Artykuł metodologiczny

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

DOI:

10.3791/62883

⸱

10 września 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Adult Psychiatry, Department of Psychiatry, University Hospitals of Geneva, 2Department of Psychiatry, University of Geneva, 3Division of Nuclear medicine and Molecular Imaging, University Hospitals of Geneva, 4Division of Radiation Oncology, Department of Oncology, University Hospitals of Geneva, 5Department of Brain Sciences, Faculty of Medicine, Imperial College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to potężne narzędzie do badania roli białka translokatora 18 kDa lub ekspresji receptora serotoniny5HT 2A w chorobie Alzheimera w skali komórkowej. Protokół ten opisuje zastosowanie ex-vivo FACS-RTT w modelu szczura TgF344-AD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki glejowe prawdopodobnie mają znaczący wpływ na patofizjologię zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD). Ich zmiany są być może związane ze stanem prozapalnym. Szczep szczurzy TgF344-AD został zaprojektowany do ekspresji ludzkich genów APP i ludzkich genówPS1 ΔE9, kodujących białka amyloidowe Aβ-40 i Aβ-42 oraz wykazujących patologię amyloidu i deficyty poznawcze wraz ze starzeniem się. Model szczurzy TgF344-AD jest używany w tym badaniu do oceny komórkowego pochodzenia wiązania białka translokatora 18 kDa (TSPO, marker aktywacji komórek glejowych) oraz poziomów receptora serotoninowego receptora 5HT2A (5HT2AR), które mogą być zakłócone w AD. Przedstawiona tutaj technika to sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją do tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), ilościowa technika specyficzna dla typu komórki, uzupełniająca techniki autoradiografii in vivo PET lub SPECT lub ex vivo/in vitro. Określa ilościowo ten sam znakowany radioizotopem, który był używany przed obrazowaniem, przy użyciu licznika γ po sortowaniu komórek cytometrycznych. Pozwala to na określenie pochodzenia komórkowego białka znakowanego radioaktywnie o wysokiej swoistości komórkowej i czułości. Na przykład badania z FACS-RTT wykazały, że (i) wzrost wiązania TSPO był związany z mikroglejem w szczurzym modelu zapalenia nerwów wywołanego lipopolisacharydem (LPS), (ii) wzrost wiązania TSPO po 12 i 18 miesiącach był związany najpierw z astrocytami, a następnie mikroglejem u szczurów TgF344-AD w porównaniu ze szczurami typu dzikiego (WT) oraz (iii) gęstość prążkowia 5HT2AR zmniejsza się w astrocytach po 18 miesiącach w tym samym szczurzym modelu AD. Co ciekawe, technikę tę można rozszerzyć na praktycznie wszystkie radioznaczniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD), charakteryzują się utratą neuronów związaną ze wzrostem objawów. AD, najczęstsza przyczyna demencji, stanowiąca 60%-70% przypadków, dotyka około 50 milionów ludzi na całym świecie1. Na poziomie neuropatologicznym dwie główne cechy choroby Alzheimera to nagromadzenie zewnątrzkomórkowych blaszek β amyloidu (Aβ) i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych Tau. Zmiany w komórkach glejowych są również związane z AD2 i możliwym zakłóceniem kilku systemów neuroprzekaźników3,4.

Linia szczura TgF344-AD została zmodyfikowana do modelu AD poprzez ekspresję ludzkich transgenówAPP i PS1 ΔE9, co prowadzi do rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej ekspresji Aβ-40 i Aβ-42 oraz tworzenia blaszek amyloidowych5. Przedstawia również akumulację hiperfosforylowanych form białka Tau prowadzących do tauopatii. W wieku od 9 do 24 miesięcy u szczurów stopniowo rozwijają się patologiczne cechy choroby Alzheimera i upośledzenia funkcji poznawczych5,6,7,8,9.

Pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i autoradiografia to techniki oparte na emisji i kwantyfikacji promieni γ. Radioznaczniki określa się ilościowo albo in vivo (PET i SPECT), albo ex vivo/in vitro (autoradiografia). Te czułe techniki przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów wielu chorób mózgu, takich jak choroba Alzheimera. Rzeczywiście, jeśli chodzi o zapalenie układu nerwowego, istnieje wiele badań oceniających białko translokatora 18 kDa (TSPO), marker zapalenia układu nerwowego in vivo, z znakowanymi radioznakami, takimi jak [11C]-(R)-PK11195 lub [11C]PBR28 (w celu przeglądu, patrz10). Ponadto badano zmiany w układach neuroprzekaźników za pomocą radioznaczników11,12,13.

