Artykuł metodologiczny

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

DOI:

10.3791/62940

⸱

12 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak piersi jest główną przyczyną śmiertelności kobiet. Wzrost komórek raka piersi i ich późniejsze przerzuty są kluczowym czynnikiem jego progresji. Chociaż mechanizmy zaangażowane w promowanie wzrostu raka piersi były intensywnie badane przy użyciu monokultur komórek raka piersi, takich jak komórki MCF-7, udział innych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka naczyniowego i limfatycznego, które są ściśle zaangażowane we wzrost guza, nie został dogłębnie zbadany. Interakcja komórka-komórka odgrywa kluczową rolę we wzroście i progresji guza. Neoangiogeneza, czyli rozwój naczyń krwionośnych, jest niezbędna do wzrostu guza, podczas gdy układ limfatyczny służy jako portal dla migracji komórek rakowych i późniejszych przerzutów. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że komórki śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych mogą znacząco wpływać na wzrost komórek rakowych. Obserwacje te wskazują na potrzebę opracowania modeli in vitro, które bardziej realistycznie odzwierciedlałyby procesy wzrostu raka piersi in vivo. Co więcej, ograniczenia w badaniach na zwierzętach wymagają opracowania modeli ex vivo, aby lepiej wyjaśnić związane z tym mechanizmy.

Ten artykuł opisuje rozwój sferoid raka piersi składających się zarówno z komórek raka piersi (komórki MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym), jak i komórek śródbłonka naczyniowego i/lub limfatycznego. Protokół opisuje szczegółowe podejście krok po kroku do tworzenia sferoid dwukomórkowych przy użyciu dwóch różnych podejść, wiszącego kropli (złoty standard i tani) oraz 96-dołkowych płytek U-bottom (drogich). Podano szczegółowe instrukcje dotyczące delikatnego podnoszenia uformowanych sferoid w celu monitorowania wzrostu poprzez mikroskopijne wymiarowanie i ocenę żywotności przy użyciu barwienia martwych i żywych komórek. Ponadto nakreślono procedury mocowania sferoid do cięcia i barwienia przeciwciałami specyficznymi dla wzrostu w celu różnicowania wzorców wzrostu sferoidów. Dodatkowo podano szczegóły dotyczące przygotowania sferoid z transfekowanymi komórkami oraz metod ekstrakcji RNA do analizy molekularnej. Podsumowując, ten artykuł zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania sferoid wielokomórkowych do badań nad rakiem piersi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt do eksperymentów ma ograniczenia. Badania na zwierzętach nie mogą dokładnie naśladować postępu choroby u ludzi, a zwierzęta i ludzie nie mają identycznych reakcji na patogeny. Dodatkowo, ograniczenia w eksperymentach na zwierzętach spowodowane obawami o cierpienie zwierząt i problemami etycznymi1,2 coraz bardziej ograniczają programy badawcze. Systemy in vitro zostały szeroko opracowane w celu obejścia wykorzystywania zwierząt; Co więcej, wykorzystanie komórek ludzkich sprawiło, że modele in vitro stały się bardziej przydatne w badaniach patofizjologicznych i terapeutycznych. Konwencjonalne monowarstwowe (2D) hodowle komórkowe są szeroko stosowane, ponieważ do pewnego stopnia naśladują ludzkie tkanki. Jednak monokultury 2D nie są w stanie naśladować ludzkich narządów, a monokultury 2D nie są w stanie symulować złożonego mikrośrodowiska oryginalnych narządów i naśladować sytuacji in vivo3,4,5,6. Dodatkowo, w jednowarstwowych hodowlach komórkowych, leczenie farmakologiczne może łatwo zniszczyć/uszkodzić wszystkie komórki. Co ważne, niektóre z tych ograniczeń można pokonać, przechodząc na wielowarstwowe trójwymiarowe (3D) hodowle komórek7,8. W rzeczywistości wykazano, że modele hodowli 3D lepiej odzwierciedlają strukturę komórkową, układ i funkcję komórek w tkankach pierwotnych. Te kultury 3D mogą być tworzone przy użyciu różnych linii komórkowych, podobnie jak funkcjonalny narząd. Rzeczywiście, istnieją dwa modele kultur 3D. Jeden model wytwarza sferoidy zagregowanych komórek, które tworzą klastry i reorganizują je w sfery (modele bez rusztowań). Drugi daje organoidy, które mają bardziej złożoną strukturę i składają się z kombinacji wielu komórek specyficznych dla narządów, które są uważane za miniaturową wersję organów9,10. Z tego powodu systemy hodowli 3D stanowią innowacyjną technologię o wielu zastosowaniach biologicznych i klinicznych. Tak więc sferoidy i organoidy mają wiele zastosowań w modelowaniu chorób i badaniach związanych z medycyną regeneracyjną, badaniami przesiewowymi leków i badaniami toksykologicznymi6,11,12,13,14,15. Rakotwórcze sferoidy, wywodzące się z technologii 3D, odtwarzają morfologię i fenotyp odpowiednich typów komórek, naśladują mikrośrodowisko guza in vivo oraz modelują komunikację komórkową i szlaki sygnałowe, które działają podczas rozwoju nowotworu16,17,18. Ponadto, aby lepiej zrozumieć biologię raka, sferoidy/organoidy nowotworowe mogą być również wykorzystywane do identyfikacji potencjalnej terapii przeciwnowotworowej specyficznej dla pacjenta (spersonalizowanej) i oceny jej skuteczności, toksyczności i długoterminowych skutków19,20,21,22. Sferoidy otworzyły znaczące możliwości badania patofizjologii, modelowania chorób i badań przesiewowych leków ze względu na ich zdolność do zachowania komórkowej i trójwymiarowej architektury tkankowej, zdolność do naśladowania sytuacji in vivo oraz interakcji komórka-komórka. Należy jednak również zdawać sobie sprawę z ograniczeń tego systemu, takich jak brak komponentu naczyniowego/ogólnoustrojowego, funkcjonalnego układu odpornościowego lub nerwowego, a system ten reprezentuje podejście redukcjonistyczne w porównaniu z modelami zwierzęcymi. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do modeli zwierzęcych, struktury 3D zapewniają jedynie przybliżenie biologii w ludzkim ciele. Zrozumienie ograniczeń metody 3D może pomóc naukowcom w zaprojektowaniu bardziej wyrafinowanych i prawidłowych procesów wytwarzania sferoid, które lepiej reprezentują narząd w większej skali23,24,25.

