Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy

Summary

Celem tego protokołu jest opracowanie modelowego systemu dla wpływu hiperoksji na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych mukowiscydozy. Sztuczna pożywka z plwociny naśladuje skład plwociny, a warunki hodowli hiperoksycznej modelują wpływ dodatkowego tlenu na społeczności drobnoustrojów płucnych.

Abstract

Uważa się, że społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych odgrywają ważną rolę w postępie mukowiscydozy (CF) i innych przewlekłych chorób płuc. Drobnoustroje są tradycyjnie klasyfikowane na podstawie ich zdolności do używania lub tolerowania tlenu. Dodatkowy tlen jest powszechną terapią medyczną stosowaną u osób z mukowiscydozą (pwCF); Jednak istniejące badania nad tlenem i mikrobiomem dróg oddechowych koncentrowały się na tym, jak hipoksja (niski poziom tlenu), a nie hiperoksja (wysoki poziom tlenu), wpływa na głównie tlenowe i fakultatywne beztlenowe społeczności drobnoustrojów płuc. Aby wypełnić tę krytyczną lukę w wiedzy, protokół ten został opracowany przy użyciu sztucznej pożywki z plwociny, która naśladuje skład plwociny z pwCF. Zastosowanie sterylizacji filtracyjnej, która daje przezroczyste podłoże, pozwala metodom optycznym śledzić wzrost drobnoustrojów jednokomórkowych w kulturach zawiesinowych. Aby stworzyć warunki hiperoksyczne, ten system modelowy wykorzystuje uznane techniki hodowli beztlenowej do badania warunków hiperoksycznych; Zamiast usuwać tlen, tlen jest dodawany do kultur poprzez codzienne spryskiwanie butelek z surowicą mieszaniną sprężonego tlenu i powietrza. Plwocina z 50 pwCF była poddawana dziennemu płukaniu przez okres 72 godzin, aby zweryfikować zdolność tego modelu do utrzymania zróżnicowanych warunków tlenowych. Sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun przeprowadzono na hodowanych i niehodowlanych próbkach plwociny z 11 pwCF w celu sprawdzenia zdolności tej pożywki do wspierania wzrostu drobnoustrojów komensalnych i chorobotwórczych powszechnie występujących w plwocinie mukowiscydozy. Krzywe wzrostu uzyskano ze 112 izolatów uzyskanych z pwCF w celu sprawdzenia zdolności tego sztucznego podłoża do plwociny do wspierania wzrostu powszechnych patogenów mukowiscydozy. Odkryliśmy, że model ten może hodować szeroką gamę patogenów i komensalów w plwocinie mukowiscydozy, odzyskuje społeczność bardzo podobną do niehodowlanej plwociny w warunkach normoksyjnych i tworzy różne fenotypy hodowli w różnych warunkach tlenowych. To nowe podejście może przyczynić się do lepszego zrozumienia nieprzewidzianych skutków wywołanych stosowaniem tlenu w pwCF na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych i powszechne patogeny układu oddechowego.

Introduction

Mukowiscydoza (CF) jest chorobą genetyczną charakteryzującą się niezdolnością do usuwania gęstego śluzu z płuc, co prowadzi do powtarzających się infekcji i postępującego spadku funkcji płuc, co często prowadzi do konieczności przeszczepu płuc lub śmierci. Mikrobiom dróg oddechowych osób z mukowiscydozą (pwCF) wydaje się śledzić aktywność choroby¹, przy czym zmniejszenie różnorodności mikrobiologicznej wiąże się z niekorzystnymi długoterminowymi wynikami^2,3. W badaniach klinicznych nad pwCF uzupełniająca tlenoterapia była związana z bardziej zaawansowaną chorobą^4,5, chociaż tradycyjnie stosowanie tlenoterapii było postrzegane po prostu jako marker ciężkości choroby⁶. Ostatnie badania przeprowadzone na pacjentach z niewydolnością oddechową wykazały, że wyższy poziom tlenu u pacjentów jest paradoksalnie związany ze wzrostem poważnych infekcji bakteryjnych i wyższą śmiertelnością⁷, co sugeruje, że dodatkowy tlen może przyczyniać się do patogenezy choroby. Wpływ dodatkowego tlenu na mikrobiom płuc mukowiscydozy i związane z nim społeczności mikroorganizmów płuc i dróg oddechowych nie został dobrze zbadany.