Jednak te techniki nie określają komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego. Może to utrudnić interpretację biologicznych podstaw zmiany w wiązaniu radioligandu w PET/SPECT. Na przykład w przypadku badań TSPO nad zapaleniem nerwów niezwykle ważne jest zrozumienie, czy wzrost czy spadek TSPO jest spowodowany zmianami astrocytowymi czy mikroglejowymi. Aby obejść te problemy, opracowano technikę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją do tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), umożliwiając ocenę wiązania radioligandów w każdym typie komórki z osobna oraz ilościowe określenie gęstości białka docelowego na komórkę. Ta innowacyjna technika jest zatem komplementarna i wysoce kompatybilna z obrazowaniem PET i SPECT.

Tutaj ta technika została zastosowana w dwóch osiach: badaniu zapalenia nerwów za pomocą radioligandów specyficznych dla TSPO i ocenie układu serotoninergicznego. Na pierwszej osi celem było zrozumienie komórkowego pochodzenia sygnału TSPO w odpowiedzi na ostrą reakcję zapalną. W związku z tym FACS-RTT zastosowano na tkankach mózgowych szczurów po indukcji zapalenia układu nerwowego poprzez wstrzyknięcie lipopolisacharydu (LPS) i po badaniu obrazowania in vivo [125I]clinde spect. Co więcej, te same obrazowanie i protokół FACS-RTT zastosowano na 12- i 24-miesięcznych szczurach TgF344-AD oraz pasujących szczurach typu dzikiego (WT). Druga oś miała na celu określenie pochodzenia zmian w układzie serotoninergicznym w tym modelu szczurzym poprzez ocenę ex vivo gęstości 5-HT2AR według typu komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone w porozumieniu z Komisją Etyki ds. Eksperymentów na Ludziach i Zwierzętach Kantonu Genewskiego, Kantonalną Komisją ds. Etyki Badań (CCER) oraz Ogólnym Kierownictwem Zdrowia Kantonu Genewa (Szwajcaria), odpowiednio. Dane są przedstawiane zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).

1. Przygotowanie i kalibracja kamery SPECT

  1. Włącz kamerę, załaduj oprogramowanie operacyjne (patrz tabela materiałów). Kliknij przycisk Home XYZ Stage, aby wykonać bazowanie.
  2. Skonfiguruj eksperyment składający się z jednego 10-minutowego skanowania. Ustaw tryb Krok na Dokładny, a tryb Akwizycji na Listmode (aby rejestrować całe spektrum emisji).
  3. Ustaw łóżko i upewnij się, że system podgrzewania, czujnik oddechu i znieczulenie są sprawne i bezpieczne (Rysunek 1A-D). Następnie umieść fantom (tj. 2 ml o znanym stężeniu 125I w probówce do mikrofuge o pojemności 2 ml), w którym zostanie umieszczona głowa zwierzęcia (wyśrodkowana na obszarze, Rysunek 1E).
  4. Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory dla trzech wymiarów za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu. Upewnij się, że objętość skanowania fantomu i zwierzęcia jest taka sama.
  5. Rozpocznij skanowanie fantomowe w celu późniejszej kalibracji z parametrami ustalonymi w krokach 1.2-1.4.

2. Konfiguracja przestrzeni roboczej do obrazowania SPECT

  1. Oczyść miejsce pracy środkiem dezynfekującym wirusobójczym i połóż miękkie papiery na wszystkich powierzchniach.
  2. Upewnij się, że w odpowiednich zbiornikach jest wystarczająca ilość izofluranu i tlenu.
  3. Przygotuj cewnik 24 G, odcinając płetwy cewnika motylkowego, aby mieć wyraźniejszy widok żyły ogona szczura.
  4. Pokryj cewnik, wypełniając go całkowicie roztworem heparyny (25000 j./ml) po wyjęciu igły. Następnie umieść igłę z powrotem, aby uniknąć tworzenia się skrzepów krwi po wprowadzeniu cewnika.

