Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Streszczenie

Obecność zanieczyszczających tkanek nienowotworowych w tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) może znacznie podważyć badania genomiczne. W tym miejscu opisujemy makrodysekcję, metodę mającą na celu zwiększenie procentowej zawartości guza w próbce tkanki poprzez usunięcie i wyeliminowanie niechcianej tkanki przed wykonaniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Bloki tkankowe FFPE podzielono na sekcje w celu wytworzenia skrawków tkanek montowanych na szkiełku o grubości 4-5 μm. Reprezentatywny wycinek został przedłożony do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie poddany przeglądowi przez certyfikowanego patologa. Podczas przeglądu patolog zidentyfikował i oznaczył obszary tkanki nowotworowej w H&E. Po zakończeniu, oznaczone H&E zostało użyte do przeprowadzenia resekcji seryjnych niebarwionych odcinków z tego samego bloku tkanki. Aby zademonstrować efekty makrodysekcji, RNA wyekstrahowane z dopasowanych makrowypreparowanych i niewypreparowanych chłoniaków rozlanych dużych komórek B (DLBCL) przeprowadzono na cyfrowym teście ekspresji genów zdolnym do określenia podtypu DLBCL i statusu translokacji BCL2. Wyniki wykazały, że makrodysekcja zmieniła podtyp lub wywołania statusu translokacji BCL2 w 60% badanych próbek. Podsumowując, makrodysekcja jest prostą i skuteczną metodą wzbogacania guza przed ekstrakcją kwasów nukleinowych, której produkt może być następnie z pewnością wykorzystany w dalszych badaniach genomicznych.

Wprowadzenie

Tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie, zebrane w ramach normalnego procesu diagnostyki klinicznej i przechowywane w klinicznych repozytoriach tkanek, stanowią ogromne źródło do badań na ludziach, w tym badań nad rakiem¹. W miarę pogłębiania się naszej wiedzy na temat chorób u ludzi staje się coraz bardziej jasne, że choroby, wcześniej uważane za pojedyncze jednostki oparte na cechach morfologicznych i immunofenotypowych, w rzeczywistości składają się z odrębnych podtypów molekularnych, które wymagają molekularnych testów podtypowania. W związku z tym coraz ważniejsze stają się testy genomowe o wysokiej czułości, zdolne do rozpoznania tych podtypów². Chociaż tkanki FFPE są znane z tego, że są słabo kompatybilne z technikami genomicznymi ze względu na problemy związane z fiksacją, wraz z rozwojem technologii i protokołów, techniki te stają się coraz bardziej kompatybilne z tym klinicznie wszechobecnym formatem tkanki^3,4,5. Jednak tkanki FFPE są często domieszkami materiałów tkankowych nowotworowych i nienowotworowych, w których obecność materiału nienowotworowego jest często niepożądana i może, jeśli występuje w dużej proporcji, znacznie podważyć i wpłynąć na wyniki analiz genomicznych⁶. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często stosowana do takich analiz, w których tkanki, które nie spełniają tego progu, mogą zostać wykluczone, mimo że w przeciwnym razie spełniają kryteria badania⁷. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku chorób rzadkich, gdzie tkanki pacjentów są cenne i trudne do pobrania w dużych ilościach.

Makrodysekcja to metoda, która minimalizuje skutki niskiej zawartości guza poprzez zmniejszenie ilości normalnej tkanki³. Usunięcie takiego mylącego materiału nienowotworowego przed ekstrakcją kwasu nukleinowego może znacznie zwiększyć procentową zawartość guza, a tym samym czystość guza ekstrahowanych kwasów nukleinowych. Resekcja tkanki opiera się na specjalistycznej ocenie patologicznej, w której obszar guza jest identyfikowany i zakreślany na świeżo wygenerowanym skrawku tkanki barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) przez certyfikowanego patologa⁸. Zakreślony H&E jest następnie używany do kierowania usuwaniem i zbieraniem odpowiednio niechcianych i docelowych tkanek. Protokół ten opisuje etapy makrodysekcji od oceny patologicznej do pobrania tkanek, które są wykonywane w Technicznym Laboratorium Podstawowym Zasobów Próbek AIDS i Raka (ACSR) w Klinice Mayo.

