Method Article

Opracowanie modelu kohodowli komórek w celu naśladowania niedokrwienia/reperfuzji serca in vitro

DOI:

10.3791/62913

⸱

October 13th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dystans przestrzenny jest kluczowym parametrem w ocenie uszkodzenia spowodowanego niedotlenieniem/reoksygenacją w modelu kokulturowym oddzielnych warstw komórek śródbłonka i kardiomiocytów, sugerując po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego wspólnej hodowli jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli komórek śródbłonka w ochronie kardiomiocytów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie. Reperfuzja powoduje dodatkowe obrażenia poza niedokrwieniem. Komórki śródbłonka (EC) mogą chronić kardiomiocyty (CM) przed uszkodzeniem reperfuzyjnym w wyniku interakcji komórka-komórka. Kohodowle mogą pomóc w zbadaniu roli interakcji między komórkami. Mieszana kohodowla jest najprostszym podejściem, ale jest ograniczona, ponieważ izolowane zabiegi i dalsze analizy pojedynczych typów komórek nie są wykonalne. Aby zbadać, czy EC mogą w zależności od dawki osłabiać uszkodzenia komórek CM i czy tę ochronę można dodatkowo zoptymalizować poprzez zmianę odległości kontaktu między dwiema liniami komórkowymi, użyliśmy mysich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic wieńcowych i kardiomiocytów dorosłych myszy do przetestowania trzech typów wkładek do hodowli komórkowych, które różniły się odległością warstwy międzykomórkowej na poziomie 0,5, odpowiednio 1,0 i 2,0 mm. Tylko w CM uszkodzenie komórek oceniane na podstawie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) znacznie wzrosło podczas niedotlenienia i dalej po ponownym dotlenieniu, gdy odległość wynosiła 2,0 mm w porównaniu z 0,5 i 1,0 mm. Gdy EC i CM były w prawie bezpośrednim kontakcie (0,5 mm), nastąpiło tylko łagodne osłabienie uszkodzenia reoksygenacyjnego CM po niedotlenieniu. Tłumienie to było znacznie zwiększone, gdy odległość przestrzenna wynosiła 1,0 mm. Przy odległości 2,0 mm EC tłumiły uszkodzenia CM zarówno podczas niedotlenienia, jak i niedotlenienia/reoksygenacji, co wskazuje, że konieczne jest wystarczające zachowanie dystansu hodowli, aby EC mogły komunikować się z CM, tak aby wydzielane cząsteczki sygnałowe mogły krążyć i w pełni stymulować szlaki ochronne. Nasze odkrycia sugerują po raz pierwszy, że optymalizacja środowiska przestrzennego kokultury EC/CM jest konieczna, aby zapewnić korzystny model in vitro do testowania roli EC w ochronie przed CM przed symulowanym uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym. Celem tego raportu jest przedstawienie badaczom podejścia krok po kroku, aby mogli wykorzystać ten ważny model na swoją korzyść.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności na całym świecie1,2. Jednak proces leczenia reperfuzji sam w sobie może powodować śmierć kardiomiocytów, znaną jako uszkodzenie niedokrwienia mięśnia sercowego/reperfuzji (IR), na które nadal nie ma skutecznego lekarstwa3. Sugeruje się, że komórki śródbłonka (EC) chronią kardiomiocyty (CM) poprzez wydzielanie sygnałów parakrynnych, a także interakcje międzykomórkowe4.

Modele kohodowli komórek były szeroko wykorzystywane do badania roli autokrynnych i/lub para....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie eksperymentalne/posiewanie

  1. Utrzymuj CM i EC zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Rozmrozić obie linie komórkowe, gdy dotrą od dostawców. Płytka w kolbach T25 po umyciu świeżą pożywką. Zaleca się zakup każdej pożywki do hodowli komórkowych od tych samych dostawców, od których zakupiono komórki. Następnego dnia odśwież komórki pożywką i użyj, gdy się zlewa.
    2. Inkubator do hodowli komórkowych należy utrzymywać w temperaturze 37 °C przy zawartości 21%O2, 5% CO2, 74% N2 i nawilżać go.
      UWAGA: Pierwotne komórki śródbłonka tętnic wieńcowych myszy użyte w tym protokole są ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie trzy typy wkładek (A, B, C) użyte w tym eksperymencie mają ten sam rozmiar porów 0,4 μm. Jedyną różnicą między nimi jest wysokość wkładki do podstawy, która pozwala na to, aby odległości między dwiema warstwami komórek współhodowanych wynosiły odpowiednio 0,5, 1,0 i 2,0 mm (Rysunek 3) oraz to, że pochodzą one od różnych dostawców (szczegóły w Tabeli materiałów).

