Odwrotne podejście genetyczne do identyfikacji regulatorów pigmentacji przy użyciu danio pręgowanego

Summary

Regulatory funkcji melanocytów regulują widoczne różnice w wyniku pigmentacji. Rozszyfrowanie funkcji molekularnej genu kandydującego na pigmentację stanowi wyzwanie. W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie systemu modelowego danio pręgowanego do identyfikacji kandydatów i klasyfikowania ich jako regulatorów zawartości melaniny i liczby melanocytów.

Abstract

Melanocyty to wyspecjalizowane komórki pochodzące z grzebienia nerwowego obecne w skórze naskórka. Komórki te syntetyzują pigment melaniny, który chroni genom przed szkodliwym promieniowaniem ultrafioletowym. Zaburzenia w funkcjonowaniu melanocytów prowadzą do zaburzeń barwnikowych, takich jak piebaldyzm, bielactwo, bielactwo, melasma i czerniak. Danio pręgowany to doskonały system modelowy do zrozumienia funkcji melanocytów. Obecność widocznych pigmentowanych melanocytów, łatwość manipulacji genetycznej i dostępność transgenicznych linii fluorescencyjnych ułatwiają badanie pigmentacji. W badaniu tym wykorzystano linie danio pręgowanego typu dzikiego i transgenicznego, które napędzają ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) pod promotorami mitfa i tyrp1, które oznaczają różne stadia melanocytów.

Wyciszanie genów kandydujących oparte na morfolinie jest osiągane w celu oceny fenotypowego wyniku pigmentacji larw i ma zastosowanie do badań przesiewowych regulatorów pigmentacji. Protokół ten demonstruje metodę od mikroiniekcji do obrazowania i selekcji fenotypów opartej na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu dwóch genów kandydujących, anhydrazy węglanowej 14 (Ca14) i wariantu histonu (H2afv), w celu kompleksowej oceny wyniku pigmentacji. Co więcej, protokół ten demonstruje segregację genów kandydujących na specyfikatory melanocytów i dyferencjały, które selektywnie zmieniają odpowiednio liczbę melanocytów i zawartość melaniny na komórkę.

Introduction

Podczas gdy użycie melaniny do fotoprotekcji ewoluowało kilkakrotnie w całym królestwie zwierząt, kręgowce najwyraźniej udoskonaliły ten proces. Dedykowane komórki produkujące pigment ze skomplikowaną maszynerią do syntezy i przechowywania melaniny są zachowane od ryb do ludzi¹. Jednak wynik pigmentacji jest dramatycznie zróżnicowany, od koloru do odbioru i prezentuje się jako żywe wzory na powłokach, skórze i włosach². Pomimo różnorodności, repertuar genów zaangażowanych w odpowiedź pigmentacyjną jest uderzająco konserwatywny. Podstawowe składniki maszynerii syntetyzującej melaninę, takie jak kluczowe enzymy syntetyzujące melaninę, składniki melanosomów i łączność ze szlakiem sygnałowym, pozostają zasadniczo identyczne we wszystkich organizmach. Subtelne różnice genetyczne powodują dramatyczne zmiany we wzorcach pigmentacji obserwowanych u różnych gatunków³. W związku z tym, odwrotne podejście genetyczne w organizmie niższych kręgowców, danio pręgowanym (Danio rerio), stanowi doskonałą okazję do rozszyfrowania udziału genów w renderowaniu stanu pigmentowego⁴.

Zarodki danio pręgowanego rozwijają się z jednokomórkowego zapłodnionego zygoty w larwę w ciągu ~24 godzin po zapłodnieniu (hpf)⁵. Uderzające jest to, że komórki równoważne melanocytom - melanofory - są dużymi komórkami, które są obecne w skórze właściwej i rzucają się w oczy ze względu na zawartość ciemnej melaniny⁶. Te komórki pochodzące z grzebienia nerwowego emitują ~11 hpf i zaczynają pigmentować ~24 hpf^6,7. Konserwatywne moduły ekspresji genów umożliwiły identyfikację kluczowych czynników, które koordynują funkcje melanocytów i doprowadziły do opracowania transgenicznych fluorescencyjnych linii reporterowych Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) i Tg(ftyrp1:GFP)^8,9,10 które oznaczają selektywne etapy rozwoju melanocytów. Wykorzystanie tych transgenicznych linii rybnych umożliwia badanie biologii komórkowej melanocytów na poziomie organizmu w kontekście tkankowym z odpowiednimi wskazówkami zgodnie z liniami czasowymi rozwoju. Te reportery uzupełniają kwantyfikację melanocytów na podstawie pigmentu i umożliwiają wyraźną ocenę liczby melanocytów niezależnie od zawartości melaniny.

