Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo układu mitochondrialnego w hodowanych astrocytach

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62957

⸱

16 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Center for Psychiatric Neurosciences, Lausanne University Hospital (CHUV) and University of Lausanne

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę mitochondrialnego obrazowania poklatkowego kultur astrocytów wyposażonych w biosensor MitoTimer i wynikową wieloparametryczną analizę dynamiki mitochondriów, mobilności, morfologii, biogenezy, stanu redoks i obrotu.

Streszczenie

Chociaż wiele uwagi poświęcono zmianom mitochondrialnym na poziomie neuronalnym, ostatnie dowody pokazują, że dynamika i funkcja mitochondriów w astrocytach jest związana z poznaniem. W artykule opisano metodę obrazowania poklatkowego kultur astrocytów wyposażonych w biosensor mitochondrialny: MitoTimer. MitoTimer to potężne i unikalne narzędzie do oceny dynamiki, ruchliwości, morfologii, biogenezy i stanu redoks mitochondriów. W tym miejscu przedstawiono różne procedury hodowli, pozyskiwania obrazów i późniejszej analizy mitochondrialnej.

Wprowadzenie

Astrocyty odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu. Prawdopodobnie najbardziej znane są z tego, że odgrywają znaczącą rolę strukturalną w mózgu, jako część bariery krew-mózg1 oraz poprzez wspieranie neuronów i synaps w całym mózgu2. Wsparcie neuronów przez astrocyty jest zarówno strukturalne3, jak i metabolic4,5, przy czym astrocyty promują neurogenezę i synaptogenezę, a jednocześnie dostarczają kluczowe metabolity, takie jak mleczan, do aktywnych neuronów4,6,7. Poza rolą wsparcia strukturalnego, astrocyty są aktywnymi komórkami, które biorą udział w sygnalizacji i buforowaniu Ca2+ (w tym spontanicznych napływach mitochondrialnych Ca2+)8,9, K+ buffering10 i mogą dostosowywać się i reagować na potrzeby mózgu w czasie urazu11,12. Będąc tak dynamicznymi komórkami, astrocyty mają duże zapotrzebowanie na energię, co wymaga wydajnej sieci mitochondrialnej. Te mitochondria odgrywają również kluczową rolę w buforowaniu nadmiaru reaktywnych form tlenu (ROS)13. Oprócz ich indywidualnych lub lokalnych ról związanych z wytwarzaniem energii i buforowaniem ROS, mitochondria funkcjonują jako sieć14. W tym sensie utrzymują równowagę między mitochondriami rozszczepialnymi i fuzyjnymi, reprezentując odpowiednio nowe/zredukowane mitochondria i starsze/utlenione mitochondria15. Ogólny stan redoks komórki można zmierzyć za pomocą stanu redoks sieci mitochondrialnej. W patologii jest to kluczowa informacja, która może rzucić światło na to, które komórki mogą nie funkcjonować optymalnie.

W ostatnich latach opracowano wiele czujników do badania dynamiki i funkcji mitochondriów w komórkach. Na przykład czujniki mierzące wymianę energii (ATP), stan redoks (NADH/NAD+, ROS) i funkcjonalność enzymatyczną (cAMP, Ca2+, Zn2+) są obecnie wykorzystywane w badaniu funkcji mitochondriów16. Wśród nich MitoTimer pozwala śledzić zmiany w morfologii mitochondriów (wielkość, kształt, powierzchnia), ruchliwości (prędkość, przemieszczenie) i dynamice (zdarzenia fuzji i rozszczepienia), a także ogólnego tempa obrotu mitochondriów i stanu redoks. MitoTimer to zmutowane białko czerwonej fluorescencji, drFP58317, z sygnałem mitochondrialnym z podjednostki VIII ludzkiej oksydazy cytochromu c18,19 do wizualizacji nowo zsyntetyzowanych mitochondriów na zielono (488 nm) i utlenionych mitochondriów na czerwono (555 nm). Wykorzystanie współczynnika fluorescencji zielonej (488 nm) i czerwonej (555 nm) pozwala na jednoczesną ocenę poszczególnych mitochondriów, ich analizę morfologiczną, zdarzenia fuzji/rozszczepienia oraz historię stanu redoks20,21. Ta unikalna właściwość może być wykorzystana do zbadania wielu pytań naukowych dotyczących fizjologicznych i patologicznych ról mitochondriów, a zatem jest bardzo obiecująca dla ujawnienia podstawowych mechanizmów dynamiki mitochondriów w wielu różnych typach komórek.