Protokół

Wszystkie próbki zostały pobrane i użyte zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IRB Mayo Clinic (PR16-000507 i PR2207-02).

1. Przygotowanie próbki

1. Włącz kąpiel wodną z unoszeniem się tkanek. Ustaw temperaturę na 39 °C i pozwól, aby woda osiągnęła odpowiednią temperaturę. Namocz drewniane patyczki do zbierania w kąpieli wodnej.
2. Zidentyfikuj i odzyskaj bloki tkanek FFPE, które mają zostać poddane sekcji.
3. Wstępnie oznacz szkiełka mikroskopowe za pomocą markera permanentnego klasy histologicznej, który jest odporny na mycie rozpuszczalnikiem.
4. Użyj mikrotomu, aby pokroić bloki FFPE. Wytnij co najmniej 2 sekcje pełnopowierzchniowe o grubości 4-5 μm na sekcję dla każdego bloku (Rysunek 1A).
5. Przenieś świeżo przeciętą wstęgę skrawków tkanki do wstępnie podgrzanej kąpieli flotacyjnej tkanek w celu zamontowania na szkiełku (Rysunek 1B, C).
   UWAGA: Ciepła woda pomaga "wyprasować" zmarszczki na odcinkach (Rysunek 1C).
6. Obsługując każdą sekcję sekwencyjnie, użyj kleszczyków, aby oderwać pojedynczą sekcję od wstążki (Rysunek 1D).
7. Zbierz pojedynczą sekcję na wstępnie oznaczonym szkiełku mikroskopowym.
   1. Zanurz szkiełko mikroskopowe pod kątem pod sekcją, ustawiając szkiełko tak, aby krawędź przekroju tkanki dotykała szkiełka (Rysunek 1E).
   2. Po zetknięciu się z sekcją tkanki powoli wyciągnij szkiełko z kąpieli flotacyjnej, aby umożliwić wyprostowanie się części tkanki równo ze szkiełkiem, gdy wynurza się z wody (Rysunek 1F).
8. Zamontuj 1 fragment tkanki na szkiełku i powtarzaj, aż wszystkie skrawki zostaną zebrane.
9. Pozwól mocowanym na szkiełku skrawkom chusteczki dokładnie wyschnąć w temperaturze pokojowej (RT).

2. Przegląd patologiczny

1. Wykonaj barwienie H&E na jednym reprezentatywnym fragmencie tkanki dla każdego bloku⁹.
2. Prześlij świeżo zabarwione H&E do oceny patologicznej przez certyfikowanego patologa.
   UWAGA: Podczas przeglądu patolog określa i rejestruje procentową zawartość guza w każdej tkance i zakreśla obszar guza na każdym szkiełku H&E (patrz Rysunek 2 i Rysunek 3, wiersz 1). Tabela 1 przedstawia procentową zawartość guza według komórkowości określoną podczas przeglądu patologicznego H&E dla próbek A-E pokazanych w Rysunek 3, wiersz 1. Sekcje z zawartością guza <60% wymagają makro-dyssekcji⁷. Liczba odcinków potrzebnych do ekstrakcji kwasu nukleinowego zależy od wielkości zakreślonego obszaru guza. Jeśli w sekcji 1 protokołu wycięto niewystarczającą ilość odcinków i możliwe są dalsze cięcia, może być konieczne wycięcie dodatkowych sekcji.

