Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatnich latach stało się oczywiste, że rybosomy nie tylko dekodują nasze mRNA, ale także kierują powstawaniem łańcucha polipeptydowego w zatłoczonym środowisku komórkowym. Rybosomy stanowią platformę do kontrolowanego przestrzennie i kinetycznie wiązania czynników ukierunkowanych na błonę, modyfikowania enzymów i fałdowania białek opiekuńczych. Niedawno odkryto, że nawet składanie się w oligomeryczne kompleksy wysokiego rzędu, jak również etapy tworzenia sieci białko-białko, są skoordynowane z syntezą.
Tutaj opisujemy Selektywne Profilowanie Rybosomów, metodę opracowaną do uchwycenia interakcji kotranslacyjnych in vivo. Omówimy szczegółowo różne etapy oczyszczania powinowactwa wymagane do wychwytywania kompleksów rybosom-powstających łańcuchów wraz z interaktorami kotranslacyjnymi, a także etapy ekstrakcji mRNA, wykluczania wielkości, odwrotnej transkrypcji, głębokiego sekwencjonowania i analizy dużych zbiorów danych, wymagane do rozszyfrowania interakcji kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi.
Wprowadzenie
Selektywne Profilowanie Ribosomów (SeRP) jest jedyną znaną do tej pory metodą, która bezpośrednio wychwytuje i charakteryzuje interakcje kotranslacyjne in vivo1,2,3,4,5,6. SeRP umożliwia globalne profilowanie interakcji dowolnego czynnika z translującymi rybosomami z rozdzielczością zbliżoną do pojedynczego kodonu2,7.
Metoda opiera się na błyskawicznym zamra....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generowanie szczepów do selektywnego profilowania rybosomów
UWAGA: Selekcytywny Ribosome Profiling (SeRP) to metoda, która opiera się na oczyszczaniu powinowactwa interesujących czynników, aby ocenić ich sposób interakcji z powstającymi kompleksami łańcuchowymi rybosomów. Rekombinacja homologiczna9, a także metody oparte na CRISPR/Cas910 są wykorzystywane do łączenia różnych czynników zainteresowania ze znacznikami w celu oczyszczania powinowactwa. Takimi znacznikami są GFP, do oczyszczania powinowactwa GFP-trap, TAP-tag do oczyszczania kulek IgG-Sepharose, a także AVI-Ta....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak pokazano na schemacie blokowym niniejszego protokołu (Rysunek 1), komórki hodowano do fazy logarytmicznej, a następnie szybko zbierano poprzez filtrację i lizowano za pomocą mielenia kriogenicznego. Lizat podzielono na dwie części: jedną przeznaczoną do analizy całkowitych odcisków mRNA chronionych przez rybosomy, a drugą do wybranych odcisków mRNA chronionych przez rybosomy, w której przeprowadzono oczyszczanie powinowactwa w celu wyizolowania kompleksów znakowanego białka, rybosomu i n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje podejście do selektywnego profilowania rybosomów w celu wychwytywania oddziaływań kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi. Ponieważ rybosom rośnie jako centrum koordynacji wyłaniania się łańcucha rodzącego się w zatłoczonej cytoplazmie, jest to kluczowa metoda identyfikacji i charakteryzowania różnych interakcji kotranslacyjnych wymaganych do zapewnienia funkcjonalnego proteomu, a także do badania różnych chorób. Do tej pory SeRP jest jedyną metodą, która może uchwyc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium za owocne dyskusje oraz Muhammadowi Makhzumy za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta została sfinansowana z grantu ISF (Israeli Science Foundation) 2106/20.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3'-Fosforylowany 28 nt RNA kontrolny oligonukleotyd | IDT | na zamówienie niestandardowe | Oczyszczanie HPLC bez RNaz; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolutny |
