Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62888

⸱

3 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opracowanie modelowego systemu dla wpływu hiperoksji na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych mukowiscydozy. Sztuczna pożywka z plwociny naśladuje skład plwociny, a warunki hodowli hiperoksycznej modelują wpływ dodatkowego tlenu na społeczności drobnoustrojów płucnych.

Streszczenie

Uważa się, że społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych odgrywają ważną rolę w postępie mukowiscydozy (CF) i innych przewlekłych chorób płuc. Drobnoustroje są tradycyjnie klasyfikowane na podstawie ich zdolności do używania lub tolerowania tlenu. Dodatkowy tlen jest powszechną terapią medyczną stosowaną u osób z mukowiscydozą (pwCF); Jednak istniejące badania nad tlenem i mikrobiomem dróg oddechowych koncentrowały się na tym, jak hipoksja (niski poziom tlenu), a nie hiperoksja (wysoki poziom tlenu), wpływa na głównie tlenowe i fakultatywne beztlenowe społeczności drobnoustrojów płuc. Aby wypełnić tę krytyczną lukę w wiedzy, protokół ten został opracowany przy użyciu sztucznej pożywki z plwociny, która naśladuje skład plwociny z pwCF. Zastosowanie sterylizacji filtracyjnej, która daje przezroczyste podłoże, pozwala metodom optycznym śledzić wzrost drobnoustrojów jednokomórkowych w kulturach zawiesinowych. Aby stworzyć warunki hiperoksyczne, ten system modelowy wykorzystuje uznane techniki hodowli beztlenowej do badania warunków hiperoksycznych; Zamiast usuwać tlen, tlen jest dodawany do kultur poprzez codzienne spryskiwanie butelek z surowicą mieszaniną sprężonego tlenu i powietrza. Plwocina z 50 pwCF była poddawana dziennemu płukaniu przez okres 72 godzin, aby zweryfikować zdolność tego modelu do utrzymania zróżnicowanych warunków tlenowych. Sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun przeprowadzono na hodowanych i niehodowlanych próbkach plwociny z 11 pwCF w celu sprawdzenia zdolności tej pożywki do wspierania wzrostu drobnoustrojów komensalnych i chorobotwórczych powszechnie występujących w plwocinie mukowiscydozy. Krzywe wzrostu uzyskano ze 112 izolatów uzyskanych z pwCF w celu sprawdzenia zdolności tego sztucznego podłoża do plwociny do wspierania wzrostu powszechnych patogenów mukowiscydozy. Odkryliśmy, że model ten może hodować szeroką gamę patogenów i komensalów w plwocinie mukowiscydozy, odzyskuje społeczność bardzo podobną do niehodowlanej plwociny w warunkach normoksyjnych i tworzy różne fenotypy hodowli w różnych warunkach tlenowych. To nowe podejście może przyczynić się do lepszego zrozumienia nieprzewidzianych skutków wywołanych stosowaniem tlenu w pwCF na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych i powszechne patogeny układu oddechowego.

Wprowadzenie

Mukowiscydoza (CF) jest chorobą genetyczną charakteryzującą się niezdolnością do usuwania gęstego śluzu z płuc, co prowadzi do powtarzających się infekcji i postępującego spadku funkcji płuc, co często prowadzi do konieczności przeszczepu płuc lub śmierci. Mikrobiom dróg oddechowych osób z mukowiscydozą (pwCF) wydaje się śledzić aktywność choroby1, przy czym zmniejszenie różnorodności mikrobiologicznej wiąże się z niekorzystnymi długoterminowymi wynikami2,3. W badaniach klinicznych nad pwCF uzupełniająca tlenoterapia była związana z bardziej zaawansowaną chorobą4,5, chociaż tradycyjnie stosowanie tlenoterapii było postrzegane po prostu jako marker ciężkości choroby6. Ostatnie badania przeprowadzone na pacjentach z niewydolnością oddechową wykazały, że wyższy poziom tlenu u pacjentów jest paradoksalnie związany ze wzrostem poważnych infekcji bakteryjnych i wyższą śmiertelnością7, co sugeruje, że dodatkowy tlen może przyczyniać się do patogenezy choroby. Wpływ dodatkowego tlenu na mikrobiom płuc mukowiscydozy i związane z nim społeczności mikroorganizmów płuc i dróg oddechowych nie został dobrze zbadany.

