Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 września 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

W tym artykule

Podsumowanie

Multipleksowa hybrydyzacja in situ (ISH) została wykorzystana do jednoczesnej wizualizacji transkryptów dla dwóch receptorów sprzężonych z białkiem G i jednego czynnika transkrypcyjnego w całym kompleksie zwoju błędnego dorosłej myszy. Protokół ten może być wykorzystany do generowania dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Streszczenie

To badanie opisuje protokół multipleksowej hybrydyzacji in situ (ISH) zwojów szyjnych myszy bez dawki, ze szczególnym naciskiem na wykrywanie ekspresji receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Utrwalone formaliną zwoje szyjne bez dawki przetworzono za pomocą technologii RNAscope w celu jednoczesnego wykrycia ekspresji dwóch reprezentatywnych GPCR (receptorów cholecystokininy i greliny) w połączeniu z jednym genem markerowym albo nodose (sparowany homeobox 2b, Phox2b), albo neuronów aferentnych szyjnych (białko palca cynkowego domeny PR 12, Prdm12). Oznaczone zwoje zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu określenia rozkładu i wzorców ekspresji wyżej wymienionych transkryptów. Krótko mówiąc, stwierdzono, że neurony doprowadzające Phox2b wykazują obfitą ekspresję receptora cholecystokininy (Cck1r), ale nie receptora greliny (Ghsr). Stwierdzono również, że niewielki podzbiór neuronów aferentnych Prdm12 wykazuje ekspresję Ghsr i/lub Cck1r. Omówiono potencjalne zastrzeżenia techniczne w projektowaniu, przetwarzaniu i interpretacji multipleksu ISH. Podejście opisane w tym artykule może pomóc naukowcom w generowaniu dokładnych map profili transkrypcyjnych neuronów doprowadzających nerwy błędnego.

Wprowadzenie

Ciała komórkowe aferentów nerwu błędnego znajdują się w zwojach szyjnych, petrosalnych i bezdawkowych1,2,3. Ich aksony przemieszczają się razem przez kilka gałęzi nerwu błędnego do terytoriów czaszkowo-szyjnych, piersiowych i brzusznych4,5,6,7. Ze swoich końcówek trzewnych, aferenty nerwu błędnego mogą reagować na szeroki zakres bodźców fizjologicznych i szkodliwych8,9,10. Jednak rozmieszczenie cząsteczek sygnałowych i receptorów zaangażowanych w wyczuwanie nerwu błędnego pozostaje słabo scharakteryzowane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że zwoje nerwu błędnego, pomimo swoich niewielkich rozmiarów, wyrażają szerokie spektrum receptorów, w tym dużą liczbę GPCRs8,11,12,13. Co więcej, neurony doprowadzające nerwu błędnego są z natury heterogeniczne i wykazują odrębne profile molekularne14. Aby skomplikować sprawę, zwoje szyjne, petrosalne i bezdawkowe są przyczepione u myszy, tworząc w ten sposób pojedynczą masę zwojową. Wreszcie, w podgrupie zwierząt, zwój nodose jest przyłączony do współczulnego górnego ganglionu szyjnego15.

W przeszłości badacze zwracali się do immunohistochemii, aby badać neurochemiczny skład neuronów doprowadzających nerwu błędnego16,17,18. Chociaż immunohistochemia z wykorzystaniem zwalidowanych przeciwciał jest przydatna, wyniki badań immunohistochemicznych należy interpretować z ostrożnością. Na przykład liczne próby zidentyfikowania specyficznych przeciwciał przeciwko GPCR nie powiodły się19,20,21,22,23,24,25, co doprowadziło badaczy do wniosku, że większość przeciwciał przeciwko GPCR jest niewiarygodna. Aby obejść te problemy, ilościowy PCR (qPCR) jest szeroko stosowany do oceny ekspresji genów w masie zwojowej nerwu błędnego gryzoni26,27,28,29. Jednak badanie ekspresji genów za pomocą qPCR odbywa się kosztem utraty informacji przestrzennej. W szczególności nie można przewidzieć, ile komórek lub jakie typy komórek wyrażają określony gen będący przedmiotem zainteresowania (np. komórki nodose vs. komórki szyjne). Powtarzające się problemy obejmują również zanieczyszczenie sąsiednimi tkankami i włączenie różnych długości nerwu błędnego, górnych zwojów szyjnych i szyjnych podczas sekcji15. W wyniku powyższych trudności kontrowersje otaczają ekspresję i dystrybucję kilku GPCR w neuronach doprowadzających nerwu błędnego. Jeden szczególnie zagadkowy przykład dotyczy receptora greliny (Ghsr). Podczas gdy niektóre badania wykazały powszechną ekspresję tego receptora w neuronach doprowadzających nerwu błędnego30,31,32, inne wykazały, że mRNA Ghsr jest prawie niewykrywalne w zwoju bez dawki11,14. Szczegółowe mapowanie mRNA Ghsr w masie zwoju błędnego jest zatem uzasadnione.