Niedawno opracowaliśmy nowy wektor lentiwirusowy (LV-G1-MitoTimer-MiR124T, zwany dalej LV-G1-MitoTimer) do badania dynamiki i funkcji mitochondriów w astrocytach in vitro i in vivo22. LV-G1-MitoTimer wykorzystuje skróconą wersję promotora fibrylarnego białka kwasowego gleju (GFAP) gfaABC1D, ze wzmacniaczem B3 (gfaABC1D(B3), zwanym dalej G1) w połączeniu z wcześniej opisanym systemem detargetowania neuronów miR124T23. Pozwala na wyłączną ekspresję biosensora mitochondrialnego w astrocytach in vitro i in vivo22. Przedstawiono tutaj różne kroki do przeprowadzenia hodowli astrocytów hipokampa szczura i wyposażenia ich w bioczujnik LV-G1-MitoTimer, a także różne kroki mikroskopowe w celu śledzenia zachowania mitochondriów astrocytów przez kilka kolejnych godzin / dni.

Protokół

Niniejszy protokół został przeprowadzony za zgodą komisji etycznej (porozumienie VD3602, Lozanna, Szwajcaria) i jest zgodny z europejskimi wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

1. Pierwotna kultura astrocytów hipokampa szczura

  1. Poświęć pięć szczeniąt szczura (Wistar IGS Rat) przez ścięcie głowy w dniu po urodzeniu 1-2.
  2. Usuń mózg i trzymaj go na szalce Petriego zawierającej 5 ml świeżej pożywki astrocytów (DMEM z GlutaMAX uzupełnionym 1% penicyliny/streptomycyny i 10% świeżej surowicy końskiej).
  3. Odizoluj hipokamp. Dysocjować w 5 ml ośrodka astrocytarnego przez trzy przejścia przez igłę 21 G i trzy przejścia przez igłę 25 G.
  4. Przenieś zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i policz w hemocytometrze.
  5. Umieść 20 000-25 000 komórek/cm2 w naczyniach wielodołkowych (9,4 mm x 10,7 mm x 9,3 mm) i przechowuj je w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przez resztę eksperymentu.
  6. Całkowicie wymienić pożywkę po 3 dniach in vitro (DIV3).
  7. W DIV8 dodaj 0,6 pg antygenu p24 na komórkę wektora lentiwirusowego kodującego bioczujnik mitochondrialny MitoTimer (LV-G1-MitoTimer22) rozcieńczony w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS + 0,01% BSA).
  8. W DIV9 przemyć wstępnie podgrzanym 1x sterylnym PBS (37 °C) i dodać świeżą pożywkę astrocytów.
  9. W DIV11 wykonaj 2 płukania wstępnie podgrzanym 1x sterylnym PBS (37 °C) i dodaj świeżą pożywkę astrocytów bez czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Wybór powłoki zależy od zamierzonego testu. Jako standardową powłokę dla hodowli pierwotnej astrocytów zaleca się stosowanie 0,2 mg/ml poli-D-lizyny lub 8,7 μg/cm2 macierzy błony podstawnej (np. Matrigel). Aby uwidocznić układ mitochondrialny astrocytów, niezbędna jest praca na spłaszczonych i rozciągniętych komórkach. W tym kontekście najbardziej odpowiednia jest kombinacja matrycy membrany podstawnej na prowadnicach w kształcie litery U IBIDI. Ważne jest również, aby nie pracować z czerwienią fenolową, która jest toksyczna dla komórki pod wpływem powtarzającej się ekspozycji na światło.

2. Długoterminowe monitorowanie systemu mitochondrialnego.

  1. Oceń astrocytarny układ mitochondrialny co najmniej 3-5 dni po infekcjach lentiwirusowych za pomocą LV-G1-MitoTimer (aby umożliwić wystarczający poziom fluorescencji w mitochondriach).
  2. Obrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu sterowanego przez oprogramowanie do akwizycji i analizy oraz moduł do pełnej automatyzacji akwizycji.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat oprogramowania i modułu użytego w tym badaniu.
  3. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w inkubator klatkowy (patrz tabela materiałów) w celu utrzymania hodowli astrocytów na poziomie 5% CO2 i 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
  4. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą wzbudzenia sekwencyjnego przy 490 nm (dla kanału zielonego) i 550 nm (dla kanału czerwonego) z detekcją sygnałów fluorescencyjnych zielonych (500-540 nm dla kanału zielonego) i czerwonych (550-600 nm dla kanału czerwonego).
  5. Wybierz 5 astrocytów na studzienkę z siecią mitochondrialną wyrażającą wystarczające poziomy LV-G1-MitoTimer przy użyciu 40-krotnego powiększenia. Zadbaj o to, aby wybierać astrocyty tak płaskie i duże, jak to możliwe, a nie zlokalizowane w skupiskach komórek (do pracy na pojedynczych komórkach).
  6. Zapisz współrzędne 5 zaznaczonych komórek w pliku xlm (map.xlm). Ten plik map.xlm umożliwia użytkownikowi powrót do tych samych komórek w miarę upływu czasu.
  7. Uzyskuj sekwencje obrazów (1 obraz/s przez 60 s) przy użyciu powiększenia 150x (100-krotny obiektyw immersyjny, 1,5-krotne powiększenie pośrednie) dla każdej współrzędnej.
  8. Powtórz akwizycję obrazu (1 obraz/s przez 60 s) dla tych samych astrocytów 6 godzin, 12 godzin i 24 godziny po zabiegach.
    UWAGA: Używaj mikroskopu wyposażonego w szybki i wydajny system autofokusa. W tym kontekście zastosowano rozwiązanie sprzętowe o nazwie Perfect Focus System (PFS). PFS wykorzystuje czujniki liniowe LED i CCD w bliskiej podczerwieni 870 nm do zwalczania wahań ostrości osiowej w czasie rzeczywistym podczas długoterminowych badań obrazowych.

