Artykuł metodologiczny

Opracowanie mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów do pomiaru energetyki mitochondriów w terenie

DOI:

10.3791/62956

⸱

27 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy mobilne laboratorium do pomiaru tempa oddychania w izolowanych mitochondriach dzikich zwierząt schwytanych w terenie. W tym miejscu opisujemy projekt i wyposażenie mobilnego laboratorium mitochondrialnego oraz związane z nim protokoły laboratoryjne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Energetyka mitochondrialna jest głównym tematem w biochemii i fizjologii zwierząt, a naukowcy używają oddychania mitochondrialnego jako wskaźnika do badania zdolności metabolicznych. Aby uzyskać pomiary oddychania mitochondrialnego, należy użyć świeżych próbek biologicznych, a cała procedura laboratoryjna musi zostać zakończona w ciągu około 2 godzin. Ponadto do wykonywania tych testów laboratoryjnych wymaganych jest wiele specjalistycznych urządzeń. Stwarza to wyzwanie dla pomiaru oddychania mitochondrialnego w tkankach dzikich zwierząt żyjących z dala od laboratoriów fizjologii, ponieważ żywe tkanki nie mogą być zachowane przez bardzo długi czas po pobraniu w terenie. Co więcej, transport żywych zwierząt na duże odległości wywołuje stres, który może zmienić energetykę mitochondriów.

Ten manuskrypt przedstawia Auburn University (AU) MitoMobile, mobilne laboratorium fizjologii mitochondriów, które można zabrać w teren i wykorzystać na miejscu do pomiaru metabolizmu mitochondriów w tkankach pobranych od dzikich zwierząt. Przedstawiono podstawowe cechy mobilnego laboratorium oraz metody pomiaru krok po kroku tempa izolowanego oddychania mitochondrialnego. Dodatkowo, przedstawione dane potwierdzają sukces wyposażenia mobilnego laboratorium fizjologii mitochondriów i wykonywania pomiarów oddychania mitochondrialnego. Nowatorstwo mobilnego laboratorium polega na możliwości dojazdu w teren i wykonywania pomiarów mitochondrialnych na tkankach zwierząt schwytanych na miejscu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory badania mające na celu pomiar energetyki mitochondriów były ograniczone do zwierząt laboratoryjnych lub zwierząt schwytanych w pobliżu uznanych laboratoriów fizjologii, co uniemożliwiało naukowcom przeprowadzanie mitochondrialnych badań bioenergetycznych w tkankach pobranych od zwierząt podczas takich działań jak migracja, nurkowanie i hibernacja1,2,3,4,5,6. Podczas gdy wielu badaczom udało się zmierzyć podstawowe i szczytowe tempo przemiany materii oraz dzienne wydatki energetyczne dzikich zwierząt7,8, zdolność badaczy do pomiaru wydajności mitochondriów pozostała ograniczona (ale patrz1,4,9). Wynika to częściowo z konieczności pozyskania świeżej tkanki do wyizolowania mitochondriów oraz laboratorium do wykonania izolacji w ciągu około 2 godzin od uzyskania świeżej tkanki. Po wyizolowaniu mitochondriów pomiary oddychania mitochondrialnego również powinny zostać zakończone w ciągu ~1 godziny.

Izolowane tempo oddychania mitochondrialnego jest zwykle wykonywane poprzez pomiar stężenia tlenu w szczelnie zamkniętym pojemniku podłączonym do elektrody Clarka. Teoria stojąca za tą metodą opiera się na podstawowej obserwacji, że tlen jest ostatnim akceptorem elektronów oddychania mitochondrialnego podczas fosforylacji oksydacyjnej. W związku z tym, gdy stężenie tlenu spada podczas eksperymentu, zakłada się, że zachodzi produkcja adenozynotrifosforanu (ATP)10. Zużyty tlen jest wskaźnikiem wyprodukowanego ATP. Naukowcy mogą stworzyć określone warunki eksperymentalne przy użyciu różnych substratów i zainicjować oddychanie stymulowane difosforanem adenozyny (ADP) (stan 3) poprzez dodanie do komory z góry określonych ilości ADP. Po fosforylacji egzogennego ADP do ATP tempo zużycia tlenu zmniejsza się i osiągany jest stan 4, który można zmierzyć. Co więcej, dodanie specyficznych inhibitorów pozwala na uzyskanie informacji dotyczących oddychania nieszczelnego i niesprzężonego10. Stosunek stanu 3 do stanu 4 określa współczynnik kontroli oddechowej (RCR), który jest wskaźnikiem ogólnego sprzężenia mitochondrialnego10,11. Niższe wartości RCR wskazują na ogólną dysfunkcję mitochondriów, podczas gdy wyższe wartości RCR sugerują większy zakres sprzężenia mitochondriów10.