Badania mechanistyczne często nie mogą być przeprowadzone bezpośrednio na ludziach z powodu trudności logistycznych i potencjalnych problemów etycznych związanych z interwencjami o nieznanych korzyściach medycznych lub szkodach. Podejścia translacyjne, które integrują ludzkie próbki biologiczne z systemami modelowymi, mogą dostarczyć ważnych informacji biologicznych w takich przypadkach. Chociaż zdolność do używania lub tolerowania tlenu tradycyjnie była ważnym elementem klasyfikacji drobnoustrojów, niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób terapeutyczne wprowadzenie dodatkowego tlenu do środowiska może zaburzyć społeczności drobnoustrojów dróg oddechowych. Aby rzucić światło na nieznany wpływ dodatkowego tlenu na mikrobiomy dróg oddechowych pwCF, musieliśmy zmierzyć się z dwoma głównymi wyzwaniami; po pierwsze, stworzenie pożywki hodowlanej, która fizjologicznie przybliża skład plwociny mukowiscydozy; Po drugie, stworzenie systemu modelowego, który pozwala na utrzymanie podwyższonego stężenia tlenu w kulturze przez dłuższy czas.

Sztuczne podłoża do plwociny (ASM) są powszechnie używane do emulacji plwociny płucnej ex vivo8,9,10, ale nie ma jasnego konsensusu co do konkretnego przepisu. Protokół ten opisuje recepturę i strategię przygotowania sztucznej plwociny, starannie opracowaną w celu fizjologicznego przybliżenia plwociny z pwCF. W tabeli 1 przedstawiono wybrane wartości receptur w oparciu o opublikowaną literaturę. Podstawowe składniki chemiczne i pH dopasowano do wartości zidentyfikowanych w badaniach ludzkiej plwociny na mukowiscydozę11,12,13. Fizjologiczne składniki odżywcze o niskim stężeniu dodawano za pomocą żółtka jaja, które stanowiło 0,25% końcowej objętości10, a także mieszanki witamin i metali śladowych14,15. Mucyna, kluczowy składnik plwociny16, została uwzględniona w 1% w/v14. Chociaż sterylizacja filtrów jest bardziej pracochłonna, wybrano ją zamiast bardziej konwencjonalnej praktyki sterylizacji termicznej, aby zmniejszyć potencjalne problemy wynikające z indukowanej ciepłem denaturacji kluczowych składników pożywki10. Dodatkową zaletą sterylizacji filtrów jest to, że wytwarza ona media, które są przezroczyste (sterylizacja termiczna może powodować powstawanie mętnych mediów w wyniku wytrącania i koagulacji soli i białek), co pozwala na wykorzystanie tej sztucznej pożywki z plwociny do śledzenia wzrostu drobnoustrojów w oparciu o wzrost zmętnienia.

Ten system modelowy dla hodowli hiperoksycznej opiera się na technikach hodowli beztlenowej, gdzie tlen jest dodawany, a nie usuwany, tworząc model dla efektu dodatkowego użycia tlenu dla pwCF. Rysunek 1 i związany z nim protokół sparingu tlenu przedstawia elementy systemu sparingu tlenowego, które można uzyskać tanio od ogólnych dostawców laboratoryjnych i szpitalnych. System ten umożliwia mieszanie sprężonego tlenu i powietrza do stałych stężeń w zakresie od 21% do 100% tlenu. Integracja czujnika tlenu pozwala na weryfikację stężenia wyjściowej mieszaniny gazów, a także sprawdzenie składu gazu wypływającego z wcześniej rozpylonych butelek z surowicą w celu sprawdzenia, czy warunki tlenowe zostały utrzymane w pożądanym zakresie.

