Artykuł metodologiczny

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

DOI:

10.3791/62917

⸱

22 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri-Columbia, 2Department of Biomedical, Biological and Chemical Engineering, University of Missouri-Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrialny Ca2+ odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu cytozolowego buforowania Ca2+, metabolizmu energetycznego i transdukcji sygnału komórkowego. Przeciążenie mitochondriówCa2+ przyczynia się do różnych stanów patologicznych, w tym neurodegeneracji i apoptotycznej śmierci komórek w chorobach neurologicznych. Tutaj przedstawiamy podejście molekularne specyficzne dla typu komórki i ukierunkowane na mitochondria do obrazowania mitochondrialnego Ca2 + w astrocytach i neuronach in vitro i in vivo. Skonstruowaliśmy plazmidy DNA kodujące genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI) GCaMP5G lub GCaMP6 (GCaMP5G / 6s) z promotorami specyficznymi dla astrocytów i neuronów gfaABC1D i CaMKII oraz sekwencją ukierunkowaną na mitochondria (mito-). W przypadku obrazowania mitochondrialnego Ca2 + in vitro plazmidy transfekowano w hodowanych astrocytach i neuronach w celu ekspresji GCaMP5G / 6s. Do obrazowania mitochondrialnego Ca2 + in vivo przygotowano wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) i wstrzyknięto je do mózgów myszy w celu ekspresji GCaMP5G/6s w mitochondriach w astrocytach i neuronach. Nasze podejście zapewnia użyteczny sposób obrazowania dynamiki mitochondrialnego Ca2 + w astrocytach i neuronach w celu zbadania związku między cytozolową i mitochondrialną sygnalizacją Ca2 +, a także interakcjami astrocytów - neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są dynamicznymi organellami subkomórkowymi i są uważane za elektrownie komórkowe do produkcji energii. Z drugiej strony mitochondria mogą pobierać Ca2+ do macierzy w odpowiedzi na miejscowy lub cytozolowy wzrost Ca2+. Mitochondrialny wychwytCa2+ wpływa na funkcję mitochondriów, w tym na procesy metaboliczne, takie jak reakcje w cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i fosforylacja oksydacyjna, oraz reguluje białka wrażliwe na Ca2+ w warunkach fizjologicznych1,2,3,4. Przeciążenie mitochondriów Ca2+ jest również wyznacznikiem śmierci komórki, w tym martwicy i apoptozy w różnych zaburzeniach mózgu5,6,7. Powoduje otwarcie mitochondrialnych porów przejściowych przepuszczalności (mPTP) i uwolnienie kofaktora kaspazy, który inicjuje apoptotyczną śmierć komórki. Dlatego ważne jest, aby badać dynamikę mitochondriów Ca2 + i obchodzenie się z nim w żywych komórkach, aby lepiej zrozumieć fizjologię i patologię komórkową.

Mitochondria utrzymują homeostazę macierzy Ca2+ poprzez równowagę między wychwytem Ca2+ a odpływem. Wychwyt mitochondrialnego Ca2 + jest głównie pośredniczony przez mitochondrialne uniportery Ca2 + (MCU), podczas gdy mitochondrialny wypływ Ca2 + jest mediowany przez wymienniki Na+-Ca2+-Li+ (NCLXs) i wymienniki H+/Ca2+ (mHCXs) 8. Równowaga może zostać zaburzona poprzez stymulację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)9. Na homeostazę mitochondriówCa2+ wpływa również buforowanie mitochondriów poprzez tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów xCa2+-xPO4x-xOH8.

