Artykuł metodologiczny

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

DOI:

10.3791/62880

⸱

17 września 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w homeostazie jelit. ROS są naturalnymi produktami ubocznymi metabolizmu komórkowego. Są one wytwarzane w odpowiedzi na infekcję lub uraz na poziomie błony śluzowej, ponieważ biorą udział w reakcjach przeciwdrobnoustrojowych i gojeniu się ran. Są również krytycznymi wtórnymi posłańcami, regulującymi kilka szlaków, w tym wzrost i różnicowanie komórek. Z drugiej strony, nadmierny poziom ROS prowadzi do stresu oksydacyjnego, który może być szkodliwy dla komórek i sprzyjać chorobom jelit, takim jak przewlekłe stany zapalne lub rak. Praca ta zapewnia prostą metodę wykrywania ROS w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania na żywo i cytometrii przepływowej, przy użyciu dostępnej na rynku sondy fluorogenicznej. W tym miejscu protokół opisuje badanie wpływu związków, które modulują równowagę redoks w organoidach jelitowych i wykrywają poziomy ROS w określonych typach komórek jelitowych, czego przykładem jest analiza jelitowych komórek macierzystych genetycznie znakowanych GFP. Protokół ten może być używany z innymi sondami fluorescencyjnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) są naturalnymi produktami ubocznymi metabolizmu komórkowego. Mogą być również aktywnie wytwarzane przez wyspecjalizowane kompleksy enzymatyczne, takie jak oksydazy NADPH związane z błoną (NOX) i podwójne oksydazy (DUOX), które generują aniony ponadtlenkowe i nadtlenek wodoru1. Poprzez ekspresję enzymów antyoksydacyjnych i zmiataczy ROS, komórki mogą precyzyjnie dostroić swoją równowagę redoks, chroniąc w ten sposób homeostazę tkanek2. Chociaż ROS może być wysoce toksyczny dla komórek i uszkadzać DNA, białka i lipidy, są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi2. W nabłonku jelitowym do proliferacji komórek macierzystych i progenitorowych wymagane są umiarkowane poziomy ROS3; wysokie poziomy ROS prowadzą do ich apoptozy4. Przewlekły stres oksydacyjny jest związany z wieloma chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit czy nowotwory. Na przykład, w mysim modelu raka jelita napędzanego przez Wnt, stwierdzono, że zwiększona produkcja ROS poprzez aktywację oksydaz NADPH jest wymagana do hiperproliferacji komórek rakowych5, 6. Określenie, w jaki sposób komórki jelitowe, w szczególności komórki macierzyste, komórki macierzyste radzą sobie ze stresem oksydacyjnym i jak środowisko komórkowe może wpływać na tę zdolność, jest niezbędne do lepszego zrozumienia etiologii tej choroby7.

W tkance różne typy komórek prezentują podstawowy stan utlenienia, który może się różnić w zależności od ich funkcji i metabolizmu oraz ekspresji różnych poziomów cząsteczek utleniających i przeciwutleniających4,7. Monitorowanie ROS in vivo jest bardzo trudne. Barwniki przepuszczalne dla komórek, które emitują fluorescencję zgodnie ze stanem redoks, zostały opracowane do wizualizacji i pomiaru komórkowych ROS w żywych komórkach i zwierzętach. Jednak ich skuteczność zależy od ich dyfuzji w żywych tkankach i ich szybkiego odczytu, co czyni je trudnymi do użycia w modelach zwierzęcych8.

W przeszłości badanie wpływu związków na generowanie ROS odbywało się przy użyciu linii komórkowych, ale może to nie odzwierciedlać sytuacji in vivo. Model organoidów jelitowych, opracowany przez grupę Clevers9, umożliwia wzrost pierwotnych komórek jelitowych ex vivo. Hodowla krypt jelitowych w matrycach, w obecności określonych czynników wzrostu, prowadzi do powstania trójwymiarowych struktur, zwanych organoidami (mini-jelitami), które odtwarzają organizację krypta-kosmki, z komórkami z różnych linii nabłonkowych wyściełającymi wewnętrzne światło, a jelitowe komórki macierzyste znajdują się w małych wypukłościach przypominających krypty.

