Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

15.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62876

⸱

7 października 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1USDA/ARS Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of Endocrinology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Hubei Provincial Clinical Research Center for Diabetes and Metabolic Disorder, 4Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Streszczenie

Immunohistochemiczne barwienie mózgów myszy jest rutynową techniką powszechnie stosowaną w neurobiologii do badania centralnych mechanizmów leżących u podstaw regulacji metabolizmu energetycznego i innych procesów neurobiologicznych. Jednak jakość, wiarygodność i odtwarzalność wyników histologii mózgu może się różnić w zależności od laboratorium. Dla każdego eksperymentu barwienia konieczna jest optymalizacja kluczowych procedur w oparciu o różnice w gatunkach, tkankach, docelowych białkach i warunkach pracy odczynników. W tym artykule szczegółowo przedstawiono niezawodny przebieg pracy, w tym perfuzję wewnątrzaortalną, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montaż tkanek i obrazowanie, które mogą być łatwo śledzone przez naukowców w tej dziedzinie.

Omówiono również, jak zmodyfikować te procedury, aby zaspokoić indywidualne potrzeby badaczy. Aby zilustrować wiarygodność i skuteczność tego protokołu, sieci okołoneuronalne wybarwiono znakowaną biotyną aglutyniną Wisteria florbunda (WFA) i wazopresyną argininy (AVP) z przeciwciałem anty-AVP w mózgu myszy. Na koniec omówiono kluczowe szczegóły całej procedury oraz zalety tego protokołu w porównaniu z innymi protokołami. Podsumowując, w artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół swobodnego barwienia immunologicznego tkanki mózgowej myszy. Przestrzeganie tego protokołu ułatwia ten proces zarówno młodszym, jak i starszym naukowcom w celu poprawy jakości, wiarygodności i odtwarzalności badań nad barwieniem immunologicznym.

Wprowadzenie

Rozpowszechnienie otyłości i związanych z nią chorób współistniejących osiągnęło poziom epidemii, powodując ogromne obciążenie społeczno-ekonomiczne1,2. Aby lepiej zrozumieć procesy biologiczne odpowiedzialne za otyłość, opracowano różne modele myszy3,4. Ponieważ mechanizmy centralne są ważne dla regulacji homeostazy energetycznej w tych modelach zwierzęcych, badania neuroanatomiczne mózgów myszy stały się niezbędną techniką w tej dziedzinie. Jednak jakość, wiarygodność i odtwarzalność technik histologicznych mózgu różnią się znacznie między laboratoriami, a nawet badaczami w tym samym laboratorium z różnych powodów (np. przeciwciała, tkanki, leczenie, gatunki, cele badań). Dlatego konieczne jest ustalenie ogólnego protokołu badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzji, sekcji mózgu, swobodnego barwienia immunologicznego, montowania tkanek i obrazowania. Tymczasem początkujący mogą szybko nauczyć się, opanować i dostosować ten protokół do swoich indywidualnych potrzeb.

Barwienie immunohistochemiczne to sprawdzona metoda, która była szeroko stosowana do wizualizacji określonych typów komórek, mRNA i białek w różnych tkankach (np. mózgu i tkankach obwodowych)5,6. Mówiąc dokładniej, antygen będący przedmiotem zainteresowania może być znakowany przez specyficzne przeciwciało pierwszorzędowe i odpowiadające mu przeciwciało drugorzędowe połączone z enzymem (np. immunohistochemia chromogenna) lub barwnikiem fluorescencyjnym (izotiocyjanian fluoresceiny)6. Jako przykład użyteczności tych technik, β-endorfina [jeden peptyd kodowany przez pro-opiomelanokortynę (POMC)] i c-fos (marker aktywności neuronalnej) zostały wybarwione w jądrze łukowatym. Wykazano, że delecja hydroksylazy tryptofanu 2 (enzymu integralnie związanego z syntezą serotoniny) w jądrze szwu grzbietowego zmniejsza ekspresję c-fos w neuronach POMC w jądrze łukowatym7. Ponadto dystrybucja mRNA receptora witaminy D została zmapowana w mózgu myszy za pomocą hybrydyzacji in situ (RNAscope)8. W artykule przedstawiono wiarygodną i wydajną metodę z przepływem pracy krok po kroku do swobodnego barwienia immunologicznego, mającą na celu poprawę jakości i odtwarzalności badań histologicznych mózgu myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