3. Analiza indywidualnej morfologii mitochondriów i stosunku LV-G1-MitoTimer

UWAGA: NIS General Analysis 3 (GA3) firmy Nikon został użyty do automatyzacji analizy morfometrycznej w tym badaniu.

  1. Dla każdej sekwencji obrazu (linia bazowa, 6 godzin, 12 godzin, 24 godziny) wybierz pierwszą klatkę dla kanałów czerwonego i zielonego, klikając Przetwarzanie ND > Wybierz klatkę.
  2. Połącz kanały czerwony i zielony, wybierając Konwersje > Scal kanał.
  3. Aby skorygować cieniowanie obrazu, wybierz opcję Przetwarzanie wstępne > Automatyczna korekcja cieniowania.
  4. Zastosuj algorytm Rolling Ball, wybierając opcję Przetwarzanie wstępne > Rolling Ball.
  5. Aby wygenerować maski binarne dla każdego mitochondrium, wybierz opcję Segmentacja > Próg.
  6. Usuń wszystkie obiekty obcięte przez obramowanie, wybierając opcję Przetwarzanie binarne > Dotykanie obramowania.
  7. Aby zmierzyć pole powierzchni, wybierz opcję Pomiar > Obszar obiektu.
  8. Aby zmierzyć średnicę, wybierz opcję Measurement > Eq Diameter.
  9. Aby zmierzyć długość, wybierz opcję Pomiar > Długość.
  10. Aby zmierzyć szerokość, wybierz opcję Pomiar > Szerokość.
  11. Aby zmierzyć chropowatość, wybierz Pomiar > Chropowatość.
  12. Aby zmierzyć cyrkularność, wybierz opcję Pomiar > Cyrkularność.
  13. Aby zmierzyć wydłużenie, wybierz Pomiar > Wydłużenie.
  14. Utwórz grupę (kliknij prawym przyciskiem myszy) z powyższym pomiarem i zmień jej nazwę na MorphoData.
  15. Zmierz średnią intensywność koloru zielonego, wybierając opcję Measurement (Pomiar) > Mean Intensity (Średnia intensywność).
  16. Zmierz średnią intensywność czerwieni, wybierając Pomiar > Średnia intensywność.
  17. Aby zmierzyć stosunek koloru czerwonego/zielonego, wybierz opcję Measurement > Ratio (Stosunek pomiaru).
  18. Utwórz grupę (kliknij prawym przyciskiem myszy) z powyższym pomiarem i zmień jej nazwę na RatioData.
  19. Wyeksportuj tabelę do pliku CSV, wybierając pozycję Odwołaj się > tabeli do pliku CSV.
  20. Zapisz skrypt analizy GA3, wybierając opcję Zapisz jako
    UWAGA: Niewyczerpująca lista kryteriów stosowanych w tej procedurze jest podsumowana w Rysunek 1, Tabela 1 i Tabela 2. Plik skryptu analizy GA3 jest dostępny w wersji uzupełniającej (Supplemental Coding File 1 i Rysunek 2). Zastosowane progi zostały dostosowane tak, aby zindywidualizować jak najwięcej mitochondriów (wykluczając duże sieci mitochondrialne tam, gdzie to możliwe). Tam, gdzie to możliwe, sieci mitochondrialne są albo indywidualizowane ręcznie, albo wyłączane z analiz. Ze względu na zmienność międzykomórkową należy przeprowadzić te analizy na co najmniej 20-25 komórkach na stan (z minimum 50 mitochondriami na komórkę).

4. Analiza ruchliwości mitochondriów

UWAGA: Ze względu na dużą złożoność ruchów mitochondrialnych, preferowana jest ręczna analiza ruchliwości. W tym przypadku system NIS Element firmy Nikon został wykorzystany do ręcznego śledzenia mitochondriów.