3. [125I]Synteza radioznacznika CLINDE

UWAGA: Radioaktywność może mieć wystarczającą energię jonizacji, aby wpływać na atomy żywych komórek i uszkadzać ich materiał genetyczny (DNA).

  1. Upewnij się, że pracujesz w odpowiednim środowisku, dopuszczonym do eksperymentów z udziałem radioaktywności.
    UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) do pracy z radioaktywnością, w tym dozymetry na palcach i ciele. Staraj się zachować bezpieczną odległość od wszelkich źródeł radioaktywności.
  2. Inkubować 100 μg prekursora tributyliny w 100 μl kwasu octowego z jodkiem sodu (Na125I) (patrz tabela materiałów) i 5 μl 37% kwasu nadoctowego w temperaturze 70 °C przez 20 minut w termocyklerze umieszczonym w komorze rękawicowej.
  3. Rozcieńczyć reakcję przy użyciu 50% acetonitrylu (ACN) w wodzie, aby osiągnąć objętość 500 μl. Wstrzyknąć 500 μl rozcieńczonej reakcji na kolumnę z odwróconymi fazami (patrz tabela materiałów).
  4. Wyizolować [125I]CLINDE za pomocą gradientu liniowego HPLC przebiegać od 5%-95% ACN w 7 mM H3PO4 przez 10 minut. Rozcieńczyć izolat w H2O, aby uzyskać końcową objętość 10 ml, a następnie wstrzyknąć rozcieńczoną reakcję do kolumny zagęszczającej (patrz Tabela materiałów).
  5. Eluować [125I]CLINDE z kolumny za pomocą 300 μl absolutnego etanolu, a następnie odparować etanol przez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
  6. Rozcieńczyć pozostałość zawierającą [125I]CLINDE w 300 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej w celu uzyskania roztworu podstawowego.
  7. Po zmierzeniu jego radioaktywności rozcieńczyć roztwór podstawowy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór 0,037 MBq w 500 μl.
  8. Oczyść znacznik za pomocą HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa). Określić czas elucji za pomocą wzorcowej kalibracji przy długości fali 450 nm i wyizolować pojedynczy pik promieniotwórczy. Wykonać wzorcową krzywą kalibracyjną przy użyciu siedmiu wzorcowych stężeń zimnego (nieradioaktywnego) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg i 5 μg w 400 μl roztworu o stężeniu 50% ACN). Ustalić czystość radiochemiczną, mierząc pojedynczy pik w chromatografii tlenowej (TLC) (fala radiowa). Upewnij się, że czystość radiochemikaliów przekracza 60%.
  9. Sprawdzić aktywność właściwą radioligandu mierzącą absorbancję promieniowania ultrafioletowego przy długości fali 450 nm oraz krzywe kalibracyjne ustalone dla zimnych związków odniesienia. Upewnij się, że aktywność właściwa jest większa niż 1000 GBq/μmol.

4. [125I]R91150 synteza radioznacznika

UWAGA: Upewnij się, że przestrzegasz tych samych zasad bezpieczeństwa, które zostały wymienione w sekcji syntezy CLINDE.

  1. Zmieszać 300 μg prekursora R91150 w roztworze 3 μl absolutnego etanolu, 3 μl lodowatego kwasu octowego, 15 μl wolnego od nośników Na125I (patrz tabela materiałów) (10 mCi) w 0,05 M NaOH i 3 μl 30% H2O2 . Inkubować przez 30 minut w komorze rękawicowej.
  2. Wstrzyknąć całą reakcję do kolumny z odwróconymi fazami (patrz tabela materiałów).
  3. Wyizolować [125I]R91150 za pomocą izokratycznej serii HPLC (ACN/woda 50/50, 10 mM bufor kwasu octowego) o natężeniu przepływu 3 ml/min.
  4. Rozcieńczyć [125I]R91150 w H2O do końcowej objętości 10 ml.
  5. Wstrzyknąć 10 ml rozcieńczonej reakcji do kolumny stężającej (patrz tabela materiałów).
  6. Eluować [125I]R91150 z kolumny z 300 μl absolutnego alkoholu etylowego.
  7. Odparować etanol przez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut.
  8. Rozcieńczyć pozostałość zawierającą [125I]R91150 w 300 μl soli fizjologicznej.
  9. Oczyść znacznik za pomocą HPLC. Oznaczyć czas elucji, stosując wzorcową kalibrację przy długości fali 450 nm i wyizolować pojedynczy pik promieniotwórczy. Ustalić czystość radiochemiczną, mierząc pojedynczy pik w TLC radiowym. Upewnij się, że czystość radiochemikaliów przekracza 98%.

