 4 godzin do 1 lub 2 dni. Protokół ten został wykonany na komputerze CentOS Linux 7 z 250 GB pamięci RAM, procesorem Intel Xeon(R) z 2,5 GHz, 12 praktycznymi rdzeniami i 48 rdzeniami wirtualnymi. Alternatywnie, komputery osobiste z 16 GB pamięci RAM i 6-rdzeniowymi procesorami 2,6 GHz mogą obliczać te zestawy w dłuższym czasie przetwarzania.
  5. Po zakończeniu przebiegu przejrzyj plik unicycler.log, aby upewnić się, że nie ma błędów — zapisz liczbę, rozmiar i stan (ukończony, niekompletny) wygenerowanych kontigów.
    1. Jeśli zostaną zidentyfikowane niekompletne kontigi (oznaczone jako niekompletne w dzienniku monocyklera), uruchom ponownie monocykler w trybie pogrubionym, dodając następującą flagę do polecenia w kroku 8.4: --mode bold.
      UWAGA: Tryb pogrubienia obniży próg jakości akceptowany dla mostków z długim odczytem podczas montażu; Może to dać kompletny montaż, ale jakość montażu może ulec pogorszeniu. Zaleca się stosowanie trybu pogrubionego tylko wtedy, gdy jest to konieczne i jako wstępny dowód na połączenie kontigowe, które zostanie później potwierdzone przez PCR.

9. Ocena jakości montażu

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje Bandage31 i QUAST32, dwa programy, które muszą być zainstalowane przed użyciem (Rysunek 2 i Rysunek 4). Bandage nie wymaga instalacji po pobraniu, a QUAST wymaga znajomości podstawowej obsługi wiersza poleceń. Zaleca się również ocenę kompletności genomu za pomocą Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO)33.

  1. Bandaż: Kliknij Plik. Następnie wybierz opcję Załaduj wykres i wybierz plik assembly.gfa, który został zapisany w unicycler_output_directory wygenerowany przez Unicyclera w kroku 8.4. Po załadowaniu kliknij przycisk Rysuj wykres na pasku narzędzi po lewej stronie i zobacz, jak kontigi (zwane węzłami) są połączone i zorganizowane, aby ocenić, czy zestaw jest kompletny (Rysunek 5).
    UWAGA: Kompletne zespoły są reprezentowane przez pojedyncze okrągłe kontigi połączone na obu końcach (Rysunek 5A,B). Niekompletne zespoły mają wiele kontigów połączonych ze sobą lub są liniowe (Rysunek 5C). Małe kontigi liniowe mogą nie być niekompletne, ponieważ mogą wskazywać na liniowe elementy pozachromosomalne. Pokrycie, zwane również głębokością, zostanie odnotowane w bandażu i reprezentuje względną obfitość kontigów do chromosomu, znormalizowanych w monocykliku do 1x.
  2. KWAST
    1. W terminalu przejdź do folderu, w którym przechowywane są dane wyjściowe monocyklera za pomocą polecenia cd: cd Desktop/Trimmed_Reads/unicycler_output_directory
      UWAGA: Spacje nie są dozwolone w ścieżce do miejsca, w którym znajduje się zestaw, tj. żadne katalogi prowadzące do wyjścia Unicyclera nie mogą mieć spacji w swojej nazwie. Alternatywnie skopiuj plik assembly.fasta na pulpit, aby uzyskać łatwy dostęp.
    2. Uruchom QUAST, wykonując następujące polecenie: quast assembly.fasta -o quast_output_directory
    3. Przejrzyj raporty wygenerowane przez QUAST w katalogu wyjściowym quast_output_directory.

10. Adnotacja genomu

UWAGA: Poniższy potok adnotacji wykorzystuje Prokka34, narzędzie wiersza poleceń, które musi zostać zainstalowane przed użyciem. Alternatywnie, użyj Prokka za pośrednictwem zautomatyzowanego GUI K-Base (Table of Materials) lub dodawaj adnotacje do genomów za pośrednictwem serwera WWW RAST35. W przypadku deponowania genomów w NCBI, zostaną one automatycznie oznaczone adnotacjami przy użyciu potoku adnotacji genomu prokariotycznego (PGAP)36.