Tutaj, korzystając z tego modelu, opisana jest prosta metoda badania stresu oksydacyjnego w pierwotnych komórkach jelitowych w rozdzielczości pojedynczej komórki, poprzez dodanie dostępnego na rynku barwnika wrażliwego na ROS do pożywki do hodowli organoidów.

Czytniki płyt są często używane do wykrywania produkcji ROS w całej populacji. Protokół ten wykorzystuje cytometrię przepływową lub test obrazowania do wykrywania ROS w określonym typie komórek z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami lub specyficznym barwieniem przeciwciał. Praca ta obejmuje hodowlę organoidów jelitowych myszy i wizualizację ROS za pomocą obrazowania konfokalnego i kwantyfikację za pomocą cytometrii przepływowej. Korzystając z organoidów jelita cienkiego pochodzących od myszy Lgr5-GFP, możliwe jest specyficzne przeanalizowanie poziomu stresu oksydacyjnego w jelitowych komórkach macierzystych po różnych zabiegach. Protokół ten można dostosować do badania wpływu cząsteczek egzogennych, takich jak dipeptyd muramylowy (MDP) pochodzący z mikrobioty10, na równowagę ROS, po stymulacji organoidów wybranymi związkami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone po zatwierdzeniu przez Komitet Użytkowania Instytutu Pasteura i przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa nr 2016-0022. Wszystkie etapy są wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej.

1. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli organoidów jelitowych

  1. Aby przygotować pożywkę do hodowli wzrostu, wymieszaj zaawansowany DMEM/F-12 uzupełniony 1x glutaminą, 1x roztworem penicyliny/streptomycyny (P/S), 10 mM HEPES, 50 ng/ml mysiego EGF, 20 μg/ml mysiego Noggin, 500 ng/ml mysiego R-Spondin1 (patrz Tabela materiałów). Pozostaw pożywkę w temperaturze pokojowej (RT) podczas ekstrakcji krypty.
    UWAGA: Niewykorzystane podłoże zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C. Unikać zamrażania i rozmrażania.
  2. Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 40 ml Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie.
    UWAGA: Niewykorzystane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Będzie używany do pasażowania organoidów.
  3. Płytki do hodowli komórkowych (komory 8-dołkowe μ-Slide i/lub 96-dołkowe okrągłe dno) w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Rozmrozić podwielokrotności matrycy membrany podstawnej (BMM) (patrz tabela materiałów) na lodzie (przed rozpoczęciem protokołu lub co najmniej 1 godzinę przed poszyciem krypt).
    UWAGA: BMM szybko zestala się, jeśli nie jest przechowywany w niskiej temperaturze.
  5. Przygotować roztwór do mycia/płukania, dodając 1% roztwór penicyliny i streptomycyny do DPBS (DPBS-P/S).
  6. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 100 mm 10 ml zimnego DPBS-P/S. Napełnij sześć probówek o pojemności 15 ml 10 ml DPBS i oznacz je od F1 do F6.
  7. Przygotować 30 ml 10 mM roztworu EDTA przez rozcieńczenie z 0,5 M EDTA w DPBS. Napełnij dwie probówki o pojemności 15 ml 10 ml 10 ml EDTA i oznacz je jako E1 i E2.
  8. Wszystkie roztwory należy wstępnie schłodzić w temperaturze 4°C i przechowywać je na lodzie podczas zabiegu.