3. Deparafinizacja

1. W dygestorii napełnij dwa szklane naczynia do barwienia nierozcieńczonym d-limonenem klasy histologicznej lub rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu i 1 szklane naczynie do barwienia nierozcieńczonym 200-procentowym etanolem molekularnym.
   UWAGA: Unikać kontaktu d-limonenu ze skórą i oczami, unikać wdychania oparów lub mgły oraz trzymać z dala od źródeł zapłonu. Przechowywać etanol z dala od źródeł ciepła, iskier i otwartego ognia, unikać rozlewania i kontaktu ze skórą lub oczami, dobrze wentylować i unikać wdychania oparów.
   UWAGA: Napełnij naczynia na tyle, aby zanurzyć szkiełka z kolumnami ( Rysunek 4A); Do napełnienia pokazanych 20-szkiełkowych naczyń do barwienia potrzeba 250 ml. Wymieniaj płyny do płukania d-limonenem i etanolem po każdych 40 szkiełkach. D-limonen (C₁₀H₁₆) jest alternatywnym, podobnie skutecznym i mniej toksycznym środkiem odparafinującym ksylen, który staje się coraz bardziej powszechny w metodologiach histologicznych i daje dobrej jakości kwas nukleinowy po ekstrakcji^{10,11,12,13,14}. Chociaż protokół ten może być wykonywany przy użyciu bardziej przyjaznych dla biotechnologii alternatyw¹⁵, ich wpływ, jeśli w ogóle, na jakość ekstrahowanych kwasów nukleinowych pozostaje do ustalenia.
2. Umieść niebarwione szkiełka z bibułą FFPE w szklanych stojakach na prowadnice Coplin (Rysunek 4A, wstawka).
3. Zanurzyć szkiełka w kratkach w myciu d-limonenem 1 na 2 minuty; delikatnie mieszać przez pierwsze 20 s.
   UWAGA: Aby zminimalizować przenoszenie między praniami, podczas wyjmowania stojaka na szkiełka z prania poczekaj, aż ruszt na chwilę spunie, a następnie delikatnie przetrzyj spód rusztu bibułą, aby usunąć nadmiar prania.
4. Zanurz szkiełka podstawowe w nierozcieńczonym roztworze D-limonenu 2 na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij, osusz i ponownie przetrzyj ruszt.
5. Zanurz szkiełka w stojaku w roztworze do płukania etanolem na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij stojak i umieść go na chłonnej chusteczce, aby odsączyć. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10 minut, ale nie dłużej niż 2 godziny.

