Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62950

⸱

27 sierpnia 2021

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Streszczenie

Ubikwityna to małe białko o masie 8,6 kDa, które jest kluczowym składnikiem układu ubikwityna-proteasom. W związku z tym może wiązać się z różnorodnym układem białek o wysokiej specyficzności, ale niskim powinowactwie. Poprzez wyświetlanie fagów, warianty ubikwityny (UbV) mogą być modyfikowane w taki sposób, aby wykazywały lepsze powinowactwo do ubikwityny typu dzikiego i zachowywały specyficzność wiązania z białkami docelowymi. Wyświetlanie fagów wykorzystuje bibliotekę fagów, w której białko płaszcza pIII nitkowatego bakteriofaga M13 (wybrane, ponieważ jest wyświetlane zewnętrznie na powierzchni faga) jest łączone z UbV. Specyficzne reszty ludzkiej ubikwityny typu dzikiego są miękkie i randomizowane (tj. Istnieje tendencja do natywnej sekwencji typu dzikiego) w celu wytworzenia UbV, dzięki czemu unika się szkodliwych zmian w konformacji białka, wprowadzając jednocześnie różnorodność niezbędną do promowania nowych interakcji z białkiem docelowym. Podczas procesu wyświetlania fagów te UbV są eksprymowane i wyświetlane na białkach płaszcza fagowego i analizowane w stosunku do białka będącego przedmiotem zainteresowania. UbV, które wykazują korzystne interakcje wiążące z białkiem docelowym, są zatrzymywane, podczas gdy słabe spoiwa są wypłukiwane i usuwane z puli bibliotecznej. Zatrzymane UbV, które są przyłączone do cząstki faga zawierającej odpowiadający jej fagimid, są eluowane, amplifikowane i zagęszczane, aby można je było przetasować z tym samym białkiem docelowym w kolejnej rundzie wyświetlania faga. Zazwyczaj wykonuje się do pięciu rund pokazu fagów, podczas których wywierana jest silna presja selekcyjna na UbV, które wiążą się słabo i/lub rozwiązle, tak że te o wyższym powinowactwie są skoncentrowane i wzbogacone. Ostatecznie UbV, które wykazują wyższą specyficzność i/lub powinowactwo do białka docelowego niż ich odpowiedniki typu dzikiego, są izolowane i mogą być charakteryzowane poprzez dalsze eksperymenty.

Wprowadzenie

Zrozumienie szczegółów molekularnych interakcji białko-białko jest kluczowe dla nakreślenia mechanizmów transdukcji sygnału procesów biologicznych, szczególnie tych, które przyczyniają się do klinicznie ważnych chorób. W ostatnich latach wyświetlanie fagów zostało wykorzystane jako praktyczna i dostępna metoda izolowania białek/peptydów o znacznie lepszym wiązaniu z pożądanym białkiem docelowym1,2,3,4, które z kolei mogą być używane jako wewnątrzkomórkowe sondy interakcji białko-białko.

Ubikwitynacja to kaskada aktywności enzymatycznych (enzym aktywujący E1 → enzym sprzężony z E2 → ligazy E3), które kowalencyjnie sprzęgają ubikwitynę (Ub) z substratami białkowymi, aby skierować je do degradacji lub pośredniczyć w zmianach sygnalizacji komórkowej. Ponadto deubikwitynazy katalizują usuwanie ubikwityny z białek. Dlatego w komórkach występują tysiące zależnych od Ub oddziaływań białko-białko, z których zdecydowana większość rozpoznaje wspólną powierzchnię o niskim powinowactwie, ale wysokiej specyficzności, aby umożliwić słabe interakcje przez duże i zróżnicowane powierzchnie.

