Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Summary

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Abstract

Ubikwityna to małe białko o masie 8,6 kDa, które jest kluczowym składnikiem układu ubikwityna-proteasom. W związku z tym może wiązać się z różnorodnym układem białek o wysokiej specyficzności, ale niskim powinowactwie. Poprzez wyświetlanie fagów, warianty ubikwityny (UbV) mogą być modyfikowane w taki sposób, aby wykazywały lepsze powinowactwo do ubikwityny typu dzikiego i zachowywały specyficzność wiązania z białkami docelowymi. Wyświetlanie fagów wykorzystuje bibliotekę fagów, w której białko płaszcza pIII nitkowatego bakteriofaga M13 (wybrane, ponieważ jest wyświetlane zewnętrznie na powierzchni faga) jest łączone z UbV. Specyficzne reszty ludzkiej ubikwityny typu dzikiego są miękkie i randomizowane (tj. Istnieje tendencja do natywnej sekwencji typu dzikiego) w celu wytworzenia UbV, dzięki czemu unika się szkodliwych zmian w konformacji białka, wprowadzając jednocześnie różnorodność niezbędną do promowania nowych interakcji z białkiem docelowym. Podczas procesu wyświetlania fagów te UbV są eksprymowane i wyświetlane na białkach płaszcza fagowego i analizowane w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania. UbV, które wykazują korzystne interakcje wiążące z białkiem docelowym, są zatrzymywane, podczas gdy słabe spoiwa są wypłukiwane i usuwane z puli bibliotecznej. Zatrzymane UbV, które są przyłączone do cząstki faga zawierającej odpowiadający jej fagimid, są eluowane, amplifikowane i zagęszczane, aby można je było przetasować z tym samym białkiem docelowym w kolejnej rundzie wyświetlania faga. Zazwyczaj wykonuje się do pięciu rund pokazu fagów, podczas których wywierana jest silna presja selekcyjna na UbV, które wiążą się słabo i/lub rozwiązle, tak że te o wyższym powinowactwie są skoncentrowane i wzbogacone. Ostatecznie UbV, które wykazują wyższą specyficzność i/lub powinowactwo do białka docelowego niż ich odpowiedniki typu dzikiego, są izolowane i mogą być charakteryzowane poprzez dalsze eksperymenty.

Introduction

Zrozumienie szczegółów molekularnych interakcji białko-białko jest kluczowe dla nakreślenia mechanizmów transdukcji sygnału procesów biologicznych, szczególnie tych, które przyczyniają się do klinicznie ważnych chorób. W ostatnich latach wyświetlanie fagów zostało wykorzystane jako praktyczna i dostępna metoda izolowania białek/peptydów o znacznie lepszym wiązaniu z pożądanym białkiem docelowym^1,2,3,4, które z kolei mogą być używane jako wewnątrzkomórkowe sondy interakcji białko-białko.

Ubikwitynacja to kaskada aktywności enzymatycznych (enzym aktywujący E1 → enzym sprzężony z E2 → ligazy E3), które kowalencyjnie sprzęgają ubikwitynę (Ub) z substratami białkowymi, aby skierować je do degradacji lub pośredniczyć w zmianach sygnalizacji komórkowej. Ponadto deubikwitynazy katalizują usuwanie ubikwityny z białek. Dlatego w komórkach występują tysiące zależnych od Ub oddziaływań białko-białko, z których zdecydowana większość rozpoznaje wspólną powierzchnię o niskim powinowactwie, ale wysokiej specyficzności, aby umożliwić słabe interakcje przez duże i zróżnicowane powierzchnie.

Ernst et al. wprowadzili mutacje do znanych regionów wiążących Ub, aby sprawdzić, czy mogą zwiększyć powinowactwo wiązania do interesującego białka, zachowując jednocześnie wysoką selektywność⁵. Opracowano bibliotekę kombinatoryczną zawierającą ponad 10 miliardów (7,5 x 10¹⁰) wariantów Ub (UbV) z mutacjami w pozycjach na powierzchni Ub, które pośredniczą w znanych interakcjach Ub-białko. Biblioteka ta składała się z fagów, które wyrażają białko płaszcza bakteriofaga M13 pIII połączone ze zróżnicowanymi UbV. W związku z tym poszczególne UbV mogą być wyświetlane na powierzchni faga za pośrednictwem białka płaszcza po ekspresji. Podczas procesu selekcji fagi, które wykazują UbVs ze znacznymi interakcjami wiążącymi z białkiem docelowym, zostaną zachowane i wzbogacone w kolejnych rundach wyświetlania faga, podczas gdy fagi wykazujące UbV, które słabo wiążą się z białkiem docelowym, są wypłukiwane i usuwane z puli fagów. Zatrzymane cząstki fagów zawierają fagiamid odpowiadający wyświetlanemu przez nie UbV, co pozwala na ich sekwencjonowanie i dalsze charakteryzowanie po wyizolowaniu.