  1. Otwórz moduł śledzenia w sieciowej usłudze informacyjnej, wybierz opcję Wyświetl > Analiza > Śledzenie.
  2. Kliknij Zdefiniuj nowy ROI.
  3. Za pomocą narzędzia do automatycznego wykrywania wybierz 25-50 mitochondriów na pierwszym obrazie sekwencji obrazów.
  4. Kliknij opcję Śledź analizę automatycznie wykrytych zwrotów z inwestycji.
  5. W razie potrzeby usuń nieprawidłowe ścieżki zwrotu z inwestycji.
  6. Eksportuj tabelę do pliku CSV.
    UWAGA: Niewyczerpująca lista kryteriów stosowanych w tej procedurze jest podsumowana w Rysunek 1 i Tabela 3. Analiza śledzenia zazwyczaj daje ścieżkę przedstawiającą ruchy środka każdego śledzonego obiektu. Różne opcje śledzenia muszą być ustawione w opcji śledzenia. Faworyzuj wybór izolowanych mitochondriów, które są wystarczająco oddalone od siebie, aby ułatwić śledzenie. Zachowaj tylko te obiekty, które mogą być konsekwentnie śledzone w całej sekwencji. Postępuj w ten sam sposób, aby usunąć wartości odstające z powodu złej jakości śledzenia. W związku z tym zbiór obiektów analizowanych w tej sekcji różni się od zestawu analizowanego dla statycznych analiz morfologicznych i będzie na ogół mniejszy.

5. Transformacja, normalizacja i analiza statystyczna danych

UWAGA: Głównie ze względu na wysoką heterogeniczność mitochondriów, generowane dane często mają nienormalny rozkład.

  1. Ręcznie rejestruj i przekształcaj pomiary przed przetwarzaniem.
  2. Dla każdej analizy i przedziału czasowego należy ręcznie znormalizować uzyskane dane za pomocą średniej uzyskanych w akwizycji referencyjnej.
  3. Ponadto należy rozważyć drugą/podwójną normalizację stanu kontrolnego, na przykład w celu oceny efektu leczenia.
  4. Następnie przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu algorytmu ANOVA dopasowanego dwukierunkowo. Tutaj zastosowano GraphPad Prism V8.

Wyniki

Pierwotna hodowla astrocytów zainfekowanych LV-G1-MitoTimer wykazała typowe sieci mitochondrialne. Przed zabiegiem astrocyty wykazujące ekspresję LV-G1-MitoTimer charakteryzowały się niejednorodnym rozmiarem mitochondriów oraz zróżnicowaną intensywnością fluorescencji zielonej i czerwonej (Rycina 3, Rycina 4 oraz Wideo 1). Układ mitochondrialny hodowli astrocytów wykazujących ekspresję LV-G1-MitoTimer monitorowano przed i po inkubacji z H2O2 (10 µM). Opisane powyżej różnice w cechach mitochondriów obliczano w ciągu 12 h (co 3 h) i normalizowano (komórka po komórce) do stanu początkowego. Na poziomie morfologicznym (Rycina 3B), efekty H2O2 stają się widoczne po około 6 h. Rzeczywiście, mitochondria uległy fragmentacji (zmniejszenie długości, powierzchni i współczynnika elongacji). Fragmentacja ta jest jeszcze bardziej wyraźna 12 h po zabiegu. Należy zauważyć, że średnice, szerokości i sferyczność nie uległy zmniejszeniu. W odniesieniu do stanu redoks i obrotu mitochondrialnego (Rycina 3C), 3 h po traktowaniu H2O2 w astrocytach zwiększyła się proporcja mitochondriów zielonych (wynik szybkiego wzrostu biogenezy mitochondriów). Po 6 h stosunek zielonych do czerwonych powrócił do poziomu bazowego, ale liczba mitochondriów czysto czerwonych znacznie wzrosła w stosunku do poziomów bazowych. Po 12 h widoczne były skutki traktowania utleniającego H2O2, które doprowadziły do znacznego wzrostu stosunku i liczby czerwonych punktów (puncta). W odniesieniu do dynamiki i mobilności (Rycina 3D), 3 h po zabiegu wszystkie kryteria uległy przejściowemu zwiększeniu. W dłuższym terminie (12 h) mitochondria poruszały się wolniej i na krótsze dystanse.