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół do rozszyfrowania biologii melanocytów poprzez ocenę dwóch krytycznych parametrów, a mianowicie zawartości melaniny i liczby melanocytów. Podczas gdy pierwszy z nich jest powszechnym odczytem funkcjonalnym wynikającym z reakcji hipopigmentacji, drugi wiąże się ze zmniejszeniem specyfikacji lub przeżycia melanocytów i często jest związany z genetycznymi lub nabytymi stanami depigmentacyjnymi. Ogólna strategia tego odwróconego genetycznego badania przesiewowego polega na wyciszeniu wybranych genów za pomocą morfoliny i zbadaniu wyników specyficznych dla melanocytów. Zawartość melaniny jest analizowana za pomocą obrazowej kwantyfikacji średnich wartości szarości, a następnie potwierdza się za pomocą testu zawartości melaniny. Liczba melanocytów na różnych etapach dojrzewania jest analizowana za pomocą oceny ilościowej opartej na obrazie, a następnie potwierdzana za pomocą analizy FACS. W tym przypadku protokół badań przesiewowych przedstawiono przy użyciu dwóch genów kandydujących, a mianowicie anhydrazy węglanowej 14, zaangażowanej w melanogenezę, oraz wariantu histonu H2AFZ.2 zaangażowanego w specyfikację melanocytów z populacji prekursorów grzebienia nerwowego. Podczas gdy pierwsza z nich zmienia zawartość melaniny, a nie liczbę melanocytów, druga zmienia liczbę określonych melanocytów, a co za tym idzie, zawartość melaniny w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia szczegółowy protokół identyfikacji roli genu kandydującego w pigmentacji i rozróżnienia jego roli w kontrolowaniu liczby melanocytów w porównaniu z zawartością melaniny.

Protocol

Eksperymenty z danio pręgowanym zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z instytucjonalnym zatwierdzeniem etyki zwierząt (IAEC) przez CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indie (Propozycja nr 45a). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt.

1. Wstrzykiwanie morfoliny do zarodków danio pręgowanego

1. Za pomocą standardowego ściągacza do igieł narysuj bardzo ostre pipety z zamkniętą końcówką.
2. Załadować roztwór zawierający morfolinę do mikropipet za pomocą końcówki do mikropobierania i wprowadzić go do aparatu do mikrowstrzykiwaczy. Dokładnie dokręć, aby zablokować mikropipetę.
   UWAGA: Konieczna jest standaryzacja dawkowania morfolinosów. Odpowiednia dawka ma wskaźnik przeżycia >70% i określony fenotyp na poziomie 24 hpf.
3. Odetnij końcówkę mikropipety za pomocą cienkich kleszczyków i skalibruj ją¹¹.
4. Aby skalibrować, wstrzyknąć 1 objętość roztworu morfolino do rurki kapilarnej z mikropipety, utrzymując czas wstrzykiwania na poziomie 1 s. Powtórz tę czynność pięć razy. Używając wzorca, 1 mm = objętość 30 nL, znajdź objętość wstrzykniętą w ciągu 5 sekund, przykładając rurkę kapilarną do skali pomiarowej. Korzystając z powyższych informacji, oblicz czas (w sekundach) wymagany do wstrzyknięcia 1-3 nL na wstrzyknięcie¹².
   UWAGA: Wzorzec, 1 mm = 30 nL, jest specyficzny dla ustawień ciśnienia mikrowtryskiwacza i średnicy kapilary używanej do kalibracji. Idealnie byłoby, gdyby wstrzyknięcie zostało wykonane na granicy faz żółtkowo-komórkowa, która powstaje w ciągu 15-20 minut po zapłodnieniu. Aby ułatwić wielokrotne wstrzyknięcia, rozwój zarodków można nieznacznie opóźnić, utrzymując je w niższej temperaturze (18 °C). Należy jednak ograniczyć to do minimum i nie wydłużać dłużej niż 30 minut ze względu na skumulowany wpływ niższej temperatury na zmiany ekspresji genów.
5. Zamontuj zarodki na odlanej z agarozy szalce Petriego (60 mm). Ułóż zarodki ciasno w grzbietach. Używając pipet z polerowanego szkła, ustawić je we właściwej orientacji do wstrzyknięcia.
6. Pod mikroskopem za pomocą manipulatorów zbliżyć mikropipetę do zarodka i wstrzyknąć do wnętrza interfejsu żółtka-komórka, naciskając przełącznik nożny.
7. Wstrzyknąć wszystkie zarodki w podobny sposób; zebrać je na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę wodną dla zarodków i inkubować w temperaturze 28 °C.
8. Zbadaj wstrzyknięte zarodki po 6-8 godzinach. Usuń wszystkie martwe zarodki, które można zidentyfikować ze względu na ich duże zmętnienie i zmieniaj wodę w zarodku co najmniej raz dziennie, aby uniknąć infekcji.