Ten protokół opisuje procedury tworzenia sztucznej pożywki do plwociny, budowy i użycia systemu oszczędzania tlenu, oraz zastosowania obu do hodowli plwociny CF w warunkach zróżnicowanego tlenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie otrzymało zgodę Partners Institutional Review Board (Protokół # 2018P002934). Kryterium włączenia obejmowało dorosłych pacjentów z mukowiscydozą, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Nie było kryterium wykluczenia. Zgodnie z wytycznymi protokołu, wszystkie próbki plwociny zostały pobrane od pacjentów z mukowiscydozą podczas zaplanowanej wizyty ambulatoryjnej u ich lekarza.

1. Preparat sztucznej plwociny

UWAGA: Podane tutaj ilości dotyczą produkcji 1 litra końcowego podłoża ze sztucznej plwociny i zakładają konkretne odczynniki wymienione w Tabeli Materiałów. Liczby muszą być dostosowane do innych objętości lub do użycia różnych odczynników, aby zapewnić ten sam produkt końcowy. Patrz tabela 1 w odniesieniu do stężeń docelowych.

  1. Mieszanka chemiczna sztucznej plwociny (ASCM)
    UWAGA: ASCM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Jest stabilny na półce i może być przygotowywany luzem lub z wyprzedzeniem. Jeśli jest przygotowywana do późniejszego użycia, należy ją autoklawować w autoklawie i bezpiecznie przechowywać w temperaturze pokojowej.
    1. Wymieszać podstawowe roztwory chemiczne wchodzące w skład tej mieszanki.
      1. Przygotuj 1 M bulionu NaCl: Dodaj 58,44 g NaCl na litr sterylnej wody.
      2. Przygotuj 1 M bulionu KCl: Dodaj 74,55 g KCl na litr sterylnej wody.
      3. Przygotować 1 M MgSO4 bulionu: Dodać 246,47 g MgSO4·7H2O na litr sterylnej wody lub 120,37 g bezwodnego MgSO4 na litr sterylnej wody.
      4. Przygotuj 1 M bulionu glukozy: Dodaj 180,16 g glukozy na litr sterylnej wody.
    2. W autoklawie wysterylizuj chemiczne roztwory podstawowe, a także pustą butelkę o pojemności 250 ml. Etapy autoklawowania należy wykonywać do co najmniej standardowych wartości 121 °C i 15 PSI przez 30 minut.
    3. Dodaj 80,59 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 250 ml.
    4. Dodać do mieszanki 152,30 ml 1 M bulionu NaCl.
    5. Dodaj do mieszanki 15,8 ml 1 M bulionu KCl.
    6. Do mieszanki dodać 610 μl 1 M bulionuMgSO4
      7. .
    7. Do mieszanki dodać 700 μl 1 M bulionu glukozowego.
  2. Mieszanina mucyny ze sztuczną plwociną (ASMM)
    UWAGA: ASMM stanowi 50% końcowej objętości nośnika. Upewnij się, że jest przygotowany tego samego dnia, co ostatnia partia pożywki.
    1. Dodaj 450 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 1 l.
    2. Dodaj 50 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do butelki.
    3. Dodaj jednorazowy magnetyczny mieszadło do butelki.
    4. Butelkę zawierającą PBS i mieszadło należy sterylizować w autoklawie.
    5. Odmierz 10 g mucyny w proszku i dodaj ją do PBS.
    6. Energicznie wstrząśnij butelką w celu wstępnego wymieszania.
