Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Podsumowanie

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

W ostatnich latach stało się oczywiste, że rybosomy nie tylko dekodują nasze mRNA, ale także kierują powstawaniem łańcucha polipeptydowego w zatłoczonym środowisku komórkowym. Rybosomy stanowią platformę do kontrolowanego przestrzennie i kinetycznie wiązania czynników ukierunkowanych na błonę, modyfikowania enzymów i fałdowania białek opiekuńczych. Niedawno odkryto, że nawet składanie się w oligomeryczne kompleksy wysokiego rzędu, jak również etapy tworzenia sieci białko-białko, są skoordynowane z syntezą.

Tutaj opisujemy Selektywne Profilowanie Rybosomów, metodę opracowaną do uchwycenia interakcji kotranslacyjnych in vivo. Omówimy szczegółowo różne etapy oczyszczania powinowactwa wymagane do wychwytywania kompleksów rybosom-powstających łańcuchów wraz z interaktorami kotranslacyjnymi, a także etapy ekstrakcji mRNA, wykluczania wielkości, odwrotnej transkrypcji, głębokiego sekwencjonowania i analizy dużych zbiorów danych, wymagane do rozszyfrowania interakcji kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi.

Wprowadzenie

Selekctive Ribosome Profiling (SeRP) to jak dotąd jedyna metoda, która wychwytuje i charakteryzuje interakcje kotranslacyjne, in vivo, w sposób bezpośredni1^,2,3,4,5,6. SeRP umożliwia globalne profilowanie oddziaływań dowolnego czynnika z translującymi rybosomami w rozdzielczości bliskiej kodonowi^2,7.

Metoda polega na błyskawicznym zamrażaniu rosnących komórek i zachowaniu aktywnej translacji. Lizaty komórkowe są następnie traktowane RNazą I w celu strawienia całego mRNA w komórce, z wyjątkiem fragmentów mRNA chronionych przez rybosom, zwanych "śladami rybosomów". Próbka jest następnie dzielona na dwie części; Jedna część jest bezpośrednio używana do izolacji wszystkich komórkowych śladów rybosomalnych, reprezentujących całą trwającą translację w komórce. Druga część służy do oczyszczania powinowactwa i oczyszczania specyficznego podzbioru rybosomów związanych z czynnikiem zainteresowania, na przykład: enzymami modyfikującymi, czynnikami translokacyjnymi, fałdowanymi białkami opiekuńczymi i interakcjami złożonego składania. Oczyszczone przez powinowactwo ślady rybosomalne są zbiorczo nazywane interaktomem. Następnie mRNA chronione rybosomem są ekstrahowane i wykorzystywane do generowania biblioteki cDNA, a następnie głębokiego sekwencjonowania.

Analiza porównawcza wszystkich próbek translatomu i interaktomu pozwala na identyfikację wszystkich orf, które są powiązane z czynnikiem zainteresowania, a także na scharakteryzowanie każdego profilu interakcji z orf. Profil ten informuje o dokładnych sekwencjach początku i zakończenia zaangażowania, z których można wywnioskować zdekodowane kodony i odpowiednie reszty powstającego łańcucha polipeptydowego, a także o zmianach prędkości rybosomów podczas interakcji^7,8. Rysunek 1 przedstawia protokół jako schemat.

Rysunek 1: Przegląd protokołu SeRP. Protokół ten można wykonać w całości w ciągu 7-10 dni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Generowanie szczepów do selektywnego profilowania rybosomów

UWAGA: Selekcytywny Ribosome Profiling (SeRP) to metoda, która opiera się na oczyszczaniu powinowactwa interesujących czynników, aby ocenić ich sposób interakcji z powstającymi kompleksami łańcuchowymi rybosomów. Rekombinacja homologiczna⁹, a także metody oparte na CRISPR/Cas9¹⁰ są wykorzystywane do łączenia różnych czynników zainteresowania ze znacznikami w celu oczyszczania powinowactwa. Takimi znacznikami są GFP, do oczyszczania powinowactwa GFP-trap, TAP-tag do oczyszczania kulek IgG-Sepharose, a także AVI-Tag oczyszczony awidyną lub streptawidyną, aby wymienić kilka udanych przykładów z ostatnich lat.

