In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Monitorowanie in vivo komórek elektroaktywnych, takich jak neurony i kardiomiocyty, stanowi ważne i skuteczne podejście w podstawowych zastosowaniach badawczych dla ludzkiego mózgu, badaniach nad łącznościami funkcjonalnymi, farmakologii i toksykologii. Narzędzia zwykle stosowane do takich badań opierają się głównie na matrycach mikroelektrod (MEAs)^1,2,3,4,5 oraz coraz bardziej wydajne i potężne urządzenia polowe (FED)^{6,7,8,9,10,11,12}. Te dwie rodziny urządzeń umożliwiają monitorowanie i stymulację aktywności elektrycznej neuronów i kardiomiocytów w czasie rzeczywistym i zwykle charakteryzują się solidnością, łatwością obsługi i niezawodnością. Te cechy sprawiają, że MEA i FED są złotym standardem dla zastosowań elektrofizjologicznych, obecnie wykorzystywanym do łączenia ze standardowymi kulturami komórkowymi, organotypowymi wycinkami mózgu i trójwymiarowymi organoidami^13,14,15,16. Pomimo ich powszechnego zastosowania i imponujących cech, MEA i FED mają pewne ograniczenia, takie jak wysoki koszt, sztywność materiałów i obecność zwykle nieporęcznej elektrody referencyjnej, która musi być umieszczona w środowisku cieczy pomiarowej i jest niezbędna do prawidłowego działania urządzeń.

Aby zbadać alternatywne rozwiązania dla komunikacji komórkowej, w ciągu ostatniej dekady włożono wiele wysiłku w badania nad urządzeniami elektronicznymi opartymi na materiałach organicznych i innowacyjnych technikach produkcji¹⁷. Wśród kilku urządzeń organicznych badanych w celu rozwiązania wyżej wymienionych ograniczeń, osobliwy tranzystor organiczny o nazwie OCMFET został niedawno zaproponowany jako ważna alternatywa dla MEA i FEDs¹⁸. Oprócz standardowych funkcji oferowanych przez technologię elektroniki organicznej, takich jak tanie materiały i techniki wytwarzania, optymalne właściwości mechaniczne i chemiczne, przezroczystość optyczna i biokompatybilność, OCMFET oferuje również bardzo wysoką czułość ładowania (ze względu na podwójnie bramkowaną strukturę) bez konieczności stosowania zewnętrznej elektrody referencyjnej. Co więcej, ten organiczny czujnik ma niezwykłą zdolność wykrywania różnych parametrów analitowych/fizycznych, w zależności od specyficznej funkcjonalności jego obszaru wykrywania, który jest oddzielony od obszaru tranzystora^19,20. Wszystkie te cechy można wygodnie wykorzystać do pozyskiwania różnych parametrów w kulturze komórkowej. W szczególności, oprócz możliwości wykrycia aktywności elektrycznej neuronów/serca, możliwe jest również wykorzystanie ultra-wysokiej czułości pH oferowanej przez osobliwą podwójnie bramkowaną strukturę OCMFET za pomocą prostej funkcjonalnej fizycznej funkcjonalności²¹ w celu niezawodnego monitorowania niewielkich lokalnych zmian pH spowodowanych komórkową aktywnością metaboliczną.