2. Hodowla organoidów jelitowych

  1. Poświęć 8-10 tygodniową mysz Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) zgodnie z krajowymi przepisami i regulacjami.
  2. Zbierz 5-8 cm jelita czczego obejmującego obszar między dwunastnicą (5 cm od żołądka) a jelitem krętym (10 cm od jelita ślepego) i trzymaj w chłodnym DPBS-P/S na lodzie.
  3. Oczyść treść jelitową, przepłukując ją 5-10 ml zimnego DPBS-P/S.
    UWAGA: Domowe strzykawki do płukania można uzyskać, podłączając końcówkę o pojemności 200 μl do dyszy strzykawki o pojemności 10 ml.
  4. Otworzyć jelito wzdłużnie za pomocą nożyczek z końcówką kulkową (patrz tabela materiałów) (aby zapobiec uszkodzeniu tkanki).
  5. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego zawierającą zimny DPBS-P/S w temperaturze pokojowej i wstrząśnij nią w celu spłukania.
  6. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwyć jelito przez aspirację i przenieś je do 15 ml probówki oznaczonej E1 zawierającej 10 ml zimnego 10 mM EDTA.
  7. Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 10 minut.
  8. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś tkankę do probówki F1 zawierającej 10 ml DPBS. Wiruj przez 2 minuty (w normalnym wirze, trzymając rurkę w ręku i upewniając się, że jelito ładnie wiruje).
  9. Umieść 10 μl frakcji na szalce Petriego i oceń jakość frakcji pod mikroskopem.
    UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane z maksymalną prędkością, a jakość każdej frakcji powinna być oceniana pod mikroskopem (Rysunek 1).
  10. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwycić jelito przez aspirację i przenieść je do probówki F2 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.
  11. Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F3 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.
  12. Powtórzyć inkubację EDTA, jak w kroku 2.6, przenosząc tkankę do probówki E2 zawierającej 10 mM EDTA.
  13. Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 5 minut.
  14. Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F4 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
  15. Powtórzyć krok 2.14, przenosząc tkankę do probówki F5 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
  16. Powtórzyć krok 2.15, przenosząc tkankę do probówki F6 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.
  17. Połącz najlepsze frakcje filtrowane grawitacyjnie przez sitko o pojemności 70 μm z probówką o pojemności 50 ml (na lodzie), aby wyeliminować kosmki i znaczne zanieczyszczenia.
    UWAGA: Zazwyczaj F5 i F6 to frakcje zawierające liczne krypty i mniej gruzu.
  18. Wirować krypty w temperaturze 150 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
  19. Opróżnij probówkę, rozbij osad mechanicznie i dodaj 5 ml zimnego DMEM/F12.
  20. Umieścić 10 μl zawiesiny na szalce Petriego i ręcznie pod mikroskopem policzyć liczbę krypt obecnych w podwielokrotności.
    UWAGA: Nie licz pojedynczych komórek ani małych zanieczyszczeń.
  21. Oblicz wymaganą objętość (V) zawiesiny krypt w μl, biorąc pod uwagę, że 300 krypt jest platerowanych na jeden dołek, W to liczba dołków, a N to liczba krypt liczonych z 10 μl zawiesiny. Przenieś krypty do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: V = 300 x W x 10/N. Jeśli w planowanym eksperymencie zostanie użyta mała objętość, można użyć probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  22. Wirować krypty w temperaturze 200 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
  23. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.
  24. Mechanicznie rozdrobnić osad i delikatnie dodać pożywkę do hodowli wzrostu, aby uzyskać stężenie 90 krypt/μl.
  25. Dodać 2 objętości nierozcieńczonego BMM, aby uzyskać końcowe stężenie 30 krypt/μl. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.
    UWAGA: Zawsze trzymaj rurkę na lodzie, aby uniknąć zestalenia BMM.
  26. Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką. Do analizy cytometrii przepływowej należy używać okrągłodennych 96-dołkowych płytek. Rozprowadź 10 μl na środku każdej studzienki jako kopułę. Do obrazowania należy użyć μ-szkiełka 8 (patrz Tabela materiałów) i umieścić 10 μl jako cienką warstwę.
    UWAGA: Ułóż organoidy jako cienką warstwę do testu obrazowania, aby umożliwić ich dogłębne obrazowanie.
  27. Pozostaw płytkę na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zestalił się. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.
  28. Dodaj 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki, uważając, aby nie odłączyć BMM.
  29. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  30. Wykonaj analizę ROS między 4 a 6 dniem hodowli. W przeciwnym razie zmień podłoże i podziel organoidy po pojawieniu się kilku długich pączkujących struktur oraz gdy martwe komórki gromadzą się w światłach organoidów.