1. Wykonaj testy wzrostu lub czynności, aby sprawdzić, czy znakowanie nie wpłynęło na funkcję białek. Należy ocenić znakowanie końcówek N' i C'.
   UWAGA: Rybosomy (rRNA), a także wiele domen wiążących rybosomy w różnych czynnikach, są wysoce naładowane, co sprawia, że wysoce naładowane znaczniki (takie jak polihistydyna) są niepreferowane do użycia, ponieważ może to prowadzić do fałszywego odkrycia lub zmienionego trybu wiązania.

2. Rozwój kultury

1. Wyhodować skonstruowane kultury drożdży (na bazie szczepu BY4741), zawierające pożądane znakowane białka, w płynnym podłożu bogatym w ekstrakt drożdżowy, pepton-dekstrozę (YPD) lub w pożywce o minimalnej zawartości dekstrozy syntetycznej (SD) (1,7 g/l drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu lub 1,7 g/l drożdżowej zasady azotowej bez siarczanu amonu z 1 g/l monosodowego kwasu glutaminowego, 2% glukozy i uzupełnionej kompletną lub odpowiednią mieszaniną aminokwasów).
2. Wyhodować 250-500 ml hodowli komórkowej do 0,5 OD₆₀₀ (mid-log), w temperaturze 30 °C, w odpowiednim podłożu.

3. Pobieranie i liza komórek

1. Szybkie zbieranie komórek poprzez filtrację próżniową na membranie nitrocelulozowej 0,45 μm ze szklanym systemem filtracji (szklany uchwyt filtra z lejkiem szklanym o pojemności 1 l, podstawa i nasadka próżniowa, sitko ze stali nierdzewnej, uszczelka i zacisk sprężynowy, 90 mm; kolba do fugowania 1 l).
2. Błyskawiczne zamrożenie zebranych komórek, zeskrobując granulowane komórki szpatułką i natychmiast zanurzając je w wypełnionej ciekłym azotem probówce o pojemności 50 ml.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Komórki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 3-4 tygodni.
3. Przeprowadzić lizę komórek przez mielenie kriogeniczne w młynie mieszającym: dwukrotnie przez 2 minuty przy 30 Hz, z 1 ml buforu do lizy (patrz tabela 1). Schłodzić w ciekłym azocie między mieleniem.

szt. pkt. szt.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
10 mg/ml CHX (cykloheksymid)	220	0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	Rozdział 88	20 mM
3M KCl	205,7	140 mM
1M MgCl2	Pytanie 26,4	6 mM
1 mln PMSF	4.4	1 mM
NP-40	4.4	0,10%
Inhibitor proteazy	2 tabletki
DNaza I	8,8	0,02 j./ml
Ostatni tom	4 400

Tabela 1: Przepis na główną mieszankę buforu do lizy.

UWAGA: Bufor do lizy może być zmieniony tak, aby zawierał więcej inhibitorów proteazy (takich jak bestatyna, leupeptyna, aprotynina, itp.) w przypadku, gdy interesujące białko jest bardzo niestabilne, ale ważne jest, aby unikać EDTA, aby utrzymać małe i duże podjednostki rybosomu zebrane podczas następujących kroków. Z podobnych powodów należy zawsze utrzymywać co najmniej 6 mM MgCl₂ w roztworze buforowym.

UWAGA: HCl jest wysoce, a PMSF jest toksyczny. Nosić rękawice i obchodzić się z nimi ostrożnie.

4. Wirować przez 2 minuty przy 30 000 x g, 4 °C w celu oczyszczenia lizatu i zebrania supernatantu.

4. Oczyszczanie kompleksów rybosom-powstające łańcuchy dla SeRP

1. W każdym eksperymencie należy podzielić supernatant na dwie części, z których każda znajduje się w innej probówce do mikrowirówki: całkowita próbka RNA (~200 μL) i próbka do oczyszczania immunologicznego (IP) (~700 μL) translatom.
2. Przetwarzanie całej próbki RNA
   1. Trawić całkowitą próbkę RNA przy użyciu 10 U RNazy I przez 25 minut w temperaturze 4 °C; obracać z prędkością 30 obr./min za pomocą obrotowego stojaka do mieszania.
      UWAGA: Warunki trawienia można skalibrować za pomocą profilowania polisomów, aby zapewnić brak nadmiernego lub niedostatecznego trawienia piku monosomów.
   2. Przygotować główną mieszankę poduszkową sacharozy zgodnie z opisem w tabeli 2.

szt. . szt.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
50% sacharozy	200	25 proc
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20 mM
3M KCl	Rozdział 18,7	140 mM
1M MgCl2	4	10 mM
100 mg/ml CHX	0,4	0,1 mg/ml
Inhibitor proteazy	1 tabletka
Ostatni tom	400

Tabela 2: Przepis na główną mieszankę sacharozy do poduszek.

