Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Arabidopsis jest zdecydowanie najczęściej używanym gatunkiem roślinnym do badań funkcjonalnych. Sterylizacja powierzchniowa nasion Arabidopsis jest podstawowym krokiem wymaganym w tym celu. Dlatego tak ważne jest opracowanie wysokoprzepustowych metod sterylizacji powierzchni nasion rzodkiewnika, aby poradzić sobie z dziesiątkami do setek próbek (np. linii transgenicznych, ekotypów lub mutantów) jednocześnie. W pracy przedstawiono metodę sterylizacji powierzchni nasion polegającą na skutecznej eliminacji cieczy w probówkach za pomocą domowego urządzenia ssącego zbudowanego ze zwykłej pompy próżniowej. Dzięki radykalnemu skróceniu pracochłonnego czasu pracy przy użyciu tej metody, obsługa kilkuset próbek w ciągu jednego dnia jest możliwa przy niewielkim wysiłku. Analizy przebiegu czasowego serii wykazały ponadto bardzo elastyczny zakres czasowy sterylizacji powierzchni przy utrzymaniu wysokich wskaźników kiełkowania. Metodę tę można łatwo dostosować do sterylizacji powierzchniowej innych rodzajów małych nasion dzięki prostemu dostosowaniu urządzenia ssącego do wielkości nasion i prędkości pożądanej do eliminacji cieczy.
Wprowadzenie
Arabidopsis to diploidalny gatunek rośliny należący do rodziny Brassicaceae. Jego stosunkowo krótki cykl życia (dwa miesiące na pokolenie w warunkach uprawy przez długi dzień), mały rozmiar rośliny i samozapylenie z produkcją setek nasion na roślinę sprawiły, że stał się pierwszym podstawowym modelem rośliny1,2. Ponadto jego genom został w pełni zsekwencjonowany3, dostępne są obszerne narzędzia genetyki odwrotnej (nasycone T-DNA, transpozon i chemicznie zmutagizowane populacje)4,5,6, a skuteczna transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest dobrze ugruntowana, aby uzyskać wystarczającą ilość linii transgenicznych do dalszych prac7. Tak więc w ciągu ostatnich dwóch dekad osiągnięto ogromny postęp, wykorzystując rzodkiewnik jako gatunek modelowy do analizowania różnych aspektów biologii roślin na poziomie molekularnym, w tym zmienności naturalnej, genetycznej i fenotypowej8,9.
Aby funkcjonalnie scharakteryzować interesujące geny u Arabidopsis, sterylizacja powierzchni nasion w celu wyeliminowania zanieczyszczeń grzybowych i bakteryjnych jest niezbędnym krokiem dla wielu dalszych protokołów wymagających kultur aksenistycznych. Transformacja genetyczna dla nadekspresji10, knock-down (RNA-I11) lub knock-out (edycja genomu12,13) funkcji genu, lokalizacji subkomórkowej14, aktywność promotora15,16, białko-białko17 i interakcja białko-DNA18, aby przytoczyć tylko najczęstsze zastosowania, wszystkie wymagają etapu sterylizacji powierzchni nasion. Tak więc, pomimo swojej względnej prostoty, sterylizacja powierzchni nasion odgrywa fundamentalną rolę w wielu analizach funkcjonalnych.