C57BL/6J myszy obu płci (w wieku 8-16 tygodni) zostały wykorzystane w niniejszym badaniu. Opieka nad wszystkimi zwierzętami i wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Baylor College of Medicine.

1. Perfuzja

UWAGA: Kroki 1.1 - 1.6 są wykonywane w dygestoriach.

  1. znieczulenie
    1. Wlać 5 ml izofluranu (patrz Tabela Materiałów) na ręcznik papierowy umieszczony na dnie eksykatora. Umieść mysz na przesłoniętej przegrodzie wewnątrz eksykatora i poczekaj, aż znikną oznaki oddychania.
      UWAGA: Bez oddychania mysz nadal ma bicie serca przez krótki okres czasu i zostanie ono ukrwione przed zanikiem bicia serca.
    2. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że nie ma odruchu na szczypanie palca u nogi.
    3. Przymocuj mysz do płyty piankowej, wbijając szpilkę w każdą stopę. Upewnij się, że płyta piankowa jest umieszczona na tacy, aby zebrać rozlaną płyn
      4. .
  2. Odsłanianie serca
    1. Wykonaj podłużne powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej nad klatką piersiową i brzuchem, a następnie odsuń skórę na bok, aby odsłonić ścianę mięśniową klatki piersiowej i brzucha. Następnie wykonaj nacięcie w warstwie mięśniowej, aby odsłonić wątrobę i jelito. Na koniec przetnij klatkę piersiową nożyczkami, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce i płuca. Użyj kleszczy hemostatycznych, aby odciągnąć klatkę piersiową na bok, aby poszerzyć obszar roboczy.
  3. Pobranie krwi terminalnej (opcjonalnie)
    1. Ostrożnie włożyć strzykawkę o pojemności 1 ml (patrz Tabela Materiałów) do prawego przedsionka serca, aż końcówka zostanie całkowicie osadzona. Trzymać strzykawkę nieruchomo i powoli pobierać krew, aż do osiągnięcia pożądanej objętości.
      UWAGA: Uważaj, aby nie przeniknąć poza prawe przedsionki; Pobranie 300-400 μl krwi jest osiągalne na jedną dorosłą mysz. Można stosować dodatki, takie jak przyspieszacz zakrzepów lub antykoagulant, w zależności od celu pobrania krwi.
  4. Umieszczenie kaniuli perfuzyjnej
    1. Dla początkujących wytnij nożyczkami mały otwór (<1 mm) w lewej komorze serca i włóż kaniulę (igła 18 G dla młodych myszy i igła 21 G dla starszych myszy) przez lewą komorę do aorty wstępującej. Alternatywnie, dla doświadczonych eksperymentatorów, przeniknij bezpośrednio do lewej komory serca kaniulą i ostrożnie włóż ją do aorty wstępującej.
    2. Umieść kołki wokół połączenia kaniuli i sprzężonej rurki na płycie piankowej, aby zapobiec ruchowi podczas perfuzji. Alternatywnie użyj kleszczy hemostatycznych, aby zamocować kaniulę na miejscu. Przystąp do przecięcia prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi z krążenia.
      UWAGA: Kaniula perfuzyjna i sprzężone rurki są podłączone do pompy perfuzyjnej.
  5. Perfuzja z solą fizjologiczną
    1. Włącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i przelej mysz przezskórnie 40-60 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Uważnie obserwuj odpływ z prawego przedsionka i kolor wątroby.
      UWAGA: Automatyczna pompa perfuzyjna (patrz Tabela Materiałów) służy do płukania krwi w ciągu 1-2 minut. Ponieważ zakres ciśnienia pompy wynosi 1-300 mmHg, prędkość można odpowiednio dostosować. Jeśli sól fizjologiczna wycieka z nosa i/lub płuca są napompowane, zmniejsz ciśnienie i wyreguluj kaniulę. Gdy odpływ nie zawiera już krwi, mózg jest wystarczająco przepłukany solą fizjologiczną. Tymczasem wątroba jest pozbawiona krwi i staje się brązowo-szara
      2. .
  6. Perfuzja z formaliną
    1. Wyłącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i włącz wyłącznik ciśnieniowy formaliny, aby przelać mysz 40 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, patrz tabela materiałów). Obserwuj kończyny zwierzęcia pod kątem oznak drżenia.
      UWAGA: Ruch ogona można również zaobserwować po infuzji 10% NBF. UWAGA: Ponieważ NBF jest niebezpieczny, sugeruje się, aby badacze nosili środki ochrony osobistej (np. odpowiednią maskę oddechową, osłonę twarzy) przez cały czas trwania zabiegu.
  7. Izolacja mózgu9
    1. Użyj nożyczek, aby zdjąć głowę. Wykonaj środkowe nacięcie wzdłuż powłoki, aby odsłonić czaszkę. Odetnij skórę i przyczep mięśniowy nożyczkami.
    2. Wykonaj cięcie na grzbiecie oczodołu, a następnie umieść ostry koniec nożyczek tęczówki w otworze wielkim. Przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, utrzymując nacisk w górę, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Ostrożnie usuń kości ciemieniowe/czołowe i opony mózgowe. Na koniec delikatnie wyjmij mózg z otwartej czaszki.
  8. Po utrwaleniu
    1. Umieść mózg w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml 5% NBF i 15% sacharozy w celu utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Aby przygotować 10 ml 5% NBF i 15% sacharozy, połącz 5 ml 10% NBF i 5 ml 30% sacharozy (w/v, rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że objętość buforu utrwalającego jest co najmniej 10 razy większa niż sama próbka. Początkowo mózg będzie unosił się w buforze i opadnie na dno po całonocnym utrwaleniu.
  9. odwodnienie
    1. Przenieść próbkę mózgu do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml 30% sacharozy w celu odwodnienia w temperaturze 4 °C, aż do zatonięcia.