Badania mechanistyczne często nie mogą być przeprowadzone bezpośrednio na ludziach z powodu trudności logistycznych i potencjalnych problemów etycznych związanych z interwencjami o nieznanych korzyściach medycznych lub szkodach. Podejścia translacyjne, które integrują ludzkie próbki biologiczne z systemami modelowymi, mogą dostarczyć ważnych informacji biologicznych w takich przypadkach. Chociaż zdolność do używania lub tolerowania tlenu tradycyjnie była ważnym elementem klasyfikacji drobnoustrojów, niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób terapeutyczne wprowadzenie dodatkowego tlenu do środowiska może zaburzyć społeczności drobnoustrojów dróg oddechowych. Aby rzucić światło na nieznany wpływ dodatkowego tlenu na mikrobiomy dróg oddechowych pwCF, musieliśmy zmierzyć się z dwoma głównymi wyzwaniami; po pierwsze, stworzenie pożywki hodowlanej, która fizjologicznie przybliża skład plwociny mukowiscydozy; Po drugie, stworzenie systemu modelowego, który pozwala na utrzymanie podwyższonego stężenia tlenu w kulturze przez dłuższy czas.

Sztuczne podłoża do plwociny (ASM) są powszechnie używane do emulacji plwociny płucnej ex vivo^8,9,10, ale nie ma jasnego konsensusu co do konkretnego przepisu. Protokół ten opisuje recepturę i strategię przygotowania sztucznej plwociny, starannie opracowaną w celu fizjologicznego przybliżenia plwociny z pwCF. W tabeli 1 przedstawiono wybrane wartości receptur w oparciu o opublikowaną literaturę. Podstawowe składniki chemiczne i pH dopasowano do wartości zidentyfikowanych w badaniach ludzkiej plwociny na mukowiscydozę^11,12,13. Fizjologiczne składniki odżywcze o niskim stężeniu dodawano za pomocą żółtka jaja, które stanowiło 0,25% końcowej objętości¹⁰, a także mieszanki witamin i metali śladowych^14,15. Mucyna, kluczowy składnik plwociny¹⁶, została uwzględniona w 1% w/v¹⁴. Chociaż sterylizacja filtrów jest bardziej pracochłonna, wybrano ją zamiast bardziej konwencjonalnej praktyki sterylizacji termicznej, aby zmniejszyć potencjalne problemy wynikające z indukowanej ciepłem denaturacji kluczowych składników pożywki¹⁰. Dodatkową zaletą sterylizacji filtrów jest to, że wytwarza ona media, które są przezroczyste (sterylizacja termiczna może powodować powstawanie mętnych mediów w wyniku wytrącania i koagulacji soli i białek), co pozwala na wykorzystanie tej sztucznej pożywki z plwociny do śledzenia wzrostu drobnoustrojów w oparciu o wzrost zmętnienia.

Ten system modelowy dla hodowli hiperoksycznej opiera się na technikach hodowli beztlenowej, gdzie tlen jest dodawany, a nie usuwany, tworząc model dla efektu dodatkowego użycia tlenu dla pwCF. Rysunek 1 i związany z nim protokół sparingu tlenu przedstawia elementy systemu sparingu tlenowego, które można uzyskać tanio od ogólnych dostawców laboratoryjnych i szpitalnych. System ten umożliwia mieszanie sprężonego tlenu i powietrza do stałych stężeń w zakresie od 21% do 100% tlenu. Integracja czujnika tlenu pozwala na weryfikację stężenia wyjściowej mieszaniny gazów, a także sprawdzenie składu gazu wypływającego z wcześniej rozpylonych butelek z surowicą w celu sprawdzenia, czy warunki tlenowe zostały utrzymane w pożądanym zakresie.

Ten protokół opisuje procedury tworzenia sztucznej pożywki do plwociny, budowy i użycia systemu oszczędzania tlenu, oraz zastosowania obu do hodowli plwociny CF w warunkach zróżnicowanego tlenu.

Protocol

To badanie otrzymało zgodę Partners Institutional Review Board (Protokół # 2018P002934). Kryterium włączenia obejmowało dorosłych pacjentów z mukowiscydozą, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Nie było kryterium wykluczenia. Zgodnie z wytycznymi protokołu, wszystkie próbki plwociny zostały pobrane od pacjentów z mukowiscydozą podczas zaplanowanej wizyty ambulatoryjnej u ich lekarza.