3. Makrodysekcja

1. Na stole napełnij słoik ze szkła Coplin 50 ml 3% glicerolu w wodzie wolnej od DNaz/RNaz
   UWAGA: Płyn do płukania glicerolem należy wymieniać co 40 szkiełek.
2. Wstępnie oznaczyć i napełnić mikroprobówki o pojemności 1,5 ml 160 μl buforu do trawienia tkankowego na mikroprobówkę.
   UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych wykonywane po makrodysekcji wykorzystywały zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE (tabela materiałów). Tak więc bufor trawienia tkankowego zastosowany w tym protokole składał się z 10 μl proteinazy K i 150 μl buforu PKD.
3. Prześledź patologiczne oznaczenia na H&E na odwrocie szkiełek tkankowych odparafinowanych.
   UWAGA: W porównaniu z tkankami nieodparafinowanymi ( Rysunek 3, rząd 2 i Rysunek 4B), odparafinowane tkanki są białe i dobrze widoczne ( Rysunek 3, Wiersz 3 i Rysunek 4C). To właśnie ta zwiększona widoczność i dostrzegalność cech odparafinizowanych tkanek umożliwia makrodysekcję. Umieść H&E twarzą do dołu na ławce i umieść przód odparafinowanego szkiełka na plecach dopasowanego patologa recenzowanego H&E (Rysunek 4D). Wyrównaj zdeparafinową tkankę z tkanką H&E (Rysunek 4E). Śledzenie oznaczeń patologa jest krytycznym krokiem w procesie makrodysekcji i należy zadbać o jak najdokładniejsze odtworzenie tych oznaczeń. Może to być szczególnie trudne w przypadku małych i/lub niepołączonych tkanek, takich jak próbki B, D i E (Rysunek 3, Figura 4E i Figura 4E wstawka i). Aby ułatwić śledzenie, należy użyć atramentowego markera z cienką lub bardzo cienką końcówką (Rysunek 4E, wstawka ii) do śledzenia oznaczeń narysowanych przez patologa. Chusteczki z etanolem mogą być przydatne do usuwania błędów i umożliwiania ponownego śledzenia, jeśli zajdzie taka potrzeba.
4. Obróć teraz oznaczoną odparafinowaną szkiełko chusteczką do góry i obrysuj linię markera rogiem czystej żyletki, aby wstępnie przyciąć krawędzie obszaru guza
.
5. Obsługując każde szkiełko sekwencyjnie, zanurz odparafinizowane szkiełka w 3% roztworze glicerolu. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona przed powolnym wyjęciem szkiełka (Rysunek 4F).
   UWAGA: Celem dipu glicerolowego jest zwilżenie tkanki, aby ułatwić zbieranie tkanek, ale także zmniejszyć gromadzenie się ładunku statycznego, który może powodować odpychanie między tkanką a plastikową mikrorurką, w której należy umieścić pobraną tkankę.
6. Delikatnie przetrzyj tylną część szkiełka chusteczką, aby usunąć nadmiar roztworu glicerolu, i połóż szkiełko na ławce, wycieraną stroną do dołu. Pozostaw chusteczki do krótkiego wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 minuty.
   UWAGA: Przeniesienie nadmiaru glicerolu do procesu ekstrakcji może negatywnie wpłynąć na wydajność i jakość ekstrakcji kwasami nukleinowymi. Tkanki powinny być lekko wilgotne, ale nie widocznie mokre po zebraniu.
7. W zależności od tego, gdzie na szkiełku znajduje się obszar zainteresowania guza, użyj płaskiej krawędzi żyletki, aby (a) bezpośrednio zebrać tkankę nowotworową, używając brzytwy do zeskrobania/zebrania interesującej tkanki ze szkiełka, lub (b) najpierw usunąć i wyrzucić tkankę nienowotworową przed pobraniem interesującej tkanki nowotworowej (Rysunek 3).
   UWAGA: Zebrana tkanka ma tendencję do gromadzenia się lub zwijania na dnie ostrza (Rysunek 4G)
8. Użyj drewnianego patyczka, aby usunąć zebraną tkankę z ostrza (Rysunek 4H i wkładka) i przenieś ją do odpowiedniej, wstępnie oznaczonej i wstępnie napełnionej mikroprobówki (Rysunek 4I).
   UWAGA: Bufor wytrawiający służy do "wciągnięcia" tkanki z drewnianego kilofa do płynu.
9. Przejdź do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
   UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych zakończono przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA/RNA FFPE zgodnie z instrukcjami producenta, a otrzymane kwasy nukleinowe określono ilościowo za pomocą spektrofotometru UV-vis. Uzyskany RNA przeprowadzono na cyfrowym teście DLBCL90 opartym na profilowaniu ekspresji genów¹⁶.

Wyniki

Łącznie 5 bloków tkankowych FFPE z rozlanym chłoniakiem z dużych komórek B (DLBCL) zostało podzielonych na sekcje, a powstałe skrawki zostały albo makrowypreparowane, albo nie przed ekstrakcją kwasu nukleinowego. Wyekstrahowany RNA przeprowadzono na teście DLBCL90¹⁶. Makrowypreparowane próbki przeprowadzono dwukrotnie, raz przy użyciu 5 μl stężenia RNA, ale nie więcej niż 300 ng całkowitego wejścia RNA i raz przy użyciu 5 μl zapasu RNA rozcieńczonego w celu dopasowania do wejść RNA ich odpowiednich niewypreparowanych odpowiedników. Wyniki DLBCL90 przedstawiono w tabeli 2.