  1. Przejdź w terminalu do folderu, w którym przechowywane są dane wyjściowe monocyklera za pomocą polecenia cd (patrz krok 9.2.1). Następnie uruchom Prokka, wykonując następujące polecenie: prokka --prefix sample_ID --outdir prokka_output_directory assembly.fasta
    UWAGA: --prefix nazwie wszystkie pliki wyjściowe na podstawie podanego sample_ID. --outdir utworzy katalog wyjściowy o podanej nazwie, w którym zostaną zapisane wszystkie pliki wyjściowe Prokka; nie twórz wcześniej katalogu wyjściowego dla Prokki.
  2. Przejrzyj adnotacje, otwierając tabelę .tsv i/lub przesyłając plik .gff wygenerowany do oprogramowania do analizy sekwencji w celu wizualizacji i analizy adnotacji (Rysunek 6).
  3. W zależności od interesujących czynników genetycznych można generować określone typy adnotacji. Zaleca się rozpoczęcie od przyjaznych dla użytkownika narzędzi na serwerze internetowym Centrum Epidemiologii Genomowej (www.genomicepidemiology.org/) do wstępnej analizy37,38,39,40,41. Dostępne są dodatkowe narzędzia do wykrywania systemów CRISPR-cas i profagów (Rysunek 3)42,43.

11. Sugerowane praktyki demokratyzacji danych

  1. Jeśli to możliwe, zdeponuj wszystkie surowe odczytane dane, a także zmontowane genomy, w publicznym repozytorium, takim jak NCBI Sequence Read Archive () i Genbank. Genomy są automatycznie opisywane za pośrednictwem potoku PGAP podczas procesu osadzania NCBI.

Wyniki

Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli i sekwencjonowania bakterii z moczu należących do rodzajów wymienionych na Rysunku 1. Nie wszystkie bakterie z moczu można hodować tą metodą. Pożywki i warunki hodowli są określone w zależności od rodzaju na Rysunku 1. Przykładowe oceny integralności gDNA za pomocą elektroforezy żelowej przedstawiono na Rysunku 2. Przegląd potoku bioinformatycznego dla przetwarzania odczytów z sekwencjonowania, składania genomu i adnotacji opisano na Rysunku 3. W celu uproszczenia zrozumienia protokołu oraz zapewnienia struktury dla skutecznej organizacji, na Rysunku 4 zamieszczono przewodnik po strukturze katalogów obliczeniowych. Ponadto dołączono reprezentatywne kompletne genomy dwóch gatunków Klebsiella spp., K. pneumoniae oraz K. oxytoca, które zostały wygenerowane zgodnie z tym protokołem. Przedstawienie tych złożeń znajduje się na Rysunku 5, który zawiera również dodatkowy, niekompletny przykład genomu K. pneumoniae. Szczegółowy przegląd każdego w pełni adnotowanego kompletnego genomu pokazano na Rysunku 6. Na koniec, w Tabeli 1 zamieszczono podsumowanie statystyk odczytów z sekwencjonowania, aby zapewnić szerokie zrozumienie surowych i przyciętych danych, wystarczających do wygenerowania wysokiej jakości zamkniętych złożeń genomów. Dodatkowo wymieniono kluczowe parametry dwóch reprezentatywnych kompletnych genomów Klebsiella spp. Genomy i surowe dane zostały zdeponowane w Genbank w ramach BioProject PRJNA683049.