2. Analiza pigmentacji

1. Preparat do liczenia melanoforów bocznej linii środkowej w zarodkach danio pręgowanego 3 dpf
   1. Traktuj zarodki 0,016% środkiem znieczulającym nerwowo-mięśniowym, aby je unieruchomić.
   2. Aby zamontować zarodki do obrazowania, dodaj kilka mililitrów 1,5-2% metylocelulozy do szalki Petriego (60 mm), aby utworzyła cienką warstwę. Za pomocą pipety Pasteura wybierz zarodki i delikatnie umieść je w metylocelulozie, aby ograniczyć dalszy ruch podczas obrazowania.
   3. Dostosuj ich położenie w celu optymalnego obrazowania bocznego (pasek grzbietowy, pręga brzuszna, pasek żółtka i melanofory w linii środkowej) lub grzbietowego (melanofory na grzbietowej części głowy). Dla lepszej rozdzielczości sąsiednich melanoforów obraz w większym powiększeniu (>5x)
2. Obrazowanie w jasnym polu
   UWAGA: Obrazowanie w jasnym polu odbywa się za pomocą mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 8-10x.
   1. Umieścić szalkę Petriego zawierającą zarodki danio pręgowanego pod mikroskopem. Za pomocą manipulatora ustaw rybę w takiej orientacji, aby wszystkie pięć pasków embrionalnych melanocytów było widocznych jednocześnie (grzbietowe, brzuszne, dwa boczne, żółtko) (Rysunek 1C). Szybko przechwytuj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji. W przypadku, gdy zwierzę odzyskuje ruch przed wykonaniem obrazu, należy je ponownie zanurzyć w znieczuleniu i kontynuować obrazowanie, gdy jest wystarczająco unieruchomione.
   2. Powtórz to ze wszystkimi rybami i upewnij się, że powiększenie pozostaje takie samo dla każdego obrazu.
3. Obliczanie średniej wartości szarości za pomocą oprogramowania ImageJ
   1. Wykonaj zdjęcia grzbietowe i boczne zarodków danio pręgowanego z 2 dpf.
   2. Otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo w ImageJ, za pomocą narzędzia Otwórz. Użyj narzędzia Kształt odręczny, aby obrysować obszar do analizy. Przejdź do opcji Ustaw pomiary i wybierz Średnia wartość szarości | obszar. Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiar), aby obliczyć średnią wartość szarości dla wybranego obszaru.
   3. Utrzymując stałą powierzchnię do analizy, należy obliczyć średnią szarą strefę dla każdego zwierzęcia z osobna.
   4. Narysuj wykres słupkowy z uzyskanymi danymi (Rysunek 2F).
4. Oznaczenie zawartości melaniny
   1. Przy 2 dpf użyj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać ~25 zarodków danio pręgowanego.
   2. Wykonaj manualną dechorionację za pomocą igieł insulinowych o pojemności 1 ml i dodaj je do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   3. Ostrożnie wyrzucić pożywkę zarodkową i dodać 1 ml lodowatego buforu do lizy (20 mM fosforanu sodu (pH 6,8), 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) z koktajlem inhibitorów proteazy i przygotować lizaty białkowe metodą sonikacji.
   4. Rozpuścić lizaty w 1 ml 1 N NaOH i inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 50 minut w łaźni wodnej. Wiruj go z przerwami, aby całkowicie ujednorodnić lizaty.
   5. Odczyty absorbancji próbek przy długości fali 490 nm należy wykonać za pomocą spektrofotometru.
   6. Oblicz zawartość melaniny, porównując absorbancję próbki ze standardową krzywą znanych stężeń syntetycznej melaniny (Rysunek 2G).

3. Liczba melanoforów

UWAGA: Analiza fluorescencji w transgenicznych zarodkach danio pręgowanego może być przeprowadzona dwiema metodami: 1) zliczanie komórek GFP-dodatnich; 2) pomiar intensywności fluorescencji.