W biosensoryce in vitro monitorowanie aktywności metabolicznej komórek jest potężnym wskaźnikiem stanu kultury i może być używane do oceny odpowiedzi komórkowej na różne bodźce, takie jak podawanie leków i stymulacja elektryczna^22,23. Ponadto, w specyficznym przypadku zastosowań neuronowych, monitorowanie zarówno aktywności elektrycznej, jak i metabolicznej jest bardzo interesujące, szczególnie w farmakologii i toksykologii²⁴. Z zamiarem wygodnego sprostania wymaganiom nowoczesnej elektrofizjologii in vitro, przy jednoczesnym zaoferowaniu wszystkich zalet OCMFET, niedawno wprowadzono urządzenie o nazwie Micro OCMFET Array (MOA). MOA to matryca oparta na OCMFET ze specjalistycznymi obszarami detekcji specjalnie zaprojektowanymi do łączenia komórkowego in vitro, umożliwiająca wieloparametryczną analizę elektrogenicznych kultur komórkowych. W szczególności dwa kanały MOA mają większe obszary wykrywania, aby zmaksymalizować ich czułość i mogą być selektywnie funkcjonalizowane w celu monitorowania określonych parametrów zainteresowania, takich jak zmiany pH pożywki hodowlanej. Pozostałe tranzystory OCMFET w strukturze działają jako zewnątrzkomórkowe czujniki aktywności elektrycznej. Rysunek 1 pokazuje strukturę 16-kanałowego MOA. Ta zdolność, w połączeniu z brakiem zewnętrznej elektrody referencyjnej, sprawia, że MOA jest bardzo interesującym narzędziem do zastosowań in vitro. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół wytwarzania wieloczujnikowego MOA do wykrywania in vitro aktywności elektrycznej i metabolicznej neuronów i kardiomiocytów. Rysunek 2 pokazuje główne etapy produkcji, użyte materiały i strukturę urządzenia.

Wszystkie obowiązujące międzynarodowe, krajowe i/lub instytucjonalne wytyczne dotyczące opieki i użytkowania zwierząt były przestrzegane. Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę zwierząt na potrzeby projektu i zminimalizować ich cierpienie.

1. Przygotowanie roztworu rozwijającego, roztworów trawiących, roztworu półprzewodników organicznych i masek fotolitograficznych

1. Przygotować roztwór rozwijający, rozcieńczając granulki NaOH w wodzie dejonizowanej o stężeniu 175 mM.
   UWAGA: Jest to reakcja egzotermiczna. Jeśli używany jest plastikowy pojemnik, mieszaj pojemnik, aż wszystkie granulki całkowicie się rozpuszczą.
2. Przygotuj roztwór do trawienia tytanu, rozcieńczając kwas fluorowodorowy (HF) w wodzie dejonizowanej (1 część stężonej 48% HF, 49 części wody dejonizowanej).
   UWAGA: Kwas fluorowodorowy może łatwo przenikać przez skórę, powodując poważne uszkodzenia głębokich warstw tkanek. Szybka neutralizacja HF jest konieczna, aby zapobiec niszczeniu tkanek, które może trwać przez kilka dni i skutkować poważnymi obrażeniami, a nawet śmiercią. Ryzyko związane z niewydolnością serca zależy od stężenia i czasu kontaktu z kwasem. Używać tylko pod wyciągiem za pomocą osłony twarzy. Zdecydowanie zaleca się również stosowanie podwójnych rękawic.
3. Przygotuj roztwór do wytrawiania złota, mieszając jod, jodek potasu i wodę dejonizowaną (na 250 g roztworu użyj 200 ml wody dejonizowanej, 20 g KI, 5 g I₂). Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i pozostaw na noc przed użyciem.
4. Przygotować roztwór półprzewodnikowy, rozpuszczając 6,13-bis(triizopropyloetynylo) pentacen (TIPS Pentacene) w anizolu (1% wagowo) i delikatnie mieszając przez 2 godziny na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C.
   UWAGA: Kontynuuj mieszanie tego roztworu. Używaj fiolek ze szkła oranżowego i/lub przechowuj je w warunkach słabego oświetlenia.
5. Przygotuj żądany zestaw masek fotolitograficznych za pomocą oprogramowania do grafiki wektorowej. Przygotuj 5 masek na cały proces: maskę do wzorowania pływających bramek (FG); maskę do otwierania przelotek i obszarów wykrywania dla zapisów elektrofizjologicznych; maska do procesu samowyrównania; maska do wzorowania górnego styku źródła, odpływu i bramki sterującej; oraz maska do aktywacji kanałów pH przez plazmę.
   UWAGA: W zależności od wymaganej rozdzielczości i konkretnego układu fotolitograficznego można stosować różne rodzaje masek. W przypadku proponowanych urządzeń (które mają maksymalną rozdzielczość boczną 40 μm) proste plastikowe elastyczne maski zostały zakupione w lokalnym punkcie ksero.

