Artykuł metodologiczny

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strumień substratu mitochondrialnego jest cechą wyróżniającą każdy typ komórki, a zmiany w jej składnikach, takich jak transportery, kanały czy enzymy, są zaangażowane w patogenezę wielu chorób. Strumień substratu mitochondrialnego można badać przy użyciu nienaruszonych komórek, komórek przepuszczalnych lub izolowanych mitochondriów. Badanie nienaruszonych komórek napotyka na kilka problemów związanych z jednoczesnym utlenianiem różnych substratów. Poza tym kilka typów komórek zawiera wewnętrzne magazyny różnych substratów, które komplikują interpretację wyników. Metody takie jak izolacja mitochondriów lub stosowanie środków przepuszczalnych nie są łatwe do odtworzenia. Izolowanie czystych mitochondriów z nienaruszonymi błonami w wystarczających ilościach z małych próbek jest problematyczne. Stosowanie nieselektywnych permeabilizatorów powoduje różne stopnie nieuniknionego uszkodzenia błony mitochondrialnej. Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) została zaoferowana jako bardziej odpowiedni przepuszczalny permeabilizator, dzięki jego zdolności do selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej bez wpływu na integralność mitochondriów. W połączeniu z respirometrią mikropłytek umożliwia badanie strumienia kilku substratów mitochondrialnych z wystarczającą liczbą powtórzeń w jednym eksperymencie przy użyciu minimalnej liczby komórek. W tej pracy protokół opisuje metodę porównywania strumienia substratów mitochondrialnych dwóch różnych fenotypów komórkowych lub genotypów i może być dostosowany do testowania różnych substratów mitochondrialnych lub inhibitorów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Respirometria oparta na mikropłytkach zrewolucjonizowała badania mitochondrialne, umożliwiając badanie oddychania komórkowego na małej próbie1. Oddychanie komórkowe jest ogólnie uważane za wskaźnik funkcji mitochondriów lub "dysfunkcji", pomimo faktu, że zakres funkcji mitochondriów wykracza poza produkcję energii2. W warunkach tlenowych mitochondria wydobywają energię zmagazynowaną w różnych substratach poprzez rozkład i przekształcanie tych substratów w produkty pośrednie metaboliczne, które mogą napędzać cykl kwasu cytrynowego3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ciągły przepływ substratów jest niezbędny dla przepływu cyklu kwasu cytrynowego w celu wytworzenia wysokoenergetycznych "donorów elektronów", które dostarczają elektrony do łańcucha transportu elektronów, który generuje gradient protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, umożliwiając syntazie ATP fosforylację ADP do ATP4. Dlatego projekt eksperymentalny do oznaczania oddychania mitochondrialnego musi obejmować charakter próbki (nienaruszone komórki, komórki przepuszczalne lub izolowane mitochondria) i substraty mitochondrialne.

Komórki przechowują rodzime substraty5, a mitochondria utleniają jednocześnie kilka typów substratów6, co komplikuje interpretację wyników uzyskanych z eksperymentów przeprowadzonych na nienaruszonych komórkach. Powszechnym podejściem do badania zdolności mitochondriów do utleniania wybranego substratu jest wyizolowanie mitochondriów lub przepuszczalność badanych komórek5. Chociaż izolowane mitochondria są idealne do badań ilościowych, proces izolacji jest pracochłonny. Napotyka trudności techniczne, takie jak potrzeba dużej wielkości próby, czystość plonu i powtarzalność techniki5. Przepuszczalne komórki stanowią rozwiązanie dla wad izolacji mitochondrialnej; Jednak rutynowe środki przepuszczalne o charakterze detergentowym nie są specyficzne i mogą uszkadzać błony mitochondrialne5.

Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) była oferowana jako selektywny środek przepuszczalny błony komórkowej7, i była z powodzeniem stosowana w połączeniu z analizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego w kilku badaniach7,8,9,10. Zmodyfikowaliśmy protokół wykorzystujący rPFO do badania przesiewowego strumienia substratu mitochondrialnego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XFe96. W tym protokole porównano cztery różne szlaki utleniania substratów w dwóch fenotypach komórkowych, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającej liczby powtórzeń i właściwej kontroli dla każdego badanego materiału.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dzień przed testem