| etanol | VWR | 20821 | |
| Kwaśny fenol– chloroform | Ambion | AM9722 | |
| Przeciwciało: mysi monklonalny anty-HA | Merck | 11583816001 | 12CA5 |
| Aprotinin | Roth | A162.3 | |
| ATP* | NEB | P0756S | 10 mM |
| Agar Bacto | BD | 214030 | |
| Pepton Bacto | BD | 211820 | |
| Bacto trypton | BD | ||
| Ekstrakt drożdżowy Bacto | BD | 212720 | |
| Chlorowodorek bestatyny | Roth | 2937.2 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| CircLigase II ssDNA Ligaza* | Epicentrum | CL9025K | 100 U/μ L |
| Koloidalny roztwór barwiący Coomassie | Roth | 4829 | |
| cKompletne, wolne od EDTA tabletki koktajlowe inhibitora proteazy | Roche Diagnostics | 29384100 | |
| Cycloheximide | Biological Industries | A0879 | |
| DEPC uzdatniona i sterylna filtrowana woda* | Sigma | 95284 | |
| D-glukoza bezwodna | Merck | G5767-500G | |
| Diethylpyrocarbonate | Roth | K028 | |
| Dimethylsuloxide * | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| drabinka DNA, 10 pz O'RangeRuler* | Thermo Fisher Scientific | SM1313 | |
| barwnik ładujący DNA* | Thermo Fisher Scientific | R0631 | 6 razy; |
| DNaza I, rekombinowany | Roche | 4716728001 | wolnych od RNAza |
| * | NEB | N0446S | |
| EDTA* | Roth | 8043 | |
| Glicerol | VWR | 24388.260. | |
| Roztwór glicyny | Sigma-Aldrich | 67419-1ML-F | 1 M |
| GlycoBlue | Ambion | AM9516 | 15 mg/ml |
| HEPES | Roth | HN78.3 | |
| HF Polimeraza Phusion* | NEB | M0530L | |
| HK z S. cerevisiae | Sigma-Aldrich | H6380-1.5KU | |
| Kwas solny | AppliChem | A1305 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 33539 | |
| Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd | Roth | CN08 | |
| Kanamycyna | Roth | T832.4 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| Leupeptin | Roth | CN33.4 | |
| Linker L(rt) | IDT | na zamówienie | |
| Ciekły azot | |||
| MgCl2 | Roth | KK36.3 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.2 | |
| Na2HPO4· 2H2O | Roth | T879.3 | |
| NaCl* | Invitrogen | AM97606 | 5 M |
| NaH2PO4· H2O | Roth | K300.2 | |
| Sepharose aktywowany przez NHS 4 kulki o szybkim przepływie | GE Life Sciences | 17090601 | |
| Nonidet P 40 substytut | Sigma | 74385 | |
| Pepstatyna A | Roth | 2936.2 | |
| Fluorek fenylometylosulfonylu | Roth | 6367 | |
| Prefabrykaty żelowe | Bio-Rad | 5671034 | 10% i 12% |
| RNaza I | Ambion | AM2294 | |
| SDS, 20% | Ambion | AM9820 | RNaz |
| Octan sodu* | Ambion | AM9740 | 3 M, pH 5,5 |
| Azydek sodu | Merck | S8032-100G | |
| Chlorek sodu | Roth | 9265 | |
| Wodorotlenek sodu* | Sigma | S2770 | 1 N |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| SUPERase-In Inhibitor RNazy | Ambion | AM2694 | |
| Indeks górny III Odwrotna transcyptaza * | Invitrogen | 18080-044 | |
| SYBR Gold * | Invitrogen | S11494 | |
| Kinaza polinukleotydowa T4 * | NEB | M0201L | |
| Ligaza RNA T4 2 * | NEB | M0242L | |
| Żel poliakrylamidowy TBE* | Novex | EC6215BOX | 8% |
| TBE– żel poliakryloamidowy mocznik* | Novex | EC68752BOX | 10% |
| TBE– żel poliakryloamidowy mocznik* | Novex | EC6885BOX | 15% |
| TBE– bufor próbki mocznika * | Novex | LC6876 | 2 razy; |
| Tris | Roth | 4855 | |
| Tris* | Ambion | AM9851 | 1 M, pH 7,0 |
| Tris* | Ambion | AM9856 | 1 M, pH 8,0 |
| UltraPure 10 razy; Bufor TBE* | Invitrogen | 15581-044 | |
| * - do przygotowania | |||
| uszczelka i zacisk sprężynowy, 90 mm,Millipore | |||
| Kolba do fugowania szlifowanego 1 L, | Millipore | XX1504705 |
Bibliografia
- Oh, E., et al. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
