Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Summary

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Abstract

Arabidopsis jest zdecydowanie najczęściej używanym gatunkiem roślinnym do badań funkcjonalnych. Sterylizacja powierzchniowa nasion Arabidopsis jest podstawowym krokiem wymaganym w tym celu. Dlatego tak ważne jest opracowanie wysokoprzepustowych metod sterylizacji powierzchni nasion rzodkiewnika, aby poradzić sobie z dziesiątkami do setek próbek (np. linii transgenicznych, ekotypów lub mutantów) jednocześnie. W pracy przedstawiono metodę sterylizacji powierzchni nasion polegającą na skutecznej eliminacji cieczy w probówkach za pomocą domowego urządzenia ssącego zbudowanego ze zwykłej pompy próżniowej. Dzięki radykalnemu skróceniu pracochłonnego czasu pracy przy użyciu tej metody, obsługa kilkuset próbek w ciągu jednego dnia jest możliwa przy niewielkim wysiłku. Analizy przebiegu czasowego serii wykazały ponadto bardzo elastyczny zakres czasowy sterylizacji powierzchni przy utrzymaniu wysokich wskaźników kiełkowania. Metodę tę można łatwo dostosować do sterylizacji powierzchniowej innych rodzajów małych nasion dzięki prostemu dostosowaniu urządzenia ssącego do wielkości nasion i prędkości pożądanej do eliminacji cieczy.

Introduction

Arabidopsis to diploidalny gatunek rośliny należący do rodziny Brassicaceae. Jego stosunkowo krótki cykl życia (dwa miesiące na pokolenie w warunkach uprawy przez długi dzień), mały rozmiar rośliny i samozapylenie z produkcją setek nasion na roślinę sprawiły, że stał się pierwszym podstawowym modelem rośliny^1,2. Ponadto jego genom został w pełni zsekwencjonowany³, dostępne są obszerne narzędzia genetyki odwrotnej (nasycone T-DNA, transpozon i chemicznie zmutagizowane populacje)^4,5,6, a skuteczn....

Protocol

1. Przygotowanie odczynników i pożywek

1. Przygotuj 70% roztwór etanolu: Dodaj 737 ml 95% technicznego etanolu do 263 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj.
   UWAGA: Przygotuj 70% roztwór etanolu na niesterylnym stole roboczym.
   UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalny i może powodować poważne podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od ognia i źródeł ciepła. W przypadku kontaktu z oczami przemyć dużą ilością wody.
2. Przygotuj 5% roztwór wybielacza: Dodaj 5 ml domowego wybielacza (zawierającego ~3,5% podchlorynu sodu, NaClO) do 95 ml sterylnej wody destylowanej. Dodaj kilka kropel niejonowego detergentu (np. Tween 20) i dokładnie wymieszaj.
   ....

Results

Aby ocenić czas potrzebny na całą procedurę sterylizacji nasion, obliczono różnice czasowe dla obchodzenia się z płynem 96 próbek w obecnym protokole i porównano je z tradycyjnymi metodami pipetowania. Wynik wskazuje, że obecny protokół oszczędza czas, skracając czas obsługi cieczy do jednej czwartej czasu w porównaniu z tradycyjnymi protokołami (Tabela 1). W tabeli podkreślono ponadto, że czas usuwania cieczy w obecnym protokole pozwala zaoszczędzić więcej czasu niż w przypadku tradycyjnych metod, przy .......

Discussion

Sterylizacja nasion jest podstawowym krokiem w badaniach funkcjonalnych nad rzodkiewnikiem. Chociaż często przeprowadza się ją w wielu różnych celach, dostępne są ograniczone badania dotyczące wysokoprzepustowej sterylizacji powierzchni nasion u Arabidopsis.

Do tej pory jedną z metod o największej przepustowości jest stosowanie chloru gazowego wytwarzanego przez zmieszanie wybielacza ze skoncentrowanym HCl. Chociaż metoda ta wymaga ograniczonego czasu pracy fizycznej, wykorzystuje gaz wysoce t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zawór akwariowy	Amazon	B074CYC5SD	Kit zawierający 2 zawory i cienkościenne rurki. Zawór zapobiega cofaniu się płynów do sterylnej końcówki
Arabidopsis Col-0 nasiona typu dzikiego	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Nasiona typu dzikiego (wrażliwe na kanamycynę)
Arabidopsis transgeniczna linia Nasiona AdoIspS-79	NA	NA	Linia transgeniczna z nadekspresją genu syntazy izoprenu z Arundo donax przekształconego w tle Col-0, opornego na kanamycynę (Li i in. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583– 2599). Dostępne na życzenie u autorów
Mikrowirówka	Eppendorf	EP022628188	Mikrowirówka stołowa służąca do odkręcania nasion
Murashige & Pożywka Skoog zawierająca witaminy	Duchefa	M0222	Standardowa pożywka do sterylnych kultur roślinnych
Kontroler pipet	Marka	26300	Służy do obsługi pipety serologicznej
Rurka polietylenowa 1	Roth	9591.1	Rurka do podłączenia pompy próżniowej do butelki dekantacyjnej (średnica wewnętrzna: 7 mm; średnica zewnętrzna: 9 mm)
Rurka polietylenowa 2	Roth	9587.1	Rurka do podłączenia butelki dekantacyjnej do zaworu akwariowego  (średnica wewnętrzna: 5 mm; średnica zewnętrzna: 7 mm)
Zakrętka ze złączami	Roth	PY86.1	2-drożna zakrętka dozownika GL45 z polipropylenu do dekantacji butelki
Pipeta serologiczna	Marka	27823	Pipeta serologiczna ze szkła z podziałką (wielokrotnego użytku). Zamiast tego można użyć pipet jednorazowych
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II używany normalnie do homogenizacji tkanek. Bez dodatku koralików do rurek działa jak shaker.
Etanol techniczny	Odczynniki ITW (Nova Chimica Srl)	212800	Etanol 96% v/v częściowo denaturowany klasy technicznej
Tween 20	Merck Millipore	655205	Niejonowy detergent działający jako środek powierzchniowo czynny
Uniwersalne złącza do węży	Roth	Y523.1	Może być stosowany do poprawy/uproszczenia połączeń przewodów
Pompa próżniowa	Merck Millipore	WP6222050	Używany do Wykonanie urządzenia ssącego