2. Kriosekcja (przekroje koronalne)

  1. preparat
    1. Umieść suchy lód na płytce regulacji wysokości przesuwnego mikrotomu i poczekaj, aż pojawi się biały szron. Ostrożnie rozprowadź 5 ml 30% sacharozy na wierzchu płytki, aby utworzyć warstwę stałej podstawy po całkowitym zamrożeniu roztworu sacharozy. Umieść wszystkie próbki mózgu (do 5 próbek mózgu w jednej partii) poziomo w linii na wierzchu sacharozy, a następnie dodaj 0,5 ml 30% sacharozy na dno każdego mózgu.
      UWAGA: Mózg natychmiast przyklei się do zamrożonej bazy sacharozy i stopniowo zamarznie od dołu do góry. Umieść dodatkową sacharozę wokół zamontowanej części mózgu, aby utworzyć mocniejszą podstawę do cięcia.
  2. Cięcia
    1. Po 5-10 minutach zamrażania, gdy mózg stanie się twardy i biały, przycinaj mózg, aż do osiągnięcia pożądanej warstwy/regionu.
      UWAGA: Dostosuj ilość suchego lodu na talerzu, aby kontrolować temperaturę. Temperatura jest zbyt niska, gdy na powierzchni mózgu pojawiają się kryształki lodu. Temperatura jest zbyt wysoka, gdy mózg staje się miękki i nie jest już biały.
    2. Przełącz się z trybu Trim na tryb Feed i przekrój tkankę mózgową do grubości 25 μm. Przygotuj 48-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS i zaznacz pięć dołków na jeden mózg myszy. Użyj pędzla, aby zebrać każdą sekcję z jednej myszy i umieść ją w jednej studzience. Zbierz kolejną sekcję tej samej myszy i umieść ją w 2. studzience.
    3. Powtarzać 2.2.2 aż do osiągnięcia 5dołka, umieszczając sekcje 6-10 w 1-5dołku i tak dalej. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych mózgów jednocześnie. Powtarzaj, aż wszystkie sekcje z jednej myszy zostaną zebrane do 5 dołków w porządku anatomicznym.
      UWAGA: Zgodnie z tą procedurą, skrawki mózgu każdej myszy są podzielone na 5 serii, które można wykorzystać do maksymalnie 5 różnych badań histologicznych.
  3. składowanie
    1. Za pomocą pędzla przenieś skrawki z każdej studzienki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej buforem krioprotektantu (20% glicerolu, 30% glikolu etylenowego i 50% PBS) i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Te sekcje przechowywane w małych probówkach (1,5 ml) mogą zaoszczędzić fizyczną przestrzeń w zamrażarce, a integralność sekcji może zostać zachowana przez kilka miesięcy.