Rak jest główną przyczyną zgonów na całym świecie, a rak piersi jest najczęstszym nowotworem u kobiet26,27,28. Aby naśladować złożone mikrośrodowisko raka piersi, sferoidy raka piersi powinny być hodowane przy użyciu komórek, które odgrywają znaczącą rolę w nowotworach piersi, tj. komórek nabłonka, komórek śródbłonka, fibroblastów i/lub komórek odpornościowych. Ponadto, w przypadku sferoidy reprezentującej raka piersi, należy również wziąć pod uwagę ekspresję żeńskich receptorów hormonalnych (receptorów estrogenowych/progesteronowych), zdolność do zachowania stanu histologicznego guza pacjenta oraz zdolność do naśladowania odpowiedzi na leczenie. Badania wykazały, że systemy kohodowli 3D mają organizację komórkową podobną do tkanki pierwotnej in vivo, mają zdolność reagowania w czasie rzeczywistym na bodźce i mają funkcjonalne receptory androgenowe29,30,31,32. W związku z tym podobne podejście może być przydatne do naśladowania guza piersi in vitro. Celem obecnego protokołu jest ustanowienie nowej metody generowania sferoid raka piersi. Metoda ta wykorzystuje komórki MCF-7 z dodatnim receptorem estrogenowym (nieśmiertelna ludzka linia komórkowa komórek nabłonkowych) i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (HUVEC) lub komórki śródbłonka limfatycznego (HMVEC-DNeo) w celu stworzenia modelu, który naśladuje lub ściśle odzwierciedla interakcje między tymi komórkami w guzie. Chociaż MCF-7 (reagujące na estrogeny) i komórki śródbłonka zostały wykorzystane do rozwoju sferoid w obecnym badaniu, inne komórki, takie jak fibroblasty, które stanowią ~ 80% masy guza piersi, mogą być również połączone w przyszłości, aby lepiej reprezentować i naśladować guz piersi.