Tabela warunków wzrostu bakterii; beztlenowe vs otoczenie; agar vs bulion; Streptococcus do Alloscardovia.
Rycina 1: Zmodyfikowana wzbogacona hodowla moczu dla różnych rodzajów bakterii obecnych w moczu. Tabela agaru oraz bulionu, które mogą być stosowane do hodowli różnych rodzajów bakterii obecnych w moczu. Sugeruje się, aby wszystkie hodowle prowadzono w temperaturze 35 °C, zgodnie z opisem w podrozdziale 1.1. Koła reprezentują podłoża odpowiednie do hodowli danego rodzaju; kolory wybrano arbitralnie w celu odróżnienia poszczególnych typów podłoży. CDC-AN BAP (czerwony), agar z krwią owczą dla beztlenowców CDC; 5% Sheep-BAP (pomarańczowy), agar z krwią owczą; BHI (zielony), infuzja mózgowo-sercowa; TSB (żółty), bulion sojowo-kazeinowy; CHROMagar Orientation (niebieski). aGardnerella vaginalis powinna być hodowana na selektywnym agarze dwuwarstwowym HBT Bilayer G. vaginalis w atmosferze mikroaerofilnej i zgodnie ze specjalnymi wymaganiami dotyczącymi hodowli w bulionie44. bLactobacillus iners powinna być hodowana na płytkach 5% Rabbit-BAP i w bulionie NYCIII w atmosferze mikroaerofilnej. cLactobacillus spp. mogą być hodowane na podłożu MRS w warunkach mikroaerofilnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat elektroforezy żelowej przedstawiający separację DNA i analizę prążków w ścieżkach 1-3; wyniki eksperymentalne.
Rycina 2: Obrazy żelu agarozowego po ekstrakcji genomowego DNA. Reprezentatywne obrazy żelu przedstawiające wyniki ekstrakcji gDNA. (A) Ścieżka 1: drabinka 1 kb, ścieżka 2: nienaruszone gDNA świadczące o udanej ekstrakcji, ścieżka 3: rozmycie (smearing) wskazujące na pofragmentowane gDNA. (B) Ścieżka 1: drabinka 1 kb, ścieżki 2 i 3: kontaminacja rRNA objawiająca się dwoma prążkami pomiędzy 1.5 kb a 3 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat składania genomu: przetwarzanie odczytów sekwencyjnych, hybrydowe składanie de novo, etapy adnotacji.
Rysunek 3: Schemat hybrydowego składania genomu. Schemat etapów od kontroli jakości i wstępnego przetwarzania odczytów do adnotacji składania. Przycinanie odczytów usuwa odczyty niejednoznaczne i niskiej jakości. Wskazano parametry Q-score i długości, które określają odczyty zachowane w analizie. Składanie wykorzystuje zarówno krótkie, jak i długie odczyty w celu wygenerowania hybrydowego składania genomu de novo. Jakość składania jest oceniana na podstawie kompletności i poprawności przy użyciu określonych narzędzi i parametrów. Końcowe składanie genomu zostaje poddane adnotacji dla wszystkich genów oraz specyficznych locus będących przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Przebieg sekwencjonowania DNA; concatenate, gzip, unicycler, prokka; struktura katalogów bioinformatycznych.
Rycina 4: Przewodnik po strukturze katalogów bioinformatycznych. Schemat zalecanej organizacji katalogów i plików dla przetwarzania krótkich i długich odczytów, składania hybrydowego, adnotacji genomu oraz kontroli jakości (QC). Kluczowe kroki przetwarzania danych w wierszu poleceń zostały zaznaczone obok odpowiednich plików i katalogów. Wskazano polecenia i flagi (pogrubione), pliki wejściowe (niebieski), pliki lub katalogi wyjściowe (czerwony) oraz dane wprowadzane przez użytkownika, takie jak konwencja nazewnictwa plików (magenta). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sekwencja chromosomu, schemat mapy plazmidu; składanie DNA, analiza genetyczna, identyfikacja plazmidów.
Rysunek 5: Grafy składania genomu wykonane programem Bandage. Reprezentatywne grafy pełnego składania genomu dla (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 oraz (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25 oraz niepełne składanie genomu dla (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. Pełny genom KoPF10 wykazuje pojedynczy zamknięty chromosom, a pełny genom KpPF25 składa się z zamkniętego chromosomu i pięciu zamkniętych plazmidów. Niepełny chromosom KpPF46 składa się z dwóch połączonych kontigów. Hybrydowe składanie de novo za pomocą Unicycler generuje graf składania, który jest wizualizowany przez Bandage. Graf składania dostarcza uproszczonego schematu genomu, wskazując zamknięty chromosom lub plazmidy poprzez łącznik łączący dwa końce pojedynczego kontigu. Obecność więcej niż jednego połączonego kontigu wskazuje na niepełne składanie. W programie Bandage można również odczytać rozmiar i głębokość pokrycia kontigów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Koliste mapy genomu; sekwencje DNA z adnotacjami genów; schemat plazmidu; analiza genomiczna.