    7. Umieść butelkę na płycie grzejnej z mieszadłem magnetycznym. Ustaw temperaturę na średnio-wysoką, celując w 50 °C, a prędkość mieszania na 1100 obr./min. Stopniowo zwiększaj prędkość, aby pręt nie spadł z magnesu.
      1. Pozostawić do podgrzania i mieszać przez 15 minut.
      2. Podnieś butelkę w żaroodpornych rękawicach. Obserwuj, aby sprawdzić, czy mucyna w proszku osiada z roztworu.
      3. Jeśli mucyna w proszku nie jest całkowicie rozpuszczona, ponownie włącz butelkę do podgrzewania/mieszania w odstępach 5-minutowych, aż do całkowitego rozpuszczenia.
    8. Pozwól mieszaninie mucyny ostygnąć do temperatury pokojowej.
  3. Mieszanka biologiczna sztucznej plwociny (ASBM)
    UWAGA: ASBM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Przygotuj go tego samego dnia, co końcową pożywkę i w przeciwieństwie do innych mieszanek, nie wystawiaj jego składników na działanie ciepła.
    1. Rozmrozić 100x bulionu witaminowego w lodówce o temperaturze 4°C lub na lodzie.
      UWAGA: Wstępnie podziel zapas witamin na 10 ml porcji, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania/rozmrażania.
    2. Dodaj 124,24 ml sterylnej wody do pustej autoklawizowanej butelki o pojemności 250 ml.
    3. Dodaj do mieszanki 25,76 ml 50x zapasu aminokwasów egzogennych.
    4. Dodaj do mieszanki 80,14 ml 100x zapasu aminokwasów endogennych.
    5. Dodaj do mieszanki 10 ml (rozmrożonego) bulionu witaminowego 100x.
    6. Dodaj do mieszanki 1 ml bulionu 1000x z metali śladowych.
    7. Dodaj do mieszanki 8,33 ml 30% emulsji z żółtka jaja.
    8. Do mieszanki dodać 400 μl bulionu ferrytynowego o gramaturze 10 g/l.
    9. Dobrze wymieszaj roztwór, ręcznie wstrząsając.
  4. Sztuczna pożywka z plwociną (ASM)
    1. Dodać 250 ml ASCM do 1-litrowej butelki zawierającej ASMM.
    2. Dodać 250 ml ASBM do średniej butelki.
    3. Miareczkować pożywkę podstawowym buforem MOPS (1 M), aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce o wąskim zakresie. Przed miareczkowaniem mieszanina pożywki będzie zbyt kwaśna.
    4. Otrzymaną sztuczną pożywkę z plwociny należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do filtracji.
    5. Aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 ml niefiltrowanej sztucznej plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 μm.
    6. Podłączyć system filtracji do pompy próżniowej, włączyć pompę próżniową, ustawić ją na 70 mbar, a następnie umieścić komorę na wytrząsarce orbitalnej wytrząsającej z prędkością 90 obr./min w chłodni w temperaturze 4 °C.
      1. Uzupełnij dodatkowymi 150 ml pożywki, ponieważ znaczna ilość jest filtrowana. Całkowite przefiltrowanie 1 l podłoża zajmuje 1-2 dni.
      2. Powtórz z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.
        UWAGA: Staraj się nie filtrować więcej niż 350 ml pożywki przez ten sam filtr 0,22 μm, ponieważ mucyna z czasem zatka filtr.
    7. Przefiltrowaną pożywkę ze sztuczną plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do użycia. Użyj ASM w ciągu jednego miesiąca od przygotowania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