Ernst et al. wprowadzili mutacje do znanych regionów wiążących Ub, aby sprawdzić, czy mogą zwiększyć powinowactwo wiązania do interesującego białka, zachowując jednocześnie wysoką selektywność5. Opracowano bibliotekę kombinatoryczną zawierającą ponad 10 miliardów (7,5 x 1010) wariantów Ub (UbV) z mutacjami w pozycjach na powierzchni Ub, które pośredniczą w znanych interakcjach Ub-białko. Biblioteka ta składała się z fagów, które wyrażają białko płaszcza bakteriofaga M13 pIII połączone ze zróżnicowanymi UbV. W związku z tym poszczególne UbV mogą być wyświetlane na powierzchni faga za pośrednictwem białka płaszcza po ekspresji. Podczas procesu selekcji fagi, które wykazują UbVs ze znacznymi interakcjami wiążącymi z białkiem docelowym, zostaną zachowane i wzbogacone w kolejnych rundach wyświetlania faga, podczas gdy fagi wykazujące UbV, które słabo wiążą się z białkiem docelowym, są wypłukiwane i usuwane z puli fagów. Zatrzymane cząstki fagów zawierają fagiamid odpowiadający wyświetlanemu przez nie UbV, co pozwala na ich sekwencjonowanie i dalsze charakteryzowanie po wyizolowaniu.

Korzystając z tej strategii inżynierii białkowej, opracowano inhibitory UbV dla ludzkich deubikwitynaz5 i proteaz wirusowych6. Co ważne, wygenerowaliśmy hamujące UbV dla ludzkich ligaz E3 z rodziny HECT poprzez przejęcie miejsca wiązania E2 i aktywację UbV, które zajmują egzozyt wiążący Ub w domenie HECT7. Możemy również hamować monomeryczne E3 z rodziny RING, celując w miejsce wiązania E2 i indukować dimeryzację UbV, aby aktywować homodimeryczne RING E3s8. W przypadku wielopodjednostkowych RING E3s, UbV mogą osiągnąć hamowanie poprzez celowanie w podjednostkę RING (np. dla APC/C complex9) lub zakłócanie tworzenia kompleksu (np. dla SCF E3s10). Reasumując, UbV można wykorzystać do systematycznego badania interakcji białko-białko w systemie Ub-proteasom (UPS), dzięki czemu możemy lepiej rozszyfrować mechanizmy biochemiczne enzymów UPS oraz zidentyfikować i zwalidować funkcjonalne miejsca interwencji terapeutycznej.

Poniższy protokół opisuje, jak wykorzystać wcześniej wygenerowaną bibliotekę UbV wyświetlaną przez fagi do celowania w interesujące białko i jak wzbogacić spoiwa UbV, które oddziałują z białkiem docelowym poprzez kolejne rundy wyświetlania faga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