Rycina 6: Kompletne mapy genomu adnotowanych asemblii hybrydowych. Mapy asemblii wygenerowane za pomocą oprogramowania Geneious Prime dla kompletnego genomu (A) K. oxytoca KoPF10 oraz (B) K. pneumoniae KpPF25, przedstawiające adnotowane geny oznaczone kolorowymi strzałkami wzdłuż szkieletów plazmidów. Na chromosomach dla uproszczenia zaznaczono jedynie geny rRNA i tRNA. Adnotacje genomu wykonano przy użyciu programu Prokka, zgodnie z opisem w sekcji 10 niniejszego protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela z danymi sekwencjonowania genomu bakteryjnego; zawiera metryki odczytów, zawartość GC i szczegóły dotyczące plazmidów.
Tabela 1: Charakterystyka kompletnego montażu reprezentatywnych gatunków Klebsiella spp.. Parametry montażu szczepu K. oxytoca KoPF10 oraz szczepu K. pneumoniae KpPF25. Podano numery dostępowe dla danych zdeponowanych w bazie NCBI. Określono liczbę odczytów przed i po przycinaniu dla obu technologii sekwencjonowania. Wartość N50 podano wyłącznie dla długich odczytów, ponieważ krótkie odczyty mają kontrolowaną długość. Replikon plazmidowy przewidziany przy użyciu bazy danych Enterobacteriaceae programu PlasmidFinder v2.1 z parametrami ustawionymi na 80% tożsamości i 60% długości. a MLST, typ sekwencji wielomiejscowej. b CDS, sekwencje kodujące. c Replikon plazmidowy przewidziany przy użyciu bazy danych Enterobacteriaceae programu PlasmidFinder v2.1 z parametrami ustawionymi na 80% tożsamości i 60% długości. d Zdeponowane dane odczytów Oxford Nanopore Technologies (ONT). e Zdeponowane dane odczytów Illumina. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Opisany tutaj kompleksowy protokół hybrydowego składania genomu oferuje uproszczone podejście do udanej hodowli różnorodnej mikroflory moczowej i uropatogenów oraz kompletnego składania ich genomów. Udane badanie genomów bakteryjnych zaczyna się od izolacji różnorodnych i czasami wybrednych drobnoustrojów w celu wyodrębnienia ich genomowego DNA. Do tej pory istniejące protokoły posiewu moczu albo nie są wystarczająco czułe, aby wykryć wiele gatunków moczu, albo obejmują długotrwałe i rozległe podejścia, które wymagają dłuższego czasu i zasobów11. Opisane zmodyfikowane podejście do ulepszonej hodowli moczu oferuje uproszczony, ale kompleksowy protokół skutecznej izolacji bakterii należących do 17 powszechnych rodzajów moczu, w tym potencjalnie patogennych lub korzystnych gatunków komensalnych, a także zarówno fakultatywnych, jak i obligatoryjnych bakterii tlenowych lub beztlenowych. To z kolei dostarcza niezbędnego materiału wyjściowego do dokładnego sekwencjonowania i składania genomów bakteryjnych oraz do krytycznych eksperymentów fenotypowych, które przyczyniają się do zrozumienia zdrowia i chorób układu moczowego. Co więcej, to zmodyfikowane podejście do hodowli zapewnia bardziej precyzyjną diagnostykę kliniczną żywych mikroorganizmów znalezionych w próbkach moczu i pozwala na ich biobankowanie na potrzeby przyszłych badań genomicznych. Protokół ten nie jest jednak pozbawiony ograniczeń. Może to wymagać długiego czasu inkubacji w zależności od organizmu, a także użycia zasobów, takich jak komora hipoksji lub kontrolowane inkubatory, które mogą nie być łatwo dostępne. Alternatywnym rozwiązaniem jest stosowanie beztlenowych opakowań GasPaks, ale są one kosztowne i nie zawsze zapewniają trwałe i kontrolowane środowisko. Wreszcie, stronniczość kulturowa, a także różnorodność próbek mogą pozwolić określonym organizmom i uropatogenom na pokonanie wybrednych bakterii. Pomimo tych ograniczeń, dzięki takiemu podejściu możliwa jest hodowla różnych bakterii moczowych.

