Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Metody oceny funkcji i struktury komórek zwojowych siatkówki oraz nerwu wzrokowego u dużych zwierząt

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62879

⸱

26 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy kilka testów in vivo (potencjał wywołany w trybie wizualnym flash, elektroretinogram wzorcowy i koherentna tomografia optyczna) u kóz i makaków rezusów, aby zrozumieć strukturę i funkcję nerwu wzrokowego i jego neuronów.

Streszczenie

Nerw wzrokowy zbiera sygnały aksonów z komórek zwojowych siatkówki i przekazuje sygnał wzrokowy do mózgu. Duże modele zwierzęce uszkodzenia nerwu wzrokowego są niezbędne do przełożenia nowych strategii terapeutycznych z modeli gryzoni do zastosowań klinicznych ze względu na ich bliższe podobieństwo do ludzi pod względem wielkości i anatomii. W tym miejscu opisujemy niektóre metody in vivo do oceny funkcji i struktury komórek zwojowych siatkówki (RGC) i nerwu wzrokowego (ON) u dużych zwierząt, w tym wzrokowy potencjał wywołany (VEP), elektroretinogram wzorcowy (PERG) i optyczna tomografia koherentna (OCT). W badaniu tym zatrudniono zarówno kozy, jak i naczelne. Przedstawiając te metody in vivo krok po kroku, mamy nadzieję zwiększyć odtwarzalność eksperymentalną w różnych laboratoriach i ułatwić wykorzystanie dużych modeli zwierzęcych neuropatii nerwu wzrokowego.

Wprowadzenie

Nerw wzrokowy (ON), który składa się z aksonów z komórek zwojowych siatkówki (RGC), przekazuje sygnał wzrokowy z siatkówki do mózgu. Choroby ON, takie jak jaskra, pourazowa lub niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego, często powodowały nieodwracalne zwyrodnienie ON/RGC i wyniszczającą utratę wzroku. Chociaż obecnie istnieje wiele przełomów w regeneracji ON i ochronie RGC w modelach gryzoni1,2,3,4,5,6, leczenie kliniczne większości chorób ON pozostało zasadniczo takie samo przez ostatnie pół wieku z niezadowalającymi wynikami7,8. Aby wypełnić lukę między badaniami podstawowymi a praktyką kliniczną, badania translacyjne z wykorzystaniem dużego modelu zwierzęcego chorób ON są często konieczne i korzystne ze względu na ich podobieństwo anatomiczne do ludzi niż do modeli gryzoni.

Makaki kozy i rezusy to dwa duże gatunki zwierząt używane w naszym laboratorium do modelowania choroby ON u człowieka. Rozmiar gałki ocznej kozy, ON, i przylegającej do niej struktury (jama oczodołowa i nosowa, podstawa czaszki itp.) jest podobny do rozmiaru człowieka na podstawie tomografii komputerowej czaszki scan9. W związku z tym model kozy daje możliwość oceny i udoskonalenia urządzeń terapeutycznych lub procedur chirurgicznych przed zastosowaniem u ludzi. Makak rezus, jako naczelny (NHP), ma unikalny system wzrokowy podobny do ludzkiego, który nie istnieje u innych gatunków10,11. Ponadto patofizjologiczne reakcje na urazy i leczenie w NHP są bardzo podobne do tych u ludzi12.