Korzystając z tej strategii inżynierii białkowej, opracowano inhibitory UbV dla ludzkich deubikwitynaz^{5 i proteaz} wirusowych⁶. Co ważne, wygenerowaliśmy hamujące UbV dla ludzkich ligaz E3 z rodziny HECT poprzez przejęcie miejsca wiązania E2 i aktywację UbV, które zajmują egzozyt wiążący Ub w domenie HECT⁷. Możemy również hamować monomeryczne E3 z rodziny RING, celując w miejsce wiązania E2 i indukować dimeryzację UbV, aby aktywować homodimeryczne RING E3s⁸. W przypadku wielopodjednostkowych RING E3s, UbV mogą osiągnąć hamowanie poprzez celowanie w podjednostkę RING (np. dla APC/C complex⁹) lub zakłócanie tworzenia kompleksu (np. dla SCF E3s¹⁰). Reasumując, UbV można wykorzystać do systematycznego badania interakcji białko-białko w systemie Ub-proteasom (UPS), dzięki czemu możemy lepiej rozszyfrować mechanizmy biochemiczne enzymów UPS oraz zidentyfikować i zwalidować funkcjonalne miejsca interwencji terapeutycznej.

Poniższy protokół opisuje, jak wykorzystać wcześniej wygenerowaną bibliotekę UbV wyświetlaną przez fagi do celowania w interesujące białko i jak wzbogacić spoiwa UbV, które oddziałują z białkiem docelowym poprzez kolejne rundy wyświetlania faga.

Protocol

1. Przygotowanie odczynnika

1. PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami): Wymieszaj 50 ml 10 x PBS roztworu z 450 ml ultraczystego H₂O. Sterylizuj przez filtrację i przechowuj w temperaturze 4 °C lub pokojowej (~20-25 °C).
2. 10% BSA (albumina surowicy bydlęcej): Powoli dodawać 1 g BSA do 7 ml ultraczystego_H2Oi mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia (bez grudek). Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość osiągnie 10 ml. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Bufor PB (PBS uzupełniony 1% BSA): Powoli dodawać 5 g BSA do 400 ml ultraczystego_H2Oi 50 ml PBS i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia (bez grudek). Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 500 ml. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Bufor PBT (PBS uzupełniony 1% BSA i 0,05% Tween 20): Powoli dodawać 5 g BSA do 400 ml ultraczystego_H2Oi 50 ml PBS i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia (bez grudek). Dodać 250 μl tabletu Tween 20. Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 500 ml. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Bufor PT (PBS uzupełniony 0,05% Tween 20): Wymieszaj 1 ml Tween 20 z 400 ml PBS. Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 2 L. Sterylizuj przez filtrację i przechowuj w temperaturze 4 °C lub pokojowej (~20-25 °C).
6. Rosół 2YT: Dodaj 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl do 800 ml ultraczystego H₂O i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia (bez grudek). Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 1 L. Sterylizuj w autoklawie i przechowuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
7. Płytki LB / carb: Dodaj 12,5 g gotowej mieszanki LB i 7,5 g agaru do 400 ml H₂O. Uzupełnij ultraczystym H₂O, aż ostateczna objętość wyniesie 500 ml i sterylizuj w autoklawie. Upewnij się, że agar jest całkowicie rozpuszczony i poczekaj, aż ostygnie do temperatury poniżej 60 °C. Dodaj 500 μl 100 mg karbenicyliny, dobrze wymieszaj i wlej do talerza. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
8. Płytki LB/tet: Dodać 12,5 g gotowej mieszaniny LB i 7,5 g agaru do 400 ml ultraczystego_H2O. Uzupełnić ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 500 ml i sterylizować w autoklawie. Upewnij się, że agar jest całkowicie rozpuszczony i poczekaj, aż ostygnie do temperatury poniżej 60 °C. Dodać 500 μl 10 mg tetracykliny, dobrze wymieszać i przelać na talerz. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
9. 20% PEG (glikol polietylenowy)/2,5 M NaCl: Dodać 50 g PEG-8000 i 36,5 g NaCl do 200 ml ultraczystego_H2O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
   UWAGA: Może to chwilę potrwać; Ogrzewanie może pomóc. Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 250 ml. Sterylizować przez filtrację lub autoklawowanie.
10. 0,1 M HCl: Wymieszaj 20 ml 1 M HCl ze 180 ml ultraczystego H₂O. Sterylizuj przez filtrację i przechowuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11,0): Dodaj 6,1 g zasady Tris do 40 ml ultraczystego H₂O. Dostosuj pH do 11,0 za pomocą HCl i mieszaj, aż Tris całkowicie się rozpuści. Uzupełnij ultraczystym_H2O, aż ostateczna objętość wyniesie 50 ml. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
12. 100 mg/ml (1000x) karbenicyliny: Dodać 2 g soli disodowej karbenicyliny do 20 ml ultraczystego_H2O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
13. 50 mg/ml (1000x) kanamycyny: Dodać 1 g siarczanu kanamycyny do 20 ml ultraczystego_H2O. Mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
14. 10 mg/ml (1000x) tetracykliny: Dodać 0,2 g chlorowodorku tetracykliny do 20 ml 70% etanolu. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Preparat białkowy