2. Wybór i przygotowanie podłoża

1. Wytnij kwadrat o wymiarach 6 x 6^cm2 z politereftalanu etylenu (PET) o wymiarach 250 μm z nieskazitelnego arkusza PET.
   UWAGA: Zacznij od nieco większego podłoża niż końcowe urządzenie, aby mieć wystarczająco szerokie marginesy, aby umożliwić manipulację standardową pęsetą laboratoryjną bez jej uszkodzenia.
2. Sprawdź podłoże za pomocą mikroskopu optycznego, aby wykluczyć obecność głębokich rowków i zadrapań. Starannie dobieraj mniej porysowane podłoża, ponieważ większe niedoskonałości mogą doprowadzić do awarii końcowego urządzenia.
3. Podłoża PET należy spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną (w tej kolejności) i wysuszyć za pomocą strumieni azotu. Przechowuj podłoża w czystych plastikowych szalkach/pojemnikach Petriego.

3. FG: osadzanie tytanu

1. Wstępnie oczyść podłoża tlenem plazmowym (30 s przy 100 W) i umieść je na uchwycie substratu w komorze próżniowej parownika termicznego.
2. Umieścić 60 mg tytanu w tyglu, zamknąć przesłonę i pompować w dół komory parowania, aż osiągnie poziom próżni niższy niż ^10-6 Torr. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zaświeci się na czerwono i odczekaj 30 sekund. Otwórz migawkę, zwiększ moc do 60% (lub do momentu, gdy tygiel zacznie świecić na jasnobiało) i poczekaj 60 sekund. Zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie.
3. Usunąć substraty z parownika, oczyścić je acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie wysuszyć za pomocą strumieni azotu. Wykonaj drugą obróbkę plazmą tlenową (60 s przy 200 W), aby lekko utlenić powierzchnię tytanu.

4. Wzór FG

1. Umieszczać po jednym substracie na powlekarkę wirową umieszczoną w dygestorium. Umieść 4 ml fotorezystu na podłożu za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 2 μm, należy użyć następujących parametrów powłoki wirowej: prędkość wirowania: 3000 obr./min; czas wirowania: 45 s; czas przyspieszenia: 0,5 s; Czas hamowania: 0,5 s.
2. Fotorezystor upiecz na miękko, umieszczając podłoże na płycie grzejnej (70 °C przez 5 min). Przechowuj podłoże w owiniętej folią aluminiową szalce Petriego/plastikowym pojemniku, aby uniknąć bezpośredniego narażenia na światło.
   UWAGA: Unikaj sugerowanej temperatury pieczenia (100 °C przez 50 s), aby zapobiec deformacji podłoża. Jednak pieczenie w niższej temperaturze przez dłuższy czas zapewnia dobre rezultaty.
3. Umieść urządzenie w bromografie i umieść plastikową maskę fotolitograficzną z pożądanym układem FG na podłożu. Wystaw się na działanie światła ultrafioletowego (UV) od góry przez 1 minutę i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.
4. Zanurz podłoże na 5 s w szklanym pojemniku wypełnionym roztworem rozwijającym (krok 1.1). Szybko opłucz go w wodzie dejonizowanej i wysusz pod azotem. Użyj mikroskopu optycznego, aby poszukać słabo rozwiniętych/nadmiernie rozwiniętych miejsc w podłożu. Powtórzyć zanurzenie podłoża w roztworze rozwijającym w przypadku niedorozwoju.
5. Wytrawić odsłonięty tytan, zanurzając go w roztworze do wytrawiania tytanu (krok 1.2) na 15 s, spłukać wodą dejonizowaną i wysuszyć azotem. Sprawdź optycznie podłoże i usuń fotorezystor za pomocą acetonu. Podłoże spłukać alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie osuszyć azotem.