3. Swobodne barwienie WFA i barwienie immunologiczne anty-AVP

  1. Umieść sitko komórkowe w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej PBS i za pomocą pędzla przenieś jedną serię odcinków mózgu do sitka komórkowego. Przepłukać skrawki w PBS, przenosząc sitko do komórek do innego dołka wypełnionego PBS. Płukać przez 6 x 10 min na wytrząsarce w przypadku skrawków przechowywanych w buforze krioprotektantu i 3 x 10 min w przypadku świeżo pokrojonych sekcji.
    UWAGA: Wszystkie procedury mycia są wykonywane na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej z sitkiem komórkowym wewnątrz każdej studzienki (patrz Tabela materiałów). Każde sitko przechowuje interesujące sekcje mózgu każdej myszy. Aby zaoszczędzić odczynniki, wszystkie opisane poniżej procedury inkubacji są wykonywane w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pomiędzy procedurami mycia i inkubacji użyj pędzla, aby przenieść sekcje mózgu między każdym sitkiem komórkowym a każdą probówką. Do mycia PBS wystarczy 12 ml na każdą studzienkę.
  2. Przygotować 1 ml znakowanego biotyną roztworu WFA (1:1,000) w buforze PBT (2,5 ml Triton X-100 rozpuszczony w 1,000 ml PBS) w probówce o pojemności 1,5 ml. Przenieś skrawki mózgu z sitka komórkowego do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej ~50 obr./min przez noc.
  3. Przepłukać skrawki mózgu PBS przez 3 x 10 minut, jak opisano w ppkt 3.1.
  4. Przygotować 1 ml roztworu streptawidyny-Dylight 488 (1:500) w PBT w probówce o pojemności 1,5 ml. Przenieś skrawki mózgu do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na platformie bujającej z prędkością ~50 obr./min.
    UWAGA: Przykryj płytkę folią, aby uniknąć ekspozycji na światło od tego kroku.
  5. Przepłukać skrawki mózgu PBS przez 3 x 10 min. Inkubować sekcje mózgu w buforze blokującym (3% normalnej surowicy osła rozcieńczonej w PBT) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wybór surowicy blokującej zależy od gatunku, z którego wytwarzane jest przeciwciało drugorzędowe. Na przykład, jeśli przeciwciało drugorzędowe pochodzi od kozy, należy użyć normalnej surowicy koziej.
  6. Inkubuj sekcje mózgu w pierwotnym przeciwciałie (królicze anty-AVP, 1:500) w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością ~50 obr./min przez noc.
    UWAGA: Przygotować zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe w buforze blokującym. Stężenie, czas trwania inkubacji i temperatura inkubacji muszą być zoptymalizowane w badaniach pilotażowych.
  7. Płucz sekcje mózgu PBS przez 3 x 10 min. Inkubuj sekcje mózgu w wtórnym przeciwciałie (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na platformie bujanej z prędkością ~50 obr./min. Płucz sekcje mózgu PBS przez 3 x 10 min.