Jak wcześniej wspomniano, pobieranie materiału biologicznego, izolacja mitochondriów i pomiar częstości oddychania muszą zostać zakończone w ciągu 2 godzin od uzyskania tkanki. Aby zrealizować to zadanie bez konieczności transportu zwierząt na duże odległości do uznanych laboratoriów, zbudowano mobilne laboratorium fizjologii mitochondriów, które można zabrać do lokalizacji terenowych, w których można zebrać te dane. Pojazd rekreacyjny Jayco Redhawk z 2018 r. został przekształcony w mobilne laboratorium fizjologii molekularnej i nazwany Auburn University (AU) MitoMobile (Rysunek 1A). Pojazd rekreacyjny został wybrany ze względu na wbudowaną lodówkę, zamrażarkę, zbiornik na wodę i instalację wodno-kanalizacyjną, energię elektryczną zasilaną z akumulatorów 12 V, generator gazu, zbiornik propanu i system samopoziomowania. Co więcej, pojazd rekreacyjny zapewnia możliwość przebywania w odległych miejscach na noc w celu zbierania danych. Przód pojazdu nie został zmieniony i zapewnia pomieszczenia do jazdy i spania (Rysunek 1B)". Wcześniej zainstalowane udogodnienia w sypialni (łóżko, telewizor i szafka) z tyłu pojazdu oraz płyta kuchenna zostały usunięte.

Wykonane na zamówienie półki ze stali nierdzewnej i niestandardowy blat kwarcowy wsparty aluminiową ramą 80/20 zostały zainstalowane w miejscu udogodnień sypialni i płyty kuchennej (Rysunek 1C). Stanowiska laboratoryjne zapewniają odpowiednią przestrzeń do zbierania danych (Rysunek 1D). Pod uwagę wzięto zużycie energii przez każdy element wyposażenia (tj. wirówkę z chłodzeniem, mitochondrialne komory oddechowe, czytniki płytek, komputery, homogenizatory, wagi, przenośną ultrazamrażarkę i inne ogólne materiały laboratoryjne). Aby sprostać dużym wymaganiom wirówki w zakresie napięcia i prądu, układ elektryczny został zmodernizowany do poziomu sprzętu lotniczego. Zewnętrzny schowek z tyłu pojazdu został przekształcony w komorę do przechowywania ciekłego azotu, która spełnia wytyczne Departamentu Transportu Stanów Zjednoczonych dotyczące przechowywania i transportu ciekłego azotu. Ten schowek został zbudowany ze stali nierdzewnej i ma odpowiednią wentylację, aby zapobiec przedostawaniu się rozprężającego się azotu do kabiny pasażerskiej pojazdu.

Aby potwierdzić, że mobilne laboratorium może być używane w mitochondrialnych badaniach bioenergetycznych, wyizolowano mitochondria i zmierzono tempo oddychania mitochondriów od dzikich myszy domowych (Mus musculus) mięśni szkieletowych kończyn tylnych. Ponieważ Mus musculus jest organizmem modelowym, tempo oddychania mitochondrialnego tego gatunku jest dobrze ustalone12,13,14. Chociaż poprzednie badania udokumentowały izolację mitochondriów za pomocą wirowania różnicowego15,16,17, poniżej opisano krótki przegląd metod stosowanych w mobilnych metodach laboratoryjnych fizjologii mitochondriów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe sekcje opisują metody laboratoryjne mitochondriów. Wszystkie procedury obchodzenia się ze zwierzętami i pobierania tkanek zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Auburn (#2019-3582).

1. Opis używanych do zbierania danych

UWAGA: Te mogą być przygotowane w laboratorium stacjonarnym i przeniesione do laboratorium mobilnego przed wyjazdem w teren (chyba że poniżej zaznaczono inaczej).