Sekwencjonowanie genomu zyskało popularność wraz z postępem technologii sekwencjonowania nowej generacji, które ogromnie zwiększyły zarówno wydajność, jak i dokładność danych sekwencjonowania14,15. W połączeniu z rozwojem algorytmów przetwarzania danych i składania de novo, kompletne sekwencje genomu są na wyciągnięcie ręki zarówno początkujących, jak i doświadczonych naukowców15,45. Wiedza na temat ogólnej organizacji genomu dostarczana przez kompletne genomy dostarcza ważnych ewolucyjnych i biologicznych spostrzeżeń, w tym duplikacji genów, utraty genów i horyzontalnego transferu genów14. Ponadto geny ważne dla oporności i zjadliwości środków przeciwdrobnoustrojowych są często zlokalizowane na ruchomych elementach, które zwykle nie są rozpoznawane w roboczych zespołach genomu15,16.

Niniejszy protokół jest zgodny z hybrydowym podejściem do łączenia danych sekwencjonowania z platform krótkiego i długiego odczytu w celu wygenerowania kompletnych zestawów genomu. Chociaż koncentruje się na genomach bakterii moczowych, procedura ta może być dostosowana do różnych bakterii z różnych źródeł izolacji. Kluczowe kroki w tym podejściu obejmują stosowanie odpowiedniej sterylnej techniki oraz wykorzystanie odpowiednich pożywek i warunków hodowli do izolacji czystych bakterii moczowych. Co więcej, ekstrakcja nienaruszonego, wysokowydajnego gDNA jest niezbędna do generowania danych sekwencjonowania wolnych od zanieczyszczających odczytów, które mogą utrudnić pomyślne składanie. Kolejne protokoły przygotowania biblioteki mają kluczowe znaczenie dla generowania wysokiej jakości odczytów o wystarczającej długości i głębokości. Dlatego niezwykle ważne jest, aby obchodzić się z gDNA z ostrożnością podczas przygotowywania biblioteki do sekwencjonowania długich odczytów, ponieważ największą zaletą tej technologii jest generowanie długich odczytów bez teoretycznego górnego limitu długości. Przedstawiono również sekcje dotyczące odpowiedniej kontroli jakości (QC) odczytów sekwencjonowania, która eliminuje zaszumione dane i poprawia wyniki montażu.

Pomimo udanej izolacji DNA, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania, charakter architektury genomowej niektórych gatunków może nadal stanowić przeszkodę w generowaniu zamkniętego zespołu genomu45,46. Powtarzające się sekwencje często komplikują obliczenia asemblera i pomimo długiego czasu odczytu danych, regiony te mogą być rozwiązywane z niską pewnością lub wcale. Długie odczyty muszą być zatem średnio dłuższe niż największy region powtórzeń w genomie lub pokrycie musi być wysokie (>100x)19. Niektóre genomy mogą pozostać niekompletne i wymagać ręcznego podejścia do uzupełnienia. Niemniej jednak, niekompletne genomy złożone hybrydowo składają się zazwyczaj z mniejszej liczby kontigów niż genomy o krótkim odczycie. Pomocne może być dostosowanie domyślnych parametrów algorytmu montażu lub przestrzeganie bardziej rygorystycznych odcięć dla odczytu QC. Alternatywnie, jednym z sugerowanych podejść jest mapowanie długich odczytów do niekompletnych regionów w poszukiwaniu dowodów na najbardziej prawdopodobną ścieżkę składania, a następnie potwierdzenie ścieżki za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera amplifikowanego regionu. Sugerowane jest mapowanie odczytów za pomocą Minimap2, a Bandage oferuje przydatne narzędzie do wizualizacji zmapowanych odczytów wzdłuż zmontowanych kontigów, dostarczając dowodów na powiązanie kontigów47.