Obrazowanie mitochondriów w kolorach zielono-czerwonych w astrocytach, prezentujące morfologię, stan redoks, mobilność i dynamikę.
Rycina 1: Kultura astrocytów wykazująca ekspresję biosensora LV-G1-MitoTimer. (A) Zdjęcia konfokalne astrocytów wykazujących ekspresję LV-G1-MitoTimer. (B) Wybrane zdjęcia konfokalne mitochondriów zredukowanych (zielone), zrównoważonych (pomarańczowe) i utlenionych (czerwone) o różnym stopniu fragmentacji. (C) Schemat podsumowujący różne kryteria dostępne do analizy w astrocycie wykazującym ekspresję LV-G1-MitoTimer. Pasek skali: (A) panel górny: 50 µm, panel dolny: 10 µm, (B) 1 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy komórek, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, tabela danych, badanie interakcji białek.
Rycina 2: Analiza morfologii i stosunku mitochondrialnego. (A) Przegląd skryptu GA3 do analizy indywidualnej morfologii i stosunku mitochondriów. (B) Początkowe fotografie astrocytu wykazującego ekspresję LV-G1-MitoTimer, analizowane za pomocą skryptu GA3. (C) Przykład masek binarnych wygenerowanych dla systemu mitochondrialnego astrocytów. Pasek skali: 10 µm (B-C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Odpowiedź komórek na H2O2 w czasie; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy radarowe morfologii, stanu redoks i mobilności.
Rycina 3: Wpływ H2O2 na układ mitochondrialny astrocytów. (A) Zdjęcia astrocytów wykazujących ekspresję LV-G1-MitoTimer 1 h przed oraz 6 h i 24 h po traktowaniu PBS (CTRL) oraz 10 µM H2O2. (B) Wykresy radarowe morfologii mitochondriów, (C) stanu redoks i obrotu oraz (D) kryteriów mobilności ocenianych w astrocytach w punkcie wyjściowym oraz 3 h, 6 h i 12 h po traktowaniu H2O2. SA: pole powierzchni; D: średnica; L: długość; W: szerokość; R: okrągłość; S: sferyczność; EF: współczynnik wydłużenia (=L/W); G/R: indywidualny stosunek czerwieni do zieleni; Gpuncta: procent zielonych mitochondriów punktowych; Rpuncta: procent czerwonych mitochondriów punktowych; Dis: przemieszczenie; Tr: długość ścieżki; Sp i SpV: prędkość i wariancja prędkości; Str: prostoliniowość. Pasek skali: 20 µm (A) i 2,5 µm (wstawka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fluorescencja astrocytów; obrazy mikroskopowe; badanie interakcji neuron-glej; analiza struktury komórkowej.
Rycina 4: Zdjęcia astrocytów wykazujących ekspresję LV-G1-MitoTimer, prezentujące jednorodną i zrównoważoną sieć mitochondrialną w stanie podstawowym.Pasek skali: 20 µm Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wideo 1: Wpływ działania H2O2 na system mitochondrialny hodowanych astrocytów. Mitochondria astrocytów przed traktowaniem H2O2 (poziom bazowy), a także 6 h i 24 h po traktowaniu H2O2 w porównaniu z niepoddanymi działaniu kontrolnymi komórkami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Kryteria morfologiczneZakresUwagi
Powierzchnia (SA)0.5–4 µm2Kryteria te dostarczają informacji o cechach fragmentacji i wydłużenia mitochondriów. Zazwyczaj ewoluują one w tym samym kierunku. Mitochondria pofragmentowane charakteryzują się zmniejszoną powierzchnią, średnicą, długością oraz współczynnikiem wydłużenia, podczas gdy zaokrąglenie, sferyczność i szerokość mogą pozostać bez zmian lub ulec zwiększeniu.
Średnica (D)0.5–1.5 µm
Długość (L)0.5–5 µm
Szerokość (W)0.5–2 µm
Okrągłość (R)0–1
Sferyczność (S)0–1
Współczynnik wydłużenia (EF = L/W)1–10

Tabela 1: Podsumowanie wybranych parametrów morfologii mitochondriów.

Kryteria stanu redoksZakresUwagi
Indywidualny stosunek (G/R)0–10Współczynnik ten wskazuje na wynik stanu redoks. Dostarcza on informacji o ogólnym stanie i wieku mitochondriów w komórce. Należy wziąć pod uwagę, że współczynnik ten stanowi równowagę między biogenezą a degradacją mitochondriów oraz procesami podziału i łączenia mitochondriów utlenionych z zredukowanymi. W związku z tym ocena liczby zielonych i czerwonych punktów (puncta) może być bardzo pomocna w interpretacji wyników. Mitochondria tworzące zielone punkty są identyfikowane, gdy intensywność koloru zielonego jest 10-krotnie większa od czerwonego. Mitochondria tworzące czerwone punkty są identyfikowane, gdy intensywność koloru czerwonego jest 10-krotnie większa od zielonego. Stan redoks astrocytu stanowi średnią ze wszystkich współczynników mitochondriów w tej komórce.
Procent mitochondriów z zielonymi punktami (Gpunkta)0%–100%
Procent czerwonych punktowych mitochondriów (Rpunkta)0%–100%

Tabela 2: Podsumowanie wybranych parametrów stanu redoks mitochondriów.