  1. Przygotować bufor do izolacji mitochondriów mięśni szkieletowych z albuminą surowicy bydlęcej (BSA), jak pokazano w Tabeli 1.
    1. Rozpuść chemikalia w wodzie dejonizowanej (~ 90% objętości), z wyjątkiem BSA wolnego od kwasów tłuszczowych. Umieścić bufor w lodówce, aż temperatura osiągnie 4 °C.
    2. Doprowadzić roztwór do pH 7,5, utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C.
    3. Dodaj BSA bez kwasów tłuszczowych i zwiększ objętość do 100%. Roztwór rozdzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przygotować bufor do izolacji mitochondriów mięśni szkieletowych bez BSA, jak pokazano w Tabeli 1.
    1. Rozpuść chemikalia w wodzie dejonizowanej (~ 90% objętości). Umieścić bufor w lodówce, aż temperatura osiągnie 4 °C.
    2. Doprowadzić roztwór do pH 7,5, utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C.
    3. Podnieś głośność do 100%. Roztwór rozdzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  3. Przygotować bufor do resuspensji mięśni szkieletowych, jak pokazano w Tabeli 1.
    1. Rozpuść chemikalia w wodzie dejonizowanej (~ 90% objętości). Umieścić bufor w lodówce, aż temperatura osiągnie 4 °C.
    2. Doprowadzić roztwór do pH 7,4, utrzymując temperaturę na poziomie 4 °C.
    3. Podnieś głośność do 100%. Roztwór rozdzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  4. Przygotować bufor do oddychania mięśni szkieletowych, jak pokazano w Tabeli 2.
    1. Rozpuść chemikalia w wodzie dejonizowanej (~ 90% objętości), z wyjątkiem BSA wolnego od kwasów tłuszczowych. Podgrzewać bufor do momentu, gdy temperatura osiągnie 37 °C.
    2. Doprowadzić roztwór do pH 7,0, utrzymując temperaturę na poziomie 37 °C.
    3. Dodaj BSA bez kwasów tłuszczowych i zwiększ objętość do 100%. Roztwór rozdzielić na stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  5. Przygotować podłoża do oddychania, jak pokazano w Tabeli 2.
    1. Upewnij się, że te podłoża są świeże w dniu zbierania danych w 100 mM Tris-HCl, pH 7,4. Przechowywać na lodzie do momentu użycia.
      UWAGA: Podane wartości mają na celu przygotowanie wystarczająco stężonego roztworu, aby wystarczająca ilość substratu została pobrana przez mitochondria. Końcowe stężenia substratów to 2 mM pirogronian, 2 mM jabłczan, 10 mM glutaminianu i 5 mM bursztynianu.