DLBCL składa się z 3 odrębnych podtypów komórek pochodzenia (COO) o różnej reakcji terapeutycznej, a mianowicie GCB, ABC i grupy pośredniej znanej jako unclassified lub UNC^17,18. Translokacje obejmujące MYC, BCL2 i/lub BCL6 samodzielnie lub w połączeniu (podwójne lub potrójne trafienie) są również często obserwowane w DLBCL, szczególnie w podtypie GCB¹⁹. Test DLBCL90 jest rozszerzeniem swojego poprzednika, testu klinicznego Lymph2Cx, a zatem jest zdolny do określania podtypu COO DLBCL, ale został opracowany głównie w celu identyfikacji próbek zawierających translokacje podwójnego trafienia (DH) z udziałem BCL2 przy użyciu cyfrowej ekspresji genów jako alternatywy dla fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ (FISH)^16,20. Wyniki przedstawione w Tabeli 2 pokazują, że makrodysekcja zmieniła status COO lub DHITsig dla 60% (3/5) badanych próbek.

Makrodysekcja próbki A nie miała wpływu na wywołanie COO, ale zmieniła wywołanie DHITsig z NEG na UNCLASS, a zmiana ta została zaobserwowana niezależnie od danych wejściowych RNA próbki makro i z podobnymi wynikami prawdopodobieństwa (0,224, 0,254). W przeciwieństwie do tego, makrodysekcja próbki C nie miała wpływu na wywołanie DHITsig, ale zmieniła wywołanie COO z GCB na UNC. Ponownie, zmiana ta została zaobserwowana niezależnie od danych wejściowych makrowypreparowanej próbki RNA. Jednak przy 0,117 prawdopodobieństwo wywołania COO było bliższe progowi wywołania wynoszącemu 0,1 dla makrowypreparowanej próbki ze zmniejszonym wejściem RNA. Podobnie jak w przypadku próbki A, makrodysekcja próbki E nie miała wpływu na wywołanie COO, ale zmieniło wywołanie DHITsig. Jednak dla próbki E wywołanie zmieniło się z UNCLASS na NEG i stało się tak niezależnie od danych wejściowych RNA makrowypreparowanej próbki z dość podobnymi wywołaniami prawdopodobieństwa (0,849, 0,833). Warto zauważyć, że ta zmiana wywołania na DHITsig NEG ma sens biologiczny, biorąc pod uwagę, że próbka E została znaleziona w ABC-DLBCL, a translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 zostały zgłoszone jako obserwowane wyłącznie w GCB-DLBCL¹⁹.