3. Umieścić próbkę na 400 μl poduszki sacharozowej i odwirować w wirniku TLA120 przez 90 minut przy 245 000 x g i w temperaturze 4 °C.
4. Szybko usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i nałożyć granulki na 150 μl buforu do lizy. Zawiesić granulki przez wytrząsanie przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i przy 300 obr./min.
5. Zawiesić resztki osadu przez pipetowanie i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: 100-200 μg całkowitego RNA jest zwykle wystarczające do profilowania rybosomów całkowitego translatomii. Można dodać etap wyczerpywania się rRNA w celu zmniejszenia zanieczyszczenia rRNA, które jest najbardziej rozpowszechnionym zanieczyszczeniem kompleksów łańcuchów rybosomów powinowactwo oczyszczanie¹¹ (zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji).

3. Przetwarzanie próbki do oczyszczania immunologicznego
   1. Przepłukać 100-400 μl matrycy wiążącej powinowactwo (kulki sprzężone z przeciwciałami w stosunku 1:1 w 70% EtOH) na próbkę za pomocą 3 x 1 ml buforu do lizy (bez inhibitorów DNazy I i proteazy); ponownie zawiesić matrycę powinowactwa w buforze do lizy, a następnie obracać z prędkością 30 obr./min za pomocą obracającego się stojaka do mieszania w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wytrącić przez wirowanie przez 30 s przy 3 000 x g, 4 °C. Wylać górny płyn. Powtórz trzy razy.
   2. Trawić próbki do oczyszczania immunologicznego przy użyciu 10 U na jednostkę A260 nm RNazy I, wraz z matrycą wiążącą powinowactwo (na przykład 100-400 μl GFP-TRAP na próbkę).
   3. Obracać przez 25 minut przy 30 obr./min z obrotowym stojakiem do mieszania, aby związać białko z matrycą powinowactwa w temperaturze 4 °C.
   4. Przygotować główną mieszankę buforu do płukania zgodnie z tabelą 3.

Rozdział szt. Rozdział szt. szt.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
10 mg/ml CHX	50	0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20 mM
3M KCl	Rozdział 233	140 mM
1M MgCl2	50	10 mM
1 mln PMSF	5	1 mM
NP-40	0,5	0,01%
Inhibitor proteazy	2 tabletki
50% glicerolu	1 000	10%
Ostatni tom	5 000

Tabela 3: Przepis na główny miks bufora myjącego.

5. Przemyć matrycę wiążącą powinowactwo trzykrotnie 1 ml buforu do płukania, za każdym razem przez ~1 min, obracając w ruszcie do mieszania z prędkością 30 obr./min, w temperaturze 4 °C.
6. Wytrącić przez odwirowanie w stężeniu 3 000 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Wyrzucić górną ciecz.
7. Umyć jeszcze dwa razy w 1 ml buforu do mycia, za każdym razem przez 5 minut, obracając w ruszcie do mieszania z prędkością 30 obr./min, w temperaturze 4 °C.
8. Wytrącać przez odwirowanie przez 30 s w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C.
9. Do elucji białek należy użyć 50 μl kulek z taką samą ilością buforu 2x próbki. Użyj reszty kulek do ekstrakcji RNA.
10. Wirować przez 30 s w temperaturze 3 000 x g, 4 °C, aby ogranulować kulki i wyrzucić górną ciecz.
11. Zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Próbki te należy wykorzystać do późniejszej ekstrakcji RNA.
    PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej. To może być punkt zatrzymania.
12. Oceń powodzenie etapu oczyszczania powinowactwa za pomocą barwienia western blot lub Coomassie podwielokrotnościami (~10% objętościowo, po wymieszaniu) każdego etapu. Zawsze używaj makiety adresu IP na nieoznakowanym szczepie WT jako kontrolki dla niespecyficznego powiązania z macierzą powinowactwa.
    UWAGA: Wysokie niespecyficzne tło można zniwelować poprzez dodatkowe etapy prania o rosnącym stężeniu soli/detergentu. Przejściowe oddziaływanie można ustabilizować za pomocą różnych środków sieciujących, na przykład zaleca się traktowanie żywych komórek paraformaldehydem (PFA) - dodanie 0,4%-1% PFA do pożywki wzrostowej przez 2-5 minut, a następnie hartowanie glicyną (0,3 M) przez 3 minuty.
    UWAGA: Paraformaldehyd jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Ponieważ paraformaldehyd szybko odparowuje i jest, pracuj w kapturze ochronnym i noś dwie warstwy rękawic.