Testy in vivo oceniające strukturę i funkcję ON i RGC są ważne w badaniach na dużych zwierzętach. Do oceny funkcji RGC wykorzystano elektroretinogram wzorcowy (PERG). Potencjał wywołany w trybie wizualnym flash (FVEP) odzwierciedla integralność szlaku siatkówkowo-genikulologiczno-korowego w układzie wzrokowym. W ten sposób PERG w połączeniu z FVEP może odzwierciedlać funkcję ON9,13,14 . Obrazowanie koherentnej koherentnej koherencji wzrokowej siatkówki (OCT) może pokazać strukturę siatkówki z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, co umożliwia pomiar grubości kompleksu zwojowego siatkówki (GCC)9,15. W przypadku badań elektrofizjologicznych w tym badaniu kluczowe znaczenie ma monitorowanie parametrów życiowych (szybkość rui, szybkość naruszeń, ciśnienie krwi) i poziom saturacji tlenem (SpO2) przed badaniem, ponieważ parametry te mają silny wpływ na przepływ krwi w oku, a tym samym na funkcjonowanie układu wzrokowego. Jednak dla uproszczenia nie monitorowaliśmy parametrów życiowych podczas wykonywania obrazowania siatkówki OCT. Zgodnie z naszym poprzednim badaniem9, grubość GCC mierzona za pomocą obrazowania siatkówki OCT jest dość stabilna, ze współczynnikiem zmienności międzysesyjnej bliskim 3%. Te testy in vivo na kozach i makakach rezusach zostały szczegółowo opisane w naszym poprzednim badaniu9. Poniżej przedstawiamy te metody, które pomagają zwiększyć przejrzystość i odtwarzalność eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone ściśle zgodnie z wytycznymi ARRIVE i przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a także przestrzegały protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Wenzhou (WMU) i Joinn Laboratory (Suzhou). Samce kóz rasy Saanen w wieku od 4 do 6 miesięcy o wadze 19-23 kg były trzymane w obiekcie dla zwierząt WMU. Samce makaków rezusów, w wieku od 5 do 6 lat i wadze 5-7 kg, były trzymane w obiekcie dla zwierząt w Joinn. Wszystkie zwierzęta utrzymywano w klimatyzowanym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (21 ± 2 °C) w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności z podawaniem pokarmu ad libitum.