1. Oznaczyć stężenie docelowego białka wyjściowego w μM. Najwygodniejszym sposobem oceny stężenia białka jest pomiar absorbancji białka wyjściowego przy 280 nm. Jeśli stężenie jest znane w mg/ml, przelicz je na μM, używając masy cząsteczkowej białka docelowego. W zależności od interesującego białka można zastosować szereg metod; zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać szczegółowe informacje.
   UWAGA: Jeśli białko jest obcięte (specyficzna domena/motyw białkowy) lub oznaczone, pamiętaj, aby uwzględnić te zmiany masy cząsteczkowej podczas konwersji z mg/ml na μM.
2. Przygotuj trzy probówki do mikrowirówek oznaczone "runda 1", "runda 2/3" i "runda 4/5".
   1. Obliczyć objętość białka niezbędną do rozcieńczenia go do 1 μM w 800 μl PBS i podzielić tę objętość do probówek bez dodawania PBS.
      UWAGA: Jeśli ilość dostępnego białka docelowego jest niska, stężenie można obniżyć nawet do 0,25 μM.

3. Przygotowanie do pierwszej rundy selekcji

1. Przygotuj kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do drugiej rundy selekcji.
   1. Zaszczepić 5 ml 2YT/tet dobrze wyizolowaną kolonią Escherichia coli i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
2. Pokryj talerz na pierwszą rundę selekcji.
   1. Rozcieńczyć białko docelowe w probówce "okrągłej 1" odpowiednią ilością PBS i podwielokrotnością 100 μl do ośmiu dołków 96-dołkowej płytki wiążącej (tj. płytki docelowej).
      UWAGA: Wyświetlanie fagów można wykonać jednocześnie dla czterech różnych białek na jednej płytce, pokrywając dołki w rogach płytki.
   2. Opcjonalna kontrola: Jeśli białko docelowe jest znakowane, na przykład GST lub MBP (białko wiążące maltozę), pokryj osiem dołków w innej 96-dołkowej płytce wiążącej 100 μl roztworu 1 μM zawierającego odpowiedni znacznik epitopu. Zostanie to wykorzystane do usunięcia niepożądanych fagów, które wiążą się ze znacznikiem w sposób niespecyficzny.
   3. Potrząsać płytką (płytkami) przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.