Kryteria mobilnościZakresUwagi
Przemieszczenie (Dis)0–10 µmWszystkie te cechy wspólnie określają ogólną dynamikę ruchliwości sieci. Mitochondria stacjonarne wykazują niewielkie przemieszczenia & długość ścieżki przy niskiej prędkości. Z drugiej strony cząstki oscylujące można odróżnić na podstawie różnicy między długością ścieżki a przemieszczeniem (co skutkuje niską prostoliniowością) oraz zwiększonej prędkości w porównaniu z cząstkami statycznymi.
Długość ścieżki (Tr)0–10 µm
Prędkość i wariancja prędkości (Sp i SpV)0–1.5  µm/s ± 0.2 µm/s
Prostoliniowość 0–1
(Str = przemieszczenie/długość ścieżki)

Tabela 3: Podsumowanie wybranych parametrów mobilności mitochondriów.

Plik kodowania uzupełniający 1: Plik skryptu GA3 do analizy morfologii poszczególnych mitochondriów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym miejscu zaproponowano nowatorską metodę podłużnego śledzenia dynamiki i obrotu układu mitochondrialnego w hodowanym astrocycie. W przeciwieństwie do podejścia poklatkowego na ustalonej grupie komórek lub jednej pojedynczej komórce na raz (najczęściej stosowanego w literaturze)24,25, badacze mogą śledzić ewolucję układu mitochondrialnego przez kilka dni na tych samych pojedynczych komórkach. W przeciwieństwie do obrazowania na żywo z pojedynczą studnią, gdzie wymagany jest wysoki poziom ekspozycji na światło, a wybór wielu pojedynczych komórek jest mniej wykonalny, proponowana metoda wykorzystuje zdolność tego mikroskopu do obrazowania kilku różnych komórek w różnych obszarach studni i powrotu do tych samych komórek w różnych punktach czasowych w celu ich ponownego zobrazowania. Dzięki normalizacji do linii bazowej przeprowadzonej dla każdego mierzonego kryterium na każdej komórce będącej przedmiotem zainteresowania, bierze pod uwagę złożoność systemu mitochondrialnego i bada wpływ leczenia na każdą komórkę w stosunku do jej własnego obrazu wyjściowego. Zdolność mikroskopu do autonomicznego przeprowadzania tego typu obrazowania na maksymalnie 16 dołkach jednocześnie (obrazowanie 5 komórek na studzienkę) pozwala na prawidłowe uwzględnienie niejednorodności systemu mitochondrialnego podczas analizy bez zmienności eksperymentalnej, która towarzyszy obrazowaniu różnych warunków w różnych dniach.

Jakość hodowli, poziom infekcji wirusowych wykazujących ekspresję biosensora LV-G1-MitoTimer, rodzaj mikroskopu i obiektywów oraz wybór odpowiednich komórek to kluczowe zmienne, które muszą pozostać jak najbardziej spójne w tym protokole. Gęstość komórek, rodzaj wektora i miana wirusa można dostosować do pytania. Chociaż poprzednie prace pokazują, że ekspresja LV-G1-MitoTimer nie ma szkodliwych konsekwencji dla funkcji i dynamiki mitochondriów 21,22,26,27, konieczne jest sprawdzenie, czy stężenie nie jest toksyczne dla komórek (na przykład sprawdzenie całkowitej liczby komórek w dobrze kontrolnej). Ponieważ używana jest pojedyncza płaszczyzna ogniskowa, astrocyty powinny być: (1) jak najbardziej płaskie, (2) odizolowane od innych znakowanych komórek (aby uprościć analizę w przypadku przemieszczenia w naczyniu) oraz (3) posiadać wysoki poziom fluorescencji. Ponieważ komórki w hodowli mogą być bardzo zmienne pod względem morfologii, system mitochondrialny może być wysoce niejednorodny. W tym kontekście analiza ROI (a nie całej komórki) kompensuje niektóre problematyczne regiony, takie jak regiony okołojądrowe, i zmniejsza zmienność. Konieczne jest wykonanie linii bazowej na stosunkowo podobnych komórkach i pobranie próbki z jak największej liczby komórek. W związku z tym idealnie nadają się mikroskopy do pozyskiwania i analizy dużej ilości treści. Podczas tego monitorowania podłużnego ważne jest również, aby nie wystawiać komórek nadmiernie na działanie światła, aby uniknąć bielenia biosensorów.