Istnieje kilka metod tworzenia sferoid, takich jak: 1) metoda wiszących kropel, która wykorzystuje grawitację33,34; 2) metoda lewitacji magnetycznej, która wykorzystuje nanocząstki magnetyczne wystawione na działanie zewnętrznego magnesu35, oraz 3) metoda mikropłytki sferoidalnej, która jest wykonywana przez wysiewanie komórek na płytkach o niskim przyczepie36,37. Na podstawie istniejących metod, które wykorzystują tylko jeden typ komórek, obecny protokół został zoptymalizowany przy użyciu komórek nabłonka i śródbłonka, aby lepiej naśladować warunki wzrostu guzów raka piersi in vivo38,39,40,41. Metodę tę można łatwo osiągnąć w laboratorium przy niskich kosztach i minimalnych wymaganiach sprzętowych. W oparciu o potrzeby/cele laboratorium, zastosowano różne podejścia do tworzenia sferoid i pozyskiwania odpowiedniego materiału komórkowego z tych sferoid. W tym kontekście, w przypadku analizy DNA, RNA lub białek, sferoidy 3D są wytwarzane przez jednoczesną hodowlę komórek śródbłonka i nabłonka metodą wiszącej kropli. Jednak w przypadku badań funkcjonalnych, na przykład w celu monitorowania wzrostu komórek po transfekcji krótkich zakłóceń (siRNA) i/lub leczeniu hormonalnym, sferoidy są generowane przy użyciu płytek U-bottom.

Celem tego technicznego protokołu jest dostarczenie szczegółowego opisu krok po kroku dla 1) tworzenia wielokomórkowych sferoidów raka piersi, 2) przygotowania próbek do barwienia histologicznego oraz 3) zbierania komórek do ekstrakcji RNA, DNA i białek. Zarówno niedroga metoda wiszącego kropli, jak i droższe płyty dolne w kształcie litery U są używane do tworzenia sferoid. W tym miejscu przedstawiono protokół przygotowania (utrwalania) sferoid do cięcia, a następnie barwienia immunologicznego za pomocą markerów w celu oceny proliferacji komórek, apoptozy i rozmieszczenia komórek nabłonka i śródbłonka w sferoidzie. Dodatkowo protokół ten pokazuje pełną analizę danych histologicznych krok po kroku za pomocą oprogramowania ImageJ. Interpretacja danych biologicznych różni się w zależności od rodzaju eksperymentu i zastosowanych przeciwciał. Cięcie nieruchomych sferoid, a następnie barwienie skrawków zostało przeprowadzone przez rutynowe laboratorium patomorfologiczne (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Przeprowadzaj obsługę komórek w sterylnych warunkach.

  1. Subkultura ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)
    1. Kolby o długości75 cm 2 pokryć kolagenem (5 μg/cm2) (ogon szczura) przez noc (ON) w temperaturze pokojowej (RT) lub 2-3 h w temperaturze 37 °C, spłukać wodą i pozostawić kolbę do wyschnięcia.
    2. Hoduj HUVEC w pożywce wzrostowej (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) uzupełnionej glutaminą (1x = 2 mM), roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (AA; 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliny i 0,025 μg/ml amfoterycyny B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 3 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 10 μg/ml heparyny) i 10% FCS (płodowa surowica cielęca) w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ). Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż komórki osiągną zbieżność 70%-80%.
    3. Umyj sub-zlewające się kultury 5 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) i dodaj 3 ml trypsyny (0,25% rozcieńczonej w HBSS (bez Ca2+ i Mg2+).
      UWAGA: HBSS można również zastąpić PBS.
    4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 minuty (sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki są odłączone i zaokrąglone do góry) i zatrzymać reakcję oddzielania przez dodanie 6 ml 10% pożywki FCS (DMEM-F12 lub EBM-2, 10% FCS).
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    6. Zawiesić komórki w pożywce wzrostowej i wysiewać nasiona w kolbach o długości 75cm2 lub szalkach hodowlanych.
  2. Subkultura Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, ludzkie komórki gruczolakoraka piersi)
    1. Hodować linie komórkowe ludzkiego raka piersi w 75 cm2 kolbach w pożywce wzrostowej (pożywka DMEM/F12 uzupełniona dostępną w handlu glutaminą (1x), roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (AA; 100 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliny i 0,025 μg/ml amfoterycyny B) i 10% FCS w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5 % emisji CO2 ). Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.
    2. Przemyć subkonfluentne hodowle komórkowe (70%-80% konfluencji) 5 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) i dodać 3 ml trypsyny (0,5% rozcieńczonej w HBSS (bez Ca2+ i Mg2+) w temperaturze 37 °C przez 5 minut (mikroskopowo sprawdzić, czy komórki są oderwane).
      UWAGA: HBSS można również zastąpić PBS.
    3. Dodać 8 ml 10% pożywki FCS w celu zatrzymania reakcji oddzielania, odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić osad w pożywce wzrostowej i płytce w75 cm 2 kolbach lub szalkach hodowlanych.