Wewnątrzkomórkowe i mitochondrialne zmiany w stężeniu Ca2+ ([Ca2+]) mogą być oceniane za pomocą fluorescencyjnych lub luminescencyjnych wskaźników Ca2+. Wiązanie Ca2+ ze wskaźnikami powoduje modyfikacje spektralne, co pozwala na rejestrację wolnych komórek [Ca2+] w czasie rzeczywistym w żywych komórkach. Obecnie dostępne są dwa rodzaje sond do monitorowania zmian Ca2+ w komórkach: organiczne wskaźniki chemiczne i genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI). Ogólnie rzecz biorąc, dla badanych pytań biologicznych dostępne są różne warianty o różnym powinowactwie do Ca2+ (w oparciu o Kd), właściwościach spektralnych (długości fal wzbudzenia i emisji), zakresach dynamicznych i czułościach. Chociaż wiele syntetycznych organicznych wskaźników Ca2 + zostało wykorzystanych do cytozolowego obrazowania Ca2 +, tylko kilka można selektywnie załadować do macierzy mitochondrialnej do mitochondrialnego obrazowania Ca2 +, przy czym Rhod-2 jest najczęściej stosowany (aby zapoznać się z przeglądami, patrz10,11). Jednak Rhod-2 ma poważną wadę polegającą na wyciekaniu podczas długotrwałych eksperymentów; Ponadto jest podzielony między mitochondria, inne organelle i cytozol, co utrudnia pomiary bezwzględne w różnych podprzedziałach. W przeciwieństwie do tego, dzięki zastosowaniu promotorów specyficznych dla typu komórki i sekwencji ukierunkowanych na przedziały subkomórkowe, GECI mogą ulegać ekspresji w różnych typach komórek i przedziałach subkomórkowych do obrazowania Ca2+ specyficznego dla komórki i przedziału in vitro lub in vivo. Wskaźniki GCaMP Ca2+ oparte na intensywności fluorescencji o pojedynczej długości fali pojawiły się ostatnio jako główne GECIs12,13,14,15,16. W tym artykule przedstawiamy protokół ukierunkowany na mitochondria i specyficzną dla typu komórki ekspresję GCaMP5G i GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) w astrocytach i neuronach oraz obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2 + w tych typach komórek. Za pomocą tego protokołu można ujawnić ekspresję GCaMP6G/6s w poszczególnych mitochondriach, a wychwyt Ca2 + w pojedynczej rozdzielczości mitochondrialnej można osiągnąć w astrocytach i neuronach in vitro i in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Missouri-Columbia.

1. Budowa plazmidów DNA

UWAGA: Do obrazowania in vitro i in vivo konstruowane są plazmidy DNA kodujące GCaMP5G/6s z promotorami specyficznymi dla astrocytów i neuronów oraz sekwencjami ukierunkowanymi na mitochondria.

  1. Wstaw sekwencję ukierunkowaną na macierz mitochondrialną (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 do miejsc klonowania EcoRI i BamHI w szkielecie plazmidu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) pZac2.1, aby uzyskać plazmidy zawierające promotor astrocytów gfaABC1D lub neuronalny promotor CaMKII18,19,20.
  2. Subklonuj GCaMP5G/6s do miejsc klonowania BamH I i Not 1 w powyższych plazmidach, aby uzyskać nowe plazmidy pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s i pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, które są ukierunkowane na ekspresję transgenu w mitochondriach w astrocytach i neuronach20,21 (Rysunek 1A).
  3. Przygotować plazmidy DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G i pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s do transfekcji do badania in vitro (sekcja 2). Opracowanie wektorów AAV o serotypie 5 dla astrocytów i serotypie 9 dla neuronów do badania in vivo18 (Sekcja 3).