1. Wizualny potencjał wywołany w technologii Flash (FVEP) u kozy

  1. Znieczulenie ogólne
    1. Ogol włosy stawu skokowego za pomocą elektronicznej maszynki do golenia.
    2. Przygotuj skórę, trzykrotnie nacierając 70% alkoholem, aby oczyścić skórę, a następnie odsłoń żyłę podskórną.
    3. Wprowadzić dożylnie cewnik do żył obwodowych (0,9 mm x 25 mm), a następnie wstrzyknąć atropinę (0,025 mg/kg) i propofol (5 mg/kg).
    4. Zaintubuj kozę rurką dotchawiczą 6 mm i podłącz ją do sztucznego respiratora.
    5. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 3,5% izofluranu w tlenie przy stałym natężeniu przepływu 2 l/min.
      UWAGA: Koza dochodzi do siebie po znieczuleniu wywołanym propofolem w ciągu kilku minut, więc należy się pospieszyć, aby zaintubować kozę.
  2. Monitorowanie układu krążeniowo-oddechowego
    1. Umieść czujnik temperatury pod językiem.
    2. Podłącz pulsoksymetr do bliższego końca ucha.
    3. Przywiąż mankiet do pomiaru ciśnienia krwi u podstawy uda.
    4. Odpowiednio zacisnąć klipsy EKG na kończynach.
      UWAGA: Normalne tętno kóz wynosi 68-150 uderzeń na minutę. Dzięki zastosowaniu znieczulenia gazowego tętno kóz wzrośnie. Dlatego nasze tętno podczas kontroli wynosi 170 ± 30 uderzeń na minutę. Skurczowe ciśnienie krwi kóz w normalnych warunkach wynosi 110-130 mmHg, a rozkurczowe ciśnienie krwi 50-60 mmHg. W stanie wdychania tlenu nasycenie krwi kozy tlenem może być zawsze utrzymane na poziomie 99%. Częstość oddychania kóz pod narkozą jest zsynchronizowana z częstością oddychania respiratora, która wynosi 10 oddechów/min. Ponieważ temperatura była mierzona spod języka kozy, a nie temperatura rdzenia, temperatura kozy wynosi zwykle 35 ± 2 °C.
  3. Wszczepienie czaszkowych i umieszczenie elektrod
    1. Ogol włosy maszynką do strzyżenia. Zdezynfekuj skórę na środku kości czołowej, trzykrotnie pocierając ją wacikiem nasączonym betadyną i 70% alkoholem.
    2. Użyj wysterylizowanych i nożyczek.
      UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne do sterylizacji należy sterylizować w autoklawie (121 °C, 20 min).
    3. Wykonaj 5 mm nacięcie skóry, aby odsłonić kość czołową za pomocą nożyczek okulistycznych, a następnie wszczepij wysterylizowaną w środek kości czołowej za pomocą śrubokręta.
    4. Ogol włosy i zdezynfekuj skórę na centralnej kości potylicznej między dwoma uszami betadyną i 70% alkoholem, a następnie jednym i drugim, trzy razy.
    5. Wykonaj nacięcie skóry o średnicy 5 mm, aby odsłonić kość potyliczną za pomocą nożyczek okulistycznych, a następnie wszczepij wysterylizowaną w środek kości potylicznej.
      UWAGA: Uziemioną elektrodę igłową wprowadza się podskórnie pod przednią czaszki. Elektrody aktywna i referencyjna są połączone odpowiednio ze potylicznymi i czołowymi za pomocą zacisków krokodylkowych w celu zmniejszenia impedancji elektrody16.
  4. Przygotowanie zwierząt
    1. Użyj światłoszczelnej szmatki, aby zakryć oko i przymocuj za opaskę na oczy, aby załatać jedno oko.
    2. Krople do oczu ze środkiem znieczulającym miejscowo (krople do oczu z chlorowodorkiem proparakainy) należy nakładać na oba oczy. Obustronne źrenice są rozszerzane przez miejscowe podawanie kropli do oczu z rozszerzaniem źrenic z tropikamidem (5%) i fenylefryną (5%).
    3. Umieść głowę kozy w stymulatorze Ganzfelda i przyciemnij światło otoczenia.
      UWAGA: Stwierdzono, że kozy mogą utrzymać dobrą fiksację gałki ocznej w znieczuleniu, więc nie jest wymagana dodatkowa interwencja w zakresie operacji fiksacji gałki ocznej.
    4. Przykryj stymulator i głowę kozy czarnym kocem na 5 minut w celu adaptacji.
    5. Użyj wziernika powieki, aby odsłonić spojówkę opuszkową. Złóż górny pierścień, pociągnij górną powiekę do góry i włóż górny pierścień najpierw do worka spojówkowego górnej powieki, a następnie w podobny sposób do dolnej powieki.
    6. Naciśnij przycisk impedancji, aby sprawdzić impedancję kontaktową elektroda-tkanka, a wartości impedancji zostaną pokazane w każdym kanale.
    7. Upewnij się, że impedancja jest niższa niż 10 kΩ dla każdej elektrody, aby uniknąć zakłóceń elektromagnetycznych powodowanych przez inne urządzenia elektryczne w tym samym pomieszczeniu.
      UWAGA: Jeśli wartość jest wyższa niż 10 kΩ, podłącz ponownie lub wymień elektrodę. Impedancja może wydawać się nienormalnie wysoka, jeśli elektryczne metalowe łóżko chirurgiczne, na którym leży koza, jest podłączone. Impedancja powinna różnić się o mniej niż 1 kΩ między elektrodą aktywną a elektrodą odniesienia, aby zmniejszyć zakłócenia elektryczne17.
    8. Naciśnij przycisk oscylografu, aby sprawdzić szum linii bazowej bez stymulacji światłem.
      UWAGA: Jeśli słychać duży hałas na linii podstawowej, odłącz wszystkie inne urządzenia elektryczne w tym samym pomieszczeniu i wyłącz telefony komórkowe. Jeśli problem z punktem odniesienia będzie się powtarzał, przejdź do kroku 1.3.10. aby sprawdzić, czy można uzyskać typowy przebieg FVEP. Jeśli nie, przełóż test FVEP na inny termin.
    9. Rozpocznij nagrywanie FVEP, wybierając natężenie światła odpowiednio 0,025, 0,5 i 3,0 cd·s/m2 w polu białego tła w prawym górnym rogu. Następnie naciśnij przycisk Badanie. Należy pamiętać, że zapis FVEP przy każdym natężeniu światła jest wykonywany dwukrotnie.
      UWAGA: Jeśli oba przebiegi wydają się wyraźnie różne, potrzebne jest jeszcze jedno powtórzenie.
    10. Zwilż rogówkę sztucznymi kroplami do oczu łez, jeśli wydaje się sucha na kamerze termowizyjnej.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem nagrywania monitoruj pozycję oczu za pomocą wbudowanej kamery na podczerwień, aby upewnić się, że wzrok jest prawidłowy, a źrenica jest w pełni odsłonięta (tak, aby rozmiar pola bodźca błyskowego wynosił 90°. Pozycję oczu znieczulonej kozy można regulować, odpowiednio obracając jej głowę. Z naszych obserwacji wynika, że błądzenie wzrokiem rzadko występuje podczas nagrywania FVEP (~10 min) u kóz w znieczuleniu ogólnym9. Nie ma więc potrzeby zatrzymywania się i ponownego dostosowywania spojrzenia podczas nagrywania.
    11. Powtórz powyższe kroki dla oka przeciwległego.
    12. Przerwij dopływ izofluranu i nieznacznie zwiększ objętość oddechową na respiratorze, aby pomóc kozie dojść do siebie po znieczuleniu ogólnym.
    13. Po znieczuleniu ogólnym należy potraktować kozę gentamycyną (4 mg/kg domięśniowo) i ceftiofurem sodowym (cefalosporyna, 2 mg/kg domięśniowo), aby zapobiec zakażeniu.
  5. Pomiar FVEP i analiza ilościowa
    UWAGA: Jak pokazano na Rysunek 1A, pierwsze dodatnie i ujemne piki w przebiegu FVEP są oznaczone jako P1 i N1, a drugi dodatni pik jako P2. Typowy czas niejawny P1, N1 i P2 wynosi odpowiednio około 40, 60 i 120 ms. Amplitudy P1 i P2 są mierzone od doliny przebiegu N1 do szczytów przebiegów odpowiednio P1 i P2.
    1. W przypadku urazu monokularowego należy użyć międzygałkowego porównania amplitudy i czasu utajonego, aby zmniejszyć zmienność międzysesyjną i zwiększyć czułość17.