2. Formacja sferoidów

  1. Płytka 5 x 105 komórek/ml (HUVEC i MCF-7) w okrągłym naczyniu o średnicy 3,5 cm i hodowla przez 48 godzin.
  2. Poddawanie działaniu lub transfekcja posianych komórek przez 24 godziny lub w zależności od potrzeb.
  3. Opcjonalny etap wykonywany na 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U: Umyj komórki 1 ml HBSS (Ca2+ i Mg2+) i wybarwić HUVEC za pomocą niebieskiego barwnika (0,5 μg/ml) i komórek MCF-7 za pomocą zielonego barwnika (0,5 μM) rozcieńczonego w odpowiednim podłożu wzrostowym i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30-40 minut.
  4. Umyj komórki 1 ml HBSS (bez Ca2+ i Mg2+), dodaj 1 ml enzymatycznego odczynnika oddzielającego (0,25% trypsyny dla HUVEC i 0,5% trypsyny dla MCF-7) do każdej okrągłej płytki za pomocą pipety P1000, a następnie inkubuj przez 2-5 minut, aż komórki zostaną odłączone.
  5. Zebrać każdy typ komórek osobno w okrągłodennej probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml i dodać 1 ml 10% pożywki FCS za pomocą pipety P1000, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Odwirować zawiesiny komórkowe o stężeniu 250 x g przez 5 minut.
  6. Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić komórki w 1 ml pożywki bezsteroidowej (EBM-2, glutamina, antybiotyk-antybiotyk, 0,4% FCS sf (węgiel drzewny).
    UWAGA: Pożywkę bezsteroidową można zastąpić normalną pożywką wzrostową.
  7. Użyj 100 μl każdej zawiesiny komórkowej rozcieńczonej 10 ml rozcieńczalnika II (patrz tabela materiałów), aby określić całkowitą liczbę komórek i obliczyć ilość pożywki zabiegowej (EBM-2, glutamina, antybiotyk-antybiotyk, 0,4% FCS sf, nośnik/leczenie) potrzebnej do uzyskania zawiesiny komórek 5 x 103 komórek/ml lub 3,4 x 105 komórek/ml na typ komórek.
    1. Liczba komórek
      1. Włączyć urządzenie i przepłukać, naciskając przyciski Function i Start (konfiguracja S3), roztworem rozcieńczalnika II w fiolce z licznikiem komórek.
      2. Użyj konfiguracji S4 i naciśnij Start, aby zmierzyć ślepą próbę świeżym roztworem rozcieńczalnika II.
      3. Wymienić fiolkę scyntylacyjną na 100 μl zawiesiny komórek w 10 ml roztworu rozcieńczalnika II i zmierzyć próbki: ustawić S4 i nacisnąć Start.
      4. Zwróć uwagę na liczbę komórek na ml na wyświetlaczu cyfrowym.
        UWAGA: Zliczanie komórek można również przeprowadzić przy użyciu innych systemów ręcznych lub automatycznych: linii siatki hemocytometru, technologii zliczania komórek z rozproszeniem światła, impedancji elektrycznej, systemów opartych na obrazowaniu wykorzystujących barwienie komórek, np. błękit trypanowy.
    2. 96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U
      1. Przygotuj 5 ml każdej zawiesiny komórek (5 x 103 komórki/ml) i wymieszaj je, aby uzyskać końcową objętość 10 ml w stosunku 1:1.
      2. Użyj ręcznej pipety powtarzalnej, aby odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki z 96-dołkowymi płytkami dolnymi w kształcie litery U.
      3. Umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej i sprawdzić, czy po 48 godzinach nie tworzą się sferoidy.
      4. Opcjonalny krok: Zrób zdjęcia sferoid (40x) za pomocą stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego.
        UWAGA: Ta metoda generuje 96 sferoid (jedna sferoida/studzienka) po 48 godzinach (obszar 1-2 piksel2) i jest zwykle używana do badań wzrostu.
    3. Wiszący drop
      1. Wymieszaj zawiesiny komórek (3,4 x 105 komórek/ml) w stosunku 1:1, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.
      2. Za pomocą pipety P20 rozsiać mieszaninę komórek w postaci 15 μl kropli na odwróconej pokrywie 10 cm szalki Petriego.
      3. Odwróć pokrywkę z kroplami i dodaj 5 ml pożywki bazowej (EBM-2) na dno naczynia, aby uniknąć parowania kropli.
        UWAGA: Ta metoda generuje jedną sferoidę/kroplę po 48 godzinach. Upewnij się, że krople są wystarczająco oddalone od siebie, aby nie łączyły się podczas zmiany pokrywy. W razie potrzeby użyj więcej niż jednej 10-centymetrowej szalki Petriego.