  1. PBS (bufor fosforanowy): zmieszać 50 mL 10x roztworu PBS z 450 mL wody ultrapure H2O. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (albumina surowicy wołowej): powoli dodać 1 g BSA do 7 mL wody ultrapure H2O i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 10 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. bufor PB (PBS uzupełniony o 1% BSA): powoli dodać 5 g BSA do 400 mL wody ultrapure H2O oraz 50 mL PBS i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. bufor PBT (PBS uzupełniony o 1% BSA i 0,05% Tween 20): powoli dodać 5 g BSA do 400 mL wody ultrapure H2O oraz 50 mL PBS i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dodać 250 µL Tween 20. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. bufor PT (PBS uzupełniony o 0,05% Tween 20): zmieszać 1 mL Tween 20 z 400 mL PBS. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 2 L. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
  6. pożywka 2YT: dodać 16 g tryptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl do 800 mL wody ultrapure H2O i mieszać do całkowitego rozpuszczenia (brak grudek). Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 1 L. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
  7. płytki LB/carb: dodać 12,5 g gotowej mieszanki LB i 7,5 g agaru do 400 mL H2O. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL i sterylizować w autoklawie. Upewnić się, że agar jest całkowicie rozpuszczony, i odczekać, aż ostygnie poniżej 60 °C. Dodać 500 µL karbenicyliny o stężeniu 100 mg/mL, dobrze wymieszać i wylać na płytki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. płytki LB/tet: dodać 12,5 g gotowej mieszanki LB i 7,5 g agaru do 400 mL wody ultrapure H2O. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 500 mL i sterylizować w autoklawie. Upewnić się, że agar jest całkowicie rozpuszczony, i odczekać, aż ostygnie poniżej 60 °C. Dodać 500 µL tetracykliny o stężeniu 10 mg/mL, dobrze wymieszać i wylać na płytki. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. 20% PEG (glikol polietylenowy)/2,5 M NaCl: dodać 50 g PEG-8000 i 36,5 g NaCl do 200 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Może to zająć trochę czasu; podgrzewanie może pomóc. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 250 mL. Sterylizować poprzez filtrację lub w autoklawie.
  10. 0,1 M HCl: zmieszać 20 mL 1 M HCl z 180 mL wody ultrapure H2O. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11,0): dodać 6,1 g bazy Tris do 40 mL wody ultrapure H2O. Dostosować pH do 11,0 za pomocą HCl i mieszać do całkowitego rozpuszczenia Tris. Dopełnić wodą ultrapure H2O do objętości końcowej 50 mL. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej (~20-25 °C).
  12. 100 mg/mL (1000x) karbenicylina: dodać 2 g soli disodowej karbenicyliny do 20 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  13. 50 mg/mL (1000x) kanamycyna: dodać 1 g siarczanu kanamycyny do 20 mL wody ultrapure H2O. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  14. 10 mg/mL (1000x) tetracyklina: dodać 0,2 g chlorowodorku tetracykliny do 20 mL 70% etanolu. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie białka

  1. Wyznacz stężenie roztworu białka docelowego w µM. Najwygodniejszym sposobem oceny stężenia białka jest pomiar absorbancji roztworu białka przy 280 nm. Jeśli stężenie jest znane w mg/mL, przelicz je na µM, korzystając z masy cząsteczkowej białka docelowego. W zależności od badanego białka można zastosować różne metody; szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja.
    UWAGA: Jeśli białko jest skrócone (konkretna domena/motyw białkowy) lub posiada znacznik, należy uwzględnić te zmiany w masie cząsteczkowej podczas przeliczania z mg/mL na µM.
  2. Przygotuj trzy probówki do mikrocentryfugi z etykietami „runda 1”, „runda 2/3” oraz „runda 4/5”.
    1. Oblicz objętość białka niezbędną do jego rozcieńczenia do stężenia 1 µM w 800 µL PBS i odnieś tę objętość do probówek bez dodawania PBS.
      ​UWAGA: Jeśli dostępna ilość białka docelowego jest mała, stężenie można obniżyć nawet do 0,25 µM.

3. Przygotowanie do pierwszej rundy selekcji

  1. Przygotuj kulturę startową do namnożenia fagów wykorzystanych w drugiej rundzie selekcji.
    1. Zaszczep 5 mL pożywki 2YT/tet dobrze odizolowaną kolonią Escherichia coli i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
  2. Pokryj płytkę do pierwszej rundy selekcji.
    1. Rozcieńcz białko docelowe w probówce „round 1” odpowiednią ilością PBS i nanieś aliquoty po 100 µL do ośmiu dołków 96-dołkowej płytki wiążącej (tj. płytki docelowej).
      UWAGA: Wyświetlanie fagowe (phage display) można przeprowadzić dla czterech różnych białek jednocześnie na jednej płytce, pokrywając dołki w narożnikach płytki.
    2. Opcjonalna kontrola: Jeśli białko docelowe posiada znacznik, taki jak GST lub MBP (maltose binding protein), pokryj osiem dołków w drugiej 96-dołkowej płytce wiążącej 100 µL roztworu o stężeniu 1 µM zawierającego odpowiedni znacznik epitopowy. Służy to do usunięcia niepożądanych fagów, które wiążą się nieswoiście ze znacznikiem.
    3. Wstrząsaj płytkę(i) przez noc w temperaturze 4 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.