5. Przygotowanie zwierząt

  1. Zważyć i znieczulić szczura TgF344-AD (samca lub samicę w wieku od 2 do 24 miesięcy) w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem. Po głębokim znieczuleniu zmniejsz przepływ izofluranu do 2% (0,4 l/min, 100% O2) w komorze.
  2. Ułóż zwierzę na wstępnie ogrzanym łóżku wyposażonym w nos anestezjologiczny. Utrzymać izofluran na poziomie 2% (0,4 l/min, 100%O2).
  3. Nałóż żel do oczu zwierzęcia i potwierdź głębokość znieczulenia poprzez monitorowanie oddechu; w razie potrzeby dostosuj znieczulenie.
  4. Wykonaj wprowadzenie cewnika 24 G do żyły ogonowej.

6. Przejęcie SPECT

  1. Przenieś zwierzę na łóżko kamery wyposażone w poduszkę grzewczą o kontrolowanej temperaturze ustawioną na 38°C (Rysunek 1E).
  2. Przymocuj głowę zwierzęcia do belki zgryzowej i zamocuj podpórki pod głowę.
  3. Skonfiguruj eksperyment na 60-minutowym skanie, składającym się z 60 klatek po 1 minutę. Użyj ponownie wszystkich pozostałych parametrów ustawionych w kroku 1. Kliknij przycisk Aktualizuj obraz, aby zaktualizować pozycję zwierzęcia.
  4. Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu dla trzech wymiarów.
  5. Wstrzyknąć 500 μl radioaktywnego radioznacznika ([125I]CLINDE lub [125I]R91150), a następnie przepłukać probówkę 300 μl sterylnego 0,9% NaCl. Jednocześnie kliknij Rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć skanowanie.
  6. Podczas skanowania upewnij się, że zwierzę jest w stałym znieczuleniu z monitorowaniem częstości oddechów. W razie potrzeby należy dostosować przepływ izofluranu.
  7. Po zakończeniu skanowania szybko poddaj znieczulone zwierzę eutanazji przez dekapitację.

7. Rekonstrukcja skanu

  1. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji skanowania (patrz Spis materiałów), a następnie otwórz zestaw danych, szukając pliku [nazwa_pliku].parameters, utworzonego w folderze skanowania.
  2. Wybierz interesujący Cię izotop. Należy zauważyć, że parametr Listmode umożliwia wybór wielu izotopów na tym etapie.
  3. Wybierz następujące parametry: rozmiar woksela 0,4 mm, 4 podzbiory (POS-EM), 6 iteracji (odpowiednik 24ME-EM), brak filtra końcowego i odpowiadający izotopowi korekcja rozpadu. Wybierz format wyjściowy na NIfTI, a następnie wybierz opcję Rozpocznij rekonstrukcję SPECT.

8. Ekstrakcja mózgu szczura

  1. W tym samym znieczuleniu, co procedura skanowania i po zapewnieniu stanu głębokiego znieczulenia zwierzęcia poprzez monitorowanie jego częstości oddechów, należy przystąpić do dekapitacji za pomocą gilotyny i szybko przenieść głowę na salę sekcyjną.
  2. Nożyczkami ostrożnie przeciąć skórę na czubku głowy od tyłu do przodu aż do środka oczu.
  3. Odetnij nadmiar mięśni wokół podstawy czaszki i kręgów szyjnych.
  4. Następnie ostrożnie umieść jedno ostrze nożyczek w otworze z tyłu czaszki, otworze wielkim, i usuń tylną część czaszki szczypcami chirurgicznymi.
  5. Następnie za pomocą szczypiec chirurgicznych ostrożnie usuń górną część czaszki. Czaszka starych samców szczurów może być gruba, usunięta jako małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
  6. Ostrożnie przetnij opony nożyczkami. Opony mózgowe mogą uszkodzić mózg podczas procesu ekstrakcji; Usuń go jako środek ostrożności.
  7. Po usunięciu górnej części czaszki odwróć głowę zwierzęcia i za pomocą małej płaskiej szpatułki ostrożnie wyciągnij mózg, przecinając nerw wzrokowy i trójdzielny.
  8. Ostrożnie przenieś mózg na płaską, czystą szklaną powierzchnię w celu przeprowadzenia sekcji na lodzie.
  9. Użyj płaskiej metalowej szpatułki i żyletki, aby wypreparować obszary zainteresowania mózgu. Umieść tkanki w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i zważ otrzymaną tkankę. Użyj sekcji mózgu bezpośrednio do izolacji komórek lub szybko zamroź ją w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.