Ta metoda obrazowania nie jest pozbawiona złożoności, a w całym protokole znajduje się kilka notatek, które uwzględniają rozwiązywanie problemów wykonanych podczas poprzednich testów z mikroskopem. Na przykład wybór zastosowanej powłoki płytki zależy od zamierzonego testu, ale uwzględniono zalecenia dotyczące najbardziej odpowiednich wyborów dla pierwotnych kultur astrocytów. Dodatkowo akwizycja obrazu powinna być wykonywana na co najmniej 5 komórkach na stan ze względu na zmienność międzykomórkową. Mówiąc dokładniej, niektóre komórki wybrane w obrazowaniu wyjściowym umrą, niektóre wyjdą poza ramę przypisanego obszaru akwizycji obrazu, a niektóre zmienią swoją morfologię, co sprawi, że mitochondria będą bardzo trudne do zindywidualizowania w analizie. Obrazowanie wielu komórek od początku zwiększa prawdopodobieństwo, że próbka komórek będzie wystarczająco duża, aby można ją było przeanalizować pod koniec eksperymentu. Oprócz bardziej złożonych aspektów tej techniki obrazowania, istnieją pewne wyraźne ograniczenia co do tego, kto może skorzystać z tego typu obrazowania i analizy. Aby w pełni wykorzystać możliwości automatyzacji pozyskiwania obrazów, używany mikroskop musi być wyposażony w system autofokusa, który poradzi sobie z szybkością odstępów czasowych między obrazami (tj. co 3 s w tym protokole) i może konsekwentnie ustawiać ostrość na danej komórce przed wykonaniem każdego obrazu. Dodatkowo, bez oprogramowania JOBS, które automatyzuje cały proces pozyskiwania obrazu, metoda ta staje się żmudna i potencjalnie niemożliwa w zależności od liczby obrazowanych komórek, ponieważ wymagałaby ręcznego znalezienia i ponownego zobrazowania każdej komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Wreszcie, ta metoda obrazowania nie jest odporna na problem fotowybielania. Z tego powodu, podobnie jak w przypadku każdej długoterminowej metody pozyskiwania, ważne jest, aby wybierać markery fluorescencyjne, które są mniej podatne na fotowybielanie i dostosować akwizycję obrazu tak, aby w jak największym stopniu uniknąć tego problemu.

Technika ta różni się od innych stosowanych obecnie w istotny sposób. W przeciwieństwie do innych badań poklatkowych, technika ta nie wymaga obrazowania w tej samej pozycji w studni przez cały czas, ani nie wymaga ręcznego przesuwania płytki w celu zobrazowania innych obszarów. Pozwala to naukowcom na obrazowanie wielu komórek w różnych warunkach w ciągu 24 godzin. W związku z tym możliwość przeprowadzenia tego obrazowania i analizy na wielu komórkach w każdym dołku daje te same informacje o populacji, które można uzyskać z szerokiego badania dużej grupy komórek, jednocześnie zapewniając konkretne pomiary z każdej zobrazowanej komórki. Chociaż niektóre specyfiki tej metody mogą nie mieć zastosowania do innych metod pozyskiwania obrazu (opisanych powyżej), korzyści przeważają nad komplikacjami związanymi z rodzajem analizy możliwej po akwizycji. Technika ta pozwala naukowcom zobaczyć dokładne konsekwencje różnych zabiegów na układ mitochondrialny, a co za tym idzie, na hodowane astrocyty.

Ponadto metoda ta jest wysoce konfigurowalna do wielu różnych pytań naukowych dotyczących zachowania i ról mitochondriów w określonych kontekstach. Tutaj przedstawiony protokół dotyczy w szczególności hodowanych astrocytów. Można jednak stosować wiele innych typów komórek, a terapie, które można testować, są ograniczone jedynie przez badane pytania. Ten rodzaj obrazowania ma potencjał, aby poszerzyć zbiorową wiedzę i zrozumienie zachowania mitochondriów, podstawowych mechanizmów, które prowadzą do dysfunkcji mitochondriów oraz wpływu wielu patologii na wrodzoną dynamikę obecną w różnych typach komórek.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez stypendium Fundacji Synapsis przyznane K.R. i Szpitalowi Uniwersyteckiemu w Lozannie (CHUV). Autorzy dziękują firmie Nikon za pomoc, a w szczególności J. Gannevatowi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Slide 8 WellIBIDI80807
19 G igłaPlexus SANTEPL001213
21 G igłaPlexus SANTEPL000142
25 G igłaPlexus SANTEPL000133
Bovin Serum AlbuminaLIFE TECH15260037
KameraHAMAMATSUORCA-flash4.0 V3 - C13440-20CU
DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX(TM)THERMOFISHER61965059
Suplement GlutamaxTHERMOFISHER35050061
Serum dla koniSIGMA16050122
SoczewkaNikon InstrumentyCFI Plan Fluor 100x Silniki olejowe
LUMENCORSPECTRA X
Liniowo kodowana zmotoryzowana platynaNikon InstrumentsN/A
MikroskopNikon InstrumentsECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE
Microscope Inkubator stopniowy z 3-kanałowym ręcznym mieszalnikiem gazów i modułem bełkotki / wilgotnościgazu OKOLABH201-NIKON-TI-S-ER
PBS 1x płynTHERMOFISHER20012068
Penicylina-StreptomycynaSIGMA15140122
szalki Petriego 100 mmSIGMAP5731
Petriego 35 mmSIGMACLS430165
ciężarne szczuryCHARLES RIVERS3
Oprogramowanie Nikon NIS-HCNikon InstrumentyNIS-Elements HC
PrismGraphPadV8.02
Stericup 500 mlMERCK MILLIPORE10412701
szalki