2. Przeprowadzanie izolacji mitochondrialnej (Rysunek 2)

UWAGA: Pomiary izolacji mitochondriów i oddychania mitochondrialnego są wykonywane w obszarze laboratoryjnym mobilnego laboratorium, a wszystkie roztwory powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Zaparkuj mobilne laboratorium na płaskim terenie. Włącz generator i wypoziomuj pojazd. Wysuń zjeżdżalnię i ustaw sprzęt.
  2. Rozmrozić żądane ilości.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, na mięsień potrzeba 30 ml buforu do izolacji mięśni szkieletowych i 10 ml bufora do izolacji mięśni szkieletowych bez BSA.
  3. Ustaw i skalibruj mitochondrialne komory oddechowe do żądanej temperatury eksperymentów i aktualnego ciśnienia atmosferycznego zgodnie z instrukcjami producenta. Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi komorami używanymi w eksperymentach.
  4. Poddaj zwierzę eutanazji poprzez dekapitację.
    UWAGA: W obecnym badaniu wykorzystano dekapitację do eutanazji. Niektóre gazy, takie jak dwutlenek węgla i izofluran, wpływają na funkcję mitochondriów18,19,20; Efekty te powinny być brane pod uwagę przy wyborze najlepszej metody eutanazji dla każdego badania. To, którą metodę należy zastosować dla każdego badania, zostanie określone na podstawie zadanego pytania naukowego.
  5. Wyciąć mięśnie szkieletowe, szybko odciąć tłuszcz i tkankę łączną, zważyć i umieścić mięsień w buforze izolacyjnym mięśni szkieletowych z BSA (co najmniej 1/10 w/v) (np. 1 g mięśni szkieletowych na 10 ml buforu).
  6. Zmiel mięśnie szkieletowe nożyczkami na lodzie.
  7. Przenieś zmieloną tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 5 ml. Homogenizuj go ostrzem (patrz Tabela materiałów) przy 50% mocy przez 5 s. Dodać proteazę (5 mg/g mokrego mięśnia) i trawić przez 7 minut, mieszając roztwór co 30 s. Zakończyć reakcję, dodając równą objętość buforu izolacyjnego z BSA.
  8. Odwirować homogenat o masie 500 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant przez dwuwarstwową gazę za pomocą naciętej końcówki pipety o pojemności 5 ml do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować supernatant o stężeniu 3 500 × g przez 10 minut, aby wytrącić brązową osadkę mitochondrialną.
  9. Wylej pozostały supernatant. Dodać taką samą objętość buforu izolacyjnego z BSA do probówki wirówkowej. Ponownie zawiesić osad mitochondrialny za pomocą elastycznego skrobaka (policjanta), delikatnie przesuwając osad mitochondrialny ze ścianek probówki wirówkowej. Wirować przy 3 500 × g przez 10 min.
  10. Wylej pozostały supernatant. Dodać taką samą objętość buforu izolacyjnego bez BSA do probówki wirówkowej. Ponownie zawiesić osad mitochondrialny, delikatnie usuwając osad mitochondrialny ze ścianek probówki wirówkowej za pomocą czystego policjanta. Wirować przy 3 500 × g przez 10 min.
  11. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondrialny w buforze do redukcji, delikatnie usuwając osad mitochondrialny ze ścianek probówki wirówkowej za pomocą czystego policjanta.
    UWAGA: Objętość bufora do resuspension będzie zależeć od wielkości osadu mitochondriów.
  12. Przenieś zawieszone mitochondria do homogenizatora Dounce z naciętą końcówką pipety o pojemności 1 ml. Za pomocą homogenizatora Dounce ostrożnie homogenizuj zawiesinę za pomocą 4-5 przejść.
  13. Umieść zawiesinę mitochondrialną w oznakowanej probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml za pomocą innej naciętej końcówki pipety o pojemności 1 ml.