2. PVEP u makaków rezusów

UWAGA: Wzorce VEPs mogą być wywoływane u makaków rezusów9 i są bardziej stabilne niż Flash VEP pod względem amplitudy i czasu niejawnego17. W związku z tym PVEP wykorzystano do wykrycia integralności szlaku siatkówka-genikulo-kora mózgowa u naczelnych innych niż ludzie.

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulić małpę izofluranem (1,5%-2%) po indukcji za pomocą Zoletil50 (4-8 mg/kg domięśniowo, tiletamina/zolazepam).
    2. Umieść wysterylizowaną elektrodę uziemiającą na płatku ucha. Wprowadzić wysterylizowaną elektrodę aktywną i elektrodę odniesienia podskórnie wzdłuż linii środkowej, odpowiednio na kości czołowej i potylicznej.
    3. Zastosuj wziernik powieki, aby odsłonić spojówkę opuszkową.
    4. Użyj samoprzylepnej, nieprzezroczystej czarnej taśmy, aby załatać oko po drugiej stronie.
  2. Nagrywanie PVEP
    1. Naciśnij przycisk Impedancja, aby sprawdzić impedancję kontaktową elektroda-tkanka, a wartości impedancji zostaną pokazane w każdym kanale; upewnij się, że jest poniżej 10k Ω. Jeśli nie, podłącz ponownie lub wymień elektrodę.
    2. Sprawdź wartości impedancji w oknie testu impedancji i upewnij się, że impedancja różni się o mniej niż 1 kΩ między elektrodami aktywnymi i odniesienia, aby zmniejszyć zakłócenia elektryczne17.
    3. Naciśnij przycisk oscylografu, aby sprawdzić szum linii bazowej bez stymulacji.
      UWAGA: Jeśli słychać duży hałas na linii podstawowej, odłącz wszystkie inne urządzenia elektryczne w tym samym pomieszczeniu i wyłącz telefony komórkowe. Jeśli problem z punktem odniesienia będzie się powtarzał, powtórz test PVEP w innym dniu.
    4. Nagraj odpowiedzi PVEP nieoczyszczonego oka, wybierając natężenie światła odpowiednio 0.5 i 1.0 cyklu/stopnia w białym tle w prawym górnym rogu, a następnie naciśnij przycisk Badanie.
      UWAGA: Dla każdego nagrania uśredniane są 64 ścieżki, aby uzyskać jeden przebieg. Dla każdej częstotliwości pozyskiwane są co najmniej dwa nagrania w celu sprawdzenia odtwarzalności sygnałów PVEP.
    5. Powtórz procedurę dla przeciwległego oka.
    6. Po zakończeniu przerwij podawanie izofluranu, aby obudzić małpę.
    7. Po znieczuleniu ogólnym należy podać małpie gentamycynę (4 mg/kg domięśniowo) i ceftiofur sodowy (2 mg/kg domięśniowo), aby zapobiec zakażeniu.
  3. Pomiar PVEP i analiza ilościowa
    1. Jak pokazano w Rysunek 1B, pierwsze ujemne i dodatnie piki w przebiegu PVEP zostały oznaczone jako N1 i P1, które zwykle występują po około 50 i 90 ms. Amplituda P1 jest mierzona od doliny N1 do szczytu P1.
    2. W przypadku urazu monokularu należy użyć międzygałkowego porównania amplitudy i czasu niejawnego, aby zmniejszyć zmienność międzysesyjną i zwiększyć czułość17.