  1. Przygotowanie odczynników i substratów.
    1. Roztwór do oznaczania mitochondriów (MAS): Przygotować roztwory podstawowe wszystkich odczynników, jak opisano w Tabeli 1. Podgrzać zapasy mannitolu i sacharozy do temperatury 37 °C do całkowitego rozpuszczenia. Wymieszać odczynniki, aby przygotować 2x MAS, a następnie ogrzać mieszaninę do 37 °C. Dostosować pH za pomocą 5N KOH do 7,4 (~7 mL), następnie dodać wodę, aby zwiększyć objętość do 1 L. Przefiltrować-wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do dnia pomiaru.
    2. Albumina surowicy bydlęcej (5% BSA): Rozpuścić 5 g BSA w 90 ml podgrzanej sterylnej wody na mieszadle magnetycznym i unikać wstrząsania. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5 N KOH, a następnie dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 100 ml. Przefiltrować-wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do dnia pomiaru.
    3. Substraty mitochondrialne: Przygotować 1 M roztwory podstawowe bursztynianu sodu, pirogronianu sodu i glutaminianu sodu w sterylnej wodzie. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy jabłczanu sodu w sterylnej wodzie i użyć wstępnie podgrzanej sterylnej wody do przygotowania 10 mM roztworu podstawowego palmitoilokarinityny. Dostosować pH każdego roztworu do 7,4 na 5 N KOH i przeprowadzić sterylizację filtracyjną. Podłoża przechowywać w temperaturze 2-8 °C. W momencie użycia podgrzej palmitoilokarnitynę do temperatury 37 °C, aby rozpuścić wszelkie osady. Do późniejszego wykorzystania należy przechowywać podwielokrotności wszystkich substratów z wyjątkiem pirogronianu w temperaturze -20 °C.
    4. Inhibitory mitochondrialne: Użyj dimetylosulfotlenku (DMSO) do przygotowania roztworów podstawowych 25 mM oligomycyny, 50 mM 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu karbonylu cyjanku karbonylu (FCCP), 20 mM rotenonu i 20 mM antymycyny A. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  2. Wysiewanie i traktowanie komórek: Jak pokazano w Rysunek 2, zasiej komórki w kolumnach 2-11. Kolumny 1 i 12 muszą pozostać puste, aby służyły jako studzienki tła. W tej pracy wykorzystano komórki HepG2 i A549.
    1. Zasiej komórki o gęstości 20 000 komórek na dołek. Do wysiewu użyj 50-80 μl pożywki do hodowli komórkowych.
    2. Wypełnić ślepe studzienki równą objętością pożywki do hodowli komórkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Pozwól komórkom przyłączyć się przez 3-4 godziny, a następnie dodaj 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do wszystkich studzienek.
    3. Po dodaniu tej ostatniej pożywki zastosować zabieg w kolumnach 7–11. W tej pracy grupa eksperymentalna była traktowana 1 mM chlorowodorkiem metforminy przez 16 godzin, a grupa kontrolna była traktowana równą objętością sterylnej wody destylowanej jako kontrola nośnika.
  3. Nawodnienie czujników: Odpipetować 200 μl sterylnej wody na studzienkę do płytki użytkowej, a następnie ostrożnie włożyć wkład czujnika, zanurzając czujniki w wodzie. Inkubować wkład w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C do następnego dnia.
  4. Wzór protokołu testu: Włączyć analizator (patrz tabela materiałów) i jednostkę sterującą. Uruchom oprogramowanie do sterowania przyrządem i akwizycji danych, a następnie zaprojektuj protokół testu zgodnie z opisem w tabeli 2. W obszarze Definicje grup utwórz cztery strategie wstrzykiwania, w których port A różni się w zależności od wstrzykniętego substratu (Rysunek 3). Nazwij strategie po podłożach lub ich skrótach.
  5. Do portów B, C i D przypisz odpowiednio związki oligomycyny, FCCP i rotenonu/antymycyny A. Utwórz osiem grup i nazwij je tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 4. W obszarze Mapa tablic przypisz grupy do odpowiednich studni, a następnie zapisz protokół jako gotowy do użycia szablon. Pozostaw analizator włączony, aby temperatura ustabilizowała się przez noc. Przechowuj analizator w miejscu o stabilnej temperaturze, aby uniknąć nagłych zmian temperatury.