3. Badanie wzrostu sferoidów

  1. Umieścić 100 μl mieszaniny komórek HUVEC i MCF-7 (5 x 102 komórek/dołek) na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U i umieścić je w inkubatorze.
  2. 48 godzin po posiewie sprawdzić, czy nie tworzą się sferoidy za pomocą odwróconego mikroskopu (jasne pole). Zrób zdjęcia (co najmniej sześć zdjęć na zabieg, 40x) po 96 godzinach posiewu.
  3. Otwórz zdjęcia za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i przetwórz obraz do 300 pikseli/cal i zapisz obraz jako plik tiff.
  4. Pobierz oprogramowanie ImageJ i otwórz je. Kliknij opcję Plik i przejdź do Otwórz.
  5. Przekonwertuj obszary zainteresowania na nasycone czarne obszary w jednolity sposób, aby uzyskać obraz binarny (czarno-biały). W tym celu wybierz opcję Obraz, wybierz Typ | 8-bitowy. Teraz obraz jest czarno-biały.
  6. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne, aby narysować granicę sferoid.
  7. Aby obliczyć obszar zainteresowania i oddzielić obiekt lub piksele pierwszego planu od pikseli tła, użyj funkcji progu: Wybierz opcję Obraz, wybierz Dostosuj i kliknij Próg.
  8. Teraz otworzy się wyskakujące okienko Próg. Górny pasek wskazuje minimalną wartość progową: ustaw wartość na zero. Dolny pasek wskazuje maksymalną wartość progową: przesuwaj pasek, aż obszar zainteresowania stanie się całkowicie czerwony.
    UWAGA: Jeśli kolor nie jest czerwony, wybierz opcję Czerwony w oknie Próg.
  9. Przejdź do punktu Analiza | Ustaw Measurements (Pomiary) i wybierz Area (Obszar i Obwód).
  10. Aby zmierzyć obszar zainteresowania, wybierz opcję Analizuj i użyj narzędzia Analizuj cząstki. W oknie Analizuj cząstki ustaw Rozmiar do zmierzenia (0,00003-Nieskończoność lub 3-Nieskończoność, w zależności od rozmiaru sferoid), wybierz opcję Podsumuj i Wyświetl wyniki. Następnie kliknij OK.
  11. Wyniki pojawią się na wykresie. Skopiuj pomiary do arkusza kalkulacyjnego, aby przeanalizować dane.
    UWAGA: Obszar jest obliczany jako łączna liczba pikseli; Użyj pola Powierzchnia całkowita do obliczeń.