3. Wzór ERG (PERG) w kozie

UWAGA: W poprzednim badaniu nie zaobserwowano przesłuchu międzygałkowego sygnału PERG u kóz, więc odpowiedzi PERG mogą być rejestrowane jednocześnie z obojga oczu9.

  1. Przygotowanie do egzaminu
    1. Znieczulić kozę za pomocą ksylazyny (3 mg/kg, domięśniowo) i umieścić na stole do badań.
    2. Umieść czujnik temperatury pod językiem kozy.
    3. Podłącz pulsoksymetr do bliższego końca ucha kozy.
    4. Przywiąż mankiet do pomiaru ciśnienia krwi do uda.
    5. Odpowiednio zacisnąć klipsy EKG na kończynach.
    6. Aby zmniejszyć impedancję elektrody, umieść wysterylizowaną czaszki na kości czołowej i połącz z elektrodą masową za pomocą zacisku krokodylkowego.
    7. Umieść dwie wysterylizowane elektrody referencyjne igłowe podskórnie 1 cm za boczną kanthi po obu stronach.
    8. Użyj wziernika powieki, aby odsłonić spojówkę opuszkową.
    9. Umieść dwie zdezynfekowane elektrody rejestrujące ERG-Jet na środku obustronnej rogówki po miejscowym zastosowaniu sztucznego łzy.
    10. Umieść dwa monitory LED o wymiarach 47.6 cm x 26.8 cm przed obojgiem oczu w odległości oglądania 50 cm.
    11. Ustaw każdy monitor tak, aby był równoległy do płaszczyzny źrenicy po tej samej stronie i wyrównaj środek monitora do płaszczyzny źrenicy.
    12. Upewnij się, że szachownica odwracania kontrastu (częstotliwość czasowa, 2.4 Hz) jest wyświetlana na obu monitorach i ma maksymalny współczynnik proporcji 4:3, który jest ustawiany w ustawieniach sprzętu.
    13. Upewnij się, że kontrast między białymi i czarnymi kratkami pozostaje na poziomie 96%, a średnia luminancja wynosi 200 cd/m2 (Candela na metr kwadratowy), co jest sprawdzane przez miernik luminancji.
      UWAGA: Zgodnie z ISCEV, średnia luminancja fotopowa 40-60 cd/m2 jest wymagana u ludzi17. W innym badaniu z wykorzystaniem modelu mysiego wzór pozostał na średnim poziomie luminancji 800 cd/m2,18. Rozmiar pola co najmniej 15° w najwęższym wymiarze jest wymagany do standardowego testu PERG u ludzi17. Dostosuj położenie elektrody rogówki, jeśli nie znajduje się ona na środku powierzchni rogówki.
  2. Nagrywanie PERG
    1. Przyciemnij światło otoczenia i naciśnij przycisk impedancji, aby sprawdzić impedancję kontaktową elektrody z tkanką. Wartości impedancji będą pokazywane w każdym kanale.
    2. Sprawdź wartości impedancji w oknie testu impedancji i upewnij się, że impedancja jest poniżej 10 kΩ. Jeśli nie, podłącz ponownie lub wymień elektrodę.
    3. Naciśnij przycisk oscylografu, aby sprawdzić szum linii bazowej bez stymulacji światłem.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby chronić delikatne elektrody nagrywające ERG-Jet. Szum bazowy w PERG jest zwykle mniejszy niż w FVEP u kóz.
    4. Rozpocznij nagrywanie PERG z obu oczu jednocześnie na częstotliwościach przestrzennych kolejno 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 i 12,6 cykli/stopień. Dla każdej częstotliwości przestrzennej uśrednia się 64 ślady, aby uzyskać jeden odczyt.
    5. Na koniec wyłącz monitor, aby zarejestrować PERG bez bodźca wizualnego jako kontrolę negatywną.
      UWAGA: Sygnały PERG są zwykle stabilne i nie wymagają powtarzania.
    6. Usuń przedniej czaszki i obudź kozę, wstrzykując Idzoxan (1,5 mg/kg), który jest antagonistą ksylazyny.
    7. Po znieczuleniu ogólnym należy potraktować kozę gentamycyną (4 mg/kg domięśniowo) i ceftiofurem sodowym (2 mg/kg domięśniowo), aby zapobiec zakażeniu.
  3. Pomiar PERG i analiza ilościowa
    1. Ustaw filtr pasmowoprzepustowy w zakresie od 1 do 75 Hz. W przypadku PERG 3.0 cpd filtr pasmowoprzepustowy jest ustawiony na zakres od 1 do 50 Hz, aby wygładzić ścieżkę bez wpływu na jej amplitudę.
    2. Jak pokazano na Rysunek 1C, pierwsze dodatnie i ujemne piki w przebiegu są oznaczone jako P1 (zwykle około 25 ms) i N1 (zwykle około 55 ms). Amplituda PERG jest mierzona od N1 do P1.
    3. W przypadku urazu monokularowego stosujemy międzygałkowe porównanie amplitudy i czasu niejawnego, aby zmniejszyć zmienność międzysesyjną i zmniejszyć czułość17.