Do tej pory opracowano dwie główne kategorie metod sterylizacji powierzchni nasion oparte na sterylizacji gazowej lub ciekłej19. Podczas gdy wydajność sterylizacji powierzchni nasion w fazie gazowej jest średnia do wysokiej, użycie niebezpiecznego odczynnika chloru gazowego jako środka do sterylizacji powierzchni utrudniło jego szerokie zastosowanie. Metody oparte na sterylizacji w fazie ciekłej, wręcz przeciwnie, opierają się na łagodniejszych chemikaliach, takich jak etanol i roztwory wybielaczy do sterylizacji powierzchni, i są szerzej stosowane, mimo że mają z natury niższą przepustowość niż fumigacja chlorem. Ogólnie rzecz biorąc, powszechnie stosuje się dwie różne metody, w których wykorzystuje się odczynniki w płynie. Jedna z powszechnie stosowanych metod opiera się na myciu etanolem i wybielaczem w różnych stężeniach przez różny okres czasu20,21. Inna metoda opiera się na zastosowaniu tylko wybielacza21,22. Obie metody są stosowane głównie do sterylizacji powierzchni nasion na małą skalę. Jednak w wielu eksperymentach konieczne jest przesiewanie wielu linii transgenicznych Arabidopsis pochodzących z jednej transformacji15,23 lub równoległe przesiewanie wielu linii transgenicznych wygenerowanych z różnych transformacji24,25. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie opublikowano żadnej płynnej metody wysokoprzepustowej sterylizacji powierzchni nasion, która stanowi, choć mało znana, ważne wąskie gardło dla podejść genomiki funkcjonalnej. Dlatego opracowanie bezpiecznych, solidnych i wysokowydajnych metod sterylizacji powierzchni nasion jest niezbędnym i krytycznym krokiem w kierunku sukcesu funkcjonalnej charakterystyki wielu genów jednocześnie.
W tym celu, w obecnym badaniu, przedstawiono ulepszoną metodę powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsis. Metoda ta jest bezpieczna, tania, wysoce wytrzymała i wysokowydajna, umożliwiając obsługę 96 niezależnych linii w ciągu jednej godziny od rozpoczęcia sterylizacji powierzchni nasion do końca siewu nasion na szalkach Petriego. Zademonstrowana metoda opiera się na powszechnie dostępnym, podstawowym oprzyrządowaniu laboratoryjnym, takim jak pompa próżniowa, materiały szklane i wyroby z tworzyw sztucznych. Ta ulepszona metoda zapewnia społeczności naukowej bezpieczne, proste i niedrogie podejście do usprawnienia sterylizacji powierzchni nasion z wydajnością odpowiednią do nowoczesnych podejść genomiki funkcjonalnej u rzodkiewnika i innych niemodelowych gatunków roślin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników i pożywek
- Przygotuj 70% roztwór etanolu: dodaj 737 mL 95% etanolu technicznego do 263 mL wody destylowanej. Wymieszaj dokładnie.
UWAGA: Przygotuj 70% roztwór etanolu na niesterylnym blacie roboczym.
OSTRZEŻENIE: Etanol jest wysoce łatwopalny i może powodować poważne podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od otwartego ognia i źródeł ciepła. W przypadku kontaktu z oczami przepłukać obficie wodą. - Przygotuj 5% roztwór wybielacza: dodaj 5 mL wybielacza domowego (zawierającego ~3,5% podchlorynu sodu, NaClO) do 95 mL sterylnej wody destylowanej. Dodaj kilka kropli detergentu niejonowego (np. Tween 20) i wymieszaj dokładnie.
UWAGA: Przygotuj 5% roztwór wybielacza w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
OSTRZEŻENIE: Podchloryn sodu, aktywny składnik wybielacza, jest silnie drażniący. Jest silnie żrący i może spowodować poważne uszkodzenia przewodu pokarmowego. W przypadku kontaktu niezwłocznie przepłukać obficie wodą. W przypadku połknięcia skontaktować się z ośrodkiem toksykologicznym lub lekarzem w celu uzyskania porady terapeutycznej. - Przygotuj pożywkę Murashige i Skoog o połowicznym stężeniu (½ MS)26.
- Dodaj 2,2 g proszku pożywki MS (wraz z witaminami) oraz 10 g sacharozy do 800 mL wody destylowanej. Dostosuj pH roztworu za pomocą 1 M KOH i uzupełnij objętość do 1 L wodą destylowaną. Odmierz 500 mL do butelki o pojemności 1 L i dodaj 4 g agaru, aby przygotować pożywkę stałą. Poddaj roztwór autoklawowaniu.
- Po autoklawowaniu schłodzić pożywkę do 50-53 °C w kąpieli wodnej i przelać do naczyń Petriego w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Aby przygotować pożywkę selekcyjną, dodać do pożywki (50-53 °C) 1000 µL/L roztworu stokowego kanamycyny o stężeniu 50 mg/mL (wymieszać 500 mg monohydratu siarczanu kanamycyny w 10 mL wody destylowanej, wysterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze -20 °C). Wymieszać dokładnie poprzez delikatne potrząsanie i przelać do naczyń Petriego, jak opisano wcześniej.