2. Rozpylanie tlenu

  1. Konfiguracja stacji rozrzedzania
    UWAGA: Ten protokół powinien być wykonany w całości tylko raz, po czym konfigurację można utrzymać poprzez prostą konserwację w razie potrzeby. Zobacz Rysunek 1 dla wizualnego schematu systemu sparingu tlenu.
    1. Zaopatrz się i odpowiednio zabezpiecz zbiorniki sprężonego powietrza i tlenu.
      UWAGA: Wysokie ciśnienie sprawia, że zbiorniki są niezwykle niebezpieczne w przypadku niewłaściwego obchodzenia się. Upewnij się, że zbiorniki są całkowicie uszczelnione i zabezpieczone, nie ma wycieków, gdy zbiornik jest zamknięty i że cały personel obsługujący jest w pełni przeszkolony w ich obsłudze.
    2. Przymocuj regulator powietrza do zbiornika sprężonego powietrza za pomocą klucza. Aby uzyskać optymalny odczyt przepływu na regulatorze, przymocuj regulator jak najbliżej pozycji pionowej.
    3. Przymocuj regulator tlenu do zbiornika ze sprężonym tlenem, mocując jak najbliżej pozycji pionowej. W zależności od butli z tlenem może być konieczne odwrócenie kierunku dokręcania.
    4. Podłącz rurki z reduktorów do złącza Y, aby połączyć przepływ gazu z dwóch zbiorników.
    5. Podłączyć wyjście łącznika Y do centralnego zaworu trójnika.
    6. Podłącz jedną stronę centralnego zaworu trójnika do manometru gazu.
    7. Podłącz drugą stronę manometru gazu do sterylnego filtra strzykawkowego o średnicy 25 mm z porami o wielkości porów 0,22 μm.
    8. Podłączyć drugi filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm do strzykawki bez tłoka, który ma być używany jako środek uwalniający gaz podczas rozpylania.
    9. Podłącz ostatnią stronę centralnego zaworu trójnika do drugiego zaworu trójnika monitora tlenu.
    10. Podłącz filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z jednej strony tego drugiego zaworu trójnika wraz z rurką do mocowania igieł 18 G.
    11. Podłącz ostatnią stronę drugiego zaworu trójnika do aparatu monitorującego tlen.
    12. Podłączyć rurkę odcinającą po drugiej stronie aparatu do monitorowania tlenu, która ma być używana jako uwalnianie gazu podczas monitorowania.
      UWAGA: Podczas testowania/używania systemu sparingu tlenu należy zwrócić uwagę na położenie trójników i upewnić się, że są one zgodne z zamierzoną ścieżką przez system. Niezastosowanie się do tego spowoduje wzrost ciśnienia wewnątrz systemu i spowoduje awarię i rozpad komponentów.
    13. W celu utrzymania systemu i utrzymania jego optymalnej wydajności korzystne są następujące praktyki.
      1. Wzmocnij połączenia dużą ilością taśmy teflonowej, aby znacznie poprawić ich uszczelnienie i zmniejszyć ryzyko oderwania się elementów od ciśnienia wewnętrznego.
      2. Utrzymuj łączne natężenie przepływu poniżej 10 l/min, aby zminimalizować maksymalne ciśnienie i zapobiec awariom.
      3. Jeśli podejrzewa się wyciek, użyj roztworu detergentu, takiego jak dostępne w handlu detektory nieszczelności cieczy, aby łatwo zidentyfikować jego lokalizację, ponieważ będzie on bulgotał nad wszelkimi wyciekami gazu. Łatka przeciekająca za pomocą taśmy politetrafluoroetylenowej (np. Teflonu).
      4. Filtry strzykawkowe o średnicy 25 mm należy wymieniać w systemie oszczędzania tlenu co dwa tygodnie, ale różni się to w zależności od częstotliwości użytkowania. Z biegiem czasu cząsteczki złapane w filtrze zmniejszają natężenie przepływu gazu i powodują wzrost ciśnienia.
      5. Przed wykonaniem pomiarów skalibruj monitor tlenu na 21% sprężonego powietrza tlenu.
      6. Po zakończeniu użytkowania systemu należy wyłączyć zbiorniki i odpowietrzyć nadmiar gazu z regulatorów, aż do całkowitego zatrzymania przepływu.
  2. Pękanie kultur w butelce surowicy
    1. Oznacz butelki z autoklawizowaną surowicą o pojemności 500 ml identyfikatorami próbki, datą/godziną inokulacji i docelową zawartością tlenu.