5. Przygotowanie biblioteki cDNA do głębokiego sekwencjonowania

1. Ekstrakcja RNA
   UWAGA: Pracuj z nieprzywierającymi probówkami o pojemności 1,5 ml bez RNaz, aby zapobiec możliwemu wyczerpaniu RNA lub DNA.
   1. Rozmrozić próbki z etapów 4.2.5 i 4.3.12 na lodzie i ponownie zawiesić próbki o 10 mM Tris-HCl pH 7,0 do końcowej objętości 700 μL.
      UWAGA: Kwas-fenol i chloroform są lotne i szkodliwe. Praca w kapturze bezpieczeństwa chemicznego.
   2. Dodaj 40 μl 20% SDS do 0,7 ml całkowitych elucji RNA lub IP. Zamknij i odwróć kilka razy. Wytrącanie się białek powinno zmienić kolor próbek na biały.
   3. Dodać 0,75 ml wstępnie podgrzanego kwasu-fenolu:chloroformu do próbek. Szczelnie zamknąć probówki i wstrząsnąć w mieszalniku termicznym z prędkością 1 400 obr./min przez 5 minut i w temperaturze 65 °C. Schładzać próbki na lodzie przez 5 minut.
   4. Odwirować probówkę z kroku 5.1.3 przy 20 000 x g przez 2 minuty. Przenieść górną warstwę wody do świeżej probówki i dodać do niej 0,7 ml kwasu fenolowo-chloroformowego.
   5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wirując. Wirować przez 2 minuty przy 20 000 x g. Przenieś górną warstwę wodną do świeżej probówki i dodaj do niej 0,6 ml chloroformu i odwiruj.
   6. Wirować przez 1 minutę przy 20 000 x g. Przenieś górną warstwę wody do świeżej probówki.
   7. Wytrącić kwasy nukleinowe, dodając 78 μl 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μl GlycoBlue i 0,75 ml izopropanolu. Dokładnie wirować przez 5 minut. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C lub 16 godzin w temperaturze -20 °C.
   8. Wirować przez 30 minut przy 20 000 x g i w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Umyj granulki lodowatym 0,75 ml 80% etanolu. Odwróć rurki, aby dokładnie umyć. Wirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
   9. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 sekund, usunąć pozostały etanol i wyrzucić płyny. Suszyć osad z otwartą pokrywką przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Zawiesić próbki w następujący sposób: dla IP zawiesić próbkę w 10 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. W celu przeprowadzenia całkowitej analizy translatomu należy ponownie zawiesić próbkę w 20 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,0,
      PUNKT ZATRZYMANIA: RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy.
2. Określić ilościowo całkowite stężenie RNA za pomocą fluorometrii
   UWAGA: Wszystkie poniższe materiały i powierzchnie powinny być wolne od RNaz podczas przygotowywania biblioteki cDNA do sekwencjonowania nowej generacji. Podczas pracy z próbkami RNA należy nosić rękawiczki.
   1. Rozcieńczyć 1 μl całkowitego RNA ekstrahowanego kwasem fenolowym w 9 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Określić ilościowo za pomocą fluorometru, zgodnie z instrukcją na stronie internetowej producenta.
   2. Rozcieńczyć próbki zawierające 50 μg RNA 10 μl 10 mM Tris-HCl, pH 7,0,
      UWAGA: Nie mierz próbek IP, użyj wszystkiego do następnego kroku.
3. Żelowo-oczyszczające fragmenty odcisków stóp rybosomów
   1. Ustaw 15% żel poliakryloamidowy TBE-mocznik i zanurz w 1x buforze TBE do biegania. Pracować przez 30 minut przy napięciu 200 V przed załadowaniem próbki. Do każdej próbki dodać 20 μl 2x buforu do próbek TBE-mocznika.
      UWAGA: Oczekiwany rozmiar pasma to około 25-35 nt.
   2. Rozmrozić drabinkę DNA o objętości 10 pz i poddać denaturacji próbki (nie drabinkę) w temperaturze 80 °C przez 2 minuty, a następnie schłodzić na lodzie. Załaduj każdą próbkę na co drugi tor. Uruchom żel na 50-70 minut przy napięciu 200 V.
   3. Rozcieńczyć 6 μl SYBR Gold (10 000 x koncentrat) w 60 ml 1x buforu TBE i bejcy, wstrząsając w osłoniętych przed światłem pudełkach przez 15-20 min. Podczas barwienia żelu przygotuj sterylny skalpel i 0,5 ml probówki z łamaczem żelu w oznaczonych probówkach o pojemności 1,5 ml.