4. PERG u makaków rezusów

UWAGA: Nie jest jasne, czy u makaków rezusów występuje przesłuch międzygałkowy sygnału PERG, więc odpowiedzi PERG z obu oczu są rejestrowane oddzielnie.

  1. Przygotowanie do egzaminu
    1. Znieczulić małpę izofluranem (1,5%-2%) po wstrzyknięciu Zoletil50 (4-8 mg/kg domięśniowo, tiletamina/zolazepam) i intubacji tchawicy.
    2. Umieść wysterylizowaną elektrodę uziemiającą podskórnie na kości czołowej. Wprowadzić wysterylizowaną elektrodę referencyjną z igłą podskórnie, 1 cm za boczną kantą po tej samej stronie.
    3. Umieścić zdezynfekowaną elektrodę rejestrującą ERG-Jet na centralnej rogówce po miejscowym zastosowaniu sztucznego łzy.
      UWAGA: Dostosuj położenie elektrody rogówki, jeśli nie znajduje się ona na środku powierzchni rogówki.
    4. Użyj samoprzylepnej, nieprzezroczystej czarnej taśmy, aby załatać jedno oko.
    5. Umieść monitor (47.6 x 26.8 cm) w odległości oglądania 50 cm.
    6. Upewnij się, że monitor jest ustawiony tak, aby był ustawiony równolegle do płaszczyzny źrenicy. Wyrównaj środek monitora do płaszczyzny źrenicy.
    7. Upewnij się, że czarno-biała szachownica odwraca się z częstotliwością 2.4 Hz, a proporcje wynoszą 4:3, co jest ustawione w ustawieniach sprzętu.
    8. Upewnij się, że kontrast między białą i czarną kratownicą wynosi 96%, a uśredniona luminancja pozostaje 200 cd/m2, co jest sprawdzane za pomocą miernika luminancji.
  2. Nagrywanie PERG
    1. Przyciemnij światło otoczenia i sprawdź impedancję kontaktową elektroda z tkanką.
    2. Upewnij się, że impedancja jest poniżej 10 kΩ. Jeśli nie, podłącz ponownie lub wymień elektrodę.
    3. Sprawdź podstawowy poziom hałasu bez stymulacji światłem.
    4. Załataj jedno oko i rozpocznij nagrywanie PERG z drugiego oka przy częstotliwościach przestrzennych kolejno 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 i 12,6 cykli/stopień.
    5. Powtórzyć kroki 4.2.1-4.2.4 dla oka przeciwległego.
    6. Przerwij podawanie izofluranu, aby obudzić małpę.
    7. Po znieczuleniu ogólnym należy podać małpie gentamycynę (4 mg/kg domięśniowo) i ceftiofur sodowy (2 mg/kg domięśniowo), aby zapobiec zakażeniu.
  3. Pomiar PERG i analiza ilościowa
    1. Jak pokazano na Rysunek 1D, pierwsze dodatnie i ujemne piki w przebiegu są oznaczone jako P1 (zwykle około 40 ms) i N1 (zwykle około 85 ms). Amplituda PERG jest mierzona od N1 do P1.
    2. W przypadku urazu jednoocznego używamy międzygałkowego porównania amplitudy i czasu utajonego, aby zmniejszyć zmienność międzysesyjną i zwiększyć czułość17.