3. Pomiary oddychania mitochondrialnego (Rysunek 3)

  1. Substraty złożone I
    1. Dodać 945 μl buforu oddechowego do komory. Upewnij się, że mieszadło się obraca, a temperatura bufora jest utrzymywana na poziomie 37 °C. Rozpocznij rejestrowanie zbierania danych.
    2. Po ustabilizowaniu się stężenia tlenu dodaj 20 μl mitochondriów i umieść pokrywę na komorze. W oprogramowaniu należy zaznaczyć, że mitochondria zostały dodane do komory.
    3. Dodać 10 μl 1 M glutaminianu, 10 μL 200 mM jabłczanu i 10 μl 200 mM pirogronianu do komory z oddzielnymi strzykawkami i poczekać, aż sygnał się ustabilizuje. W oprogramowaniu zaznacz, że substraty zostały dodane.
      UWAGA: Te podłoża są zwykle używane do pomiaru oddychania opartego na węglowodanach. Aby zapoznać się z innymi kombinacjami substratów, które mają być używane do pomiaru oddychania pod wpływem tłuszczu, zobacz21.
    4. Dodać 5 μl ADP za pomocą osobnej strzykawki i obserwować szybkie zużycie tlenu (stan 3). W oprogramowaniu oznacz, że ADP został dodany.
      UWAGA: Po fosforylacji dodanego ADP, tempo zużycia tlenu ustabilizuje się do stanu 4.
    5. Po 4 minutach zbierania danych w stanie 4 zakończ nagrywanie. Zapisz plik danych.
  2. Substraty kompleksu II
    1. Dodać 963 μl buforu oddechowego do komory. Upewnij się, że mieszadło się obraca, a temperatura bufora jest utrzymywana na poziomie 37 °C. Rozpocznij rejestrowanie zbierania danych.
    2. Po ustabilizowaniu się stężenia tlenu dodaj 20 μl mitochondriów i umieść pokrywę na komorze. W oprogramowaniu oznaczają, że mitochondria zostały dodane do roztworu.
    3. Dodać 2 μl 4 μg/μl rotenonu, a następnie 10 μl 500 mM bursztynianu do komory za pomocą oddzielnych strzykawek i poczekać, aż sygnał się ustabilizuje. W oprogramowaniu zaznacz, że substraty zostały dodane.
    4. Dodać 5 μl ADP za pomocą oddzielnej strzykawki i obserwować szybkie zużycie tlenu (stan 3). W oprogramowaniu oznacz, że ADP został dodany.
      UWAGA: Po fosforylacji dodanego ADP, tempo zużycia tlenu ustabilizuje się do stanu 4.
    5. Po 4 minutach zbierania danych w stanie 4 zakończ nagrywanie. Zapisz plik danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny manuskrypt badał oddychanie mitochondrialne Mus musculus (n = 7, mężczyzna = 5, kobieta = 2; wiek = 1,30 ± 0,2 roku) w mobilnym laboratorium fizjologii mitochondriów (Rysunek 1). Do pomiaru oddychania mitochondrialnego mięśni szkieletowych wykorzystano całą kończynę tylną, a więc mięśnie tlenowe i beztlenowe, do izolacji mitochondriów (Ryc. 2). Przykłady surowych danych dotyczących oddychania mitochondrialnego przedstawiono w Rysunek 3....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mobilne laboratorium fizjologii mitochondriów umożliwia naukowcom izolację mitochondriów i pomiar tempa oddychania mitochondriów w ciągu 2 godzin od pobrania tkanek w odległych lokalizacjach terenowych. Przedstawione wyniki sugerują, że pomiary oddychania mitochondrialnego wykonane w AU MitoMobile są porównywalne z pomiarami wykonanymi w uniwersyteckim laboratorium badawczym. W szczególności przedstawione tutaj wartości dla stanu 3, stanu 4 i RCR dla musculus pochodzenia dzikiego są porównywalne z wcześniej opub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Markowi Nelmsowi i Johnowi Tennantowi z wydziału inżynierii elektrycznej i komputerowej Samuel Ginn College of Engineering na Uniwersytecie Auburn za pomoc w wyposażeniu konstrukcyjnym i elektrycznym AU MitoMobile. Ponadto autorzy dziękują za fundusze na wyposażenie AU MitoMobile i badań z grantu Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 1,7 mlVWR87003-294
Probówki wirówkowe 2,0 mlVWR87003-298
Probówki wirówkowe 50 mlVWR21009-681Probówka wirówkowa Nalgene Oak Ridge
ADPVWR97061-104
ATPVWR700009-070
BradfordVWR7065-020
Przezroczysta 96-dołkowa płytkaVWR82050-760Homogenizator Greiner Bio-One
DounceVWR22877-284Corning
EGTAVWREM-4100
Bibułafiltracyjna W zestawie z Hansatech OxyGraph
Wolne kwasy tłuszczowe BSAVWR89423-672
GlukozaVWRBDH8005-500G
GlutaminianVWRA12919
Strzykawki HamiltonVWR60373-985Gaslight 1700 Series Strzykawki
Hansatech OxyGraphHansatech Instruments LtdBrak numeru katalogowego, ale można go znaleźć w sekcji Produkty --> Jednostki sterujące elektrodami
KH2PO4VWR97062-350
JabłczanVWR97062-140
MannitolVWR97061-052
MembranaW zestawie z Hansatech OxyGraph
MgCl2VWR97063-152
MOPSVWR80503-004
PolicjantVWR470104-462
PolytronThomas Scientific11090044
Chlorek potasu (KCl)VWR97061-566
ProteazaVWR97062-366Trypsyna jest powszechnie stosowana, jednak można stosować inne proteazy.
Kwas pirogronowyVWR97061-448
Ditionit soduVWRAA33381-22
BursztynianVWR89230-086
SacharozaVWRBDH0308-500G
Tris-BaseVWR97061-794
Tris-HClVWR97061-258

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
  2. Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
  3. Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401(2018).
  4. Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
  5. Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
  6. Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
  7. Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
  8. Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
  9. Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545(2019).
  10. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  12. Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
  13. Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
  14. Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  16. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251(2017).
  17. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  18. Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
  19. Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
  20. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).
  21. Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
  24. Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  26. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431(2011).
  27. Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
  28. Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
  29. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  30. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317(2011).
  31. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965(2008).
  32. Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811(2017).
  33. Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
  34. Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial RespirationMobile Physiology LaboratoryField Mitochondrial MeasurementMitochondria IsolationRespiration ChambersTissue HomogenizationOxygen ConsumptionSkeletal Muscle MitochondriaRespiratory Control Ratio

Powiązane artykuły