Hybrydyzacja in situ (ISH) została również wykorzystana do oceny wzorców ekspresji genów w masie zwoju błędnego 7,11,12,33,34,35. Ponieważ techniki oparte na RNA pozostają w większości przypadków bardziej niezawodne i specyficzne niż techniki oparte na przeciwciałach36,37, badania ISH okazały się cenne dla lepszego zrozumienia neurochemicznego kodowania neuronów doprowadzających nerwy błędnego. Niemniej jednak tradycyjne techniki ISH same w sobie nie są pozbawione zastrzeżeń. Radioaktywny ISH jest wrażliwy, ale generuje tło i pozostaje uciążliwy38. Nieradioaktywny ISH jest mniej skomplikowany, ale też mniej czuły38. W przeciwieństwie do tego, niedawno opracowana metoda RNAscope ISH jest bardzo czuła i generuje minimalne background39. W obecnym badaniu zastosowano multipleksowy fluorescencyjny RNAscope do wykrywania GPCR w neuronach doprowadzających błędnych myszy. Skupiliśmy się na mapowaniu dystrybucji Ghsr i porównaliśmy jej dystrybucję z dystrybucją receptora cholecystokininy (Cck1r), innego GPCR, o którym dobrze wiadomo, że ulega ekspresji w zwoju nodose ganglion34. Wreszcie, dwa czynniki transkrypcyjne, sparowany homeobox 2b (Phox2b) i białko palca cynkowego 12 domeny PR (Prdm12), zostały użyte jako selektywne markery odpowiednio dla neuronów dozujących nodose i szyjnych14. Bez wizualizacji Phox2b lub Prdm12 trudno byłoby z całą pewnością zidentyfikować aferenty szyjne i aferentne bez dawki. W całym artykule omówiono również potencjalne pułapki techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Myszy użyte w tym badaniu były samcami typu dzikiego na czystym tle C57BL/6J. Do multipleksu ISH użyto w sumie 4 myszy. Wszystkie myszy miały około 8 tygodni w momencie złożenia ofiary. Jeden samiec myszy (w wieku około jednego roku) został również wykorzystany do wykazania endogennej fluorescencji związanej ze starzeniem się. Zwierzęta trzymano w wentylowanych klatkach w obiekcie barierowym z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UT Southwestern Medical Center dokonał przeglądu i zatwierdził procedury opisane poniżej. Szczegóły dotyczące odczynników i narzędzi można znaleźć w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie próbek