Dodatkowym wyzwaniem związanym z generowaniem kompletnych genomów jest znajomość i wygoda korzystania z narzędzi wiersza poleceń. Wiele narzędzi bioinformatycznych jest opracowywanych tak, aby oferować możliwości obliczeniowe każdemu użytkownikowi; jednak ich wykorzystanie opiera się na zrozumieniu podstaw systemu UNIX i programowania. Protokół ten ma na celu dostarczenie wystarczająco szczegółowych instrukcji, aby umożliwić osobom bez wcześniejszego doświadczenia w wierszu poleceń generowanie zamkniętych zestawów genomu i dodawanie do nich adnotacji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Moutusee Jubaida Islam i dr Luke'owi Joyce'owi za ich wkład w ten protokół. Chcielibyśmy również podziękować University of Texas at Dallas Genome Center za ich opinie i wsparcie. Ta praca została sfinansowana przez Welch Foundation, nagroda numer AT-2030-20200401 dla N.J.D., przez National Institutes of Health, nagroda numer R01AI116610 dla K.P., oraz przez Katedrę Zdrowia Kobiet Felecia i Johna Cainów, której właścicielem był P.E.Z.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< strong> Sprzęt: < / strong>
Bioanalyzer 2100AgilentG29398AOpcjonalny, ale zalecany
WirówkaEppendorf-Dowolna wirówka do wirowania stożków i probówek do mikrowirówek (np. Modele 5810R/5424R)
ElektroforezaBioRad Laboratories1645070
System obrazowania żelowegoBioRad LaboratoriesModele ChemiDoc
InkubatorThermoFisher Scientific--Dowolny inkubator CO2 (np. Thermo Forma model 3110)
Stojak magnetycznyNew England BioLabsS1509512-tubowy
stojak MinIONOxford Nanopore Technologies--
NanodropThermoFisher ScientificND-ONE-W
NastępnySeq 500IlluminaSY-415-1002Inne modele Illumina są dopuszczalne
Czytnik płytekBioTek--Synergy H1
Fluorometr kubitowyThermoFisherScientific Q33238
RotatorBenchmark Scientific TermocyklerH2024
ThermoFisher Scientific-dowolny termocykler do PCR reakcje (np. System ProFlex PCR)
< silny> Materiały: < / strong>
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Bufor TBE Fisher ScientificBP3991
10X----1M Tris, 1M Kwas borowy, 0,2M EDTA (pH 8,0)
1429R starterSigma Aldrich (niestandardowe oligonukleotydy)--GGTTACCTTGTTACGACTT
1kb DrabinaVWR101228-494
1M Tris-Cl (pH 7,5)ThermoFisher Scientific15567027
6x Barwnik ładującyFisher ScientificNC0783588
8F primerSigma Aldrich (Niestandardowe oligokleotydce)--AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
AgarFisher ScientificBP1423-2
AgarozaBioRad Laboratories63001
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63880
System woreczków beztlenowych - GasPak EZBD Systemy diagnostyczneB260683
Kwas borowyFisher ScientificA73-500
Bulion do infuzji sercamózgu Systemy diagnostyczne BD212304
CDC Anaerobe 5% Agar z krwią owcząBD Systemy diagnostyczneL007357
Systemy diagnostyczne BDw orientacji CHROMagarPA-257481.04
DNeasy Blood & TkankaQIAGEN69504
DreamTaq Master MixThermoFisher ScientificK1081
Suche beztlenowe paski wskaźnikoweSystemy diagnostyczne BD 271051
EDTAFisher ScientificS311-500
Etanol 200 ProofSigmaAldrich E7023Do biologii molekularnej
BromeketydynyThermoFisher ScientificBP130210
Zestaw do zalewania komórek przepływowychOxford Nanopore TechnologiesEXP-FLP002
Zestaw do mycia komórek przepływowychOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH003
Zestaw do ekstrakcji żelu MiniprepBioBasicBS654
Zestaw do sekwencjonowania ligacjiOxford Nanopore TechnologiesSQK-LSK109
LysozymeResearch Products International CorpL381005.05
MutanolizynaSigma AldrichM9901-5KU
Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12Oxford Nanopore TechnologiesEXP-NBD104
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BioLabsM0367L
NEBNext FFPE DNA Repair MixNew England BioLabsM6630L
Bufor do szybkiej ligacji NEBNextNew England BioLabsB6058S
NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing moduleNew England BioLabsE7546L
Nextera DNA CD IndexesIllumina20018708
Nextera DNA Flex Library Prep - (M) TagmentationIllumina20018705
Woda wolna od nukleazSigma AldrichW4502
Zestaw testowy Qubit 1X dsDNA HSThermoFisher ScientificQ33230
Probówki do oznaczania kubitówThermoFisher ScientificQ32856
Szybka ligaza DNA T4New England BioLabsE6056L
R9 Komórka przepływowaOxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN106D
RNaza AThermoFisher ScientificEN0531
Laboratoria HemostatuKrwi OwczejDS13250
Bufor TE----10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8,0)
Triton X-100Sigma AldrichT8787
Tryptyczny bulion sojowyBD Systemy diagnostyczne211825
Software & Narzędzia bioinformatyczne: < / strong>
Bandaż----https://rrwick.github.io/Bandage/
Centrum Epidemiologii Genomicznej----http://www.genomicepidemiology.org/
CLC Genomics Workbench 12QIAGEN--
CRISPRcasFinder---- https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/
FastQC----https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
Geneious PrimeGeneious--
gVolante (BUSCO)----https://gvolante.riken.jp/
Kbase Prokka Wrapper----https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release
Minimap2---- https://github.com/lh3/minimap2
MinKNOWOxford Nanopore Technologies--
NanoFilt----https://github.com/wdecoster/nanofilt
NanoStat---https://github.com/wdecoster/nanostat
PHASTER----https://phaster.ca/
Prokka----https://github.com/tseemann/prokka
QUAST----http://quast.sourceforge.net/quast
Trymer w bród---https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
Trimmomatic----http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Monocykler----https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length