    2. W kapturze biologicznym dodaj 24 ml sztucznej pożywki z plwociny do każdej ustawianej butelki z surowicą.
    3. Dodać 1 ml plwociny pacjenta homogenizowanej igłą 18 G (rozcieńczoną sterylną solą fizjologiczną, jeśli to konieczne, w celu uzyskania wystarczającej objętości próbki dla każdego warunku hodowli) do każdej butelki z surowicą.
    4. Za pomocą sterylnej pęsety umieść autoklawowane gumowe korki na górze każdej butelki z serum.
    5. Dociśnij gumowe korki, uważając, aby nie dotknąć spodu korka rękami.
    6. Zdejmij butelki z kaptura, nałóż i zaciśnij aluminiowe uszczelki. Usuń środkową część z uszczelek.
    7. Przetrzyj górną część butelek chusteczką nasączoną alkoholem i przepuść je przez płomień palnika Bunsena.
    8. Umieścić sterylną igłę 18-G w strzykawce bez tłoka z filtrem. Najpierw włóż ten uwalniacz gazu do butelki.
    9. Przymocuj sterylną igłę 18-G do wylotu gazu z systemu i włóż igłę odprowadzającą gaz również do butelki.
    10. Poprowadź trójniki ze zbiorników przez monitor tlenu. Sprawdź, czy docelowe stężenie tlenu przepływa przez system. Docelowy przepływ gazu wynosi około 5 l/min.
    11. Przekieruj trójniki ze zbiorników do wylotu gazu. Gaz zaczyna przepływać przez butelkę z serum.
      UWAGA: Zwróć szczególną uwagę na manometr podczas rozpryskiwania tlenu. Jeśli ciśnienie nieoczekiwanie wzrośnie, natychmiast wyłącz system.
    12. Przepuszczaj tlen przez butelkę z serum przez 1 minutę. Przy prędkości 5 l/min pozwala to na 10 wymian powietrza i zapewnia, że atmosfera wewnętrzna osiąga pożądane ciśnienie cząstkowe.
    13. Usunąć igłę 18-G z separatorem gazu.
    14. Pozwól, aby ciśnienie w butelce z surowicą wzrosło do atmosfery +1 (2 atmosfery na poziomie morza), a następnie natychmiast usuń igłę odprowadzającą gaz.
      UWAGA: Utrzymanie ciśnienia pomaga w utrzymaniu warunków hiperoksycznych w czasie.
    15. Umieścić butelkę z surowicą w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min. Inkubować próbki w trzech 24-godzinnych odstępach. W każdym 24-godzinnym odstępie czasu pobiera się podwielokrotność do dalszej analizy, ponownie rozpyla próbki i zwraca je do inkubacji na łączny czas inkubacji wynoszący 72 godziny.
  3. Pomiar tlenu na wylocie
    1. Skalibruj miernik tlenu na 21% sprężonego powietrza, a następnie wyłącz zbiornik.
    2. Przeprowadź wlot butelki z surowicą przez monitor tlenu i przymocuj sterylną igłę do końca.
    3. Wprowadzić igłę przez gumowy korek do butelki z serum.
    4. Poczekaj, aż odczyt odpływu się ustabilizuje. Niskie natężenie przepływu z butelek z surowicą oznacza, że może to potrwać do 2 minut. Podaj szczytową różnicę w stosunku do powietrza w pomieszczeniu (liczba najbardziej oddalona od 21%).
    5. W przypadku wykonywania wielu odczytów należy przepłukać układ sprężonym powietrzem między odczytami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Te protokoły zostały zastosowane do 50 odkrztuszonych próbek plwociny z pwCF, które zostały przekazane do rutynowej opieki do ambulatoryjnej kliniki mukowiscydozy w Massachusetts General Hospital w Bostonie, Massachusetts. Plwocinę każdego pacjenta hodowano w warunkach 21%, 50% i 100% tlenu przy użyciu sztucznej pożywki z plwociną, z 0,5 ml podwielokrotności pobranych z każdej hodowli po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach posiewu do testów. Kultury zostały sfotografowane, gdy dokonano ekstrakcji w celu śledzenia z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opracowano model in vitro w celu zbadania wpływu hiperoksji na społeczności drobnoustrojów płucnych. Model ten, oparty na sztucznej pożywce z plwociną i codziennym płukaniu butelek z surowicą, utrzymuje podwyższone stężenie tlenu i wspomaga wzrost drobnoustrojów zidentyfikowanych w plwocinie z pwCF.