4. Montaż

  1. Napełnij dwie szalki Petriego (o średnicy 150 mm) 100 ml 1x PBS każda. Przenieś wszystkie sekcje mózgu z jednego sitka do pierwszego naczynia i wyrównaj sekcje mózgu w porządku neuroanatomicznym od ogonowego do rostralnego.
    UWAGA: Aby uniknąć mieszania sekcji pochodzących od różnych zwierząt, montuj jedną serię sekcji mózgu od jednego zwierzęcia na raz.
  2. Po tym jak wszystkie sekcje mózgu zostaną wyrównane w pierwszym naczyniu, zanurz jeden szkiełko w drugim naczyniu z jednym końcem lekko przechylonym ze stojakiem (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2). Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie umieść sekcję mózgu tuż pod interfejsem bufora powietrza na pochylonym suwaku. Powtórz tę samą procedurę z inną sekcją mózgu i zamontuj ją obok pierwszej sekcji.
  3. Użyj pipety transferowej, aby powoli i delikatnie usunąć bufor, aby obniżyć jego poziom, aż obie sekcje mózgu znajdą się całkowicie powyżej granicy faz powietrze-bufor.
    UWAGA: Uważaj, aby zminimalizować zakłócenia powierzchni buforowej, w przeciwnym razie sekcje mózgu mogą odpłynąć. Po wyschnięciu ten rząd odcinków mózgu będzie mocno przylegał do szkiełka. W razie potrzeby delikatnie wyreguluj sekcje na szkiełku, aby upewnić się, że nie ma zmarszczek ani fałd w tkance, gdy skrawki są jeszcze mokre.
  4. Powtarzaj ten proces, aż dojdziesz do dna szkiełka. Kontynuuj powtarzanie, aż wszystkie sekcje zostaną zamontowane na prowadnicy (prowadnicach).

5. Szkiełko nakrywkowe

  1. Po wyschnięciu wszystkich skrawków (1-24 h w temperaturze pokojowej) umieść 80-100 μl zapobiegającego blaknięciu podłoża montażowego z DAPI (patrz Tabela Materiałów) na szkiełku podstawowym i delikatnie nałóż szklane szkiełko nakrywkowe, aby przykryć próbki.
    UWAGA: Szkiełko nakrywkowe nakładaj ostrożnie i powoli, aby uniknąć pęcherzyków.
  2. Umieść szkiełka w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi (patrz tabela materiałów) i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zobrazuj wszystkie sekcje w ciągu 1-3 dni, aby uniknąć blaknięcia fluorescencji i rozwoju autofluorescencji.