4. Pierwsza runda selekcji

  1. Przygotowanie materiału wejściowego do drugiej rundy.
    1. Zaszczep 30 mL pożywki 2YT/tet 200 µL kultury startowej z kroku 3.1.
    2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm, aż bakterie osiągną średnią fazę logarytmiczną (OD600 Symbol równowagi statycznej ΣF=0, schemat ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił. 0,6 - 0,8). Trwa to około trzech h.
  2. Blokowanie płytki z celem.
    1. Usuń roztwór powlekający z płytki (lub z obu płytek, jeśli przygotowano płytkę kontrolną), odwracając ją i wstrząsając nad zlewem. Osusz delikatnie ręcznikami papierowymi.
    2. Dodaj 300 µL buforu PB do każdego powleczonego dołka.
    3. Usuń bufor PB w sposób opisany w kroku 4.2.1 i dodaj kolejne 200 µL buforu PB.
    4. Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.
  3. Przygotowanie biblioteki fagów.
    1. Rozmroź bibliotekę fagów na lodzie i rozcieńcz ją w PBS do stężenia 100-krotnie przekraczającego różnorodność biblioteki. Na przykład, jeśli różnorodność biblioteki wynosi 1 x 1010, a stężenie biblioteki 1 x 1013, rozcieńcz bibliotekę tak, aby stężenie wyniosło 1 x 1012. Dla bibliotek użytych w tym protokole rozcieńcz je 10-krotnie w PBS, łącząc 1 mL biblioteki z 9 mL PBS.
      UWAGA: Różnorodność biblioteki powinna zostać określona podczas jej tworzenia i nie można jej łatwo ocenić w inny sposób. Stężenie biblioteki można wyznaczyć, zaszczepiając komórki E. coli w średniej fazie logarytmicznej (OD600 Symbol równowagi statycznej ΣF=0, schemat ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił. 0,6 - 0,8) i wysiewając na LB/carb.
    2. Dodaj 1/5 objętości PEG/NaCl. Na przykład dla 10 mL wcześniej rozcieńczonej biblioteki dodaj 2 mL PEG/NaCl.
    3. Inkubuj na lodzie przez 30 min.
    4. Wirowarkuj przy 11 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C, odlej nadsącz i ponownie wiruj przez 2 min, aby osadzić pozostały nadsącz.
      UWAGA: Umieść probówkę w rotorze w tej samej orientacji co za pierwszym razem, aby osad pozostał w tym samym miejscu, co ułatwi jego dostrzeżenie.
    5. Delikatnie resuspenduj osad fagowy w 1 mL PBT na jedno białko. Dla czterech białek resuspenduj osad w 4 mL PBT.
      UWAGA: Staraj się nie dotykać osadu i nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.
  4. Ekspozycja fagów na białko(a) docelowe.
    1. Opcjonalna kontrola: Dodaj 100 µL biblioteki fagów do każdego powleczonego dołka na płytce kontrolnej. Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm, a następnie przenieś bibliotekę z płytki kontrolnej na płytkę z celem. Pomiń krok 4.4.2.
    2. Usuń bufor PB z płytki z celem w sposób opisany w kroku 4.2.1 i dodaj 100 µL biblioteki fagów do każdego powleczonego dołka.
    3. Inkubuj w temperaturze pokojowej (~20-25 °C) przez 1 h przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.
  5. Elucja fagów z pierwszej rundy.
    1. Usuń bibliotekę fagów i przemyj powleczone dołki czterokrotnie buforem PT. Odwróć płytkę i ostrożnie stuknij o ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie krople.
      UWAGA: Jeśli na jednej płytce powlecono wiele białek docelowych, staraj się zminimalizować przepływ wszystkich kolejnych roztworów między dołkami.
    2. Dodaj 100 µL 0,1 M HCl do każdego powleczonego dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min przy mieszaniu orbitalnym z prędkością 300 rpm.
    3. Zneutralizuj pH, dodając 12,5 µL 1 M Tris-HCl (pH 11) do każdego powleczonego dołka.
    4. Zbierz eluowane fagi ze wszystkich 8 dołków do jednej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL. Podczas przenoszenia pipetuj roztwór w górę i w dół, aby go ujednolicić i odessać cały płyn z dołków.
    5. Dodaj 10% BSA do zgromadzonych eluowanych fagów do stężenia końcowego 1%. Dla typowej objętości elucji z pierwszej rundy wynoszącej 950 µL dodaj 95 µL 10% BSA. Przechowuj w temperaturze 4 °C. Jest to materiał wyjściowy z pierwszej rundy.