2. Konfiguracja aspiratora
UWAGA: Konfiguracja instrumentu została podsumowana na Rysunku 1.
- Podłącz wlot pompy próżniowej do jednego końca rurki polietylenowej (PE) o odpowiedniej średnicy. Drugi koniec rurki podłącz do wylotu dwudrożnej pokrywy butelki do dekantacji. Połączenie rurki szczelnie owiń folią uszczelniającą (Tabela materiałów), aby zapewnić szczelność połączenia.
- Podłącz drugą rurkę PE do wlotu (otworu wystającego do wnętrza butelki) zakrętki butelki do dekantacji. Drugi koniec rurki podłącz do wylotu zaworu akwariowego. W razie potrzeby owiń połączenie folią uszczelniającą, aby wyeliminować wycieki powietrza.
- Bezpośrednio przed użyciem, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, załóż sterylną końcówkę do pipety o pojemności 200 µL na wlot filtra akwariowego.
Rysunek 1: Schemat urządzenia ssącego do wysokoprzepustowego usuwania płynów sterylizacyjnych. Dla przejrzystości poszczególne elementy nie są narysowane w skali. Litera (A) oznacza pompę próżniową, (B) butelkę zbiornikową do zbierania płynów (etanolu, wybielacza lub sterylnej wody), (C) zawór zapobiegający cofaniu się płynów, (D) sterylną końcówkę do pipety 200 µL oraz (E) probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierającą nasiona i płyn sterylizacyjny. Strzałki wskazują kierunek przepływu powietrza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Wysokoprzepustowa sterylizacja powierzchni nasion w cieczy
UWAGA: Cała procedura oraz minimalny czas wymagany do sterylizacji powierzchniowej nasion dzikiego typu (Col-0) Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (Rzodkiewnik pospolity) dla 96 niezależnych próbek zostały podsumowane na Ryc. 2.
- Oznacz markerem permanentnym dwie serie po 48 probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL, nadając im kolejne numery.
- Do każdej z 96 sterylnych probówek do mikrocentryfugi 1.5 mL dodaj od 100 do 200 nasion Arabidopsis (mniej więcej 1-2 mm nad dnem stożkowym probówki).
- Używając sterylnej pipety serologicznej 10 mL wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, odmierz około 1000 µL 70% etanolu do każdej probówki (pierwsza seria nasion, 48 probówek) i ostrożnie zamknij nakrętki.
UWAGA: Dozowanie roztworów nie musi być niezwykle precyzyjne, o ile odmierzona objętość jest kilkukrotnie większa niż objętość nasion. Alternatywnie ten krok można wykonać poza komorą laminarną (w warunkach niesterylnych). - Wstrząsaj probówkami w wytrząsarce z częstotliwością oscylacji 8.0 Hz przez co najmniej 3 min.
- Wyjmij adaptery z wytrząsarki i przenieś je do koszyka mikrocentryfugi laboratoryjnej.
- Szybko odwiruj nasiona, używając funkcji Pulse (dostępnej w większości mikrocentryfug laboratoryjnych), aby osiągnąć 1880 x g (~15 s).
UWAGA: Dłuższy czas lub wyższe siły wirowania negatywnie wpływają na kiełkowanie nasion. - Przenieś 48 probówek z adapterów do jednego statywu i otwórz wszystkie probówki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Unikaj zanieczyszczeń, nie dotykając części nakrętek wchodzącej do probówek. Jeśli nakrętki znajdują się zbyt blisko siebie, podziel probówki na dwa statywy dla łatwiejszej obsługi.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza załóż sterylną żółtą końcówkę 200 µL na wlot zaworu akwariowego domowej roboty aspiratora i włącz pompę.
- Wprowadź żółtą końcówkę tuż ponad poziom nasion, aby uniknąć kontaktu z nimi podczas odsysania cieczy. Alternatywnie szybko umieść końcówkę na dnie probówki; jeśli nasiono zablokuje ssanie cieczy, wymień końcówkę żółtą na nową.