1. Preparat sztucznej plwociny

UWAGA: Podane tutaj ilości dotyczą produkcji 1 litra końcowego podłoża ze sztucznej plwociny i zakładają konkretne odczynniki wymienione w Tabeli Materiałów. Liczby muszą być dostosowane do innych objętości lub do użycia różnych odczynników, aby zapewnić ten sam produkt końcowy. Patrz tabela 1 w odniesieniu do stężeń docelowych.

1. Mieszanka chemiczna sztucznej plwociny (ASCM)
   UWAGA: ASCM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Jest stabilny na półce i może być przygotowywany luzem lub z wyprzedzeniem. Jeśli jest przygotowywana do późniejszego użycia, należy ją autoklawować w autoklawie i bezpiecznie przechowywać w temperaturze pokojowej.
   1. Wymieszać podstawowe roztwory chemiczne wchodzące w skład tej mieszanki.
      1. Przygotuj 1 M bulionu NaCl: Dodaj 58,44 g NaCl na litr sterylnej wody.
      2. Przygotuj 1 M bulionu KCl: Dodaj 74,55 g KCl na litr sterylnej wody.
      3. Przygotować 1 M MgSO4 bulionu: Dodać 246,47 g MgSO₄·7H₂O na litr sterylnej wody lub 120,37 g bezwodnego MgSO4 na litr sterylnej wody.
      4. Przygotuj 1 M bulionu glukozy: Dodaj 180,16 g glukozy na litr sterylnej wody.
   2. W autoklawie wysterylizuj chemiczne roztwory podstawowe, a także pustą butelkę o pojemności 250 ml. Etapy autoklawowania należy wykonywać do co najmniej standardowych wartości 121 °C i 15 PSI przez 30 minut.
   3. Dodaj 80,59 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 250 ml.
   4. Dodać do mieszanki 152,30 ml 1 M bulionu NaCl.
   5. Dodaj do mieszanki 15,8 ml 1 M bulionu KCl.
   6. Do mieszanki dodać 610 μl 1 M bulionu_MgSO4
   .
   7. Do mieszanki dodać 700 μl 1 M bulionu glukozowego.
2. Mieszanina mucyny ze sztuczną plwociną (ASMM)
   UWAGA: ASMM stanowi 50% końcowej objętości nośnika. Upewnij się, że jest przygotowany tego samego dnia, co ostatnia partia pożywki.
   1. Dodaj 450 ml sterylnej wody do pustej butelki o pojemności 1 l.
   2. Dodaj 50 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do butelki.
   3. Dodaj jednorazowy magnetyczny mieszadło do butelki.
   4. Butelkę zawierającą PBS i mieszadło należy sterylizować w autoklawie.
   5. Odmierz 10 g mucyny w proszku i dodaj ją do PBS.
   6. Energicznie wstrząśnij butelką w celu wstępnego wymieszania.
   7. Umieść butelkę na płycie grzejnej z mieszadłem magnetycznym. Ustaw temperaturę na średnio-wysoką, celując w 50 °C, a prędkość mieszania na 1100 obr./min. Stopniowo zwiększaj prędkość, aby pręt nie spadł z magnesu.
      1. Pozostawić do podgrzania i mieszać przez 15 minut.
      2. Podnieś butelkę w żaroodpornych rękawicach. Obserwuj, aby sprawdzić, czy mucyna w proszku osiada z roztworu.
      3. Jeśli mucyna w proszku nie jest całkowicie rozpuszczona, ponownie włącz butelkę do podgrzewania/mieszania w odstępach 5-minutowych, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   8. Pozwól mieszaninie mucyny ostygnąć do temperatury pokojowej.
3. Mieszanka biologiczna sztucznej plwociny (ASBM)
   UWAGA: ASBM stanowi 25% końcowej objętości nośnika. Przygotuj go tego samego dnia, co końcową pożywkę i w przeciwieństwie do innych mieszanek, nie wystawiaj jego składników na działanie ciepła.
   1. Rozmrozić 100x bulionu witaminowego w lodówce o temperaturze 4°C lub na lodzie.
      UWAGA: Wstępnie podziel zapas witamin na 10 ml porcji, aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania/rozmrażania.
   2. Dodaj 124,24 ml sterylnej wody do pustej autoklawizowanej butelki o pojemności 250 ml.
   3. Dodaj do mieszanki 25,76 ml 50x zapasu aminokwasów egzogennych.
   4. Dodaj do mieszanki 80,14 ml 100x zapasu aminokwasów endogennych.
   5. Dodaj do mieszanki 10 ml (rozmrożonego) bulionu witaminowego 100x.
   6. Dodaj do mieszanki 1 ml bulionu 1000x z metali śladowych.
   7. Dodaj do mieszanki 8,33 ml 30% emulsji z żółtka jaja.
   8. Do mieszanki dodać 400 μl bulionu ferrytynowego o gramaturze 10 g/l.
   9. Dobrze wymieszaj roztwór, ręcznie wstrząsając.
4. Sztuczna pożywka z plwociną (ASM)
   1. Dodać 250 ml ASCM do 1-litrowej butelki zawierającej ASMM.
   2. Dodać 250 ml ASBM do średniej butelki.
   3. Miareczkować pożywkę podstawowym buforem MOPS (1 M), aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce o wąskim zakresie. Przed miareczkowaniem mieszanina pożywki będzie zbyt kwaśna.
   4. Otrzymaną sztuczną pożywkę z plwociny należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do filtracji.
   5. Aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 ml niefiltrowanej sztucznej plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 μm.
   6. Podłączyć system filtracji do pompy próżniowej, włączyć pompę próżniową, ustawić ją na 70 mbar, a następnie umieścić komorę na wytrząsarce orbitalnej wytrząsającej z prędkością 90 obr./min w chłodni w temperaturze 4 °C.
      1. Uzupełnij dodatkowymi 150 ml pożywki, ponieważ znaczna ilość jest filtrowana. Całkowite przefiltrowanie 1 l podłoża zajmuje 1-2 dni.
      2. Powtórz z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.
         UWAGA: Staraj się nie filtrować więcej niż 350 ml pożywki przez ten sam filtr 0,22 μm, ponieważ mucyna z czasem zatka filtr.
   7. Przefiltrowaną pożywkę ze sztuczną plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do użycia. Użyj ASM w ciągu jednego miesiąca od przygotowania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