1. Przygotowanie do liczenia komórek GFP dodatnich metodą GFP we wczesnych zarodkach danio pręgowanego
   1. Zbierz 200-250 zarodków GFP i umyj je w sitku przy użyciu zwykłej wody z zarodków. Jako kontrolę ujemną GFP, zarodki typu dzikiego (Assam Wildtype) z ujemnym wynikiem GFP, w którym dopasowują się do stadium zarodka¹².
   2. W zależności od interesującego stadium przenieść zarodki na szalkę Petriego zawierającą 0,6 mg/ml pronazy. Po 5-10 minutach, za pomocą pipety Pasteura, przenieś zdekorionowane zarodki na świeżą szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz ~100 zarodków i przenieś je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
   3. Ostrożnie odrzucić pożywkę i dodać 200 μl lodowatego roztworu Ringera (buforu do usuwania żółtka). Trzymając probówkę na lodzie, pipetuj zawartość w górę iw dół ~20 razy, aż żółtko się rozpuści. Odwirować probówki o stężeniu 100 × g przez 1 minutę w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Ponownie odwirować i ostrożnie wyrzucić supernatant.
   4. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieść pozbawione żółtka zarodki na szalkę Petriego zawierającą 10 ml roztworu trypsyny (bufor dysocjacyjny komórek). Wykonuj go na wielu szalkach Petriego, aby uniknąć przepełnienia zarodków i nieefektywnej trypsynizacji. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml wymieszać roztwór zawierający ciała zarodków raz lub dwa razy, aby zmniejszyć agregację.
   5. Inkubować szalki Petriego w temperaturze pokojowej przez 15 minut (zarodki <24 hpf) lub 30 minut (zarodki 24-30 hpf). Od czasu do czasu odsysać i dozować zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby wspomóc rozpad komórek.
   6. W okresie inkubacji zainicjuj cytometr przepływowy do zliczania komórek.
   7. Umieść sitko o wielkości 70 μm nad stożkową probówką o pojemności 50 ml i przepuść przez sitko zawiesinę trypsynizowaną w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Umyj szalki Petriego tą samą zawiesiną kilka razy, aby usunąć komórki przyklejone do powierzchni.
   8. Wirować próbki w temperaturze 450 × g, 4 °C przez 5 minut w obracającym się wirniku kubełkowym.
   9. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w 1 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   10. Wirować ponownie w temperaturze 450 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
   11. Na koniec ponownie zawieś osad w PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej i trzymaj go na lodzie do momentu uruchomienia FACS.
2. Przygotowanie cytometru przepływowego
   1. Włączyć cytometr przepływowy i rozpocząć uruchamianie.
      UWAGA: Przed włączeniem maszyny opróżnij kosz na śmieci i napełnij zbiornik płynu w osłonie.
   2. Znormalizuj przepływ strumienia dla dyszy 70 μm (lub 85 μm). Pozostaw go w spokoju na 10-15 minut, jeśli jest niestabilny.
3. Liczenie komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą cytometru przepływowego
   1. Zainicjuj nowy folder eksperymentu i utwórz wykres punktowy rozproszenia do przodu w stosunku do rozrzutu bocznego oraz histogram intensywności izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
   2. Najpierw załaduj komórki typu dzikiego, aby ustawić przednie i boczne bramki rozproszenia (aby wykluczyć dublety i zanieczyszczenia) oraz próg FITC.
   3. Po ustawieniu bramek wyjmij próbkę i załaduj komórki wyizolowane z zarodków Tg(ftyrp1:GFP) w celu policzenia melanocytów.
      UWAGA: Tutaj, ponieważ ftyrp1: GFP specyficznie oznacza dojrzałe melanocyty, liczba komórek GFP-dodatnich pod bramką FITC będzie odpowiadać liczbie melanocytów.
   4. Powtórz powyższy krok z próbkami wstrzykniętymi morfolino, aby oszacować i porównać liczbę melanocytów z kontrolą.
4. Pomiar intensywności fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego
   1. Za pomocą szklanej pipety Pasteura zbierz 100-120 zarodków i przenieś je na szalkę Petriego zawierającą zwykłą wodę z zarodków.
   2. Przy ~ 10-12 hpf przenieś zarodki do 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika, aby zahamować pigmentację.
   3. Wykonaj manualną dechorionację za pomocą igieł insulinowych do obrazowania zarodków <48 hpf.
   4. Aby unieruchomić zarodki, należy je potraktować 0,016% tricainą.
   5. Aby zamontować zarodki do obrazowania, umieść kilka ml 1,5-2% metylocelulozy na szalce Petriego (60 mm), tak aby utworzyła cienką warstwę. Dodaj zarodki do metylocelulozy, aby ograniczyć dalszy ruch podczas obrazowania. Umieścić szalkę Petriego zawierającą próbki pod mikroskopem. Za pomocą końcówki do pipety ustaw zwierzę w żądanej orientacji.
   6. Pobieraj obrazy za pomocą oprogramowania do akwizycji. W przypadku zarodków <24 hpf należy uchwycić cały zarodek na raz pod 10-krotnym powiększeniem. W przypadku >24 etapów hpf należy pobrać wiele pól skanowania, a następnie zmontować je (zszyć) ze sobą.
   7. Powtórz to ze wszystkimi rybami i upewnij się, że ustawienie akwizycji pozostaje stałe przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Kwantyfikacji
   1. Analizuj obraz dalej za pomocą oprogramowania ImageJ.
   2. Otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo w ImageJ, za pomocą narzędzia Otwórz.
   3. Użyj narzędzia do kształtowania odręcznego, aby obrysować obszar do analizy (Rysunek 3E).
   4. Naciśnij M (lub Analizuj | Pomiar), aby uzyskać wybrany pomiar intensywności obszaru.
   5. Utrzymując stałą powierzchnię przeznaczoną do analizy, należy obliczyć średnią intensywność na obszar dla każdego zwierzęcia z osobna.