5. Przygotowanie do kolejnych rund selekcji

  1. Przygotować kulturę startową do namnażania fagów wejściowych do następnej rundy selekcji zgodnie z krokiem 3.1.
  2. Pokryć płytkę dla trzeciej rundy selekcji zgodnie z krokiem 3.2, uwzględniając poniższe zmiany.
    1. Pokryć tylko cztery studzienki na białko w 96-dołkowej płytce wiążącej. Użyć połowy zawartości probówek „round 2/3” lub „round 4/5” dla odpowiedniej rundy. Rozcieńczyć zawartość tych probówek w razie potrzeby, aby zapobiec sedymentacji białek z roztworu.
  3. Przygotować fagi wejściowe do następnej rundy selekcji.
    1. Użyć połowy produktu z pierwszej rundy z kroku 4.5.5 do inokulacji 3 mL komórek w średniej fazie logarytmicznej z kroku 4.1. W przypadku typowego produktu z pierwszej rundy, inokulować 500 µL produktu.
    2. Inkubować w 37 °C przez 30 min przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
    3. Dodać faga pomocniczego M13K07 do stężenia końcowego 1 x 1010 PFU/mL.
    4. Inkubować w 37 °C przez 1 h przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
    5. Przenieść całe 3 mL kultury do 30 mL pożywki 2YT/carb/kan. Hodować przez noc w 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
    6. Następnego dnia przenieść kulturę do 50 mL probówki wirówkowej i wirować przy 11,000 x g przez 10 min w 4 °C, aby wytrącić komórki.
    7. Zlać nadosad z probówki do nowej probówki wirówkowej 50 mL, zmieszać z 8 mL PEG/NaCl i inkubować na lodzie przez 10 min.
    8. Wirować przy 11,000 x g przez 10 min w 4 °C, odrzucić nadosad i ponownie wirować przez 2 min.
      UWAGA: Podczas drugiego wirowania umieścić probówkę w rotorze w tej samej orientacji co za pierwszym razem, aby osad pozostał w tym samym miejscu, co ułatwi jego zauważenie.
    9. Resuspendować osad fagowy w 800 µL PBT tak, aby był całkowicie jednorodny i nie było widocznych grudek.
    10. Przenieść roztwór fagowy do probówki do mikrowirówki 1,5 mL i wirować przy 16,200 x g przez 4 min w 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń.
    11. Przenieść nadosad do nowej probówki do mikrowirówki. Stanowi on materiał wejściowy do następnej rundy selekcji.
  4. Opcjonalnie: Wyznaczyć miano roztworów wejściowych i wyjściowych.
    1. Użyć 500 µL kultury startowej E. coli do inokulacji 5 mL 2YT/tet i inkubować w 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm, aż bakterie osiągną średnią fazę logarytmiczną (OD600 Symbol równowagi statycznej ΣF=0, diagram ilustrujący koncepcje i obliczenia bilansu sił. 0,6 - 0,8). Zajmuje to około 1 h.
    2. Rozcieńczyć roztwory fagów wejściowych/wyjściowych do 10-3  - 10-5 w PBS i dodać 10 µL każdego rozcieńczenia do 90 µL hodowli komórek.
      UWAGA: Używać rozcieńczonych roztworów fagów natychmiast, ponieważ fagi z czasem adsorbują się do ścianek probówki, co może prowadzić do wyników fałszywie negatywnych w transformacjach.
    3. Inkubować w 37 °C przez 20 min przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
    4. Wysiać 5 µL na oddzielne płytki LB/carb.
      ​UWAGA: Ilość wysiewana jest zmienna i zależy od poprzednich wyników lub preferencji operatora.