2. Rozpylanie tlenu

1. Konfiguracja stacji rozrzedzania
   UWAGA: Ten protokół powinien być wykonany w całości tylko raz, po czym konfigurację można utrzymać poprzez prostą konserwację w razie potrzeby. Zobacz Rysunek 1 dla wizualnego schematu systemu sparingu tlenu.
   1. Zaopatrz się i odpowiednio zabezpiecz zbiorniki sprężonego powietrza i tlenu.
      UWAGA: Wysokie ciśnienie sprawia, że zbiorniki są niezwykle niebezpieczne w przypadku niewłaściwego obchodzenia się. Upewnij się, że zbiorniki są całkowicie uszczelnione i zabezpieczone, nie ma wycieków, gdy zbiornik jest zamknięty i że cały personel obsługujący jest w pełni przeszkolony w ich obsłudze.
   2. Przymocuj regulator powietrza do zbiornika sprężonego powietrza za pomocą klucza. Aby uzyskać optymalny odczyt przepływu na regulatorze, przymocuj regulator jak najbliżej pozycji pionowej.
   3. Przymocuj regulator tlenu do zbiornika ze sprężonym tlenem, mocując jak najbliżej pozycji pionowej. W zależności od butli z tlenem może być konieczne odwrócenie kierunku dokręcania.
   4. Podłącz rurki z reduktorów do złącza Y, aby połączyć przepływ gazu z dwóch zbiorników.
   5. Podłączyć wyjście łącznika Y do centralnego zaworu trójnika.
   6. Podłącz jedną stronę centralnego zaworu trójnika do manometru gazu.
   7. Podłącz drugą stronę manometru gazu do sterylnego filtra strzykawkowego o średnicy 25 mm z porami o wielkości porów 0,22 μm.
   8. Podłączyć drugi filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm do strzykawki bez tłoka, który ma być używany jako środek uwalniający gaz podczas rozpylania.
   9. Podłącz ostatnią stronę centralnego zaworu trójnika do drugiego zaworu trójnika monitora tlenu.
   10. Podłącz filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z jednej strony tego drugiego zaworu trójnika wraz z rurką do mocowania igieł 18 G.
   11. Podłącz ostatnią stronę drugiego zaworu trójnika do aparatu monitorującego tlen.
   12. Podłączyć rurkę odcinającą po drugiej stronie aparatu do monitorowania tlenu, która ma być używana jako uwalnianie gazu podczas monitorowania.
       UWAGA: Podczas testowania/używania systemu sparingu tlenu należy zwrócić uwagę na położenie trójników i upewnić się, że są one zgodne z zamierzoną ścieżką przez system. Niezastosowanie się do tego spowoduje wzrost ciśnienia wewnątrz systemu i spowoduje awarię i rozpad komponentów.
   13. W celu utrzymania systemu i utrzymania jego optymalnej wydajności korzystne są następujące praktyki.
       1. Wzmocnij połączenia dużą ilością taśmy teflonowej, aby znacznie poprawić ich uszczelnienie i zmniejszyć ryzyko oderwania się elementów od ciśnienia wewnętrznego.
       2. Utrzymuj łączne natężenie przepływu poniżej 10 l/min, aby zminimalizować maksymalne ciśnienie i zapobiec awariom.
       3. Jeśli podejrzewa się wyciek, użyj roztworu detergentu, takiego jak dostępne w handlu detektory nieszczelności cieczy, aby łatwo zidentyfikować jego lokalizację, ponieważ będzie on bulgotał nad wszelkimi wyciekami gazu. Łatka przeciekająca za pomocą taśmy politetrafluoroetylenowej (np. Teflonu).
       4. Filtry strzykawkowe o średnicy 25 mm należy wymieniać w systemie oszczędzania tlenu co dwa tygodnie, ale różni się to w zależności od częstotliwości użytkowania. Z biegiem czasu cząsteczki złapane w filtrze zmniejszają natężenie przepływu gazu i powodują wzrost ciśnienia.