  1. W dniu złożenia ofiary należy podać myszom nadmierną dawkę wodzianu chloralu (500 mg/kg, i.p.). Perfuzję głęboko znieczulonych myszy przezsercowo za pomocą pompy perystaltycznej z 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 50 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Odbywa się to w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu formaliny.
  2. Ponieważ zwoje guzkowe, petrosalne i szyjne są zrośnięte, tworząc pojedynczą masę zwojową w mouse15, ostrożnie zbierz całą masę zwoju błędnego z każdej strony (lewej i prawej) za pomocą lunety preparacyjnej oraz cienkich nożyczek i kleszczyków sprężynowych (patrz Tabela Materiałów).
  3. Podczas ścinania głowy myszy dużymi nożyczkami (patrz Tabela materiałów), unikaj zmiażdżenia pnia mózgu.
  4. Postępując zgodnie z podejściem preparacyjnym opisanym wcześniej w klasie rat40, usuń mięśnie mostkowo-gnykowe i omohyoidalne wzdłuż tchawicy za pomocą małych kleszczyków (Tabela materiałów), aby odsłonić kość potyliczną. Oczyść cały obszar mięśni, tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej, aż widoczna będzie tętnica szyjna, nerw błędny, nerw podjęzykowy i otwór wielki. Przetnij cały nerw podjęzykowy małymi nożyczkami sprężynowymi (tabela materiałów).
  5. Poszukaj zwoju nodose jako półprzezroczystej masy w pobliżu otworu magnum15. Za pomocą małych nożyczek (Tabela materiałów) ostrożnie przełam kość potyliczną, aby jeszcze bardziej odsłonić zwój szyjny. Szukaj czarnych melanocytów na powierzchni szyi jako wizualnego punktu orientacyjnego.
  6. Przeciąć przyczepy nerwowe między masą zwoju błędnego i usunąć całą masę zwojową, delikatnie pociągając za obwodowy koniec nerwu błędnego, jednocześnie przecinając zwój szyjny w kierunku pnia mózgu małymi nożyczkami sprężynowymi (tabela materiałów).
  7. Usuń tkankę spojówkową i tłuszcz przylegający do nerwu błędnego i masy zwojowej tak bardzo, jak to możliwe.
  8. Ponieważ łatwo jest zgubić jeden ganglion podczas przenoszenia z jednej rurki do drugiej, należy zachować ~0,5 cm nerwu błędnego, aby ułatwić przenoszenie i lokalizację próbek.
  9. Umieścić zwoje nerwowe za pomocą cienkich kleszczyków w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 4 °C w formalinie przez 24 godziny, a z 30% sacharozą przez kolejne 24 godziny.
  10. Umieść zwoje nerwowe wewnątrz małej kropli (~4 mm Ø) medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na kawałku folii aluminiowej. Następnie zamrozić próbkę na podłożu z suchego lodu.
  11. Pociąć próbki za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C na odcinki o grubości 14 μm i zebrać na szklanych szkiełkach mikroskopowych w 3 seriach oddalonych od siebie o 42 μm.
    UWAGA: Unikaj umieszczania sekcji blisko krawędzi zjeżdżalni. Aby oszczędzać odczynniki, sekcje tkanek powinny być jak najściślej upakowane, ale bez nakładania się na siebie.
  12. Próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do ISH przez co najmniej 6 miesięcy.
    UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów dotyczących fluorescencji endogennej.