   4. Wytnij żądane pasma sterylnym skalpelem (użyj świeżego lub dobrze wyczyść między próbkami) i umieść każdy kawałek żelu w tubie z łamaczem żelu.
   5. Zrób zdjęcie żelu, aby upewnić się, że w żelu nie pozostały żadne pozostałości próbki.
   6. Odwirować probówki zawierające pokrojone plastry o masie 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przenieść pozostałe kawałki żelu z probówki do probówki o pojemności 1,5 ml.
   7. Dodać 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0. Wstrząsać w mieszarce termicznej przy 1 400 obr./min przez 10 minut w temperaturze 70 °C.
   8. Przenieść do kolumny z octanu celulozy z końcówką pipety o szerokim otworze i odwirować przy 20 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
   9. Przelej płyn do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i schładzaj na lodzie.
   10. W celu wytrącenia kwasów nukleinowych należy dodać: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc i 2 μL GlycoBlue i dokładnie wymieszać. Umieścić próbki w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę.
   11. Wirować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C i odrzucić sklarowany osad. Umyj granulki 0,75 ml lodowatego 80% etanolu. Odwróć probówki w celu dokładnego umycia, aż granulki oddzielą się od dna. Ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
   12. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 s i usunąć pozostały etanol. Suszyć granulki pod otwartą pokrywką przez 5 minut w temperaturze 65 °C.
   13. Dodać 15 μl 10 mM Tris o pH 7,0 i dokładnie zawiesić granulki. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 s i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
       PUNKT ZATRZYMANIA: Oczyszczone RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
4. Defosforylacja
   1. Do każdej próbki należy użyć 3 μl następującej mieszanki: Dodać 1 μl inhibitora RNazy do 2 μl 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej T4 bez ATP. Dodać 2 μl kinazy polinukleotydowej T4 do każdej próbki. Delikatnie odpipetować do dobrego wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, bez wstrząsania.
   2. Aby dezaktywować enzym, inkubować próbkę w temperaturze 75 °C przez 10 minut i wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C, przez 20 s. Dodać 0,5 ml 10 mM Tris, pH 7,0.
   3. Aby wytrącić kwas nukleinowy, dodaj 2 μl GlycoBlue, 550 μl IPA i 55 μl 3 M NaOAc.
   4. Próbki należy dokładnie wymieszać i schłodzić w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h,
      PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej.
   5. Powtórz kroki 5.3.11-5.3.13.
      PUNKT ZATRZYMANIA: Defosforylowane RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy.
5. Oznaczanie ilościowe za pomocą bioanalizatora
   1. Każdą próbkę RNA należy rozcieńczyć w stosunku 1:4, mieszając 1 μl próbki i 4 μl wody uzdatnionej metodą DEPC.
      UWAGA: DEPC jest substancją rakotwórczą. Noś rękawice i pracuj ostrożnie.
   2. Uruchom mały chip RNA/TapeStation z bioanalizatorem. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Oczekiwany rozmiar fragmentu RNA chronionego rybosomem wynosi około 28-30 nt.
6. Koniec Ligate 3' z Linkerem-1
   1. Rozcieńczyć 5 pmol małych fragmentów RNA do 10 μl 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturować próbki w temperaturze 80 °C przez 2 minuty i schłodzić na lodzie.
   2. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z tabelą 4 i użyć 29 μl na próbkę.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
PEG 8000 z filtrem sterylnym w 50%	16	20%
Dmso	4	10%
10× Bufor ligazy T4 RNA 2	4	1x
Inhibitor RNazy SUPERazy	cyfra arabska	2 U
Łącznik adenylowany 10 mM 3-L1	0,1	25 μM
Woda uzdatniona metodą DEPC	2.9
Ostatni tom	29

Tabela 4: Przepis na 3' końcówkę podwiązania głównego mieszanki.