4. Badanie immunohistochemiczne sferoidów

  1. Przygotowanie próbki
    1. Mieszaninę komórek HUVEC i MCF-7 (5 x 103 komórki / studzienkę) umieścić na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U w pożywce wzrostowej HUVEC przez 96 godzin.
    2. Zebrać około 50 sferoid do probówki o pojemności 1,5 ml z odciętą końcówką pipety P200 μL; pozwolić im opaść grawitacyjnie na dnie probówki, a następnie wyrzucić supernatant.
    3. Utrwalić sferoidy za pomocą 500 μl 4% PFA przez 1 godzinę, RT.
    4. Gotować 2% roztwór agaru Nobla w PBS za pomocą płyty grzejnej z mieszadłem magnetycznym przez 3-5 minut, aby całkowicie rozpuścić proszek agarozy i schłodzić do około 60 °C.
    5. Usunąć PFA za pomocą pipety P1000, przemyć sferoidy 500 μl PBS i pozostawić do osadnienia. Odrzucić supernatant.
    6. Ostrożnie odpipetować 600 μl roztworu agarozy do probówki o pojemności 1,5 ml ze sferoidami i natychmiast umieścić probówkę w wirówce z poziomym wirnikiem o wymiarach 177 x g na 2 minuty.
    7. Dodaj krótki sznurek w środku roztworu agarozy, aby łatwo wyjąć zatyczkę z probówki.
    8. Zestalić korek agarozowy na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Dodać 500 μl PBS do probówki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć wysychania granulki.
      UWAGA: Próbki są gotowe do późniejszego odwodnienia, zatopienia parafiny, przekrojenia, przeniesienia na szkiełka mikroskopowe i barwienia IHC (wykonanego przez Sophistolab).
  2. Akwizycja i przetwarzanie obrazu
    1. Rejestruj obrazy przekrojów sferoidalnych za pomocą mikroskopu stereoskopowego.
    2. Zapisz trzy obrazy dla każdej próbki jako pliki .jpg.
    3. Otwórz oprogramowanie ImageJ. Otwórz obraz JPEG, kliknij Plik, a następnie Otwórz.
    4. Wybierz Kolor i Dekonwolucja kolorów w opcji Obraz.
    5. Wybierz H DAB vectors (Wektory H DAB) w oknie Color Deconvolution 1.7 (Dekonwolucja kolorów 1.7), a pojawią się trzy obrazy.
      UWAGA: Trzy obrazy to: Kolor 1 reprezentuje tylko barwienie hematoksyną (niebieski/fioletowy), a kolor 2 reprezentuje tylko barwienie DAB (brązowy). Kolor 3 nie jest potrzebny do analizy obrazu z dwoma barwieniami.
    6. Wybierz okno Kolor 1 i ustaw Próg: przejdź do punktu menu Obraz | Dostosuj i kliknij Próg. Zostanie wyświetlone okno Próg.
    7. Pozostaw minimalną wartość progową ustawioną na zero i dostosuj maksymalną wartość progową, aby usunąć sygnał tła bez wpływu na sygnał rzeczywisty. Kliknij Zastosuj.
      1. Pomiar powierzchni
        1. Kliknij Analizuj, wybierz Ustaw miarę. Wybierz Obszar, Średnia wartość szarości oraz Min i Max wartość szarości, a następnie kliknij OK, aby potwierdzić.
        2. Zmierz rozmiar jądra za pomocą opcji Analizuj, a następnie wybierz opcję Zmierz.
          UWAGA: W oknie Wyniki wyświetlana jest nazwa obrazu (Etykieta), rozmiar obrazu (Obszar), średnia intensywność pikseli obrazu IHC (Średnia) oraz minimalne i maksymalne wartości szarości (Min., Maks.). Do obliczeń należy użyć wartości średniej.
        3. Powtórz kroki 4.2.6-4.7.1.2 dla okna Kolor 2 (i Kolor 3, jeśli występuje podwójne barwienie).
      2. Kwantyfikacja komórek
        1. Kliknij Proces, wybierz opcję Binarny i wybierz Zlewnia, aby oddzielić komórki.
        2. Przejdź do Analizuj i kliknij Analizuj cząstki. W oknie podręcznym Analizuj cząstki ustaw rozmiar komórek, aby wykluczyć nieokreślone cząstki. Następnie w opcji Pokaż kliknij listę rozwijaną i wybierz Konspekty. Następnie kliknij OK.
        3. Powtórz kroki 4.2.6-4.2.7 i kroki kwantyfikacji komórek (sekcja 4.2.7.2) dla okna Kolor 2 (i Kolor 3, jeśli występuje podwójne barwienie).
          UWAGA: Teraz pojawią się trzy okna: 1) Wyniki podsumowania (liczba zliczonych komórek, łączna powierzchnia, średni rozmiar, % powierzchni i średnia), 2) Wyniki (w zależności od zliczanych komórek) i 3) Okno rysowania (przedstawiony obraz zliczanych komórek).