5. PAŹ u kozy

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulić kozę za pomocą ksylazyny (3 mg/kg domięśniowo), a następnie zaintubować.
    2. Rozszerzyć źrenicę, podając miejscowo krople do oczu z rozszerzającymi się źrenicami z tropikamidem (5%) i fenylefryną (5%).
    3. Użyj wziernika powieki, aby całkowicie odsłonić źrenicę.
    4. Połóż głowę kozy na podbródku.
      UWAGA: Chociaż znieczulenie gazowe nie jest wykonywane, należy regularnie intubować kozę, aby chronić drogi oddechowe przed uciskiem przez podbródek.
  2. Obrazowanie OCT
    UWAGA: W tym badaniu obrazowanie OCT siatkówki wykonuje się przy użyciu systemu OCT przy długości fali 870 nm. Optyczna rozdzielczość osiowa skanera OCT wynosi 12 μm. Tryb skanowania okrężnego służy do skanowania głowy nerwu wzrokowego (ONH) w trybie wysokiej rozdzielczości. 100 klatek jest uśrednianych w celu optymalizacji jakości obrazu. Szczegółowy przewodnik szkoleniowy jest dostępny online (patrz tabela materiałów).
    1. Wstępne skanowanie OCT (badanie podstawowe)
      1. Kliknij przycisk Start, aby przejść do interfejsu wykrywania. Poczekaj, aż urządzenie zakończy ładowanie, a następnie naciśnij żółty przycisk Start, aby rozpocząć obrazowanie.
      2. Wyrównaj kozę z kamerą na podczerwień, aby wyśrodkować ONH na obrazie konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO), modyfikując jej pozycję głowy.
      3. Dostosuj joystick, aby równomiernie oświetlić cały obraz w podczerwieni w celu poprawy jakości obrazu.
      4. Przesuń joystick do przodu, aż na pionowym ekranie pojawi się obraz OCT wyprostowanej siatkówki.
      5. Zmodyfikuj joystick, aby uzyskać równomiernie gęsty i poziomo umieszczony obraz OCT siatkówki.
      6. Naciśnij przycisk na joysticku, aby automatycznie uchwycić obraz i przytrzymaj joystick, aby utrzymać jakość obrazu na ekranie obrazu na żywo, aż akwizycja obrazu zostanie zakończona. Następnie naciśnij przycisk Pobierz.
      7. Obudź kozę, wstrzykując Idzoxan (1,5 mg/kg), który jest antagonistą ksylazyny.
        UWAGA: Wyśrodkowanie ONH w badaniu podstawowym pomaga dostosować skan podstawowy i skan kontrolny zgodnie z naszym doświadczeniem.
    2. Kontrolne skanowanie OCT
      1. Wybierz wysokiej jakości początkowy obraz OCT; kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Ustaw odniesienie.
      2. Rozpocznij obrazowanie OCT, jak wspomniano powyżej.
      3. Naciśnij przycisk Kontynuacja, aby umożliwić automatyczne dopasowanie bieżącego skanowania do skanowania referencyjnego.
      4. Po dopasowaniu (okrągły pierścień skanowania zmieni kolor na zielony) naciśnij przycisk na joysticku, aby aktywować automatyczne śledzenie w czasie rzeczywistym.
      5. Obudź kozę, wstrzykując Idzoxan (1,5 mg/kg ), który jest antagonistą ksylazyny.
        UWAGA: Aby ułatwić proces dopasowywania, (1) przesuń ONH w oknie na żywo, odpowiednio obracając głowicę lub (2) obróć ONH w oknie na żywo, przechylając głowę, aby bieżący obraz cSLO wyglądał bardziej podobnie do obrazu bazowego. Ten odruch przedsionkowo-oczny działa dobrze w znieczuleniu ksylazynowym 19.
  3. Pomiar OCT
    1. Kliknij przycisk Pomiar, aby przejść do okna pomiaru.
    2. Wybierz narzędzie do wymazywania i wyczyść linię RNFL, która jest automatycznie oznaczana przez program.
    3. Wybierz narzędzie do rysowania linii, aby ręcznie obrysować granicę między IPL i INL (Rysunek 2).
      UWAGA: Grubość GCC w sześciu obszarach okołobrodawkowatych (T, TS, TI, N, NS, NI) oraz uśredniona grubość GCC wokół ONH (G) można odczytać na ekranie (Rysunek 2). Test studenta, jednoczynnikowa ANOVA lub dwuczynnikowa ANOVA mogą być użyte do ilościowego określenia danych OCT w przypadku rozkładu normalnego.