3. Organoidy pasażujące

  1. Rozpocznij pasażowanie organoidów jelita cienkiego od 6dnia hodowli, kiedy uformowały się znaczące struktury pączkujące, a światła organoidów stały się ciemne.
    UWAGA: Światło organoidu ciemnieje z powodu nagromadzenia martwych komórek, zanieczyszczeń i śluzu. Nie pozwól, aby organoidy przerosły przed podziałem. Współczynnik podziału zależy od wzrostu organoidów. Zaleca się pasażowanie organoidów w stosunku 1:2 w 6. dniu i 1:3 w 10. dniu.
  2. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie.
    UWAGA: Tutaj podane są objętości dla 96-dołkowej płytki hodowlanej. Jeśli używany jest inny format, dostosuj odpowiednio głośność.
  3. Ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety lub pompy próżniowej ze studzienek, nie dotykając kopuł BMM, i wyrzucić ją.
  4. Dodać 100 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 do dołka. Pipetować w górę i w dół, aby rozbić BMM i przenieść zawartość studzienki do probówki o pojemności 15 ml.
  5. Umyj studzienkę 200 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 i zbierz ją do tej samej probówki.
    UWAGA: W przypadku przechodzenia przez wiele studzienek z tych samych warunków eksperymentalnych, zawartość studzienek można zebrać w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
  6. Wirować probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  7. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do osadu. Używając końcówki P1000, weź końcówkę P10 (bez filtra) i pipetuj w górę i w dół co najmniej 20 razy.
  8. Dodać 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do probówki. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  9. Odessać supernatant za pomocą pipety lub pompy próżniowej, nie naruszając osadu. Następnie rozerwij granulkę mechanicznie.
  10. Dodać BMM rozcieńczony w pożywce do hodowli wzrostu (stosunek 2:1). Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.
  11. Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką.
  12. Trzymaj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zastygł. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.
  13. Dodać 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
    UWAGA: Uważaj, aby nie odczepić BMM.
  14. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

4. Przygotowanie odczynników i materiałów do oceny stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych

  1. Przygotować 250 mM roztwór podstawowy inhibitora N-acetylocysteiny (NAC) (patrz tabela materiałów), ponownie zawiesić 10 mg z 245 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 1 mM.
  2. Przygotować 50 mM roztwór podstawowy induktora wodoronadtlenku tert-butylu (tBHP), 70% w wodzie, rozcieńczyć 3,22 μl z 496,8 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 200 μM.
  3. Do badania cytometrii przepływowej należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 250 μM z sondy fluorogenicznej (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w DMSO. Stosować przy stężeniu końcowym 1 μM.
    UWAGA: Jak wskazano w instrukcjach producenta, sonda fluorogeniczna jest wrażliwa na światło i tlen. Akcje i podwielokrotności nie powinny być otwierane i zamykane zbyt wiele razy.
  4. Do badania obrazowego należy przygotować roztwór roboczy sondy fluorogenicznej o stężeniu 1,25 mM, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1/2 w DMSO. Stosować w stężeniu końcowym 5 μM.
  5. Przygotować końcowy roztwór 0,1 μg/ml DAPI w DPBS, który ma być użyty do dyskryminacji martwych komórek w teście cytometrii przepływowej.
  6. Rozcieńczyć Hoechst 33342 do 1,25 mg/ml w DPBS. Stosować w końcowym stężeniu 5 μg/ml do stosowania do barwienia jądrowego w teście obrazowania.
  7. Ciepły DMEM bez czerwieni fenolowej w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Kroki te opisują stosowanie kontroli ujemnych i pozytywnych, które muszą być uwzględnione we wszelkich testach, przy użyciu warunków wskazanych w Rysunek 2A. Test może być stosowany do badania związków przeciw- lub prooksydacyjnych. Kroki są takie same, a jedyna różnica polega na tym, że związki są dodawane przed użyciem barwnika fluorogenicznego.