2. Obrazowanie in vitro mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach

  1. Przygotuj pierwszorzędowe astrocyty z kory noworodków myszy P1 i pierwotne neurony z kory zarodków E15-1618,22,23,24, i hoduj je na szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i neuronalnej pożywki podstawowej (NBM) zawierającej 2% witaminy B27, odpowiednio.
  2. Transfekcja dojrzałych astrocytów i neuronów za pomocą plazmidów pZac-gfaABC1D-GCaMP6s i pZac-CaMKII-GCaMP5G przy użyciu odczynnika transfekcji na bazie lipidów do ekspresji GCaMP6 w mitochondriach astrocytów i GCaMP5G w mitochondriach neuronów18,20,21. Przetransfekuj komórki w każdym dołku 0,5 μg DNA i zmień pożywkę 6 godzin później.
    UWAGA: Astrocyty i neurony są gotowe do obrazowania 1-2 dni po transfekcji.
  3. Wykonaj obrazowanie mitochondrialne Ca2+ in vitro 1-2 dni po transfekcji.
    1. Przenieś szklane szkiełka nakrywkowe wyhodowane z astrocytami lub neuronami do komory perfuzyjnej PH-1 pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub dwufotonowym.
    2. Stymuluj astrocytarny mitochondrialny wychwyt Ca2+ za pomocą 100 μM ATP w ACSF lub stymuluj mitochondria neuronalne za pomocą 100 μM glutaminianu/10 μM glicyny20,25 (Rysunek 2 i Rysunek 3).
      UWAGA: Zmiany roztworu z ACSF na ACSF zawierające ATP i glutaminian/glicynę są kontrolowane przez system perfuzji ALA-VM821. Szybkość zmiany roztworu jest kontrolowana na poziomie 1-2 ml/min poprzez regulację zaworu.