2. Obróbka wstępna i ISH

  1. Przed dniem eksperymentów należy przeprowadzić autoklaw laboratoryjne naczynia laboratoryjne przeznaczone do użycia w ISH, w tym naczynia do barwienia i mycia słoików buforowych.
    UWAGA: Podczas pracy w warunkach wolnych od RNaz nie jest krytyczna, zawsze noś rękawice. Butelki z roztworem do odkażania RNazy (tabela materiałów) należy przechowywać w zasięgu ręki na wypadek podejrzenia zanieczyszczenia.
  2. Pierwszego dnia rozprowadź szkiełka do temperatury pokojowej na ławce specjalnie przeznaczonej do ISH. Opłucz szkiełka w 1x PBS i piecz je przez 30 minut w temperaturze 60 °C w piecu do pieczenia (tabela materiałów).
  3. Po utrwaleniu szkiełek w 4% formalinie przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Doprowadź odczynniki w zestawie multipleksowym (tabela materiałów) do temperatury pokojowej.
  5. Odwodnić szkiełka w 50%, 70% i 100% etanolu przez 5 minut każda. Nakładać roztwórH2O2na próbki przez 10 minut, a następnie spłukać w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).
  6. Próbki należy traktować odczynnikiem do pobierania docelowego przez 5 minut, przepłukać ddH2O, a następnie dodać 100% etanol i wysuszyć na powietrzu. Za pomocą pisaka hydrofobowego utwórz barierę wokół próbek.
    UWAGA: Nie należy nakładać bariery hydrofobowej zbyt blisko odcinków tkanki.
  7. Nakładać proteazę przez 30 minut w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji (tabela materiałów).
  8. W międzyczasie podgrzej sondy w temperaturze 40 °C i schłodzić je w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować szkiełka z pożądaną kombinacją sond docelowych (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; lub Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji.
  9. Inkubować tkankę kontroli ujemnej z sondą C1 z reduktazą dihydrodipikolinianu (DapB) przez 2 godziny w temperaturze 40 °C w piecu do hybrydyzacji.
  10. Wypłucz szkiełka w buforze do płukania i przechowuj przez noc w 5x soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC) w temperaturze pokojowej. Dla wygody podziel eksperyment na dwa dni. Następnego dnia przepłukać szkiełka buforem do przemywania i inkubować je z odczynnikami do amplifikacji wymienionymi poniżej (patrz instrukcja obsługi w Tabeli materiałów).
  11. Zastosuj AMP1 (30 min w 40 °C), AMP2 (30 min w 40 °C) i AMP 3 (15 min w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.
  12. Rozpuścić każdy barwnik Opal (tabela materiałów) w dimetylosulfotlenku i przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
  13. Dla kanału 1 inkubować szkiełka z HRP-C1 (15 min w 40 °C) i Opal 520 (kolor zielony; rozcieńczenie 1/1 500; 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.
  14. Dla kanału 2 inkubować szkiełka z HRP-C2 (15 min w 40 °C) i Opal 570 (kolor żółty; rozcieńczenie 1/1 500; przez 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.
  15. Dla kanału 3 inkubować szkiełka z HRP-C3 (15 min w 40 °C) i Opal 690 (kolor dalekiej czerwieni; rozcieńczenie 1/1,500; przez 30 minut w 40 °C). Płukać w buforze do płukania między każdym krokiem.
  16. Umyj szkiełka i wystawij je na działanie 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) przez 30 s.
  17. Natychmiast nałóż podłoże mocujące na każde szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na wycinku tkanki.
  18. Przechowywać tkanki poziomo w uchwycie na szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.

3. Mikroskopia i analiza danych

UWAGA: Dane Multiplex ISH mogą być obrazowane za pomocą szerokiej gamy instrumentów z odpowiednimi filtrami. Jednak preferowaną metodą obrazowania jest mikroskopia konfokalna z obiektywami 20x i 63x (olej); Zapoznaj się z dyskusją, aby poznać przyczyny. Patrz Rysunek 2 w celu określenia optymalnego stosunku sygnału do szumu.