3. Dodaj 1 μl ligazy T4 RNA 2 i delikatnie odpipetuj do dobrego wymieszania. Inkubować w temperaturze 23 °C przez 2 godziny.
4. W celu wytrącenia kwasów nukleinowych należy dodać: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL 3 M NaOAc i 2 μL GlycoBlue. Dokładnie wymieszać i umieścić próbki w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej.
5. Powtórz kroki 5.3.2-5.3.12.
6. Zawiesić osad w 6 μl 10 mM Tris, pH 7,0. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 s i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy.

7. Oczyszczanie żelem 3' połączonych śladów stóp
   1. Ustaw 10% żel poliakryloamidowy TBE-mocznik i zanurz w 1x buforze TBE do biegania. Pracować przez 30 minut przy napięciu 200 V przed załadowaniem próbki. Do każdej próbki dodać 6 μl 2x buforu do próbek TBE-mocznik.
      UWAGA: Oczekiwany rozmiar pasma to około 71-73 nt.
   2. Powtórz kroki 5.3.2-5.3.13.
      PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy.
8. Odwrotna transkrypcja 3ʹ połączonych fragmentów odcisku stopy w celu wygenerowania ssDNA
   1. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z tabelą 5 i użyć 3 μl na próbkę.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
10 mM dNTP	1	0,5 mM
Łącznik 25 μM L(rt)	0,5	625 nM
Woda uzdatniona metodą DEPC	1,5
Ostatni tom	3

Tabela 5: Przepis na główną mieszankę odwrotnej transkrypcji przed denaturacją kwasów nukleinowych.

2. Odwirować i odwirować próbkę.
3. Próbki inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
4. Schłodzić próbki na lodzie.
5. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z tabelą 6 i użyć 6 μl na próbkę. Odwirować i odwirować próbkę. Dodać 1 μl indeksu górnego III do każdej próbki i delikatnie odpipetować, aby dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 50 °C.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
5× Bufor FS	4	1x
Inhibitor RNazy SUPERazy	1	2 U
Naziemna telewizja cyfrowa 0,1 mln	1	5 mM
Ostatni tom	6

Tabela 6: Przepis na główną mieszankę bufora odwrotnej transkrypcji po denaturacji kwasów nukleinowych.

6. Dodać 2,3 μl 1 N NaOH, który hydrolizuje RNA i wygasza odwrotną transkrypcję.
   UWAGA: NaOH jest silnie. Nosić rękawice i okulary ochronne
.
7. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 95 °C, aż próbka zmieni kolor na różowy.
8. Ustaw 10% żel poliakryloamidowy TBE-mocznik i zanurz w 1x buforze TBE do biegania. Pracować przez 30 minut przy napięciu 200 V przed załadowaniem próbki. Do każdej próbki dodać 23 μl 2x buforu do próbek TBE-mocznika.
   UWAGA: Oczekiwany rozmiar prążka DNA to 115-117 nt.
9. Powtórz kroki 5.3.2-5.3.12.
10. Zawiesić osad w 15 μl 10 mM Tris, pH 8,0. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 s i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy.

9. cyrkularyzacja ssDNA
   1. Przygotować następującą mieszankę wzorcową i załadować 4 μl na próbkę, jak wyszczególniono w tabeli 7.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
10× Bufor CircLigase II	cyfra arabska	1x
5 M Betaina (opcjonalnie)	1	0,25 mln
50 mM MnCl2	1	2,5 mM
Ostatni tom	4

Tabela 7: Przepis na główną mieszankę cyrkularyzacji ssDNA.

2. Dodać 1 μl ligazy ssDNA CircLigase II do każdej próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.
   UWAGA: Skuteczność tego etapu można zwiększyć, dodając 1 μl ligazy ssDNA CircLigase II do każdej próbki po 1 godzinie inkubacji.
3. Dezaktywować enzym przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 10 minut.
4. Schłodzić na lodzie i kontynuować amplifikację PCR lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
   PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez lata.

10. Amplifikacja PCR
    1. Przygotować następującą mieszaninę wzorcową do PCR i załadować 82 μl na próbkę, jak wyszczególniono w tabeli 8.

pkt. pkt.