4. Pierwsza runda wyboru

1. Przygotuj drugą rundę wejściową.
   1. Zaszczepić 30 ml 2YT/tet 200 μl kultury siewnej z kroku 3.1.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym z prędkością 200 obr./min, aż bakterie znajdą się w fazie środkowej (OD₆₀₀ 0,6 - 0,8). Trwa to około trzech godzin.
2. Blokuj tarczę celowniczą.
   1. Usuń roztwór powlekający z talerza lub obu płytek, jeśli została wykonana płyta kontrolna, odwracając i potrząsając zlewem. Osusz na ręcznikach papierowych.
   2. Dodać 300 μl buforu PB do każdej powlekanej studzienki.
   3. Usuń bufor PB jak w kroku 4.2.1 i dodaj kolejne 200 μl buforu PB.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.
3. Przygotuj bibliotekę fagów.
   1. Rozmrozić bibliotekę fagów na lodzie i rozcieńczyć ją do 100-krotności różnorodności biblioteki w PBS. Na przykład, jeśli różnorodność biblioteki wynosi 1 x 10¹⁰, a stężenie biblioteki wynosi 1 x 10¹³, rozcieńcz bibliotekę tak, aby stężenie wynosiło 1 x 10¹². W przypadku używanych tutaj bibliotek należy je rozcieńczyć 10-krotnie w PBS, łącząc 1 ml biblioteki z 9 ml PBS.
      UWAGA: Różnorodność biblioteki powinna zostać określona podczas tworzenia biblioteki i nie może być łatwo oceniona w inny sposób. Stężenie w bibliotece można określić poprzez inokulację komórek E. coli w środkowej fazie logarytmicznej (OD₆₀₀ 0,6 - 0,8) i posiew na LB/carb.
   2. Dodać 1/5 objętości PEG/NaCl. Na przykład dla 10 ml wcześniej rozcieńczonej biblioteki dodaj 2 ml PEG/NaCl.
   3. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
   4. Wirować przy 11 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie odwirowywać przez 2 minuty, aby usunąć pozostały supernatant.
      UWAGA: Umieść rurkę w wirniku w tej samej orientacji po raz drugi, ponieważ jako pierwsza utrzymywała pelety w tym samym miejscu, dzięki czemu łatwiej będzie je zobaczyć.
   5. Delikatnie zawiesić osad faga w 1 ml PBT na białko. W przypadku czterech białek ponownie zawiesić osad w 4 ml PBT.
      UWAGA: Staraj się nie dotykać granulatu i nie wprowadzaj pęcherzyków powietrza.
4. Wyświetlić do docelowego białka (białek) docelowego.
   1. Opcjonalna kontrola: Dodać 100 μl biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki na płytce kontrolnej. Inkubować w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min i przenieść bibliotekę z płytki kontrolnej na płytkę docelową. Pomiń krok 4.4.2.
   2. Usunąć bufor PB z płytki docelowej, jak w kroku 4.2.1 i dodać 100 μl biblioteki fagów do każdej powlekanej studzienki.
   3. Inkubować w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.
5. Elute wokół jednego faga.
   1. Usunąć bibliotekę fagów i przemyć powlekane studzienki czterokrotnie buforem PT. Odwróć talerz i postukaj w ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople.
      UWAGA: Jeśli wiele białek docelowych jest pokrytych na jednej płytce, staraj się zminimalizować przepływ wszystkich kolejnych roztworów między studzienkami.
   2. Dodać 100 μl 0,1 M HCl do każdej pokrytej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z wytrząsaniem orbitalnym 300 obr./min.
   3. Zneutralizować pH, dodając 12,5 μl 1 M Tris-HCl (pH 11) do każdej powlekanej studzienki.
   4. Zebrać wymyte fagi ze wszystkich 8 dołków w jednej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pipetować w górę i w dół podczas przenoszenia, aby roztwory były jednorodne i odessać cały płyn z dołków.
   5. Dodać 10% BSA do połączonego eluowanego faga do końcowego stężenia 1%. Aby uzyskać typową okrągłą objętość elucji wynoszącą 950 μl, dodaj 95 μl 10% BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C. To jest okrągłe pierwsze wyjście.