Podejście to składa się z kilku kluczowych etapów. Pierwszym z nich jest wybór sterylizacji filtracyjnej, a nie sterylizacji termicznej sztucznej pożywki z plwociny. Steryliz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Część tej pracy została wykonana w Morskim Laboratorium Biologicznym przy wsparciu Morskiego Laboratorium Biologicznego, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (grant numer 5600373) oraz darowi od Fundacji Simonsa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BME Vitamins (100x) RoztwórMilliporeSigmaB6891Skoncentrowany roztwór uzupełniających witamin.
Zaciskarka, 30 mmDWK Nauki Przyrodnicze224307Zaciskarka do mocowania aluminiowych uszczelek do butelek z serum.
D-(+)-GliporeSigmaG7021Stała glukoza w proszku (izomer prawoskrętny).
Pompa membranowa ME 2 NTVACUUBRAND20730003Pompa próżniowa do filtracji próżniowej.
Emulsja z żółtka jajaHiMediaFD045Sterylna emulsja 30% żółtka jaja w soli fizjologicznej.
Ferrytyna, kationizowana zMillipore, śledziony koniaSigmaF7879Roztwór ferrytyny (białka magazynującego żelazo).
FIREBOY plus Bezpieczny palnik BunsenaIntegra Biosciences144000Palnik Bunsena z interfejsem użytkownika i funkcjami bezpieczeństwa.
Papier Hydrion pH (1.0– 14.0)Micro Essential Laboratory94pH dla zakresu 1,0 i 14,0.
Papier Hydrion pH (4.0– 9.0)Micro Essential Laboratory55pH dla zakresu 4,0 i 9,0.
Papier Hydrion pH (6.0– 8.0)Micro Essential Laboratory345pH dla zakresu 6,0 i 8,0.
Urządzenie zabezpieczające Hypodermic Needle-Pro EDGE, igły 18 GSmiths Medical40181518 G z nasadkami zabezpieczającymi.
Manometr liniowyMilliporeSigma20469Manometr gazowy do monitorowania ciśnienia w butle.
Innova 42 Wytrząsarka inkubowanaEppendorf2231000756Inkubator kombinowany/wytrząsarka orbitalna.
Strzykawka Luer-Lok z dołączoną igłąBecton Dickinson309580Kombinacja strzykawki 3 ml i igły 18 G.
Asortyment zaworów LuerWorld Precision Instruments14011Zawory do przewodów przepływu gazu.
Wytrząsarka orbitalna LSEThermoFisher Scientific6780-NPWytrząsarka orbitalna do mieszania mediów podczas filtracji.
Siarczan magnezu siedmiowodnyMilliporeSigmaM2773Stała sól epsom (siarczan magnezu siedmiowodny).
Jednostopniowy regulator powietrza medycznego z przepływomierzemWestern EnterprisesM1-346-15FMRegulator natężenia przepływu powietrza z miernikiem 15 l / min.
MEM Aminokwasy (50x) RoztwórMilliporeSigmaM5550Skoncentrowany roztwór aminokwasów egzogennych.
MEM Aminokwasy endogenne (100x) RoztwórMilliporeSigmaM7145Skoncentrowany roztwór aminokwasów endogennych.
Filtr Millex-GP, 0,22 i mikro; mMilliporeSigmaSLMP25SS0,22 &mikro; m Sterylny filtr strzykawkowy z membraną polieterosulfonową.
Milli-Q AcademicMilliporeSigmaZMQS60E01sterylny system filtracji wody Milli-Q.
Monitor tlenu MiniOX 3000 MSA814365Procentowy monitor przepływu tlenu w przepływie gazu.
Bufor MOPS (1 m, pH 9,0)BBM-90Boston BioProductsdo regulacji pH podłoża.
Mucyna zmiliporów żołądka wieprzowegoSigmaM2378Mucyna (glikozylowane białko tworzące żel) w proszku.
Zestaw montażowy z naturalnego polipropylenuAparatura Harvard72-1413Złącza do rurek przepływających gaz.
Nextera XT DNA Library Preparation KitIlluminaFC-131-1096Przygotowanie biblioteki do identyfikacji podczas sekwencjonowania.
System sekwencjonowania NovaSeq 6000Illumina770-2016-025-NPlatforma sekwencjonowania typu shotgun do generowania odczytów próbek.