Rysunek 1: Generowanie wycinków tkanek montowanych na szkiełku za pomocą mikrotomu. (A) Blok tkanki FFPE utrzymywany na miejscu przez uchwyt mikrotomu i cięty w celu wytworzenia wstęgi sekwencyjnych skrawków tkanki FFPE. (B) Za pomocą wstępnie namoczonych drewnianych patyczków, wstążkę pobiera się z mikrotomu i przenosi do ciepłej łaźni wodnej. (C) Ciepło wody pomaga wygładzić zagniecenia na wstążce tkankowej. (D) Poszczególne skrawki tkanki FFPE usuwa się z wstęgi tkankowej poprzez umieszczenie zamkniętych kleszczy na styku dwóch odcinków i delikatne rozchylenie kleszczy, co powoduje oderwanie odcinków od siebie. (E) Skrawki pobiera się z wody poprzez zanurzenie szkiełka podstawowego pod kątem i delikatne przesuwanie boku w kierunku przekroju tkanki, aż krawędź przekroju dotknie szkiełka podstawowego. (F) Gdy szkiełko i sekcja się zetkną, powoli wyjmij szkiełko z wody, pozwalając, aby sekcja tkanki opadła równo ze szkiełkiem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Patologia i przegląd histologiczny wycinków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). (A,B) Wycinek tkanki H&E jest poddawany przeglądowi mikroskopowemu przez certyfikowanego patologa. (C,D) Gdy patolog obejrzy całą tkankę i stwierdzi, że nie jest to 100% tkanka nowotworowa, patolog użyje markera, aby otoczyć obszar guza tkanki. (E,F) Przyłożenie oznaczonego H&E do oryginalnego bloku tkanki FFPE pokazuje, że nie cała tkanka jest materiałem nowotworowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Próbki tkanek. Ten obraz przedstawia patologicznie oceniane i oznaczone guzem H&Es (rząd 1), nieprzetworzone skrawki tkanki FFPE montowane na szkiełku (rząd 2), odparafinowane skrawki tkanki FFPE montowane na szkiełku (rząd 3), odparafinowane skrawki tkanki FFPE montowane na szkiełku z oznaczeniami patologicznymi prześledzonymi na odwrocie szkiełka (rząd 4), odparafinowane i makrorozcięte skrawki tkanki FFPE montowane na szkiełku (rząd 5) dla 5 próbek (A-E) użytych do zademonstrowania tego protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Deparafinowanie i makro-rozwarstwienie skrawków tkanek FFPE: (A) W dygestoriach, chusteczki FFPE zamontowane w stojaku na szkiełka są myte w dwóch płuczkach d-limonenu i jednym płukaniu etanolem. (B,C) Po umyciu cała parafina została usunięta, a na szkiełku pozostała tylko chusteczka, która jest teraz biała i dobrze widoczna w porównaniu z jej wstępnie umytym odpowiednikiem. (D) Odparafinowany, montowany na szkiełku fragment tkanki umieszcza się twarzą w dół na odwrocie pasującego oznaczonego H&E. (E) Oznaczenia obszaru guza na H&E są następnie śledzone na odwrocie odparafinowanego szkiełka za pomocą cienkiego lub ultracienkiego markera permanentnego z końcówką (F) Oznaczony odparafinowany fragment tkanki montowany na szkiełku jest następnie zanurzany w płynie do płukania glicerolem w celu zwilżenia sekcji tkanki do pobrania. Szkiełko jest powoli usuwane z glicerolu, a tył szkiełka przeciera się chusteczką w celu usunięcia nadmiaru glicerolu przed położeniem szkiełka zadrukowaną do góry na stole. (G) Używając płaskiej strony czystej żyletki, tkanka jest makropreparowana, a niechciana tkanka poza oznaczeniami patologa jest odrzucana przed pobraniem tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, która gromadzi się wzdłuż krawędzi ostrza. (H) Drewniany patyczek służy do usuwania zebranej tkanki z krawędzi ostrza. (I) Tkanka jest następnie przenoszona do wstępnie znakowanego buforu do wytrawiania tkanek z mikroprobówką i jest gotowa do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Identyfikator próbki	Cała tkanka (a)		Obszar tkanki z zakreślonym symbolem (b)		Całkowita zawartość guza w całej tkance (c)	Krotny wzrost zawartości guza przez makrodysekcję (d)	Nie analizowane w makro (e)		Makro wycięte (f)
	% Żywotny guz	% Inne	% Żywotny guz	% Inne			# z 5 μm wyodrębnionych slajdów	RNA conc (ng/μL)	# z 5 μm wyodrębnionych slajdów	RNA conc (ng/μL)
Próbka A	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
Próbka B	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
Próbka C	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
Próbka D	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
Próbka E	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