9. Izolacja komórek

  1. Upewnij się, że pracujesz w czystym i sterylnym środowisku. Zaleca się pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC). Upewnij się, że rękawice i każdy element wyposażenia wprowadzany do BSC są sterylne.
  2. Aby przygotować komórki do sortowania komórek, postępuj zgodnie z protokołem Jaclyn M. Schwarz14.
    UWAGA: W tym eksperymencie do przygotowania komórek użyto dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji neuronów (patrz Tabela materiałów).
    1. Umieścić próbki w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml z 1 ml HBSS (bez Ca i Mg), a następnie odwirować (300 x g, 2 min, temperatura pokojowa = RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.
    2. Dodać 1900 μl mieszaniny enzymatycznej 1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, mieszając probówki przez inwersję co 5 minut.
    3. Dodać 30 μl mieszanki enzymatycznej 2, delikatnie mieszać pipetą 1 (patrz tabela materiałów) tam i z powrotem 30 razy. Następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, mieszając probówki przez odwrócenie co 5 minut.
    4. Delikatnie mieszać w tę i z powrotem za pomocą pipety 2, a następnie pipety 3 przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji tkanek.
    5. Przefiltruj komórki za pomocą sitka o wielkości 80 μm, dodaj 10 ml HBSS (bez Ca i Mg). Odwirować (300 x g, 10 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.
    6. W celu wyczerpania mieliny należy ponownie zawiesić osad za pomocą 400 μl buforu do usuwania mieliny (patrz tabela materiałów), a następnie dodać 100 μl kulek do usuwania mieliny (patrz tabela materiałów), a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Dodać 5 ml buforu do usuwania mieliny, odwirować (300 x g, 10 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.
    8. Dodać 500 μl buforu do usuwania mieliny i umieścić probówkę w kolumnie pola magnetycznego. Przemyć kolumnę czterokrotnie 1 ml buforu do usuwania mieliny.
    9. Odwirować (300 x g, 2 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Krótko wirować (2 s), aby zdysocjować komórki i dodać 5 μl bloku Fc CD32. Ponownie wykonać wir i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych będących przedmiotem zainteresowania; inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Odwirować (350 x g, 5 min, 4 °C) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze.
    12. Po krótkim wirowaniu (2 s) dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Dodać 2 ml buforu do usuwania mieliny, odwirować (350 x g, 5 min, 4 °C) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl sterylnego PBS i przejść bezpośrednio do sortowania komórek.

10. Sortowanie komórek

  1. Przygotuj probówkę do mikrofuge z 500 μl sterylnego PBS do zebrania posortowanych komórek.
  2. Dodać 10 μl Hoechst na 1000 μl roztworu komórkowego, aby zabarwić jądra żywych komórek i odróżnić je od martwych komórek.
  3. Przenieść komórki tak szybko, jak to możliwe, do maszyny do sortowania komórek w temperaturze 4 °C.
  4. Najpierw posortuj komórki według rozproszenia do przodu i bocznego, a następnie posortuj komórki dodatnie Hoechst. Następnie posortuj komórki na podstawie interesujących Cię przeciwciał. Zbierz dodatnio zabarwione komórki oddzielnie. Upewnij się, że odróżniłeś komórki dodatnie od autofluorescencyjnych.
  5. Policz liczbę posortowanych komórek dla każdej puli zainteresowań.