2. Dzień próby

  1. Wymiana wody na kaliber: Wylej wodę z tabliczki narzędziowej i odpipetuj 200 μl wstępnie podgrzanego kalibru na studzienkę do płytki użytkowej. Włożyć wkład z powrotem do inkubatora wolnego od CO2 do czasu przeprowadzenia testu. Aby uniknąć szybkiego parowania kalibru, utrzymuj źródło wilgoci wewnątrz inkubatora i wyłącz lub zmniejsz prędkość wentylatora do minimum.
  2. Przygotowanie roztworów roboczych: Zacznij od podgrzania 2x MAS, 5% BSA i sterylnej wody do 37 °C. W międzyczasie pozwól zapasom inhibitorów osiągnąć temperaturę pokojową. Użyj ciepłych 2x MAS i sterylnej wody destylowanej, aby przygotować 5 ml stężenia roboczego substratów i inhibitorów, jak opisano w Tabeli 3.
  3. Ładowanie portów iniekcyjnych: Jak pokazano na Rysunek 3, załaduj 20 μl substratów do portu A. Załaduj mieszaninę bursztynianu/rotenonu do portu A w wierszach A i B. Załaduj mieszaninę pirogronianu/jabłczanu do portu A w wierszach C i D. Załaduj mieszaninę glutaminianu/jabłczanu do portu A w wierszach E i F. Załaduj mieszaninę palmitoilokarnityny/jabłczanu do portu A w wierszach G i H. Na całą płytkę załaduj port B 22 μl preparatu oligomycyny, port C 25 μl preparatu FCCP, a port D 27 μl mieszaniny rotenonu/antymycyny A.
  4. Rozpoczęcie etapu kalibracji: Na karcie Uruchom test kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć test. Włóż załadowany wkład czujnika i rozpocznij etap kalibracji. Poczekaj na zakończenie kalibracji przed przejściem do następnego kroku.
  5. Przygotowanie pożywki testowej (MAS-BSA-rPFO): Aby przygotować 20 ml pożywki testowej, wymieszaj 10 ml 2x MAS, 9,2 ml sterylnej wody i 0,8 ml 5% BSA w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 2 μl 10 μM rPFO do uzyskania stężenia 1 nM i ponownie zawiesić mieszaninę za pomocą delikatnego pipetowania. Unikaj wstrząsania i nie używaj miksera wirowego do mieszania. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C aż do momentu użycia.
  6. Mycie komórek: Umyj komórki i puste studzienki ślepej próby dwukrotnie wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez wapnia i magnezu za pomocą pipety wielokanałowej. Należy unikać ponownego użycia tych samych końcówek w celu odrzucenia pożywki do hodowli komórkowych i dodania PBS. Wykonaj ten krok poza przepływem laminarnym, aby chronić komórki przed wysychaniem przez przepływ powietrza.
  7. Przepuszczalność komórek w pożywce testowej: Za pomocą pipety wielokanałowej wyrzuć PBS i zastąp go 180 μl wstępnie podgrzanego podłoża testowego (MAS-BSA-rPFO).
  8. Rozpoczęcie pomiaru: Natychmiast po przepuszczalności należy wymienić tabliczkę użytkową skalibrowanego wkładu czujnika na płytkę ogniwa i rozpocząć pomiar.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od znormalizowania wyników do drugiego pomiaru wyjściowego oddechu, aby pokazać wartości jako procent zużycia tlenu (OCR%). Wyniki testu są pokazane w Rysunki 5, Rysunek 6, Rysunek 7 i Rysunek 8. Ważne jest, aby przypisać odpowiednie dołki tła dla każdej grupy i dezaktywować źródła tła innych grup. Rysunek 5 pokazuje, że grupa leczona ma wyższy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest modyfikacją wcześniej opublikowanych badań 7,8,9,10 oraz podręcznika użytkownika produktu. W przeciwieństwie do protokołu producenta, zamiast 3x MAS stosuje się 2x MAS, ponieważ 2× MAS jest łatwiejszy do rozpuszczenia i nie tworzy osadów po zamrożeniu. Zamrożone 2 porcje MAS mogą być przechowywane do sześciu miesięcy i wykazują spójne wyniki. Kolejną różnicą jest uwzględnienie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują pracownikom Zakładu Fizjologii na Wydziale Lekarskim w Hradcu Králové oraz Zakładu Patofizjologii Trzeciego Wydziału Lekarskiego za pomoc w przygotowaniu chemikaliów i próbek. Prace te były wspierane przez programy grantowe Uniwersytetu Karola PROGRES Q40/02, grant czeskiego Ministerstwa Zdrowia NU21-01-00259, grant Czeskiej Fundacji Nauki 18-10144 oraz projekt INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej oraz przez Unię Europejską.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól monopotasowa adenozyny 5′ -difosforan dwuwodnyMerckA5285przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Antymycyna AMerck A8674sklep pod -20 & deg; C
Albumina surowicy bydlęcejMerckA3803przechowywać w 2 - 8 & deg; C
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonyluMerckC2920przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
DimetylosulfotlenekMerckD8418sklep w RT
D-MannitolMerck63559sklep w RT
Dulbecco's sól fizjologiczna buforowana fosforanemGibco14190-144sklep w RT
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylo)-N,N,N′,N′-tetraoctowyMerck03777sklep w RT
HEPESMerckH7523przechowywać w RT
Sól disodowa kwasu L(-)jabłkowegoMerckM9138przechowywać w RT
Kwas L-glutaminowy sól sodowa hydrat MerckG5889przechowywać w RT
Sześciowodny chlorek magnezuMerckM2670przechowywać w RT
OligomycynaMerckO4876przechowywać w -20 ° C
Chlorek palmitoilo-DL-karnitynyMerckP4509przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Wodorotlenek potasuMerck484016przechowywać w RT
Fosforan potasu jednozasadowyMerckP5655przechowywać w RT
RotenonMerckR8875przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Oprogramowanie komputerowe Seahorse WaveTechnologiePobierz z www.agilent.com
Seahorse XFe96 AnalyzerTechnologie
Agilent Seahorse XFe96 FluxPakAgilent technologies102416-100Wkłady z czujnikiem XFe96 i mikropłytki do hodowli komórkowych XF96
Pirogronian soduMerckP2256przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni; C
Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodnyMerckS2378sklep w RT
SacharozaMerckS7903sklep w RT
WaterMerckW3500sklep w RT
XF calibrantAgilent technologies100840-000sklep w RT
XF Permeabilizer błony plazmatycznejAgilent technologies102504-100Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) - Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; Z
Agilent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Permeabilizacja perfringolizyn Opermeabilizacja kom rekanalizator Seahorse XFrespirometria w mikrop ytkachoddychanie mitochondrialneoddychanie indukowane substratemleczenie metforminkom rki A549

Powiązane artykuły