       5. Przed wykonaniem pomiarów skalibruj monitor tlenu na 21% sprężonego powietrza tlenu.
       6. Po zakończeniu użytkowania systemu należy wyłączyć zbiorniki i odpowietrzyć nadmiar gazu z regulatorów, aż do całkowitego zatrzymania przepływu.
2. Pękanie kultur w butelce surowicy
   1. Oznacz butelki z autoklawizowaną surowicą o pojemności 500 ml identyfikatorami próbki, datą/godziną inokulacji i docelową zawartością tlenu.
   2. W kapturze biologicznym dodaj 24 ml sztucznej pożywki z plwociny do każdej ustawianej butelki z surowicą.
   3. Dodać 1 ml plwociny pacjenta homogenizowanej igłą 18 G (rozcieńczoną sterylną solą fizjologiczną, jeśli to konieczne, w celu uzyskania wystarczającej objętości próbki dla każdego warunku hodowli) do każdej butelki z surowicą.
   4. Za pomocą sterylnej pęsety umieść autoklawowane gumowe korki na górze każdej butelki z serum.
   5. Dociśnij gumowe korki, uważając, aby nie dotknąć spodu korka rękami.
   6. Zdejmij butelki z kaptura, nałóż i zaciśnij aluminiowe uszczelki. Usuń środkową część z uszczelek.
   7. Przetrzyj górną część butelek chusteczką nasączoną alkoholem i przepuść je przez płomień palnika Bunsena.
   8. Umieścić sterylną igłę 18-G w strzykawce bez tłoka z filtrem. Najpierw włóż ten uwalniacz gazu do butelki.
   9. Przymocuj sterylną igłę 18-G do wylotu gazu z systemu i włóż igłę odprowadzającą gaz również do butelki.
   10. Poprowadź trójniki ze zbiorników przez monitor tlenu. Sprawdź, czy docelowe stężenie tlenu przepływa przez system. Docelowy przepływ gazu wynosi około 5 l/min.
   11. Przekieruj trójniki ze zbiorników do wylotu gazu. Gaz zaczyna przepływać przez butelkę z serum.
       UWAGA: Zwróć szczególną uwagę na manometr podczas rozpryskiwania tlenu. Jeśli ciśnienie nieoczekiwanie wzrośnie, natychmiast wyłącz system.
   12. Przepuszczaj tlen przez butelkę z serum przez 1 minutę. Przy prędkości 5 l/min pozwala to na 10 wymian powietrza i zapewnia, że atmosfera wewnętrzna osiąga pożądane ciśnienie cząstkowe.
   13. Usunąć igłę 18-G z separatorem gazu.
   14. Pozwól, aby ciśnienie w butelce z surowicą wzrosło do atmosfery +1 (2 atmosfery na poziomie morza), a następnie natychmiast usuń igłę odprowadzającą gaz.
       UWAGA: Utrzymanie ciśnienia pomaga w utrzymaniu warunków hiperoksycznych w czasie.
   15. Umieścić butelkę z surowicą w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 37 °C z prędkością 150 obr./min. Inkubować próbki w trzech 24-godzinnych odstępach. W każdym 24-godzinnym odstępie czasu pobiera się podwielokrotność do dalszej analizy, ponownie rozpyla próbki i zwraca je do inkubacji na łączny czas inkubacji wynoszący 72 godziny.
3. Pomiar tlenu na wylocie
   1. Skalibruj miernik tlenu na 21% sprężonego powietrza, a następnie wyłącz zbiornik.
   2. Przeprowadź wlot butelki z surowicą przez monitor tlenu i przymocuj sterylną igłę do końca.
   3. Wprowadzić igłę przez gumowy korek do butelki z serum.
   4. Poczekaj, aż odczyt odpływu się ustabilizuje. Niskie natężenie przepływu z butelek z surowicą oznacza, że może to potrwać do 2 minut. Podaj szczytową różnicę w stosunku do powietrza w pomieszczeniu (liczba najbardziej oddalona od 21%).
   5. W przypadku wykonywania wielu odczytów należy przepłukać układ sprężonym powietrzem między odczytami.