- Używając sterylnej pipety serologicznej 10 mL w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odmierz do każdej probówki około 1000 µL 5% roztworu wybielacza.
- Szczelnie zamknij wszystkie nakrętki i włóż wszystkie probówki z powrotem do adapterów wytrząsarki. Wstrząsaj probówkami z częstotliwością oscylacji 8.0 Hz przez co najmniej 3 min.
- Szybko odwiruj nasiona, używając funkcji Pulse mikrocentryfugi laboratoryjnej przez czas niezbędny do osiągnięcia 1880 x g (~15 s).
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza załóż nową sterylną żółtą końcówkę 200 µL na zawór akwariowy podłączony do pompy próżniowej i włącz pompę.
- Wprowadź żółtą końcówkę ponad poziom nasion, aby uniknąć kontaktu z nimi podczas odsysania roztworu wybielacza.
- Używając sterylnej pipety serologicznej 10 mL w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odmierz do każdej probówki około 1000 µL sterylnej H2O.
UWAGA: Połącz dwie serie nasion, aby zminimalizować czas trwania operacji. - W komorze z laminarnym przepływem powietrza załóż nową sterylną żółtą końcówkę 200 µL na zawór akwariowy podłączony do pompy próżniowej i włącz pompę.
- Wprowadź żółtą końcówkę tuż ponad poziom nasion, aby uniknąć kontaktu z nimi podczas odsysania H2O.
- Używając sterylnej pipety serologicznej 10 mL, odmierz do każdej probówki około 500 µL sterylnej H2O i zamknij wszystkie nakrętki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nasiona są gotowe do wysiewu. W razie potrzeby przechowuj probówki w temperaturze pokojowej maksymalnie przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc.
- Napełnij butelkę zbiornika służącego do zbierania cieczy odpowiednią ilością wody i poddaj autoklawowaniu. Następnie wylej ciecz do zwykłego zlewu.
UWAGA: Poddaj ciecz autoklawowaniu, aby zabić wszystkie nasiona znajdujące się w zbiorniku.
Rysunek 2: Przegląd procedury i minimalny czas wymagany do sterylizacji powierzchniowej nasion Arabidopsis dla 96 niezależnych próbek.W przedstawionym eksperymencie 96 niezależnych próbek jest przetwarzanych w dwóch równolicznych partiach. Cała procedura jest identyczna dla obu partii i są one przetwarzane równolegle, jednak partia druga jest przetwarzana z opóźnieniem jednego kroku w stosunku do partii pierwszej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Wysiewanie i ocena Arabidopsis na płytkach z pożywką ½ MS
- Przenieść nasiona oraz 300-400 µL sterylnej H2O do szalki Petriego, delikatnie pipetując za pomocą pipety 1000 µL.
- Po przeniesieniu zawartości 10 probówek, wlać do każdej szalki około 1,5-2,0 mL roztopionej pożywki ½ MS bez antybiotyków.
UWAGA: Pożywkę ½ MS należy roztopić wcześniej, a następnie przechowywać w kąpieli termostatycznej ustawionej na 50-53 °C, aby zapobiec jej krzepnięciu. Należy dopilnować, aby temperatura nie przekroczyła 58 °C, aby nie obniżyć zdolności kiełkowania nasion. - Szybko zakręcić szalką, aby równomiernie rozłożyć w niej nasiona. Zakleić szalki taśmą po przeciwnych stronach.
- Zawinąć szalki w folię plastikową lub aluminiową, a następnie umieścić w lodówce (4 °C) na 3 dni w ciemności, aby uzyskać jednorodne kiełkowanie.
- Przenieść szalki do komory wzrostowej ustawionej na 23 °C w warunkach długiego dnia (16 h światła/8 h ciemności), przy natężeniu światła 100-120 µmol·m-2·s-1 i 60% wilgotności względnej.
- Po dwóch dniach ocenić rośliny pod kątem obecności korzonków. Wykryć wyłonienie się korzonka oraz formowanie zielonych liścic (pełne otwarcie obu liścic), aby ocenić kiełkowanie nasion.