Bibliografia

  1. Brubaker, L., Wolfe, A. The urinary microbiota: a paradigm shift for bladder disorders. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 28 (5), 407-412 (2016).
  2. Neugent, M. L., Hulyalkar, N. V., Nguyen, V. H., Zimmern, P. E., De Nisco, N. J. Advances in understanding the human urinary microbiome and its potential role in urinary tract infection. mBio. 11 (2), (2020).
  3. Klein, R. D., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: microbial pathogenesis, host-pathogen interactions and new treatment strategies. Nature Reviews. Microbiology. 18 (4), 211-226 (2020).
  4. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), 83637(2013).
  5. Reitzer, L., Zimmern, P. Rapid growth and metabolism of uropathogenic Escherichia coli in relation to urine composition. Clinical Microbiology Reviews. 33 (1), 00101-00119 (2019).
  6. Snyder, J. A., et al. Transcriptome of uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infection. Infection and Immunity. 72 (11), 6373-6381 (2004).
  7. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 14(2016).
  8. Babikir, I. H., et al. The impact of cathelicidin, the human antimicrobial peptide LL-37 in urinary tract infections. BMC Infectious Diseases. 18 (1), 17(2018).
  9. Jancel, T., Dudas, V. Management of uncomplicated urinary tract infections. The Western Journal of Medicine. 176 (1), 51-55 (2002).
  10. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T. 40 (4), 277-283 (2015).
  11. Price, T. K., et al. The clinical urine culture: Enhanced techniques improve detection of clinically relevant microorganisms. Journal of Clinical Microbiology. 54 (5), 1216-1222 (2016).
  12. Kass, E. H. Asymptomatic infections of the urinary tract. Transactions of the Association of American Physicians. 69, 56-64 (1956).
  13. Garcia, L. S. Clinical microbiology procedures handbook. 3rd edn. , ASM Press. (2010).
  14. Fraser, C. M., Eisen, J. A., Nelson, K. E., Paulsen, I. T., Salzberg, S. L. The value of complete microbial genome sequencing (you get what you pay for). Journal of Bacteriology. 184 (23), 6403-6405 (2002).
  15. Chen, Z., Erickson, D. L., Meng, J. Benchmarking hybrid assembly approaches for genomic analyses of bacterial pathogens using Illumina and Oxford Nanopore sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 631(2020).
  16. Greig, D. R., Dallman, T. J., Hopkins, K. L., Jenkins, C. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of bacterial antibiotic resistance determinants in a multidrug-resistant strain of enteroaggregative Escherichia coli. Microbial Genomics. 4 (10), 000213(2018).
  17. Carraro, D. M., et al. PCR-assisted contig extension: stepwise strategy for bacterial genome closure. Biotechniques. 34 (3), 626-628 (2003).
  18. Tettelin, H., Radune, D., Kasif, S., Khouri, H., Salzberg, S. L. Optimized multiplex PCR: efficiently closing a whole-genome shotgun sequencing project. Genomics. 62 (3), 500-507 (1999).
  19. Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L., Holt, K. E. Unicycler: Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Computational Biology. 13 (6), 1005595(2017).
  20. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in Microbiology. 6, 791(2015).
  21. Turner, S., Pryer, K. M., Miao, V. P., Palmer, J. D. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 46 (4), 327-338 (1999).