5. Przygotowanie do kolejnych rund selekcji

1. Przygotować kulturę nasion do hodowli faga wejściowego do następnej rundy selekcji, jak w kroku 3.1.
2. Pokryj płytkę w trzeciej rundzie selekcji, jak w kroku 3.2, zmianami opisanymi poniżej.
   1. Pokryj tylko cztery dołki na białko w 96-dołkowej płytce wiążącej. Do odpowiedniej rundy należy użyć połowy zawartości probówek "round 2/3" lub "round 4/5". W razie potrzeby rozcieńczyć zawartość tych probówek, aby uniknąć osadzania się białek w roztworze.
3. Przygotuj dane wejściowe faga do następnej rundy selekcji.
   1. Użyj połowy okrągłego jednego wyjścia z kroku 4.5.5, aby zaszczepić 3 ml komórek środkowej fazy logarytmicznej z kroku 4.1. Aby uzyskać typową rundę z jednym wyjściem, zaszczepić 500 μl produktu.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   3. Dodać pomocniczy M13K07 do końcowego stężenia 1 x^{10 10} PFU/ml.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   5. Przenieś całe 3 ml kultury do 30 ml 2YT/carb/kan. Rośnie przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   6. Następnego dnia przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia komórek.
   7. Zdekantować supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wymieszać z 8 ml PEG/NaCl i inkubować na lodzie przez 10 minut.
   8. Wirować przy 11 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie odwirować przez 2 minuty
      UWAGA: Umieść rurkę w wirniku w tej samej orientacji po raz drugi, ponieważ jako pierwsza utrzymywała pelety w tym samym miejscu, dzięki czemu łatwiej będzie je zobaczyć.
   9. Zawiesić osad fagowy w 800 μl PBT, aby był w pełni jednorodny i nie były widoczne żadne grudki.
   10. Przenieść roztwór fagowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 16 200 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C do osadzania szczątków.
   11. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To są dane wejściowe dla następnej rundy selekcji.
4. Opcjonalnie: Mianowanie roztworów wejściowych i wyjściowych.
   1. Użyj 500 μl kultury nasion E. coli, aby zaszczepić 5 ml 2YT/tet i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min, aż bakterie znajdą się w połowie fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ 0,6 - 0,8). Trwa to około 1 godziny.
   2. Rozcieńczyć roztwory wejściowe/wyjściowe fagów do ^10-3 - ^10-5 w PBS i dodać 10 μl każdego rozcieńczenia do 90 μl hodowanych komórek.
      UWAGA: Rozcieńczone roztwory fagów należy natychmiast uzytkownika, ponieważ z czasem zaadsorbuje się w probówce, a przemiany mogą dawać wyniki fałszywie ujemne.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   4. Tabliczka 5 μl na oddzielnych płytkach LB/carb.
      UWAGA: Ilość platerowanych powłok jest zmienna w zależności od poprzednich wyników/osobistych preferencji.

6. Kolejne rundy selekcji

1. Wykonaj wszystkie kolejne rundy wraz z przygotowaniem, jak to zostało zrobione odpowiednio w krokach 3 i 4, z różnicami zaznaczonymi poniżej.
   1. Użyj danych wejściowych wytworzonych w poprzedniej rundzie jako źródła fagów, a nie biblioteki. Pokryj 4 dołki na białko docelowe 100 μl materiału wejściowego faga uzyskanego z poprzedniej rundy. Pozostałe dawki wejściowe fagów należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Spraw, aby etap prania w 4.5.1 był bardziej rygorystyczny z każdą rundą selekcji. Runda pierwsza wymaga mycia 4 razy, runda druga wymaga 6 razy, runda trzecia wymaga 8 razy, a rundy czwarta i piąta wymagają mycia 10 razy.
   3. Zmniejsz niektóre objętości w porównaniu z tymi użytymi w pierwszej rundzie, ponieważ kolejne rundy pokrywają tylko cztery studzienki zamiast ośmiu. Na przykład w kroku 4.5.5 do wyjścia faga dodaje się tylko 45 μl 10% BSA, a w kroku 5.3.1 tylko 250 μl wyjścia faga jest używane do inokulacji komórek.

7. Przetwarzanie po selekcji i izolacja fagów

1. Określ miano roztworów wejściowych i wyjściowych dla rund czwartej i piątej.
   1. Jeśli nie zostało to jeszcze zrobione w kroku 5.4, wykonaj te same kroki, aby określić miano w czwartej i piątej rundzie wyjściowym faga, najlepiej wytwarzając zakres 30-300 kolonii na kilku płytkach.
2. Hodowla i izolacja faga.
   1. Porcję 450 μL 2YT/carb/M13K07 do każdej probówki 96 mini probówek do hodowli.
   2. Wybierz dobrze odizolowane kolonie z dowolnej płytki z kroku 7.1, aby zaszczepić każdą probówkę.
      UWAGA: Użyj górnej połowy pudełka dla czterech wyjść, a dolnej połowy dla rund piątych.
   3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem orbitalnym 200 obr./min.
   4. Wirować przy 1 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Przenieś jak najwięcej supernatantu do nowego pudełka do hodowli mini probówek 96 bez naruszania osadu komórkowego i wyrzuć stary. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   6. Z nowego pudełka przenieś 100 μl z każdej probówki do 96-dołkowej niewiążącej płytki zawierającej 100 μl 50% glicerolu we wszystkich studzienkach. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C jako zapasowy zapas.