11. Zliczanie gamma

  1. Skalibrować system liczenia γ za pomocą 10 μl tego samego roztworu fantomowego, który został użyty do kalibracji SPECT, ale rozcieńczyć go w 1 ml wody.
    UWAGA: Roztwór fantomowy jest rozcieńczany ze względu na zwiększoną precyzję systemu liczenia γ.
  2. Umieść probówkę z posortowanymi komórkami w systemie zliczania γ i przystąp do liczenia γ zgodnie z protokołem producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WT doświadczyły skanowania in vivo SPECT za pomocą radioznacznika [125I]CLINDE po jednostronnym wstrzyknięciu LPS (Rysunek 2). Ten skan (przy użyciu zsumowanych danych z obrazów 45-60 minut po wstrzyknięciu radioznacznika) wykazał wyższe wiązanie [125I]CLINDE w miejscu wstrzyknięcia LPS (Figura 2A) niż w przeciwległym obszarze mózgu (Figura 2B). Próbki ex vivo, które przeszły FACS-RTT, potwierdziły te wyniki i ujawniły obe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z naszą wiedzą, technika ta była pierwszą, która opisała podejście, które pozwala lepiej zrozumieć zmiany wiązania radioznacznika in vivo na poziomie komórkowym. Protokół opisuje wieloskalową metodę ilościowego oznaczania wiązania radioznacznika na poziomie komórkowym na przykładzie [125I]CLINDE (TSPO) lub [125I]R91150 (5HT2AR).

Technika ta jest wystarczająco solidna i czuła, aby precyzyjnie wykryć pochodzenie komórkowe szerokiego spektrum zmia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant nr 320030-184713). Autorzy, BBT i KC, są wspierani przez Fundację Velux (projekt nr 1123). Autor ST otrzymał wsparcie od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (stypendium Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr P2GEP3_191446), Fundacji Prof. Dr. Maxa Cloetty (stypendium Clinical Medicine Plus) oraz Fundacji Jeana i Madeleine Vachoux.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowySigma-Aldrich
AcetonitrylSigma-Aldrich
BioVetBioVetOprogramowanie do kontroli parametrów życiowych
Bondclone C18 kolumna z odwróconymi fazamiPhenomenex, Schlieren, Szwajcaria
Des-Surw GenewieWirusobójczy
blok Fc / anty-CD32BD BiosciencesBDB550270Reaktywność dla szczura
Anty-szczur CD90 sprzężony z FITC202504Reaktywność dla szczura
HeparynaB. BraunB01AB01
HPLCKnauer
Insyte-W 24 GA 0,75 CALA 0,7 x 19 mmBD Biosciences321312Cewnik 24 G
IsofluraneBaxterZDG9623
LacryviscAlcon2160699
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Miękka taśma Micropore3MF51DA01
MILabs-Uspect IIMILabsdo kamery SPECT
MoFlo AstriosBeckman CoulterSortownik komórek
Koraliki do usuwania mieliny IIMiltenyi Biotec130-096-733Zawiera kulki i bufor do usuwania mieliny.
NaCl 0,9% Sterylny roztwórB. Braun395202
Zestaw do dysocjacji neuronów (P)Miltenyi Biotec130-092-628Zawiera mieszaniny enzymów, pipety 1, 2 i 3.
Arkusz siatki nylonowejAmazonCMN-0074-10YD40 cali szerokości, siatka 80 mikronów
Kwas nadoctowySigma-Aldrich
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-090-976
R91150 pré kursorCERMN
Sep-Pak C18 KolumnaWodyKolumna Stężenie
kolumny Jodek sodu Na125PerkinElmer
Prekursor tributylinyCERMN
U-SPECT Rec2.38cMILabsWersja Rec2.38cOprogramowanie do rekonstrukcji obrazów
SPECT USPECT IIMILabsSpect Camera
Wizard 3"Licznik gammaPerkinElmer
Szpital Uniwersytecki Oprogramowanie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
  2. Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
  3. D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
  4. D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
  5. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  6. Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
  7. Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153(2018).
  8. Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
  9. Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712(2020).
  10. Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346(2020).
  12. Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
  13. Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
  14. Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).
  15. Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
  16. Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rkowe r d o promieniotw rczo ciaktywacja kom rek glejowychwi zanie TSPOastrocyty i mikroglejszczur TgF344 ADreceptor 5HT2Aobrazowanie SPECTilo ciowe okre lanie typ w kom rek

Powiązane artykuły