  22. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  23. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  24. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Science Reports. 6, 38828(2016).
  25. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  26. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34 (15), 2666-2669 (2018).
  27. Wilson, G., et al. The UNIX Shell. Zenodo. , (2019).
  28. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  29. Vaser, R., Sovic, I., Nagarajan, N., Sikic, M. Fast and accurate de novo genome assembly from long uncorrected reads. Genome Research. 27 (5), 737-746 (2017).
  30. Walker, B. J., et al. Pilon: an integrated tool for comprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement. PLoS One. 9 (11), 112963(2014).
  31. Wick, R. R., Schultz, M. B., Zobel, J., Holt, K. E. Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics. 31 (20), 3350-3352 (2015).
  32. Gurevich, A., Saveliev, V., Vyahhi, N., Tesler, G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 29 (8), 1072-1075 (2013).
  33. Simao, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31 (19), 3210-3212 (2015).
  34. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  35. Aziz, R. K., et al. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 9, 75(2008).
  36. Tatusova, T., et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6614-6624 (2016).
  37. Carattoli, A., Hasman, H. PlasmidFinder and In Silico pMLST: Identification and Typing of Plasmid Replicons in Whole-Genome Sequencing (WGS). Methods in Molecular Biology. 2075, 285-294 (2020).
  38. Carattoli, A., et al. In silico detection and typing of plasmids using PlasmidFinder and plasmid multilocus sequence typing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 3895-3903 (2014).
  39. Larsen, M. V., et al. Multilocus sequence typing of total-genome-sequenced bacteria. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1355-1361 (2012).
  40. Bortolaia, V., et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (12), 3491-3500 (2020).
  41. Joensen, K. G., et al. Real-time whole-genome sequencing for routine typing, surveillance, and outbreak detection of verotoxigenic Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. 52 (5), 1501-1510 (2014).
  42. Arndt, D., et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44 (1), 16-21 (2016).
  43. Couvin, D., et al. CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins. Nucleic Acids Research. 46 (1), 246-251 (2018).
  44. Totten, P. A., Amsel, R., Hale, J., Piot, P., Holmes, K. K. Selective differential human blood bilayer media for isolation of Gardnerella (Haemophilus) vaginalis. Journal of Clinical Microbiology. 15 (1), 141-147 (1982).
  45. Nagarajan, N., Pop, M. Sequence assembly demystified. Nat Reviews. Genetics. 14 (3), 157-167 (2013).
  46. Phillippy, A. M., Schatz, M. C., Pop, M. Genome assembly forensics: finding the elusive mis-assembly. Genome Biology. 9 (3), 55(2008).
  47. Wick, R. R. Unicycler Wiki. , Available from: https://github.com/rrwick/Unicycler/wiki (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hybrydowe sk adanie genomusk adanie de novogenomy bakterii z moczusekwencjonowanie kr tkich odczyt wsekwencjonowanie Nanoporeadnotacja genomudetekcja plazmid wpotok sk adania genomuoporno na rodki przeciwdrobnoustrojowe
Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.