5. Osadzanie dielektryka bramki

1. Przygotować komorę osadzania powlekarki Parylene, rozprowadzając 2 ml promotora adhezji (metakrylan silanu - 3-(trimetysylilo)propylu)) na ściankach komory osadzania za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Umieścić 300 mg dimeru Parylene C (odpowiadającego końcowej grubości 150 nm) na powlekarce Parylene. Ustaw dolną wartość ciśnienia na 7 mbar, a wyższą wartość ciśnienia na 10 mbar. Po osadzeniu podłoża należy oczyścić acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną, a następnie osuszyć azotem.

6. Otwarcie obszarów detekcyjnych OCMFET do rejestracji aktywności elektrycznej i tworzenia przelotek w celu uzyskania dostępu do tylnej części FG

1. Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.
2. Umieść urządzenie w bromografie i umieść plastikową maskę fotolitograficzną na podłożu dla przelotek (okrągłe otwory o średnicy 50 μm nad obszarami wykrywania i 100 x 100 μm² otwory nad FG z dala od obszarów wykrywania (określane jako kontakt wsteczny FG w Rysunek 1 i Rysunek 2)) pod mikroskopem stereoskopowym w celu poprawy precyzji wyrównania. Wystaw maskę na działanie promieniowania UV od góry przez 1 minutę i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jej zarysowania.
   UWAGA: Przelotki po stronie FG z dala od obszaru wykrywania (pokazane jako kontakt wsteczny FG w Rysunek 1 i Rysunek 2) są niezbędne do kontaktu podczas charakteryzowania tranzystora. Co więcej, dostęp elektryczny do FG może być bardzo przydatny dla różnych rodzajów funkcjonalizacji (np. elektroosadzania).
3. Wywołaj fotorezystor zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.4. Wystaw podłoże za pomocą wzorzystego fotorezystu (który działa tutaj jak maska) na działanie plazmy tlenowej (180 s przy 200 W), aby usunąć Parylen C z obszarów wykrywania.
   UWAGA: Szybkość wytrawiania parylenu C w izotropowym myjce plazmowej o mocy 200 W wynosi około 90 nm/min. Wykonuje się lekkie przetrawienie w celu dalszego oczyszczenia obszarów wykrywania. Fotorezystor jest również trawiony podczas tego procesu. Jednak jego grubość (2 μm) jest znacznie wyższa niż Parylene C.
4. Umieść podłoża w szklanym pojemniku wypełnionym acetonem w kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby całkowicie usunąć fotorezyst. Podłoża spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą i osuszyć azotem.
   UWAGA: Stosowanie sonikacji zamiast zwykłego spłukiwania podłoży acetonem ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia niepożądanemu fałdowaniu i ponownemu osadzaniu się fragmentów parylenu C na powierzchni obszarów wykrywania.

7. Samoczynne wyrównanie źródła i odpływu za pomocą FG

1. Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2. Umieść urządzenie w bromografie i umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z prostymi czarnymi prostokątami, które całkowicie zakrywają obszary tranzystora. Wystaw maskę na działanie promieniowania UV przez 1 minutę zarówno od góry, jak i od dołu i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jej zarysowania.
   UWAGA: W przypadku dwustronnej ekspozycji FG działają jak maski fotolitograficzne w odniesieniu do dolnej ekspozycji, podczas gdy obecność górnej maski zapewnia, że tylko fotorezyst obecny na kanale tranzystorów pozostaje nienaświetlony.
2. Wywołaj fotorezystor zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 4.4.