Tabela 1: Dane z przeglądu patologii. Tabela przedstawia (a) procent żywotnego guza w całym przekroju tkanki według obszaru, (b) procent żywotnego guza w obszarze zakreślonym/zaznaczonym przez patologa podczas przeglądu według komórkowości, (c) szacowaną ogólną komórkowość guza całej tkanki (a x b), (d) szacowany krotny wzrost komórkowości guza osiągnięty w makrodysekcji, e) i f) liczbę wyekstrahowanych wyekstrahowanych skrawków tkanek FFPE o wielkości 5 μm i wynikowe stężenia RNA dla dopasowanych próbek niepoddanych makrosekcji i makrodyssekcji. % Innych odnosi się do wszystkich innych tkanek obecnych w danej próbce, które nie są tkanką nowotworową i mogą obejmować tkankę łączną, fibroblasty zrębu, naczynia krwionośne, a także inne nieodłączne elementy zrębu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Identyfikator próbki		Wejście RNA (ng)	DLBCL90 Rozmowa telefoniczna z dyrektorem operacyjnym	DLBCL90 prawdopodobieństwo sprawdzenia	Wywołanie DHITsig	Prawdopodobieństwo DHITsig pos	Prawdopodobieństwo ujemne DHITsig
Nie analizowane w makro	Próbka A	95,0	Gcb	0,000	Neg	0,135	0,865
	Próbka B	170,0	Gcb	0,000	Neg	0,032	0,968
	Próbka C	68,5	Gcb	0,028	Neg	0,033	0,967
	Próbka D	286,5	abecadło	0,998	Neg	0,002	0,998
	Próbka E	126,0 pkt.	abecadło	0,989	BEZ KLASY	0,212	0,788
Makro wycięte	Przykładowe A_M	291,7	Gcb	0,000	BEZ KLASY	0,224	0,776
	Przykładowe B_M	300,0	Gcb	0,000	Neg	0,016	0,984
	Przykładowe C_M	231,2	BEZ KLASY	0,210	Neg	0,015	0,985
	Przykładowe D_M	300,0	abecadło	0,999	Neg	0,002	0,998
	Przykładowe E_M	223,2 pkt.	abecadło	0,987	Neg	0,151	0,849
Makropreparowane i rozcieńczone RNA	Przykładowe A_M	95,0	Gcb	0,000	BEZ KLASY	0,254	0,746
	Przykładowe B_M	170,0	Gcb	0,000	Neg	0,023	0,977
	Przykładowe C_M	68,5	BEZ KLASY	0,117	Neg	0,027	0,973
	Przykładowe D_M	286,5	abecadło	0,999	Neg	0,002	0,998
	Przykładowe E_M	126,0 pkt.	abecadło	0,995	Neg	0,167	0,833

Tabela 2: DLBCL90 wyniki cyfrowego testu ekspresji genów. Pięć próbek (A-E) albo nie zostało poddanych makrosekcji, albo zostało poddanych makrosekcji przed wykonaniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Otrzymany RNA poddano testowi DLBCL90, dla którego maksymalna objętość wejściowa RNA wynosi 5 μL. Próbki niepoddane makrosekcji przeprowadzono przy użyciu 5 μl podstawowego RNA. Każdą makrowyciętą próbkę przeprowadzono dwukrotnie, używając (a) 5 μl podstawowego RNA, chyba że możliwe były podwielokrotności 60 ng/μl oraz (b) 5 μl podstawowego RNA rozcieńczonego w celu dopasowania stężeń/danych wejściowych ich odpowiedników bez makrosekcji. Przyrostek _M oznacza, że próbka została poddana makroanalizie. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Tkanki FFPE są często heterogenicznymi domieszkami tkanek nowotworowych i nienowotworowych. Testy genomowe o wysokiej czułości stają się coraz bardziej powszechne zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, ale mogą być mylone przez obecność zanieczyszczającej tkanki nienowotworowej. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często zalecana w badaniach genomicznych. Procent guza można określić na podstawie obszaru tkanki zajętego przez materiał nowotworowy lub na podstawie proporcji komórek nowotworowych w tkance. Chociaż guz według obszaru jest powszechnie używanym wskaźnikiem czystości guza, nie zawsze przedstawia dokładny opis tkanki. Rozważmy dwie tkanki, obie z 1000 komórek, z których 500 to komórki nowotworowe. W tkance A 500 komórek nienowotworowych to komórki zrębu o objętości podobnej do objętości komórki nowotworowej. W tej tkance procent guza można uznać za 50% zarówno pod względem komórkowości, jak i obszaru. W tkance B 500 komórek nienowotworowych to komórki tłuszczowe o objętości 4 razy większej niż komórka nowotworowa. W tej tkance odsetek guza wynosi nadal 50% pod względem komórkowości, ale 20% pod względem powierzchni. Trzecia tkanka, tkanka C, składa się z 500 komórek nowotworowych plus 400 komórek tłuszczowych i 800 komórek zrębu o objętościach odpowiednio 4 i 0,5 razy większych niż komórki nowotworowe. Biorąc pod uwagę, że 100 komórek tłuszczowych równa się objętości 800 komórek zrębu, procent guza C wynosi 29% pod względem komórkowości (500/1700), ale nadal 20% pod względem powierzchni. Tkanka D składa się również z komórek guza, tłuszczu i zrębu o proporcjach objętości 1x, 4x i 0,1x. Jednak liczba komórek wynosi odpowiednio 400, 10 i 720. Tak więc procent guza tkanki D wynosi 35% pod względem komórkowości (400/1130), ale 78% pod względem powierzchni. Przykłady te są nadmiernie uproszczone i nie odzwierciedlają rzeczywistego składu tkanek, ale wyraźnie pokazują znaczenie składu tkanek i różnicę między zawartością guza w zależności od obszaru i komórkowości. Co ważne, jeśli chodzi o wzbogacanie zawartości guza w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych, komórkowość guza jest ważniejszym atrybutem ze względu na zwiększony potencjał mylący ekstrakcji materiału genomowego z większej liczby komórek nienowotworowych niż komórek nowotworowych. Podkreśla to nie tylko potrzebę oceny zawartości guza w tkankach pod względem procentowej komórkowości, ale także potrzebę wycięcia niechcianej tkanki w celu zminimalizowania wszelkich potencjalnych negatywnych skutków tkanki nienowotworowej. Dostępnych jest kilka metod wzbogacania tkanek, z których główne to makrodysekcja i mikrodysekcja.