5. Żywe/martwe barwienie w sferoidach

  1. Przygotować 4 mM roztwory podstawowe Calceiny AM w DMSO (barwi żywe komórki na zielono) i 2 mM homodimeru etydyny w DMSO (barwi martwe komórki na czerwono) w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  2. Obliczyć ilość roztworu niezbędną do dodania 10 μl/basenik mieszaniny kalceiny AM i homodimeru etydyny rozcieńczonej w stosunku 1:50 w EBM-2.
  3. Dodać mieszaninę barwiącą do sferoid i umieścić płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 30-60 minut.
  4. Rejestruj zdjęcia (40x) za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.

6. Izolacja białka sferoidy i RNA

  1. Przygotować zawiesiny komórek w proporcji 3,4 x 105 komórek/ml na typ komórek, wymieszać je w stosunku 1:1 i wysiać mieszaninę komórek za pomocą pipety P20 w postaci 15 μl kropli na pokrywie 10 cm szalki Petriego. Odwrócić pokrywkę i umieścić ją w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli tkankowej na 96 godzin.
  2. Użyj 5-6 ml PBS, aby zebrać sferoidy w 15 ml okrągłodennej probówce z polistyrenu za pomocą sterylnych pipet polistyrenowych o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Możliwe jest również użycie probówek stożkowych o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować zawiesinę sferoid o stężeniu 250 x g przez 5 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant.
  4. Dodać 500 μl trypsyny (100%) i pipetować w górę iw dół za pomocą pipety P1000 przez 30 s, aby zdezagregować sferoidy, uzyskując zawiesinę komórek.
  5. Zneutralizować trypsynę 10% pożywką FCS, odwirować probówki przy 250 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  6. Zgodnie z protokołem producenta (specjalny zestaw do izolacji RNA bez DNA), do lizy osadu komórkowego należy użyć 300 μl buforu do lizy RNA.
    UWAGA: Bufor do lizy może być również bezpośrednio dodawany do nienaruszonych sferoid (nie jest wymagany etap trypsyny) w celu ekstrakcji RNA. Dodać 300 μl buforu do lizy do granulowanych sferoid, umieścić probówki w lodzie i rozcierać 10 razy za pomocą pipety P200. Następnie wyizoluj RNA jak powyżej. Dysocjacja sferoidalna może być potrzebna, jeśli odzysk RNA jest niski z powodu interferencji macierzy.
  7. Alternatywnie należy użyć 70 μl buforu do lizy do izolacji białek. Homogenizować przez 2-4 s metodą sonikacji i określić stężenie białka zgodnie z protokołem producenta za pomocą zestawu testowego BCA.
    UWAGA: W celu izolacji białek, granulowane sferoidy mogą być poddawane lizie bezpośrednio w buforze do lizy, a następnie poddawane sonikacji. Użyj 25 μg białka całkowitego do wykonania western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model sferoidów wykorzystujący kokultury nabłonkowe i śródbłonkowe jest wymagany do ścisłego naśladowania in vivo warunków guzów piersi w eksperymentach in vitro. Schemat w Rysunek 1 przedstawia protokół tworzenia sferoid z komórkami nabłonkowymi raka piersi i komórkami śródbłonka naczyniowego lub limfatycznego (Rysunek 1). Każdy typ komórki wysiewa się osobno w okrągłym naczyniu o średnicy 3,5 cm i traktuje stymulatorami/inhibitorami wzrostu lub transfekuje olig...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z hodowlami komórkowymi 2D, rewolucyjna technologia hodowli sferoidalnych 3D jest lepszym i potężniejszym narzędziem do rekonstrukcji mikrośrodowiska narządu, interakcji komórka-komórka i reakcji na leki in vitro. Jest to pierwszy protokół opisujący powstawanie sferoid z wielokomórkowych (nabłonkowych i śródbłonkowych) linii komórkowych do badań nad rakiem piersi. Protokół ten zapewnia sferoidalny wzrost sferoidów w 3D przez okres do 5 dni, a sferoidy można badać po zatopieniu parafiny, pocięciu i b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Fundację Badań nad Rakiem / Szwajcarską Ligę Raka grant KFS-4125-02-2017 dla RKD oraz grant Narodowego Instytutu Zdrowia DK079307 dla EKJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 mm i razy; 20 mm Naczynia hodowlane poddane działaniu kultur tkankowychCorningCLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Naczynie do hodowli tkankowychFalcon353001