6. Kolejne rundy selekcji

  1. Wszystkie kolejne rundy przeprowadzić wraz z przygotowaniami zgodnie z krokami 3 i 4 odpowiednio, z zastrzeżeniem różnic opisanych poniżej.
    1. W miejsce biblioteki jako źródła fagów należy wykorzystać materiał wejściowy otrzymany w poprzedniej rundzie. 4 studzienki na każde białko docelowe pokryć 100 µL materiału wejściowego fagów pozyskanego z poprzedniej rundy. Pozostałe ilości materiału wejściowego fagów przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Krok płukania opisany w punkcie 4.5.1 należy czynić bardziej rygorystycznym w każdej kolejnej rundzie selekcji. Runda pierwsza wymaga 4 płukań, runda druga 6 płukań, runda trzecia 8 płukań, a rundy czwarta i piąta wymagają odpowiednio 10 płukań.
    3. Należy zmniejszyć niektóre objętości w porównaniu do tych stosowanych w rundzie pierwszej, ponieważ w kolejnych rundach pokrywa się tylko cztery studzienki zamiast ośmiu. Na przykład w kroku 4.5.5 do materiału wyjściowego fagów dodaje się tylko 45 µL 10% BSA, a w kroku 5.3.1 do inokulacji komórek wykorzystuje się tylko 250 µL materiału wyjściowego fagów.

7. Przetwarzanie po selekcji i izolacja fagów

  1. Wyznaczyć miano roztworów wejściowych i wyjściowych dla rundy czwartej i piątej.
    1. Jeśli nie wykonano tego w kroku 5.4, przeprowadzić te same czynności w celu wyznaczenia miana fagów wyjściowych z rund czwartej i piątej, dążąc do uzyskania od 30 do 300 kolonii na kilku płytkach.
  2. Hodowla i izolacja fagów.
    1. Do każdej probówki w 96-probówkowym stojaku do kultur mini przenieść 450 µL pożywki 2YT/carb/M13K07.
    2. Wybrać dobrze odizolowane kolonie z dowolnych płytek z kroku 7.1, aby zaszczepić każdą probówkę.
      UWAGA: Górną połowę stojaka wykorzystać dla wyników z rundy czwartej, a dolną dla wyników z rundy piątej.
    3. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 200 rpm.
    4. Wirować przy 1,200 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść jak największą ilość supernatantu do nowego 96-probówkowego stojaka do kultur mini, nie naruszając osadu komórkowego, a stary stojak zutylizować. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Z nowego stojaka przenieść 100 µL z każdej probówki na płytkę 96-dołkową typu non-binding, w której każdym dołku znajduje się 100 µL 50% glicerolu. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C jako zapasowy stok.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wiążące białka otrzymane metodą phage display można weryfikować i analizować na wiele sposobów. Zaleca się rozpoczęcie od sekwencjonowania fagów z użyciem starterów flankujących zróżnicowaną wstawkę w bibliotece fagemidowej. Idealny eksperyment phage display wykaże wyraźną preferencję w kierunku kilku sekwencji (Rycina 1). Obecne będą również inne sekwencje, ale w mniejszej liczbie, występując raczej jako szum tła. W przedstawionym przykładzie, w którym phage display przeprowadzono pomiędzy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak wspomniano w kroku 2.1 (przygotowanie białka), do oceny stężenia białka można zastosować różne metody, a każda z nich będzie miała unikalne zalety i wady w zależności od konkretnego białka docelowego użytego do wyświetlania fagów. Źródło szczegółowych opisów i protokołów dla popularnych metod zostało podane wcześniej11.