Results

Spoiwa produkowane z wyświetlacza fagowego mogą być weryfikowane i analizowane na wiele sposobów. Zaleca się, aby najpierw przystąpić do sekwencjonowania faga za pomocą starterów, które otaczają zróżnicowaną wstawkę w bibliotece fagów. Idealny eksperyment z wyświetlaniem fagów wykaże wyraźną skłonność do kilku sekwencji (Rysunek 1). Inne sekwencje również będą obecne, ale z mniejszą liczbą, pojawiając się bardziej jako szum tła. W podanym przykładzie, w którym przeprowadzono wyświetlanie fagów między ...

Discussion

Jak wspomniano w kroku 2.1 (przygotowanie białka), do oceny stężenia białka można zastosować różne metody, a każda z nich będzie miała unikalne zalety i wady w zależności od konkretnego białka docelowego użytego do wyświetlania fagów. Źródło szczegółowych opisów i protokołów dla popularnych metod zostało podane wcześniej¹¹.

Użycie faga zatrzymanego przez poprzednią rundę wyświetlania fagów jako danych wejściowych dla kolejnej rundy wzbogaca dobre spoiwa poprzez stopniow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0,65 mL, sterylny, 96/Rack, 10 Rack/opakowanie)	Fisher Scientific	14-222-198	Hodowla wyjść fagów po wyświetleniu faga.
BD Difco Odwodnione podłoża hodowlane: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Przygotowanie płytek do miareczkowania.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V	BioShop Canada	ALB001	Składnik buforowy.
Sól disodowa karbenicyliny 89,0-100,5% bezwodna	Millipore-Sigma	C1389-5G	Hodowla komórek zakażonych fagami.
Kompaktowa cyfrowa wytrząsarka do mikropłytek	Fisher Scientific	11-676-337	Wytrząsanie płytek podczas inkubacji z biblioteką fagów.
Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniająca	Fisher Scientific	07-200-684	Uszczelnianie zapasów glicerolu fagowego.
Dehydratyzowany agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Przygotowanie płytek do miareczkowania.
DS-11 Spektrofotometr/fluorometr	DeNovix	DS-11 FX+	Pomiar stężenia białka.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, nieobrobiona, z dnem w kształcie litery U	Fisher Scientific 7000133		Przechowywanie zapasów glicerolu fagowego.
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-500	Elucja fagów.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemicznie kompetentny E. coliFisher	Scientific	C854003	Szczep bakteryjny do infekcji fagowej.
Siarczan kanamycyny	Fisher Scientific	AAJ1792406	Hodowla komórek pomocniczych zakażonych fagami M13K07.
M13KO7 pomocniczy	Nowa Anglia Biolabs	N0315S	Zezwalaj na pakowanie i wydzielanie fagów.
MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalna	laboratoryjna Fisher Scientific	11-676-076	Hodowla komórek bakteryjnych.
Nunc MaxiSorp 96-dołkowa mikropłytka, płaskie dno	Life Technologies	44-2404-21	Białka unieruchamiające.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10X Roztwór	Fisher Scientific	BP3994	Składnik buforowy/pożywka do reprodukcji fagów.
Folie poliestrowe do testu ELISA i inkubacji	VWR	60941-120	Pokrywanie mikropłytek podczas inkubacji.
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Wytrącanie fagów.
Chlorek sodu	Millipore-Sigma	S3014	Wytrącanie fagów.
Sterylne plastikowe probówki hodowlane: Półprzezroczysty polipropylen	Fisher Scientific	14-956-1D	Wkłady do hodowli fagów.
Chlorowodorek tetracykliny	Fisher Scientific	BP912-100	Hodowla komórek E. coli OmniMax.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizujący eluowany roztwór fagowy.
Trypton w proszku	Fisher Scientific	BP1421-2	Składnik pożywki do wzrostu komórek.
Tween 20	Komponent Fisher Scientific	BP337500	Buffer.
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422-2	Składnik pożywki do wzrostu komórek.