5. Analizy statystyczne
UWAGA: Do analiz statystycznych wykorzystano testy parzyste Tukeya.
- Wartości P poniżej 0,01 należy uznać za istotne statystycznie. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić z co najmniej pięcioma powtórzeniami biologicznymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu oceny czasu wymaganego dla całej procedury sterylizacji nasion, obliczono różnice czasowe w obsłudze cieczy dla 96 próbek w obecnym protokole i porównano je z tradycyjnymi metodami pipetowania. Wynik wskazuje, że obecny protokół pozwala zaoszczędzić czas, skracając czas obsługi cieczy do jednej czwartej czasu potrzebnego przy zastosowaniu tradycyjnych protokołów (Tabela 1). Tabela dodatkowo podkreśla, że czas usuwania cieczy w obecnym protokole pozwala zaoszczędzić więcej czasu niż w przypadku met...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Sterylizacja nasion jest podstawowym krokiem w badaniach funkcjonalnych nad rzodkiewnikiem. Chociaż często przeprowadza się ją w wielu różnych celach, dostępne są ograniczone badania dotyczące wysokoprzepustowej sterylizacji powierzchni nasion u Arabidopsis.
Do tej pory jedną z metod o największej przepustowości jest stosowanie chloru gazowego wytwarzanego przez zmieszanie wybielacza ze skoncentrowanym HCl. Chociaż metoda ta wymaga ograniczonego czasu pracy fizycznej, wykorzystuje gaz wysoce t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Autonomiczną Prowincję Trydentu dzięki podstawowemu finansowaniu grupy Ecogenomics Fondazione E. Mach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zawór akwariowy | Amazon | B074CYC5SD | Kit zawierający 2 zawory i cienkościenne rurki. Zawór zapobiega cofaniu się płynów do sterylnej końcówki |
| Arabidopsis Col-0 nasiona typu dzikiego | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Nasiona typu dzikiego (wrażliwe na kanamycynę) |
| Arabidopsis transgeniczna linia Nasiona AdoIspS-79 | NA | NA | Linia transgeniczna z nadekspresją genu syntazy izoprenu z Arundo donax przekształconego w tle Col-0, opornego na kanamycynę (Li i in. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Dostępne na życzenie u autorów |
| Mikrowirówka | Eppendorf | EP022628188 | Mikrowirówka stołowa służąca do odkręcania nasion |
| Murashige & Pożywka Skoog zawierająca witaminy | Duchefa | M0222 | Standardowa pożywka do sterylnych kultur roślinnych |
| Kontroler pipet | Marka | 26300 | Służy do obsługi pipety serologicznej |
| Rurka polietylenowa 1 | Roth | 9591.1 | Rurka do podłączenia pompy próżniowej do butelki dekantacyjnej (średnica wewnętrzna: 7 mm; średnica zewnętrzna: 9 mm) |
| Rurka polietylenowa 2 | Roth | 9587.1 | Rurka do podłączenia butelki dekantacyjnej do zaworu akwariowego (średnica wewnętrzna: 5 mm; średnica zewnętrzna: 7 mm) |
| Zakrętka ze złączami | Roth | PY86.1 | 2-drożna zakrętka dozownika GL45 z polipropylenu do dekantacji butelki |
| Pipeta serologiczna | Marka | 27823 | Pipeta serologiczna ze szkła z podziałką (wielokrotnego użytku). Zamiast tego można użyć pipet jednorazowych |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II używany normalnie do homogenizacji tkanek. Bez dodatku koralików do rurek działa jak shaker. |
| Etanol techniczny | Odczynniki ITW (Nova Chimica Srl) | 212800 | Etanol 96% v/v częściowo denaturowany klasy technicznej |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Niejonowy detergent działający jako środek powierzchniowo czynny |
| Uniwersalne złącza do węży | Roth | Y523.1 | Może być stosowany do poprawy/uproszczenia połączeń przewodów |
| Pompa próżniowa | Merck Millipore | WP6222050 | Używany do Wykonanie urządzenia ssącego |
Bibliografia
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408(2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587(2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