Results

Te protokoły zostały zastosowane do 50 odkrztuszonych próbek plwociny z pwCF, które zostały przekazane do rutynowej opieki do ambulatoryjnej kliniki mukowiscydozy w Massachusetts General Hospital w Bostonie, Massachusetts. Plwocinę każdego pacjenta hodowano w warunkach 21%, 50% i 100% tlenu przy użyciu sztucznej pożywki z plwociną, z 0,5 ml podwielokrotności pobranych z każdej hodowli po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach posiewu do testów. Kultury zostały sfotografowane, gdy dokonano ekstrakcji w celu śledzenia z...

Discussion

W tym badaniu opracowano model in vitro w celu zbadania wpływu hiperoksji na społeczności drobnoustrojów płucnych. Model ten, oparty na sztucznej pożywce z plwociną i codziennym płukaniu butelek z surowicą, utrzymuje podwyższone stężenie tlenu i wspomaga wzrost drobnoustrojów zidentyfikowanych w plwocinie z pwCF.

Podejście to składa się z kilku kluczowych etapów. Pierwszym z nich jest wybór sterylizacji filtracyjnej, a nie sterylizacji termicznej sztucznej pożywki z plwociny. Steryliz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Roztwór	MilliporeSigma	B6891	Skoncentrowany roztwór uzupełniających witamin.
Zaciskarka, 30 mm	DWK Nauki Przyrodnicze	224307	Zaciskarka do mocowania aluminiowych uszczelek do butelek z serum.
D-(+)-	GliporeSigma	G7021	Stała glukoza w proszku (izomer prawoskrętny).
Pompa membranowa ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Pompa próżniowa do filtracji próżniowej.
Emulsja z żółtka jaja	HiMedia	FD045	Sterylna emulsja 30% żółtka jaja w soli fizjologicznej.
Ferrytyna, kationizowana z	Millipore, śledziony koniaSigma	F7879	Roztwór ferrytyny (białka magazynującego żelazo).
FIREBOY plus Bezpieczny palnik Bunsena	Integra Biosciences	144000	Palnik Bunsena z interfejsem użytkownika i funkcjami bezpieczeństwa.
Papier Hydrion pH (1.0– 14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH dla zakresu 1,0 i 14,0.
Papier Hydrion pH (4.0– 9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH dla zakresu 4,0 i 9,0.
Papier Hydrion pH (6.0– 8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH dla zakresu 6,0 i 8,0.
Urządzenie zabezpieczające Hypodermic Needle-Pro EDGE, igły 18 G	Smiths Medical	401815	18 G z nasadkami zabezpieczającymi.
Manometr liniowy	MilliporeSigma	20469	Manometr gazowy do monitorowania ciśnienia w butle.
Innova 42 Wytrząsarka inkubowana	Eppendorf	2231000756	Inkubator kombinowany/wytrząsarka orbitalna.
Strzykawka Luer-Lok z dołączoną igłą	Becton Dickinson	309580	Kombinacja strzykawki 3 ml i igły 18 G.
Asortyment zaworów Luer	World Precision Instruments	14011	Zawory do przewodów przepływu gazu.
Wytrząsarka orbitalna LSE	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Wytrząsarka orbitalna do mieszania mediów podczas filtracji.
Siarczan magnezu siedmiowodny	MilliporeSigma	M2773	Stała sól epsom (siarczan magnezu siedmiowodny).
Jednostopniowy regulator powietrza medycznego z przepływomierzem	Western Enterprises	M1-346-15FM	Regulator natężenia przepływu powietrza z miernikiem 15 l / min.
MEM Aminokwasy (50x) Roztwór	MilliporeSigma	M5550	Skoncentrowany roztwór aminokwasów egzogennych.
MEM Aminokwasy endogenne (100x) Roztwór	MilliporeSigma	M7145	Skoncentrowany roztwór aminokwasów endogennych.