8. Osadzanie złota, tworzenie kanałów i wzorowanie źródeł, drenów i bramek kontrolnych

1. Oczyść podłoża delikatną obróbką plazmową (30 s przy 30 W), aby zwiększyć przyczepność metalu do Parylenu C i umieść je na uchwycie podłoża wewnątrz komory próżniowej parownika termicznego.
2. Umieść 30 mg złota w tyglu, zamknij żaluzję i pompuj w dół komorę parowania, aż osiągnie ^10-5 Torr. Zwiększ moc parownika, aż tygiel zaświeci się na czerwono i odczekaj 30 sekund. Otwórz migawkę, zwiększ moc do 40% (lub do momentu, gdy tygiel zacznie świecić na jasnobiało), odczekaj 60 sekund, zamknij migawkę i zmniejsz zasilanie.
3. Umieść podłoża w pojemniku z acetonem wewnątrz kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby oderwać fotorezystor, usuwając w ten sposób złoto z kanału tranzystorów. Podłoża spłukać acetonem, alkoholem izopropylowym i wodą i osuszyć azotem. Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.
4. Umieść urządzenie w bromografie i umieść na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z żądanymi źródłami, drenami i układem bramek sterujących. Wystaw na działanie światła UV przez 1 minutę od góry i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.
5. Wywołaj fotorezystor zgodnie z opisem w kroku 4.4. Wytrawić odsłonięte złoto, zanurzając je w roztworze do wytrawiania złota (krok 1.3) na 10 s, spłucz je wodą dejonizowaną i wysusz azotem. Sprawdź optycznie podłoże i usuń fotorezystor za pomocą acetonu. Spłucz alkoholem izopropylowym i wodą dejonizowaną i osusz azotem.

9. Osadzanie i aktywacja Parylenu C do pomiaru pH

1. Umieść fotorezystor na podłożach, stosując te same parametry, co w krokach 4.1 i 4.2.
2. Umieścić urządzenie w bromografie i umieścić na podłożu plastikową maskę fotolitograficzną z otworami odpowiadającymi obszarom wykrywania pH przez OCMFET. Wystaw na działanie światła UV przez 1 minutę od góry i ostrożnie zdejmij maskę, uważając, aby zminimalizować boczne ruchy maski po podłożu, aby uniknąć jego zarysowania.
3. Wywołaj fotorezystor zgodnie z opisem w kroku 4.4. Całe urządzenie, z wyjątkiem obszarów wykrywających pH, należy zabezpieczyć poliimidową taśmą izolacyjną (patrz Tabela materiałów). Na podłożu nanieść warstwę 500 nm parylenu C (co odpowiada 1 g dimera parylenu C) przy użyciu tych samych parametrów, które opisano w kroku 5.1.
   UWAGA: Całkowita grubość Parylenu C w obszarach wyczuwających pH wynosi 650 nm. Do tego osadzania nie jest wymagany silan.
4. Ostrożnie usuń poliamidową taśmę izolacyjną. Wystaw substrat na działanie plazmy tlenowej (5 min i 30 s przy 200 W), aby aktywować Parylen C w obszarach wyczuwających pH OCMFETs.
   UWAGA: Poliimidowa taśma izolacyjna jest tutaj niezbędna, aby ograniczyć osadzanie się Parylenu C. W rzeczywistości proste uniesienie za pomocą fotorezystu nie daje pozytywnych rezultatów ze względu na prawie bezotworowy charakter powłoki konforemnej uzyskanej za pomocą Parylenu C.
5. Umieść podłoża w pojemniku z acetonem wewnątrz kąpieli ultradźwiękowej na 10 s, aby całkowicie usunąć fotorezyst. Podłoża spłukać acetonem i alkoholem izopropylowym (bez wody) i osuszyć azotem.

10. Osadzanie półprzewodników, umieszczanie w komorze hodowlanej i ostateczne wycinanie urządzenia z PET

1. Umieścić podłoża na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C. Odleć kroplę (1 μl) roztworu półprzewodnikowego (krok 1.4) na każdy obszar kanału, przykryć całe podłoże pokrywką i pozostawić do wyschnięcia pod kapturem chemicznym na 30 minut.
2. Przygotuj komorę hodowlaną, drukując za pomocą drukarki 3D pierścień akrylonitryl-butadien-styren o promieniu wewnętrznym 15 mm, grubości 1 mm i wysokości 7 mm. Przykleić komorę hodowlaną do środkowej części podłoża za pomocą polidimetylosiloksanu (stosunek utwardzacza: 15% wagowo). Wytnij urządzenie z PET ręcznie lub za pomocą wycinarki laserowej.