6. Obrazowanie

  1. Włącz skaner i komputer (patrz Spis materiałów). Umieść szkiełka w uchwycie szkiełek z urządzeniem ładującym i włóż uchwyt do skanera.
    UWAGA: Skaner umożliwia skanowanie wielu kanałów (np. kanałów 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowego (DAPI), zielonego i czerwonego) jednocześnie. Skaner skanuje preparaty tylko z 20-krotnym powiększeniem, a tradycyjny mikroskop fluorescencyjny (patrz Tabela materiałów) może być używany, gdy potrzebne jest większe powiększenie (np. 40x).
  2. Otwórz oprogramowanie skanera (patrz tabela materiałów). Wybierz odpowiednie miejsce przechowywania i profil skanowania.
  3. Rozpocznij skanowanie podglądu, klikając przycisk Rozpocznij skanowanie podglądu. Po skanowaniu podglądu otwórz kreatora wykrywania tkanek i zakreśl obszary zainteresowania do obrazowania.
  4. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie po wybraniu regionów do obrazowania. Poczekaj, aż urządzenie zakończy skanowanie. Sprawdź plik wynikowy i wyeksportuj images.
    UWAGA: Jeśli profil nie jest odpowiedni dla szkiełka, wyreguluj, ponownie ustawiając ostrość i zmieniając czas ekspozycji lub natężenie światła, aby dostosować profil do tkanek. Więcej informacji technicznych można znaleźć w instrukcji skanera (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat tego protokołu został krótko przedstawiony na Rysunku 1. Procedura kriosekcjonowania w tym laboratorium jest zaprezentowana na Rysunku 2A, na którym jednocześnie wykonano sekcje 5 próbek mózgu. Montowanie przekrojów mózgu pokazano na Rysunku 2B, a w pełni zamontowany preparat z przekrojami mózgu zilustrowano na Rysunku 2C. Na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia ustaloną metodę badań neuroanatomicznych mózgu myszy, w tym perfuzji, sekcji tkanek, swobodnego barwienia immunologicznego, montażu tkanek i obrazowania. Należy jednak zoptymalizować kilka kluczowych szczegółów niezbędnych do uzyskania spójnych i wiarygodnych wyników.

Jakość perfuzji ma kluczowe znaczenie dla udanego barwienia. Wyniki barwienia mogą być zakłócone, jeśli krew pozostaje w mózgu, biorąc pod uwagę, że komórki krwi (np. czerwone krwinki) mogą generować sztuczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badacze byli wspierani przez granty z NIH (K01DK119471 do CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 i R01DK120858 do YX), USDA/CRIS (51000-064-01S do YX) oraz American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) do LT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Flour 594 osioł anty-królik IgG (H+L)InvitrogenA21207
  30% sacharozyVWR47030230 g Sacharozy rozdzielonej na 100 ml PBS&
nbsp; Neutralna buforowana formalinaVWR16004-12810%, 25 ° C, pH 6,8-7,2
1 ml Sub-Q StrzykawkaBD309597
48-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning3548
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowejCorning3516
Zapobiegające blaknięciu media montażowe z DAPIVector LaboratoriesH-1200
Autoklawowalny eksykator z tworzywa sztucznegoThermo Scientific Nalgene5315-0150
Przeciwciało AVPPhoenix PharmaceuticalsH-065-07
Sitko do komórekCorning431752
Bufor krioprotekcyjnePreferencje użytkownikaNie dotyczy20% glicerol, 30% glikolu etylenowego i 50% PBS
IzofluranCovetrus11695-6777-2
Leica DFC310FX mikroskopLeicaNie dotyczy
Pudełka na preparaty mikroskopowe (50 miejsc)VWRNie dotyczy
PBTPreferencje użytkownikaNie dotyczy2,5 ml Triton X-100 rozpuszczony w 1000 ml PBS
Perfuzja dwa zautomatyzowane systemy perfuzyjneLeica39471005
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 20xVWRVWRVE703-1L25 ° C, pH 7,3-7,5, 1x skład:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Bufor fosforanowy
Mikrotom przesuwny Microm HM450ThermoFisherMicrom HM450
Chlorek soduRICCA Chemical7220-320,9%, 25 ° C, pH 7,4
Białko streptawidyny, DyLight 488ThermoFisher#21832
Triton X-100Sigma-Aldrich089k01921
Przeciwciało WFASigma-AldrichL1516
Skaner Zeiss Axio Z1ZeissNie dotyczy
skaneraZen 3.1
Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
  2. Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).
  3. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
  4. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  5. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  6. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).
  7. Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
  8. Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  10. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
  11. Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).
  12. Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).
  13. He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
  14. Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie m zgu myszybarwienie immunohistochemicznesekcjonowanie m zguperfuzja wewn trzaortalnamontowanie tkanekobrazowanie fluorescencyjnesieci oko oneuronalneaglutynina z Wisteria floribundaargynina wazopresyna
Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.