Jednostopniowy regulator tlenu z przepływomierzemWestern EnterprisesM1-540-15FMRegulator natężenia przepływu tlenu z miernikiem 15 l / min.
Rurka tlenowa z 2 standardowymi złączamiSunMed2001-01Rurka do łączenia elementów instalacji gazowej.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10x, pH 7,4Molecular Biologicals InternationalMRGF-6235Skoncentrowany roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem.
PC 420 Płyta grzejna/mieszadłoMarshall ScientificCO-PC420Kombinowana płyta grzejna/mieszadło.
Chlorek potasuMilliporeSigmaP9541Stała sól chlorku potasu.
Jednorazowe mieszadła PTFEThermoFisher Scientific14-513-95Jednorazowe mieszadła magnetyczne.
Taśma teflonowa z uszczelnieniem gwintu PTFE VWR470042-938Taśma teflonowa do wzmacniania połączeń instalacji gazowej.
Wkład oczyszczający Q-Gard 2MilliporeWkład oczyszczający SigmaQGARD00D2do systemu Milli-Q.
Butelki do przechowywania pożywek wielokrotnego użytkuThermoFisher Scientific06-423AButelki do mieszania i przechowywania pożywek hodowlanych.
Korek gumowy, 30 mm, szary bromobutylDWK Life Sciences224100-331Korki gumowe do butelek z serum.
Butelka na serum z formowaną podziałką, 500 mlDWK Nauki przyrodnicze223952Szklane butelki na surowicę do szczelnej hodowli.
Zestaw przedłużek do małych otworówBraun Medical471960Przedłużka rurki ze złączami luer lock.
Chlorek soduMilliporeSigmaS3014Sól chlorku sodu w postaci stałej.
Spike-in Control I (wysokie obciążenie mikrobiologiczne)ZymoBIOMICSD6320Mikroorganizmy spike-in (I. halotolerans i A. halotolerans) do obliczeń bezwzględnego obciążenia mikrobiologicznego
Stericup Sterylny system filtracji próżniowej Stericup Quick ReleaseMilliporeSigmaS2GPU02RE250 mL 0,22 i mikro; m próżniowa komora filtracyjna.
Super Sani-Cloth Bakteriobójcze chusteczki jednorazoweProfessional Disposables InternationalH04082Jednorazowe chusteczki bakteriobójcze do sterylizacji.
Mieszanina metali śladowych, 1000xThermoFisher ScientificNC0112668Skoncentrowany roztwór fizjologicznych metali śladowych.
Uszczelka aluminiowa bez podszewki, 30 mmDWK Life Sciences224187-01Uszczelki aluminiowe zaciskane na górze gumowych korków.
USP Medical Grade Air TankAirgasAI USP200Zbiornik sprężonego powietrza do wejścia do systemu spargingu.
USP Medical Grade Oxygen TankAirgasOX USP200Zbiornik sprężonego tlenu do wejścia do systemu spargingu.
Bibuła testowa Papier testowy Bibuła testowa Bufor MOPS firmy

Bibliografia

  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060(2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798(2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532(2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423(2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938(2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953(2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28(2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390(2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrobiom mukowiscydozysztuczne podłoże plwocinydrobnoustroje dróg oddechowychnapowietrzanie tlenemhodowla w butelkach z surowicąsekwencjonowanie metagenomiczneskład społeczności mikrobowejpatogeny płucsterylizacja filtracyjna
Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.