Aby stworzyć model wspólnej hodowli in vitro z oddzielnymi warstwami .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne kroki w protokole
Modele kokultur komórkowych wykorzystano do badania komórkowych mechanizmów kardioprotekcji. Sposób stworzenia dwóch oddzielnych warstw z sensownym odstępem między nimi jest zatem kluczowy dla opracowania odpowiedniego modelu kokultury. Wyzwaniem w badaniu symulowanego uszkodzenia w podczerwieni, tj. HR, jest to, że nie tylko samo niedokrwienie (niedotlenienie), ale także reperfuzja (reoksygenacja) pogarsza dysfunkcję komórkową. W związku z tym realistyczny model musi odz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Laboratorium Biomedyczne Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych (I01 BX003482) oraz przez fundusze instytucjonalne dla M.L.R.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kardiomiocyty dorosłych myszy (CM)Celprogen Inc11041-14Izolowany z dorosłej tkanki serca myszy C57BL / 6J
Automatyczny licznik komórek Countess IIInvitrogenA27977Liczenie komórek do obliczania liczby komórek
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuaireNU425400Sterylny kaptur do hodowli
komórkowych Zamrażanie kultur komórkowych MediumCell Biologics Inc6916Służy do zamrażania komórek w celu długotrwałego przechowywania linii komórkowych
Inkubator kultur komórkowychNuaireNu-5500Aby zapewnić normalne warunki życia komórek (21% O2, 5% CO2, 74% N2, 37° C, nawilżany)
Zbiornik gazu do inkubatora kultur komórkowychSprężone gazyUN1013Gaz potrzebny do inkubatora do hodowli komórkowych 
Wkładki do hodowli komórkowych A (0,5 mm)Corning Inc353095Używane do kohodowli EC-CM
Wkładki do hodowli komórkowych B (1,0 mm)Millicell MilliporePIHP01250Używane do kohodowli EC-CM
Wkładki do hodowli komórkowych C (2,0 mm)Greiner Bio-One662640współhodowli EC-CM
Anstel Enterprises Inc4235Do powlekania i pasażowania kultur komórkowych
Kolby do hodowli komórkowych CMs T25Celprogen IncE11041-14Używane do regularnej hodowli CMs, powlekane przez producenta
CMs Cell Culture Medium CompleteCelprogen IncM11041-14SCMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete bez fenoluCelprogen IncM11041-14PNPożywka hodowlana CMs bez czerwieni fenolowej używana podczas pomiaru LDH
CMs Cell Culture Plates 96 dobrzeCelprogen IncE11041-14-96wellUżywany do eksperymentów pomiaru LDH, pokryty przez producenta
CMs Hypoxia Cell Culture MediumCelprogen IncM11041-14GFPNCMs hodowla komórek w stanie niedotlenienia (bez glukozy i surowicy)
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessInvitrogenC10283Szkiełka zliczające używane do liczenia komórek
Cyquant LDH Cytotoxicity KitThermo Scientific C20301Zestaw do pomiaru LDH
Kolby do hodowli komórkowych EC T25Fisher Scientific FB012935Używany do regularnych hodowli
EC ECs Pożywka do hodowli komórkowych CompleteCell Biologics IncM1168ECs Culture Complete
ECs Pożywka do hodowli komórkowych Kompletna pożywka bez fenoluCell Biologics IncM1168PFECs pożywka hodowlana bez czerwieni fenolowej używana podczas pomiaru LDH
ECs Cell Culture Plates 96-dołkowaFisher Scientific (Costar)3370Używana do eksperymentów z LDH pomiar
ECs Culture Roztwór do powlekania na bazie żelatynyCell Biologics Inc6950Stosowany do powlekania kolb i płytek do ECs
ECs Hypoxia Cell Culture MediumCell Biologics IncGPF1168Hodowla komórek EC w warunkach niedotlenienia (bez glukozy i surowicy)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Fisher ScientificMT35011CVFBS-HI zatwierdzony przez USDA do hodowli i utrzymania komórek
Komora hipoksyjnaStemCell Technologies27310Aby stworzyć stan niedotlenienia w środowisku 0,01% O2
Przepływomierz w komorze hipoksjiStemCell Technologies27311Do połączenia ze zbiornikiem gazu hipoksyjnego w celu uzyskania stałej prędkości przepływu gazu
Zbiornik gazu hipoksycznego (butla 0,01% O2)A-L Sprężone gazyUN1956Służy do płukania podłoża hipoksyjnego i komory (0,01%O2/5% CO2/94,99N2)
Mikroskop NikonTMSDo obserwacji stanu komórek
Mysz Pierwotne komórki śródbłonka tętnicy wieńcowej (EC)Cell Biologics IncC57-6093Izolowany z tętnicy wieńcowej myszy C57BL / 6
NUNC 15ML CONICL Probówki FisherScientific12565269Do procesu hodowli komórek, eksperymentów, przygotowania roztworu itp.
Probówki CONICL NUNC 50MLFisher Scientific12565271Do procesu hodowli komórkowych, eksperymentów, przygotowania roztworów itp.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8662Służy do mycia komórek podczas hodowli lub eksperymentów
Czytnik płytekBioTek Instrument 11120533Kolorymetryczny lub fluorometryczny odczyt płytek
Reakcja 96 Well Palte (przezroczysty bez pokrywy)Fisher Scientific12565226Używany do odczytu płytki pomiarowej LDH
Trypsyna / EDTA dla CMsCelprogen IncT1509-0141 x sterylny filtr i testowany na kulturach tkankowych
Trypsyna / EDTA dla ECsCell Biologics Inc6914/06190,25%, testowany na nacięciu komórek
AL Używane do wirówki do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hausenloy, D. J., et al. Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery. Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).
  2. Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Myocardial is....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Co CultureCardiac IschemiaReperfusion InjuryEndothelial CellsCardiomyocytesHypoxia ReoxygenationLDH ReleaseCell Cell InteractionsIn Vitro ModelCulture Inserts

Related Articles