11. Charakterystyka elektryczna tranzystorów

1. Scharakteryzuj każdy tranzystor za pomocą miernika źródłowego^18,19,20,21 (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Zarówno charakterystyka wyjściowa, jak i wejściowa powinny być mierzone w celu ekstrapolacji parametrów tranzystorów (głównie ruchliwość nośników, napięcie progowe, stosunek I_{ON/I OFF} oraz nachylenie podprogowe).

Potencjał MOA został tutaj zweryfikowany zarówno do rejestracji aktywności elektrycznej, jak i monitorowania aktywności metabolicznej. Dokładna ocena zdolności urządzenia do wykrywania zewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych opierała się na dokładnej charakterystyce kultur kardiomiocytów szczurów (szczególnie w pierwotnych kardiomiocytach szczurów mierzonych po 8 dniach in vitro [DIV])18. Rysunek 3A pokazuje kompletny MOA z 16 OCMFETami. Górna wstawka przedstawia przykład zlewającej się hodowli kardiomiocytów szczura przylegającej do powierzchni MOA. Aby podkreślić ich zdrowie, komórki zostały wybarwione immunologicznie pod kątem białka sarkomerycznego, tropomiozyny, po sesji nagraniowej. Dolna wstawka pokazuje pojedynczy sygnał kardiomiocytów mierzony za pomocą OCMFET.

Interesujące, urządzenie mogło wykryć spontaniczną aktywność elektryczną oraz aktywność wywołaną po podaniu różnych substancji chemicznych, jak pokazano na Rysunek 3B. Walidacja ta miała kluczowe znaczenie dla wykazania wykonalności zastosowania tego podejścia do łączenia ogniw elektrogenicznych. Ze względu na konfigurację matrycy, MOA pozwolił również na rekonstrukcję prędkości propagacji sygnału sercowego, demonstrując w ten sposób przydatność systemu do badania sieci komórkowych (Rysunek 3C). W celu dalszej walidacji w celu określenia rzeczywistej granicy wykrywalności urządzenia, MOA został również przetestowany z neuronami prążkowia (21 DIV)18, uzyskując interesujące wyniki pod względem amplitudy sygnału i wiarygodności nagrań. Jak widać na Rysunek 3D, OCMFET może wzmacniać potencjały pola neuronalnego z niezwykłą stabilnością, wykazując stosunek sygnału do szumu (SNRS) do 3,2 (w tym samym zakresie, co SNR uzyskane za pomocą standardowych MEAs25). Konfiguracja nagrywania składała się z niestandardowej wielokanałowej elektroniki do polaryzacji tranzystora oraz odczytu i kondycjonowania sygnału. Każdy kanał do zapisu elektrycznego ma pierwszy stopień składający się z przetwornika I/V z rezystorem sprzężenia zwrotnego 1 MΩ i filtrem pasmowo-przepustowym 150 Hz-1,3 kHz o wzmocnieniu napięciowym 110. Dla wszystkich prezentowanych pomiarów tranzystory były polaryzowane z VDS = VGS = -1 V. Konwersja A/D oraz wizualizacja i zapis danych zostały przeprowadzone za pomocą karty akwizycji danych (patrz Tabela Materiałów). Wszystkie sesje pomiarowe zostały przeprowadzone w klatce Faradaya, aby zminimalizować hałas elektryczny i środowiskowy w systemie.