5. Wizualizacja stresu oksydacyjnego w organoidach 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Pobrać organoidy posiane w 8 studzienkach μ-Slide i dodać 1 μl roztworu podstawowego NAC do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
  2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.
  4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Dodać 1 μl na studzienkę z rozcieńczenia 1,25 mM sondy fluorogenicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM.
  6. Dodać 1 μl na studzienkę rozcieńczenia 1,25 mg/ml Hoeschta, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml.
  7. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Usuń podłoże, nie naruszając BMM. Delikatnie dodaj 250 μl ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Jeśli planowane jest długoterminowe przejęcie, dodaj do DMEM związki czynników wzrostu bez czerwieni fenolowej.
  9. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogeniczną (ROS).
    UWAGA: Wzbudzenie/emisja (ex/em) dla sondy fluorogenicznej wynosi 644/665, ex/em dla Hoechst (jądra) wynosi 361/486, a ex/em dla GFP (jelitowa komórka macierzysta od myszy Lgr5-GFP) wynosi 488/510. Obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w oleju służy do wykrywania sygnałów w komórkach macierzystych. Nie zmieniaj ustawień lasera między próbkami. Obiektyw 20x może być użyty, aby umożliwić przegląd produkcji ROS.
  10. Użyj kontroli dodatniej, aby ustawić intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej.
  11. Korzystanie z ekranu okularu szkiełka do identyfikacji organoidów GFP wyrażających i regulacji intensywności lasera.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany ręcznie.
  12. Zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu. Ustaw stos z 25 μm (rozmiar kroku 5 μm), aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby zoptymalizować konfigurację. Korzystając z żywych komórek, akwizycję należy przeprowadzić w ciągu 1 godziny po zakończeniu inkubacji.
  13. Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym (patrz Spis materiałów).
  14. Przejdź przez z-stack i wybierz sekcję, w której środek organoidów jest dobrze reprezentowany i utwórz nowy obraz z wybranym obszarem.
  15. Określ ilościowo obrazy zgodnie z krokami 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Wybierz narzędzie Linia odręczna.
    2. Narysuj linię wzdłuż jąder.
      UWAGA: Wybierz tylko regiony prezentujące komórki GFP-dodatnie, jeśli analizowane są tylko komórki macierzyste.
    3. Zwiększ szerokość linii, aby pokryć warstwę komórki linią bez uwzględniania resztek świetlnych.
    4. Wybierz kanał dla sygnału ROS i zmierz intensywność fluorescencji w wybranym regionie i dodaj adnotacje do wartości.
    5. Narysuj linię w miejscu, w którym nie ma sygnału i zmierz natężenie fluorescencji tła, które zostanie odjęte od poprzedniej wartości, aby uzyskać ostateczną intensywność.

6. Kwantyfikacja stresu oksydacyjnego na zdysocjowanych organoidach za pomocą cytometru przepływowego

  1. Dodać 1 μl roztworu podstawowego NAC do studzienek w celu kontroli ujemnej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
    UWAGA: Użyć organoidów posianych w 96-dołkowych płytkach z okrągłym dnem.
  2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.
  4. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń pożywkę, nie naruszając dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Odłóż ten talerz na bok.
  6. Dodaj 100 μl trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zniszczyć BMM.
  7. Inkubować nie dłużej niż 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Za pomocą pipety wielokanałowej pipetę należy pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby oddzielić organoidy.
  9. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
  10. Odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki. Dodać z powrotem pożywkę zebraną w kroku 6.3 do odpowiednich studzienek i ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 5 razy.
  11. Dodać sondę fluorogeniczną o końcowym stężeniu 1 μM. Dodać 1 μl do studzienki z rozcieńczenia 250 μM i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Nie dodawaj sondy fluorogenicznej do dołków potrzebnych do ustawień przyrządu ( Rysunek 2B).
  12. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.
  13. Zawiesić komórki w 250 μl 0,1 μg/ml roztworu DAPI. Przenieś próbki do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej, trzymaj probówki na lodzie i kontynuuj analizę.
    UWAGA: Dodaj PBS zamiast DAPI do studzienek potrzebnych do ustawień instrumentu (Rysunek 2B).
  14. Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia przedniego i bocznego na niebarwionych napięciach kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu monobarwionych próbek.
  15. Stosując odpowiednią strategię bramkowania (Rysunek 4A), zbierz co najmniej 20 000 zdarzeń.
    UWAGA: Preferowanych jest 50 000 wydarzeń. Szczegółowe ustawienia akwizycji różnią się w zależności od używanego instrumentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako dowód koncepcji opisanego protokołu, użyto krypt uzyskanych z linii myszy Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, w której jelitowe komórki macierzyste wykazują mozaikową ekspresję GFP, która została ustalona przez Barkera i wsp., do scharakteryzowania jelitowych komórek macierzystych10 początkowo i pozwalają na mapowanie tych komórek na podstawie ich ekspresji GFP. W ten sposób dostarczany jest model do porównywania poziomów ROS w określonej populacji typów komórek po różnych zabiegach. Zastosowano inhibito...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta zapewnia krok po kroku protokół izolacji mysich krypt jelita czczego, hodowli ich w organoidy 3D i analizy ROS w organoidach poprzez połączenie czułej na ROS sondy fluorogenicznej z jakościowym obrazowaniem mikroskopowym całych organoidów i ilościowym pomiarem ROS za pomocą cytometrii przepływowej na pojedynczych komórkach po dysocjacji organoidów.