3. Obrazowanie in vivo mitochondrialnegoCa2+ w astrocytach i neuronach

  1. Preparaty AAV.
    1. Przygotować następujące wektory rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przy użyciu plazmidów DNA przygotowanych w sekcji 1: wektory rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G i rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s.
      UWAGA: W tym eksperymencie wektory rAAV serotypu 5 przygotowano do ekspresji GCaMP5G w mitochondriach w astrocytach, a wektory rAAV serotypu 9 przygotowano do ekspresji GCaMP6 w mitochondriach w neuronach.
  2. Stereotaktyczny wtrysk AAV.
    1. Znieczulij mysz 3% izofluranem.
      UWAGA: W dalszej części zabiegu poziom izofluranu zmniejsza się do 2%.
    2. Po tym, jak mysz osiągnie chirurgiczny poziom znieczulenia, określony przez uszczypnięcie ogona i palca u nóg, ogol włosy nad miejscem operacji, korą ruchową lub somatosensoryczną za pomocą trymera do włosów.
    3. Umieść mysz na urządzeniu stereotaktycznym myszy i przymocuj głowę za pomocą pasków nausznych. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić je podczas zabiegu. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu.
      UWAGA: Operację należy wykonywać przy użyciu procedur aseptycznych. Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być sterylizowane w autoklawie lub za pomocą sterylizatora gorących kulek.
    4. Po zamontowaniu myszy na urządzeniu stereotaktycznym trzykrotnie wysterylizuj skórę głowy naprzemiennym peelingiem na bazie jodu i 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia.
    5. Rozciąć skórę w osi bregma-lamda i utworzyć otwór na zadziory o średnicy ~1 mm za pomocą wiertła o dużej prędkości w zamierzonym miejscu wstrzyknięcia silnika lub kory somatosensorycznej.
    6. Za pomocą strzykawki Hamiltona o gramaturze 33 G zawierającej wirusa związanego z adenowirusem (wektory rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x10 11 GC] lub wektory rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) wstrzyknąć do 1 μl wirusa w obszar docelowy.
      UWAGA: Na przykład, w celu dostarczenia wirusa do kory mózgowej, wstrzyknij roztwór wirusa na dwie głębokości w wielu krokach. Najpierw wbij igłę na głębokość 1 mm od opony twardej i odczekaj 5 minut, aż mózg dojdzie do siebie. Następnie przesunąć igłę na głębokość ~700 μm i wstrzyknąć 500 nL roztworu wirusa z prędkością wstrzyknięcia 10 nL/s za pomocą strzykawki Hamilton sterowanej przez sterownik pompy mikrostrzykawkowej. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 5 minut, aby wirus mógł dyfundować do mózgu. Następnie przesunąć igłę do miejsca drugiego wstrzyknięcia na głębokości 300 μm. W tym miejscu wstrzyknij dodatkowe 500 nl roztworu wirusa. Odczekaj 10 minut, aby wirus mógł dyfundować do mózgu.
    7. Zamknij skórę głowy i skórę za pomocą kleju tkankowego. Pozwól myszom dojść do siebie na poduszce grzewczej. Po wyzdrowieniu wyślij myszy z powrotem do ośrodka dla zwierząt.
  3. Ininstalacja w oknie czaszkowym i obrazowanie in vivo dwufotonowe (2-P) mitochondrialnych sygnałów Ca2+.
    UWAGA: Wszczepienie okna czaszkowego wykonuje się 3 tygodnie po wstrzyknięciu AAV przez korę ruchową lub somatosensoryczną26,27,28,29. Karprofen (10 mg/kg) jest wstrzykiwany podskórnie w celu złagodzenia potencjalnego bólu przed operacją. Zabiegi chirurgiczne okna czaszkowego są identyczne z zabiegami chirurgicznymi z użyciem iniekcji AAV i są wykonywane w warunkach aseptycznych.
    1. Znieczulij mysz 3% izofluranem.
      UWAGA: Jest to dawka początkowa i zmniejszona do 2% na późniejszą operację. Podczas obrazowania do znieczulenia stosuje się wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) 130 mg ketaminy/10 mg ksylazyny/kg masy ciała rozpuszczonej w ACSF.
    2. Umieść mysz na urządzeniu stereotaktycznym myszy i przymocuj głowę za pomocą pasków nausznych. Nałóż maść okulistyczną na oczy. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu.
      UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być wysterylizowane.
    3. Wykonaj nacięcie o długości 5-8 mm w linii środkowej skóry głowy i usuń płat skóry za pomocą nożyczek.
    4. Po odsłonięciu czaszki należy wykonać kraniotomię o średnicy 2,0-3,0 mm za pomocą szybkiego wiertła nad obszarem, w który wstrzyknięto wirusa (tj. kora ruchowa lub kora somatosensoryczna, Ryc. 1B). Najpierw wykonaj cztery małe otwory, a następnie wywierć wzdłuż okręgu łączącego otwory. Następnie podnieś i usuń kość ostrymi nożyczkami i usuń. Odsłonięta opona twarda może zostać usunięta lub pozostawiona w stanie nienaruszonym w celu zaklinowania okna czaszki.
    5. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 3-5 mm z przezroczystym silikonem na kraniotomii. Użyj wykałaczki, aby delikatnie wepchnąć okienko czaszki na powierzchnię mózgu. Następnie uszczelnij krawędź niewielką ilością kleju silikonowego.
      UWAGI: Alternatywnie, zamiast dysku silikonowego, między szkłem nakrywkowym a tkanką mózgową można zastosować 1,2% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia.
    6. Na koniec uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem dentystycznym. Uważaj, aby nałożyć cement lekko na krawędzi okna czaszki, aby uzyskać mocne wiązanie. Przymocuj wykonaną na zamówienie metalową płytkę głowy do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
      UWAGA: Metalowa płytka służy do mocowania głowy myszy do stolika mikroskopu 2-P podczas sesji obrazowania (Rysunek 1C).
    7. Dodaj 0,5 ml roztworu ACSF na szkiełko nakrywkowe na okienku czaszki w celu zanurzenia w wodzie podczas obrazowania.
    8. Wykonaj obrazowanie poklatkowe in vivo 2-P mito-GCaMP5G w astrocytach i mito-GCaMP6 w neuronach o długości fali 910 nm przez okno czaszki (Rysunek 1C)18,20,27.
      UWAGA: Podczas obrazowania myszy znajdują się na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę fizjologiczną. Myszy zostaną złożone w ofierze natychmiast po zakończeniu sesji obrazowania.
    9. Oznacz astrocyty in vivo sulforodaminą 101 (SR101), gdy konieczne jest określenie kolokalizacji.
      1. Na końcu kroku 3.3.4 nanieść 100 μl 100 μM SR101 w ACSF na powierzchnię kory mózgowej na 1-5 minut.
      2. Spłucz powierzchnię ACSF, aby zmyć niezwiązany SR101. Korzystając z obrazowania 2-P, wspólne znakowanie mito-GCaMP5G i SR101 w astrocytach można zaobserwować 45-60 minut później (Figura 4A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było dostarczenie metodologii obrazowania mitochondrialnych sygnałów Ca2+ za pomocą GECI w astrocytach i neuronach in vitro i in vivo. Przedstawiono wyniki obrazowania mitochondriów Ca2+ in vitro i in vivo.