Jak wcześniej wspomniano, wykorzystując prostą fizyczną funkcjonalność przedstawioną w protokole, możliwe było przygotowanie bardzo czułych czujników pH z supernernstiańską reakcją. Ze względu na przedstawione podejście do produkcji, te urządzenia pH mogą być zintegrowane z MOA i używane do monitorowania niewielkich zmian pH indukowanych przez aktywność metaboliczną pierwotnych neuronów hipokampa szczura26. W szczególności, jak pokazano na Rysunek 4, tylko jeden z dwóch OCMFET dedykowanych do wykrywania niskich częstotliwości został selektywnie funkcjonalizowany, aby zademonstrować wykonalność tego podejścia. Ta selektywna funkcjonalizacja pozwoliła na ocenę odpowiedzi dwóch OCMFET na chemicznie indukowane zmiany metaboliczne: w szczególności wysoki stan metaboliczny można uzyskać przy użyciu bicukuliny (BIC), inhibitora receptorów GABA A27, podczas gdy niski stan metaboliczny może być wywołany przez dodanie tetrodotoksyny (TTX), która ostatecznie powoduje śmierć komórkową28. Konfiguracja nagrywania składała się z tej samej niestandardowej wielokanałowej elektroniki, która była używana do elektronicznych pomiarów aktywności.

W przeciwieństwie do poprzedniego przypadku, dwa dedykowane kanały zostały użyte do rejestrowania powolnych zmian wywołanych przez komórkową aktywność metaboliczną. Każdy kanał składał się z prostego obwodu złożonego z dwóch głównych bloków: przetwornicy I/V z rezystorem sprzężenia zwrotnego 1 MΩ i filtrem dolnoprzepustowym o częstotliwości odcięcia 10 Hz. Tranzystory były spolaryzowane z VDS = VGS = -1 V, a wszystkie pomiary zostały przeprowadzone wewnątrz klatki Faradaya, aby zminimalizować wpływ szumów zewnętrznych na nagrania (jest to szczególnie ważny aspekt biorąc pod uwagę niskie wahania prądu indukowane komórkową aktywnością metaboliczną). Podczas eksperymentów kultury utrzymywano w pożywce hodowlanej o niskim buforze, a cały system umieszczono w kontrolowanym środowisku (37 °C i ciągły strumień CO2 / powietrze). Zgodnie z oczekiwaniami, tylko prąd wrażliwego na pH OCMFET mógł być modulowany przez dodanie 25 μM BIC. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez indukcję obecnej zmienności przez odpowiadającą jej zmianę komórkowej aktywności metabolicznej.

Ten sam eksperyment został powtórzony po dodaniu 10 μM TTX, co spowodowało stopniowe spowolnienie metabolizmu komórkowego. Po dodaniu TTX ani OCMFET wrażliwy na pH, ani niewrażliwy na pH nie wykazały żadnej odpowiedzi, co dowodzi skuteczności tego podejścia. Wyniki te wskazują na skuteczność proponowanej funkcjonalizacji i jej względną stabilność do 2 tygodni. Ważnym wnioskiem, który można wyciągnąć z proponowanych eksperymentów (zarówno aktywności elektrycznej, jak i aktywności metabolicznej) jest to, że możliwe jest przygotowanie różnych rodzajów czujników poprzez selektywną funkcjonalizację różnych OCMFET w tym samym obszarze hodowli. Ten aspekt stanowi nietrywialne osiągnięcie w dziedzinie biodetekcji do zastosowań komórkowych, ponieważ możliwość monitorowania różnych parametrów w tej samej hodowli komórkowej ma kluczowe znaczenie dla lepszego scharakteryzowania złożoności tych systemów biologicznych.