6. OCT u makaków rezusów

  1. Wykonać obrazowanie OCT siatkówki u makaków rezusów przy użyciu tego samego sprzętu i procedury, co w przypadku kóz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A pokazuje reprezentatywne wyniki FVEP u kóz. Chociaż przebiegi o tej samej intensywności błysku są względnie podobne, nadal zalecamy dwukrotne zbadanie przebiegów. Fale elektromagnetyczne generowane przez urządzenia elektroniczne będą zakłócać zebrane sygnały elektryczne, powodując wysoki szum linii podstawowej i słabą powtarzalność przebiegu. Dlatego zaleca się upewnienie się, że podczas badania elektrofizjologicznego nie ma nadmiarowych urządzeń elektronicznych podłączonych do ot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono protokół VEP, PERG i OCT u kóz i makaków rezusów. Te metody in vivo mogą być stosowane w dużych modelach zwierzęcych różnych neuropatii nerwu wzrokowego, takich jak jaskra, niedokrwienna lub urazowa neuropatia nerwu wzrokowego i zapalenie nerwu wzrokowego9.

PVEP jest bardziej stabilny i czuły niż FVEP17; Jednak nie można go wywołać w Goat9. W związku z tym FVEP wykonuje się u kóz, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z następujących grantów: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Medyczny projekt badawczy w Wenzhou (Y20170188), Krajowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFC1101200); Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (81770926; 81800842); Kluczowy program badawczo-rozwojowy prowincji Zhejiang (2018C03G2090634); oraz kluczowy program badawczo-rozwojowy szpitala okulistycznego w Wenzhou (YNZD1201902). Sponsor lub organizacja finansująca nie odgrywała żadnej roli w projektowaniu lub prowadzeniu tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Monitory o wymiarach 47,6 x 26,8 cm firmyDELL Inc.E2216HVBodźce wizualne czarno-białych szakrownic z odwróceniem kontrastu były wyświetlane na ekranach
6,0 mm rurka tchawicyHenan Tuoren Medical Device Co., LtdPVC 6.0
atropinę
atropiny atropinyGuangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co., Ltd.zmniejszają wydzielanie oskrzeli i chronią serce przed aktywacją nerwu błędnego
Carbomer Eye GelFabrik GmbH Spółka zależna Bausch & Lombzwilżyć rogówkę i ustabilizować elektrody nagrywające
ERG-Jet Elektrody nagrywająceRoland Consult Stasche& Finger GmbH2300 La Chaux-De-FondsERG nagrywanie
wziernika okaShanghai Jinzhong Medical Device Co., LtdZYD020otwarta szczelina powiekowa
Heidelberg Spectralis OCT system HeidelbergEngineeringOCT
Obrazowanie( https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
izofluranuRWD Life Science Co., LtdR510-22znieczulenie izofluranem
samce kóz SaanenCaimu Livestock Company, kraj (Hangzhou, Chiny)Samce kóz Saanen w wieku od 4 do 6 miesięcy o wadze 19 lat; Elektroda igłowa 23 kg
Roland Consult Stasche& Finger GmbHU51-426-G-Dzastosowanie do elektrody uziemiającej FVEP i elektrod referencyjnych PERG
obwodowy cewnik żylny dożylnieBD shanghai Medical Device Co., Ltd383019dożylny dostęp do atropiny i propofolu
propofolXian Lipont Enterprise Union Management Co., Ltd.indukować znieczulenie izofluranem u kóz
Krople do oczu tropicamidu fenylefrynySANTEN OY, Japonia5% tropicamid i 5% chlorowodorek fenylefryny
urządzenie do elektrofizjologii wizualnejGotec Co., LtdGT-2008V-IIIdo stosowania w FVEP i PERG
ksylazynaHuamu Animal Health Products Co., Ltd.znieczulenie ksylazynowe: domięśniowe wstrzyknięcie ksylazyny 3 mg/kg
zoletil50Virbacindukuje znieczulenie izofluranem u małp
zapewnia w drogach oddechowych

Bibliografia

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119(2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2(2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117(2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881(2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki zwojowe siatk wkipotencja wywo any wzrokiemelektroretinogram wzorcowytomografia optyczna koherencyjnamodele du ych zwierz tuszkodzenie nerwu wzrokowegomakak rezusmodel kozyneuropatia nerwu wzrokowego

Powiązane artykuły