Sygnalizacja Ca 2+ in vitro mitochondrialna w hodowanych astrocytach i neuronach
Mitochondrialny wychwyt Ca2 +...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy metodę i protokół obrazowania mitochondrialnych sygnałów Ca2+ w astrocytach i neuronach. Wdrożyliśmy strategie ukierunkowane na mitochondria i specyficzne dla typu komórki w celu ekspresji GECI GCaMP5G/6s. Aby celować w GCaMP5G/6s w mitochondriach, włączyliśmy sekwencję ukierunkowaną na mitochondria do plazmidów. Aby wyrazić GCaMP5G / 6s w astrocytach i neuronach in vivo, wprowadziliśmy do plazmidów promotor specyficzny dla astrocytów gfaABC1D i specyficzny dla neuronów pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), przyznając R01NS069726 i R01NS094539 SD. Dziękujemy Erice DeMers za nagranie audio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Maść na sztuczne łzyRugbyNDC-0536-6550-9183% biała wazelina
Klej cyjanoakrylowyWorld Precision Instruments3M Vetbond Klej
preparacyjny stereoskopNikonSMZ 2BChirurgia
Dumont z cienką końcówkąFine Science Tools11255-20do usuwania opony twardej
Szkiełka nakrywkowe, Grubość 0,13-0,17 mmFisher Scientific12-542Ado osłony okna czaszki
Szybkoobrotowe mikrowiertłoFine Science Tools18000-17z wiertłem do polerowania kości
Strzykawka iniekcyjnaHamilton2,5 mldo wstrzykiwań wirusowych
KetaminaVEDCONDC-50989-996-06100 mg/kg masy ciała
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigma-AldrichA9793redukująca artefakty ruchu
Metalowa ramaWykonana na zamówienie, patrz rys. 1dla mocowania mózgu do stolika mikroskopu
Sterownik pompy mikrostrzykawkowejWorld Precision InstrumentsUMP3Regulator prędkości wtrysku
Mysz stereotaktycznaStoelting51725do trzymania myszy
Komora perfuzyjnaWarner Instruments64-0284
System persfuzyjnyALA Scientific InstrumentsALA-VM8
Samoregulująca poduszka grzewczaFine Science Tools21061zapobiegająca hipotermii myszy
Sulforodamina 101InvitrogenS-359czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania astrocytów
Nożyczki chirurgiczne, 12 cmFine Science Tools14002-12do preparacji
TrephineFine Science Tools18004-23do oczyszczania materiału
KsylazynaVEDCONDC-50989-234-1110 mg/kg masy ciała

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
  2. Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
  3. Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
  4. Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
  5. Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
  6. Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
  7. Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034(2013).
  8. Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321(2021).
  9. Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
  10. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  11. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  12. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  13. Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).
  14. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  17. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
  18. Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
  19. Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  20. Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
  21. Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
  22. Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
  23. Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416(2016).
  24. Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
  25. Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
  26. Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
  27. Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
  28. Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
  29. Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
  30. Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
  31. Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie wapnia mitochondrialnegogenetycznie kodowane wska nikiobrazowanie neuron w i astrocyt wmikroskopia dwufotonowapobieranie wapnia przez mitochondriaobrazowanie in vivoGCaMP5G GCaMP6sswoisto typ w kom rkowychtransfekcja wektorami wirusowymioperacyjne wszczepienie okna kranio tomograficznego

Powiązane artykuły