Rysunek 1: Widok z góry na 16-kanałowy MOA do metabolicznego i elektrycznego monitorowania komórek elektroaktywnych. Podziałka = 1 cm. Skróty: OCMFET = organiczne tranzystory polowe z modulacją ładunku; FG = brama pływająca; S/D = źródło/odpływ; MOA = mikro tablica OCMFET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Główne etapy produkcji MOA do metabolicznego i elektrycznego monitorowania komórek elektroaktywnych. (A i B) Odparowana folia Ti jest modelowana przy użyciu standardowego procesu fotolitograficznego w celu przygotowania pływającej bramki OCMFET. C) Depozycja 15 nm parylenu C. Warstwa ta, wraz z natywnym tlenkiem Ti, działa jak dielektryk bramki tranzystorów. (D i E) Warstwa Parylenu C jest wzorowana za pomocą plazmowej obróbki tlenowej. Wzorzysta warstwa fotorezystu służy do selektywnego naświetlania obszarów detekcji nagrań elektrycznych i styków zwrotnych bramki pływającej. (F) Wzór górnych styków Au, a mianowicie źródła, drenu, bramki sterującej i styku zwrotnego bramki pływającej. Technika samonastawności służy do poprawy wydajności elektrycznej urządzenia. (G-I) Osadzanie drugiej warstwy parylenu C na obszarze wykrywania OCMFET w celu monitorowania aktywności metabolicznej. Po ekspozycji na plazmę tlenową warstwa ta będzie działać jak membrana wrażliwa na pH (J). (K) Przekrój poprzeczny kompletnego MOA (z materiałami) po osadzeniu półprzewodnika organicznego (TIPS Pentacene) i ustawieniu komory hodowlanej. Skróty: OCMFET = organiczne tranzystory polowe z modulacją ładunku; FG = brama pływająca; S/D = źródło/odpływ; MOA = mikro tablica OCMFET; CG = bramka sterująca; PET = politereftalan etylenu; Par C = Parylen C; KOŃCÓWKI = pentacen 6,13-bis(triizopropylosilyloetynylu); ABS = akrylonitryl-butadien-styren. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zapisy aktywności elektrycznej komórek za pomocą MOA. (A) Zlewająca się hodowla kardiomiocytów szczurów (8 DIV) przylegających do powierzchni MOA, utrwalona po sesji nagraniowej i immunologicznie wybarwiona dla białka sarkomerycznego, tropomiozyny (górna wstawka). Dolna wstawka: przykład pojedynczego sygnału kardiomiocytów mierzonego za pomocą OCMFET. Podziałka = 150 μm. (B) Chemiczne dostrojenie aktywności elektrycznej kultury kardiomiocytów. Przyspieszenie aktywności wynikało z dodania 100 mM noradrenaliny, natomiast supresja wynikała z dodania 100 mM werapamilu. Po lewej: modulacja częstotliwości dudnienia; po prawej: statystyki dotyczące 5 OCMFET - średnia i odchylenie standardowe: liczba skoków w ciągu 4 minut aktywności podstawowej (129 ± 4,6), noradrenaliny (280 ± 28,6) i werapamilu (15 ± 1,9). (C) Rekonstrukcja propagacji sygnału sercowego. Po prawej: wykres rastrowy spontanicznej aktywności kultury wskazujący na propagację sygnału ze stanowiska 14 do stanowiska 41 (po prawej). (D) Potencjały czynnościowe komórek prążkowia z zarodka szczura (21 DIV). Ten rysunek został zmodyfikowany z 18. Skróty: OCMFET = organiczny tranzystor polowy z modulacją ładunku; MOA = mikro tablica OCMFET; NE = noradrenalina; VER = werapamil; DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zapisy aktywności metabolicznej z MOA. Reakcja kanałów MOA wrażliwych na pH (A) i niewrażliwych na pH (B) niewrażliwych na pH na dodanie 25 μM BIC przed i po dodaniu 10 μM TTX. Po dodaniu TTX zachowanie kanału wrażliwego na pH staje się podobne do kanału niewrażliwego na pH. W szczególności nie można zaobserwować żadnej bieżącej zmienności po dodaniu BIC z powodu śmierci komórkowej wywołanej przez TTX. (C) MOA do rejestracji aktywności metabolicznej. Tranzystory OCMFET wrażliwe i niewrażliwe na pH są zaznaczone odpowiednio na zielono i czerwono. Wstawka: zdrowe neurony hipokampa wyhodowane na urządzeniu po 15 DIV. Pasek skali = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z 26. Skróty: OCMFET = organiczny tranzystor polowy z modulacją ładunku; MOA = mikro tablica OCMFET; BIC = bicuculline; TTX = tetrodotoksyna; DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.