Filtr Millex-GP, 0,22 i mikro; m	MilliporeSigma	SLMP25SS	0,22 &mikro; m Sterylny filtr strzykawkowy z membraną polieterosulfonową.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	sterylny system filtracji wody Milli-Q.
Monitor tlenu MiniOX 3000 MSA		814365	Procentowy monitor przepływu tlenu w przepływie gazu.
Bufor MOPS (1 m, pH 9,0)	BBM-90	Boston BioProducts	do regulacji pH podłoża.
Mucyna z	miliporów żołądka wieprzowegoSigma	M2378	Mucyna (glikozylowane białko tworzące żel) w proszku.
Zestaw montażowy z naturalnego polipropylenu	Aparatura Harvard	72-1413	Złącza do rurek przepływających gaz.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Przygotowanie biblioteki do identyfikacji podczas sekwencjonowania.
System sekwencjonowania NovaSeq 6000	Illumina	770-2016-025-N	Platforma sekwencjonowania typu shotgun do generowania odczytów próbek.
Jednostopniowy regulator tlenu z przepływomierzem	Western Enterprises	M1-540-15FM	Regulator natężenia przepływu tlenu z miernikiem 15 l / min.
Rurka tlenowa z 2 standardowymi złączami	SunMed	2001-01	Rurka do łączenia elementów instalacji gazowej.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10x, pH 7,4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Skoncentrowany roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem.
PC 420 Płyta grzejna/mieszadło	Marshall Scientific	CO-PC420	Kombinowana płyta grzejna/mieszadło.
Chlorek potasu	MilliporeSigma	P9541	Stała sól chlorku potasu.
Jednorazowe mieszadła PTFE	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Jednorazowe mieszadła magnetyczne.
Taśma teflonowa z uszczelnieniem gwintu PTFE VWR		470042-938	Taśma teflonowa do wzmacniania połączeń instalacji gazowej.
Wkład oczyszczający Q-Gard 2	MilliporeWkład oczyszczający Sigma	QGARD00D2	do systemu Milli-Q.
Butelki do przechowywania pożywek wielokrotnego użytku	ThermoFisher Scientific	06-423A	Butelki do mieszania i przechowywania pożywek hodowlanych.
Korek gumowy, 30 mm, szary bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Korki gumowe do butelek z serum.
Butelka na serum z formowaną podziałką, 500 ml	DWK Nauki przyrodnicze	223952	Szklane butelki na surowicę do szczelnej hodowli.
Zestaw przedłużek do małych otworów	Braun Medical	471960	Przedłużka rurki ze złączami luer lock.
Chlorek sodu	MilliporeSigma	S3014	Sól chlorku sodu w postaci stałej.
Spike-in Control I (wysokie obciążenie mikrobiologiczne)	ZymoBIOMICS	D6320	Mikroorganizmy spike-in (I. halotolerans i A. halotolerans) do obliczeń bezwzględnego obciążenia mikrobiologicznego
Stericup Sterylny system filtracji próżniowej Stericup Quick Release	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0,22 i mikro; m próżniowa komora filtracyjna.
Super Sani-Cloth Bakteriobójcze chusteczki jednorazowe	Professional Disposables International	H04082	Jednorazowe chusteczki bakteriobójcze do sterylizacji.
Mieszanina metali śladowych, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Skoncentrowany roztwór fizjologicznych metali śladowych.
Uszczelka aluminiowa bez podszewki, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Uszczelki aluminiowe zaciskane na górze gumowych korków.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Zbiornik sprężonego powietrza do wejścia do systemu spargingu.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Zbiornik sprężonego tlenu do wejścia do systemu spargingu.