Pierwszym krytycznym krokiem w tej metodzie jest procedura ekstrakcji krypt. Rzeczywiście, jakość przygotowania krypt jest kluczem do udan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Growth culture podłoże
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)Suplement ThermoFisher12634010
B-27, bez witaminy AThermoFisher12587010Stężenie magazynowe: 50x
GlutaMAX (glutamina)ThermoFisher35050038Stężenie magazynowe: 100x
HepesThermoFisher15630056Stężenie w magazynie: 1 M
Murine EGFR& D2028-EG-200Stężenie zapasów: 500 &mikro; g/ml w
PBS mysi NogginR& D1967-NG/CFStężenie zapasów: 100 &mikro; g/ml w PBS
Mysia R-spondyna1R& D3474-RS-050Stężenie magazynu: 50 &mikro; g/ml w
suplemencie PBS N-2ThermoFisher17502048Stężenie magazynowe: 100x
penicylina-streptomycyna (P/S)ThermoFisher15140122Stężenie zapasowe: 100x (10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny)
Materiał
70 &mikro; m sitko komórkoweCorning352350
96-dołkowe okrągłe dnoNożyczki3799
Fine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Odczynnik Deep RedThermoFisherC10422
DAPI (4',6-diamidyno-2-phé nyindol, dichlorhydrat) (sonda fluorgeniczna)ThermoFisherD1306stock przy 10 mg/ml
DPBS 1x bez wapnia i magnezu (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM bez czerwieni fenolowej)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570w sile 10 mg/ml
Matrigel Growth Factor Reduction, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)Corning356231po otrzymaniu rozmrozić o/n w lodówce, przechowywać przez 1 godzinę na lodzie i przygotować 500 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
µ-Slide 8 StudzienkiIbidi80826
N-acetylocysteina (NAC)SigmaA9165
roztwór wodoronadtlenku tert-butylu (tBCHP) (70% wag. W H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej (trypsyna)ThermoFisher12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH8,0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Inhibitor skał do stosowania w celu zminimalizowania śmierci komórki po dysocjacji tkanek
Programy i sprzęt
Attune NxT (Flow Cytometer)ThermoFischerAnalizator cytometru przepływowego
Fiji/ImageJGenerowanieobrazów
FlowJoBD BioscienceAnaliza FACS
Observer.Z1System konfokalnyZeiss
Opterra (konfokalny pole zamiatane)System konfokalnyBruker
szybka kamera EMCCD Evolve Delta 512Fotometrycznysystem konfokalny
PrismGraphPad Oprogramowaniedo analizy statystycznej
z końcówką kulkową Corning https://imagej.net/software/fiji/downloads

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy mysiecytometria przep ywowamikroskopia konfokalnahodowla organoid wanaliza kom rek macierzystychobrazowanie na ywo

Powiązane artykuły