Results

Przepływ pracy opisany w Rysunek 1 został wykorzystany do przeprowadzenia perturbacji genetycznej opartej na morfolinie w stadium jednokomórkowym danio pręgowanego. Analizę pigmentacji przeprowadzono przy użyciu różnych metod, o których mowa poniżej. Aby zilustrować reprezentatywne wyniki, standaryzowane objętości antysensownego morfolino ukierunkowanego na geny h2afv i ca14 wstrzyknięto do żółtka lub stadium jednokomórkowego zarodka danio pręgowanego. Wstępne fenotypowanie...

Discussion

Fenotyp pigmentacji często objawia się zmianami w zawartości melaniny lub liczbie melanocytów zawierających pigment. Opisana tu metoda pozwala na rozbiór tej dychotomii i pozwala na jakościową, jak i ilościową ocenę zawartości melaniny i liczby melanoforów na zarodek, niezależnie od zawartości melaniny. Wysoka płodność danio pręgowanego, widoczny charakter barwnikowych melanocytów i brak transferu melanosomów umożliwiają analizę biologii melanocytów przy użyciu tego odwróconego podejścia genetycznego, które jest podatne ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml Mikroprobówki	Axygen	MCT-150-A	Do przygotowania roztworu MO
2 ml Mikroprobówki	Axygen	MCT-200-C	Do mycia etapów w protokole FACS
Agaroza	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	Do mikroiniekcji
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	Do sortowania komórek
Rurka kapilarna	Drummond	1-000-0010
Sitko do komórek Corning	CLS431751 Do		wytwarzania zawiesiny pojedynczej komórki
Pożywka DMEM o wysokiej zawartości glukozy	Protokół FACS	Sigma-Aldrich	D5648
Metanosulfonian etylu (Trikaina)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	do unieruchamiania ZF do obrazowania
Dihydrat soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	Do probówek FACS buforu do lizy na zimno
	Protokół BD-Biosciences	342065	FACS
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Protokół Invitrogen	10270	FACS
Oprogramowanie pryzmat	Graphpad Graphstats Technologies	NA	Do reprezentacji danych
Oprogramowanie ImageJ	National Institute of Health	NA	Do analizy obrazu
Strzykawki insulinowe (1 ml)	DispoVan	NA	Do manualnej dechorionacji
Melanina, syntetyczna	Sigma-Aldrich	M8631	Do oznaczania zawartości melaniny
Metyloceluloza	Sigma-Aldrich	M7027-250G	do unieruchamiania ZF do obrazowania
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	5242956003	Do mikroiniekcji
Morpholino	Gene-tools	NA	Do eksperymentów knock-down
N-fenylotiomocznik (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	w celu zahamowania tworzenia melaniny
Ściągacz igieł	Sutter Instrument	P-97	Do mikroiniekcji
Nunc 15 mL Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkowe	Thermo Fisher Scientific	339650	Protokół FACS
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	Dla płytki zarodkowe Fluorek
fenylometylosulfonylu	Sigma-Aldrich 10837091001		Do buforu do lizy na zimno
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	Do mycia komórek
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	Do dechorionacji
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	P8340	Do buforu do lizy na zimno
Osłona płyn	BD FACSFlowTM	342003	Protokół FACS
Fosforan sodu	Merck	7558-79-4	Bufor do lizy na zimno
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	lizy na zimno
TrypLE	Gibco	1677119	Do trypsynizacji