5 ml Pipet serologiczny, polistyren, pakowany pojedynczo, sterylnyFalcon357543
Adobe PhotoshopWersja: 13.0.1 (64- bit)
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 razy;)Sigma-AldrichA5955
Calcein-AMSigma-Aldrich17783
CD31 (klaster różnicowania 31)Cell Marque131M-95monoklonalna mysz ab klon JC70
CellTracker Green CMFDA (dioctan 5-chlorometylofluoresceiny)InvitrogenC7025
CK8/18 (cytokeratyny 8 i 18)DBSMob189-05mysz monoklonalna ab, klon 5D3
CKX41 Mikroskop odwróconyOlympus Life ScienceAparat cyfrowy Olympus DP27
Rozszczepiona kaspaza 3Sygnalizacja komórkowa9661Lpoliklonalny królik ab
Kolagen (ogon szczura)Roche11 179 179 001
Redlica ISOTON II RozcieńczalnikBeckman Coulter844 80 11Rozcieńczalnik II
Redlica Z1, Redlica z licznikiem komórek Elektronika, Luton, Wielka Brytania
Odwodnione podłoża hodowlane: Szlachetny agarBD DifcoBD 214220
Skórny mikronaczyniowy śródbłonek noworodków, łączeni dawcy (HMVEC-DNeo)LonzaCC-2516
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Mieszanina pożywki i składników odżywczych F-12 SzynkaSigma-AldrichD6434
EBM-2 Wzrost komórek śródbłonka Podłoże podstawowe-2Lonza190860
Ethidium homodimerSigma-Aldrich46043
Surowica cielęca płodu (FCS)Thermo Fisher ScientificSH30070
Surowica cielęca płodu Charcoal Stripped (FCS sf)Thermo Fisher ScientificSH3006803
Stereoskopy fluorescencyjne Leica M205 FALeica Microsystems
GlutaMAX Suplement (100x)Gibco35050038
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejGibco14175053
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
HUVEC – Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowejLonzaCC-2517
ImageJNational Institute of Health, USAWayne Rasband
Wersja: 1.52a (64-bitowa)
Ki67Cell Marque275R-16monoklonalny królik ab, klon SP6
W pełni zmotoryzowany stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny LeicaLeica MicrosystemsM205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome149MULTI0C1
Zestaw suplementów wzrostu o niskiej surowicy (zestaw LSGS)Komórki GibcoS003K
MCF-7 – ludzka linia komórkowa gruczolakoraka piersiKlinika Ginekologii, Szpital Uniwersytecki w ZurychuOpracowany przez dr Andrè Fedier uzyskany z płytki ATCC
Nunclon Sphera 96U-wellThermo Fisher Scientific174925
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-AldrichP6148
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xBCA Gibco
Pierce ThermoScientific23225
Bufor do lizy białekSygnalizacja komórkowa, Danvers, USA9803
Zestaw miniprzygotowawczy Quick-RNAZymo ResearchR1055
Bufor do lizy RNAZymo ResearchR1060-1-100Zawartość w zestawie Quick-RNA Miniprep
Wirówka Rotina 46R OkrągłeHettich
, 5 mlFalcon352003
SonicatorBandelin electronics, Berlin, DE
Czytnik mikropłytek Tecan Infinite serii M200Tecan, Salzburg, AU
Kolby do hodowli tkankowych 75TPP90076
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT3924
Zestaw do oznaczania białek 10010015 probówki polistyrenowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97(2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460(2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116(2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720(2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29(2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sferoidy raka piersikom rki nab onka gruczo u mlekowegohodowla w kropli wisz cejp ytka z p kolistym dnembarwienie ywotno ci kom reksekcjonowanie sferoid wmarker proliferacji kom rkowejmikro rodowisko nowotworu

Powiązane artykuły