Bibliografia

  1. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  2. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell biology of astrocyte-synapse interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  3. Bernardinelli, Y., Muller, D., Nikonenko, I. Astrocyte-synapse structural plasticity. Neural Plasticity. 2014, 232105(2014).
  4. Benarroch, E. E. Neuron-astrocyte interactions: Partnership for normal function and disease in the central nervous system. Mayo Clinic Proceedings. 80 (10), 1326-1338 (2005).
  5. MacVicar, B. A., Choi, H. B. Astrocytes provide metabolic support for neuronal synaptic function in response to extracellular K+. Neurochemical Research. 42 (9), 2588-2594 (2017).
  6. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417 (6884), 39-44 (2002).
  7. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120 (3), 421-433 (2005).
  8. Volterra, A., Liaudet, N., Savtchouk, I. Astrocyte Ca2+ signalling: An unexpected complexity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 327-335 (2014).
  9. Huntington, T. E., Srinivasan, R. Astrocytic mitochondria in adult mouse brain slices show spontaneous calcium influx events with unique properties. Cell Calcium. 96, 102383(2021).
  10. Kofuji, P., Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience. 129 (4), 1045-1056 (2004).
  11. Ridet, J. L., Malhotra, S. K., Privat, A., Gage, F. H. Reactive astrocytes: Cellular and molecular cues to biological function. Trends in Neurosciences. 20 (12), 570-577 (1997).
  12. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  13. Young, A., Gill, R., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation: The linchpin for the transmission of regulatory information on redox buffering capacity in mitochondria. Chemico-Biological Interactions. , 151-162 (2019).
  14. Lackner, L. L. Shaping the dynamic mitochondrial network. BMC Biology. 12, 35(2014).
  15. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox homeostasis and mitochondrial dynamics. Cell Metabolism. 22 (2), 207-218 (2015).
  16. de Michele, R., Carimi, F., Frommer, W. B. Mitochondrial biosensors. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 48, 39-44 (2014).
  17. Terskikh, A., et al. "Fluorescent timer": Protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  18. Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. Journal of Biological Chemistry. 264 (18), 10595-10600 (1989).
  19. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 5 (6), 635-642 (1995).
  20. Ferree, A. W., et al. MitoTimer probe reveals the impact of autophagy, fusion, and motility on subcellular distribution of young and old mitochondrial protein and on relative mitochondrial protein age. Autophagy. 9 (11), 1887-1896 (2013).
  21. Hernandez, G., et al. MitoTimer: A novel tool for monitoring mitochondrial turnover. Autophagy. 9 (11), 1852-1861 (2013).
  22. Richetin, K., et al. Tau accumulation in astrocytes of the dentate gyrus induces neuronal dysfunction and memory deficits in Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 23 (12), 1567-1579 (2020).
  23. Merienne, N., et al. Gene transfer engineering for astrocyte-specific silencing in the CNS. Gene Therapy. 22 (10), 830-839 (2015).
  24. Sison, M., et al. 3D Time-lapse imaging and quantification of mitochondrial dynamics. Scientific Reports. 7, 43275(2017).
  25. Miyazono, Y., Hirashima, S., Ishihara, N., Kusukawa, J., Nakamura, K. I., Ohta, K. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350(2018).
  26. Trudeau, K. M., Gottlieb, R. A., Shirihai, O. S. Measurement of mitochondrial turnover and life cycle using MitoTimer. Methods in Enzymology. 547, 21-38 (2014).
  27. Stotland, A., Gottlieb, R. A. α-MHC MitoTimer mouse: In vivo mitochondrial turnover model reveals remarkable mitochondrial heterogeneity in the heart. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 90, 53-58 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Dynamika mitochondrialnakultury astrocytówbiosensor MitoTimermorfologia mitochondriówstan redoksmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie poklatkowemobilność mitochondriówtraktowanie nadtlenkiem wodoru
Obrazowanie na żywo układu mitochondrialnego w hodowanych astrocytach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.