Użycie faga zatrzymanego przez poprzednią rundę wyświetlania fagów jako danych wejściowych dla kolejnej rundy wzbogaca dobre spoiwa poprzez stopniow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Technologia wariantu ubikwityny została opracowana w laboratorium Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ jest obecnie stypendystą CIFAR Azrieli Global Scholar w programie Humans & The Microbiome Program. Badania te zostały sfinansowane z grantów NSERC Discovery Grants przyznanych WZ (RGPIN-2019-05721).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Axygen Mini Tube System (0,65 mL, sterylny, 96/Rack, 10 Rack/opakowanie)Fisher Scientific14-222-198Hodowla wyjść fagów po wyświetleniu faga.
BD Difco Odwodnione podłoża hodowlane: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher ScientificDF0446-17-3Przygotowanie płytek do miareczkowania.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja VBioShop CanadaALB001Składnik buforowy.
Sól disodowa karbenicyliny 89,0-100,5% bezwodnaMillipore-SigmaC1389-5GHodowla komórek zakażonych fagami.
Kompaktowa cyfrowa wytrząsarka do mikropłytekFisher Scientific11-676-337Wytrząsanie płytek podczas inkubacji z biblioteką fagów.
Corning Microplate Aluminiowa taśma uszczelniającaFisher Scientific07-200-684Uszczelnianie zapasów glicerolu fagowego.
Dehydratyzowany agarFisher ScientificDF0140-01-0Przygotowanie płytek do miareczkowania.
DS-11 Spektrofotometr/fluorometrDeNovixDS-11 FX+Pomiar stężenia białka.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, nieobrobiona, z dnem w kształcie litery UFisher Scientific 7000133Przechowywanie zapasów glicerolu fagowego.
Kwas solnyFisher ScientificA144-500Elucja fagów.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemicznie kompetentny E. coliFisherScientificC854003Szczep bakteryjny do infekcji fagowej.
Siarczan kanamycynyFisher ScientificAAJ1792406Hodowla komórek pomocniczych zakażonych fagami M13K07.
M13KO7 pomocniczyNowa Anglia Biolabs  N0315SZezwalaj na pakowanie i wydzielanie fagów.
MaxQ 4000 Wytrząsarka orbitalnalaboratoryjna Fisher Scientific11-676-076Hodowla komórek bakteryjnych.
Nunc MaxiSorp 96-dołkowa mikropłytka, płaskie dnoLife Technologies44-2404-21Białka unieruchamiające.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10X RoztwórFisher ScientificBP3994Składnik buforowy/pożywka do reprodukcji fagów.
Folie poliestrowe do testu ELISA i inkubacjiVWR60941-120Pokrywanie mikropłytek podczas inkubacji.
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1Wytrącanie fagów.
Chlorek soduMillipore-SigmaS3014Wytrącanie fagów.
Sterylne plastikowe probówki hodowlane: Półprzezroczysty polipropylenFisher Scientific14-956-1DWkłady do hodowli fagów.
Chlorowodorek tetracyklinyFisher ScientificBP912-100Hodowla komórek E. coli OmniMax.
Tris BaseFisher ScientificBP1525Neutralizujący eluowany roztwór fagowy.
Trypton w proszkuFisher ScientificBP1421-2Składnik pożywki do wzrostu komórek.
Tween 20Komponent Fisher ScientificBP337500Buffer.
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP1422-2Składnik pożywki do wzrostu komórek.

Bibliografia

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382(2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372(2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Warianty ubikwitynymodulatory białekpowinowactwo wiązaniainżynieria białekenzymatyczna immunoabsorpcyjna analizatest ELISAoddziaływania białko-białkoprzesiewanie bibliotek
Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.