Odczynnik	Ilość na próbkę (μl)	Końcowe stężenie
Woda uzdatniona metodą DEPC	61,6
5× Bufor reakcyjny Phusion HF	Rozdział 17,6	1x
10 mM dNTP	1.8	200 μM
Starter do przodu 100 μM PCR	0,2	225 nM
Polimeraza HF Phusion	0,8	1,6 U
Ostatni tom	Rozdział 82

Tabela 8: Przepis na główny miks amplifikacji PCR.

2. Do każdej probówki zawierającej mieszankę wzorcową dodać 5 μl cyrkularyzowanego DNA.
   UWAGA: Resztę okrągłych próbek DNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Do każdej próbki dodać inny 1 μl 20 μM startera do odwróconych kodów kreskowych do PCR (zob. tabela 9) i dokładnie wymieszać.
4. Każdą probówkę należy podzielić na cztery oddzielne probówki do PCR, z których każda będzie używana do innej liczby cykli PCR.
5. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z następującym programem, jak opisano w Tabeli 10.

cykl	denaturacja (98 °C)	Wyżarzanie (60 °C)	Wydłużenie (72 °C)
1	30 sekund
2-16	10 sekund	10 sekund	5 sekund

Tabela 10: Program PCR do reakcji PCR.

6. Po cyklach 8, 9, 10 i 11 wyjmij probówki PCR (w przypadku próbek IP cykle wahają się od 9 do 15) jako pierwszą próbę. Po każdym cyklu wstrzymaj program, wyjmij jedną porcję i umieść ją na lodzie, a następnie szybko wznów program.
   UWAGA: Liczba cykli powinna być dostosowana w oparciu o ilość krążącego DNA w każdej reakcji. Zapoznaj się z Rysunek 4, aby zapoznać się z przykładem i dalszymi wyjaśnieniami.
7. Do każdych 17 μl reakcji dodaj 3,5 μl 6x barwnika ładującego DNA.
8. Rozmrozić drabinę DNA o wartości 10 pz.
9. W celu rozdzielenia wielkości za pomocą elektroforezy żelowej, zanurz 8% poliakrylamid TBE w 1x buforze TBE i załaduj próbki o każdym innym numerze cyklu do sąsiednich studzienek i uruchom żel przez 50 minut przy napięciu 180 V.
10. Rozcieńczyć 6 μl SYBR Gold (10 000 x koncentrat) w 60 ml 1x buforu TBE i bejcy, wstrząsając w osłoniętych przed światłem pudełkach przez 15-20 min.
11. Podczas barwienia żelu przygotuj sterylny skalpel i 0,5 ml probówki z łamaczem żelu w oznaczonych probówkach o pojemności 1,5 ml.
12. Zrób zdjęcie poplamionych kwasów nukleinowych.
13. Odetnij żądane pasmo o oczekiwanym rozmiarze pasma 174-176 pz za pomocą sterylnego skalpela i umieść plasterek żelu w przygotowanej probówce z łamaczem żelu o pojemności 0,5 ml (dokładnie wyczyść między próbkami i użyj środka dezaktywującego RNazę lub zmień na nowe ostrze).
14. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C, a następnie przenieść pozostałe kawałki żelu z probówki o pojemności 0,5 ml do probówki o pojemności 1,5 ml.
15. Dodać 500 μl 10 mM Tris, pH 8,0 i wstrząsać w mieszalniku termicznym z prędkością 1 400 obr./min przez 10 minut w temperaturze 70 °C.
16. Przenieść rozpuszczony żel do kolumny z octanem celulozy za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze.
17. Odwirować kolumnę przez 3 minuty przy 20 000 x g i temperaturze 4 °C, a następnie przenieść przepływ do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i schłodzić na lodzie.
18. Aby wytrącić kwas nukleinowy, dodaj: 550 μL IPA, 32 μL 5 M NaCl, 1 μL 0,5 M EDTA i 2 μL GlycoBlue i dokładnie wymieszaj.
19. Próbki należy przechowywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C lub -20 °C przez noc.
    PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez noc lub dłużej.
20. Powtórz kroki 5.3.11-5.3.12.
21. Zawiesić w 11 μl 10 mM Tris, pH 8,0. Wirować w temperaturze 450 x g, 4 °C przez 20 s i przenieść próbkę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    PUNKT ZATRZYMANIA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez lata.