  1. Użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w linie laserowe o długości fali 488, 561 i 633 nm. Należy zastosować następujące parametry akwizycji (zob. tabela 1): Opal 690 (HeNe 633 nm, zakres wykrywania 668-696 nm, moc 2,0, wzmocnienie 724); Opal 570 (laser DPSS 561 nm, zakres detekcji 579-627 nm,
  2. Aby poprawić jakość obrazów, nabierz ze średnią linii 4 i rozmiarem piksela co najmniej 1024 x 1024.
    UWAGA: Powyższe parametry są podane tylko jako przykład, a modyfikacje są zalecane w zależności od jednego instrumentu, powiększenia (20x lub 63x), poziomów ekspresji i endogennych poziomów fluorescencji dla danej tkanki.
  3. Gdy parametry akwizycji są zadowalające, zbierz obrazy przy użyciu tych samych ustawień. Przypisz fałszywe kolory do każdego kanału, aby ułatwić wizualizację.
    UWAGA: Na przykład czerwony (Phox2b lub Prdm12), cyjan (Cck1r), żółty (Ghsr) i szary (DAPI).
  4. Przeprowadź zliczanie komórek za pomocą obrazów cyfrowych, identyfikując zarys profili RNAscope-dodatnich z jednym jądrem lekko wybarwionym DAPI. Oblicz procent profili RNAdodatnich wyrażających każdy transkrypt [Rysunek 3A-C].
  5. Aby poprawić rygor i dokładność szacunków, policz co najmniej 2000 profili neuronalnych od co najmniej 4 różnych zwierząt. Liczenie należy wykonywać oddzielnie od lewego i prawego zwoju.
  6. Wprowadź dane na wykresie kołowym z łączną liczbą zliczonych profili.
  7. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby uzyskać obrazy i zszyć ze sobą obrazy 20x. Użyj ImageJ-Fiji i innego oprogramowania do zdjęć i projektowania, aby wygenerować końcowe płyty. Dopasowania kontrastu i jasności można stosować równomiernie do wszystkich obrazów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć metodę RNAScope można stosować u zwierząt w każdym wieku, płci lub o dowolnym podłożu genetycznym, zaleca się pracę z młodymi osobnikami dorosłymi (<3 miesiąca życia). Wynika to z faktu, że artefakty fluorescencyjne (np. lipofuscyna) są powszechne w neuronach starszych zwierząt41. Zwoje utrwalone w formalinie pochodzące od starszych myszy często wykazują zaskakująco intensywną endogenną fluorescencję, którą można łatwo pomylić z rzeczywistym barwieniem (Rysunek 1A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika ISH została wynaleziona pod koniec lat sześćdziesiątychXX wieku 42. Jednak dopiero w połowie lat 80. XX wieku zaczęto go stosować do wykrywania mRNA w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym43,44. Biorąc pod uwagę niejednorodność układu nerwowego i nawracające problemy z przeciwciałami, lokalizacja określonego transkryptu na poziomie komórkowym pozostaje nieocenionym narzędziem. Niemniej jednak tradycyjne metody ISH pozostały pra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Neuroanatomię/Histologię/Mózg Injection Core, finansowaną przez grant NIH #5P01DK119130-02. Autorzy pragną podziękować za pomoc UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (kierowanej przez dr Phelpsa) i jej personelu (Abhijit Bugde i Marcel Mettlen), wspieranej częściowo przez NIH Grant #1S10OD021684-01, wspólny zasób Harold C. Simmons Cancer Center, wspierany częściowo przez NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10xPBS Fisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763-80
° Czamrażarka PHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Oprogramowanie dozdjęć i projektowania
Piec do pieczeniaThermo ScientificModel: 658
Mikroskop konfokalnyZeissLSM880 Airyscan
Szkło osłonoweLaboratoria Badań Mózgu2460-1.5D
KriostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 KleszczeFST11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lmedium montażowe
Piec do hybrydyzacjiw piecu
Długopis hydrofobowyVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FidżiNIH
Duże nożyczkiHenry Schein100-7561
Mikroprobówki wirówkoweVWR20170-333
Minipompa o zmiennym przepływieFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTBiomarker fluorescencyjny
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTBiomarker fluorescencyjny
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTBiomarker fluorescencyjny
ProLong Gold Podłoże montażowe Antifade Mountantdo komórek znakowanych fluorescencyjnie
RNAscope Multiplex Fluorescencyjny zestaw odczynników v2ACD /Bio-Techne323100multiplex
sonda RNAscope Mysz Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
Sonda RNAscope Mysz DapBACD /Bio-Techne310043
Sonda RNAscope Mysz GhsrACD /Bio-Techne
Sonda RNAscope Mysz Phox2b-C2ACD / Bio-Techne407861-C2
Sonda RNAscope Mysz Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Roztwór odkażający Rnazy
Małe nożyczki preparacyjneProwadnice
Superfrost PlusFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
Instrukcja obsługiACD323100 USM
Vannas Nożyczki sprężynoweRobozRS 5620
Oprogramowanie do obrazowania ZENZeiss
Adobe HybEZ426141 Millipore Sigma Z265977

Bibliografia

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Receptory sprz one z bia kiem Gmultipleksowa hybrydyzacja in situ ISHzwoje szyjne nerwu b dnegotechnologia RNAscopemikroskopia konfokalnareceptor cholecystokininyreceptor grelinymarker Phox2b
Wykrywanie ekspresji receptora sprzężonego z białkiem G w mysich neuronach doprowadzających nerwu błędnego za pomocą hybrydyzacji Multiplex In Situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.