11. Ilościowe określanie rozkładu wielkości za pomocą bioanalizatora
    1. Rozcieńczyć każdą próbkę w stosunku 1:4, mieszając 1 μl próbki z 4 μl wody uzdatnionej DEPC.
    2. Uruchom mały chip RNA Bioanalyzer. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
       UWAGA: Przewidywana długość to 175 ± 5 pz.
12. Ilościowe określenie stężenia DNA za pomocą fluorometru
    1. Wykonaj kontrolę stężenia dsDNA o wysokiej czułości za pomocą fluorometru zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Multipleksy i sekwencje próbek zgodnie z zaleceniami Illumina (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Analiza danych

1. Wykonaj analizę zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym.

Wyniki

Jak pokazano na schemacie blokowym tego protokołu (Rysunek 1), komórki były hodowane do fazy logarytmicznej, a następnie szybko zbierane przez filtrację i poddawane lizie przez mielenie kriogeniczne. Lizat został następnie podzielony na dwa: jeden dla całkowitych śladów mRNA chronionych rybosomem, a drugi dla wybranych śladów mRNA chronionych rybosomami, na których przeprowadziliśmy oczyszczanie powinowactwa w celu ściągnięcia znakowanych kompleksów łańcuchów białko-rybosom-powstające. Zapewniliśmy oz...

Dyskusja

W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje podejście do selektywnego profilowania rybosomów w celu wychwytywania oddziaływań kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi. Ponieważ rybosom rośnie jako centrum koordynacji wyłaniania się łańcucha rodzącego się w zatłoczonej cytoplazmie, jest to kluczowa metoda identyfikacji i charakteryzowania różnych interakcji kotranslacyjnych wymaganych do zapewnienia funkcjonalnego proteomu, a także do badania różnych chorób. Do tej pory SeRP jest jedyną metodą, która może uchwyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3'-Fosforylowany 28 nt RNA kontrolny oligonukleotyd	IDT	na zamówienie niestandardowe	Oczyszczanie HPLC bez RNaz; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolutny
etanol	VWR	20821
Kwaśny fenol– chloroform	Ambion	AM9722
Przeciwciało: mysi monklonalny anty-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Agar Bacto	BD	214030
Pepton Bacto	BD	211820
Bacto trypton	BD
Ekstrakt drożdżowy Bacto	BD	212720
Chlorowodorek bestatyny	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligaza*	Epicentrum	CL9025K	100 U/μ L
Koloidalny roztwór barwiący Coomassie	Roth	4829
cKompletne, wolne od EDTA tabletki koktajlowe inhibitora proteazy	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC uzdatniona i sterylna filtrowana woda*	Sigma	95284
D-glukoza bezwodna	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsuloxide *	Sigma-Aldrich	276855
drabinka DNA, 10 pz O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
barwnik ładujący DNA*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6 razy;
DNaza I, rekombinowany	Roche	4716728001	wolnych od RNAza
*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glicerol	VWR	24388.260.
Roztwór glicyny	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/ml
HEPES	Roth	HN78.3
HF Polimeraza Phusion*	NEB	M0530L
HK z S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Kwas solny	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd	Roth	CN08
Kanamycyna	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	na zamówienie
Ciekły azot
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4· 2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4· H2O	Roth	K300.2
Sepharose aktywowany przez NHS 4 kulki o szybkim przepływie	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substytut	Sigma	74385
Pepstatyna A	Roth	2936.2
Fluorek fenylometylosulfonylu	Roth	6367
Prefabrykaty żelowe	Bio-Rad	5671034	10% i 12%
RNaza I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNaz
Octan sodu*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5,5
Azydek sodu	Merck	S8032-100G
Chlorek sodu	Roth	9265
Wodorotlenek sodu*	Sigma	S2770	1 N
Sacharoza	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In Inhibitor RNazy	Ambion	AM2694
Indeks górny III Odwrotna transcyptaza *	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold *	Invitrogen	S11494
Kinaza polinukleotydowa T4 *	NEB	M0201L
Ligaza RNA T4 2 *	NEB	M0242L
Żel poliakrylamidowy TBE*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE– żel poliakryloamidowy mocznik*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE– żel poliakryloamidowy mocznik*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE– bufor próbki mocznika *	Novex	LC6876	2 razy;
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7,0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8,0
UltraPure 10 razy; Bufor TBE*	Invitrogen	15581-044
* - do przygotowania
uszczelka i zacisk sprężynowy, 90 mm,Millipore
Kolba do fugowania szlifowanego 1 L,	Millipore	XX1504705