Makrodysekcja, metoda opisana w tym protokole, jest stosunkowo szybka, prosta i nie wymaga kosztownego ani specjalistycznego sprzętu. Chociaż makrodysekcja może znacznie poprawić zawartość guza, ważne jest, aby zrozumieć, że nie eliminuje całkowicie materiału nienowotworowego. Celem makrodysekcji jest wystarczające wzbogacenie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania poprzez wykluczenie niechcianej tkanki w celu zmniejszenia "szumu" wynikającego z niechcianej tkanki, co z kolei może wzmocnić sygnał zainteresowania ze strony tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Tak więc wzbogacanie guza za pośrednictwem makrodysekcji jest sposobem na zwiększenie stosunku sygnału do szumu w celu lepszego wykrywania markerów będących przedmiotem zainteresowania, w szczególności markerów molekularnych specyficznych dla nowotworu o niskiej liczebności lub słabej ekspresji. Jednak makrodysekcja ma ograniczenia ze względu na brak precyzji oferowanej przez grube narzędzia, takie jak żyletki, i jest podatna na problemy z precyzją wynikające z grubości linii markera patologa, a także potencjalne błędy podczas śledzenia granic H&E patologów. Jak wspomniano powyżej, nie jest możliwe osiągnięcie 100% czystości guza ze względu na obecność nieodłącznych i indukujących nowotwór elementów zrębu (tj. tkanki łącznej, fibroblastów zrębu, naczyń krwionośnych, łagodnych reaktywnych limfocytów, makrofagów) osadzonych w samym guzie. Rzeczywiście, wiele inwazyjnych lub rozlanych nowotworów złośliwych indukuje silną desmoplastyczną odpowiedź zrębu, w wyniku czego powstają skupiska komórek nowotworowych, które są ściśle zmieszane z fibroblastami zrębu i innymi typami komórek nienowotworowych; gdzie nowotwory związane z tym wzorcem reakcji zrębu, takie jak tkanki raka trzustki²¹, mogą odnieść większe korzyści z cyfrowo sterowanej mikrodysekcji niż ręcznej makrodysekcji.

Ręczna mikrodysekcja jest wykonywana pod mikroskopem w celu ułatwienia identyfikacji, rozwarstwienia i izolacji tkanek określonych komórek lub populacji za pomocą igły lub skalpela i ma tę zaletę, że jest bardziej precyzyjna w porównaniu z makrodysekcją²². Jednak ręczna mikrodysekcja jest pracochłonnym procesem, któremu brakuje finezji potrzebnej w przypadku złożonych tkanek o niskiej zawartości guza lub skomplikowanych cechach, które są niekompatybilne z ręcznym rozwarstwieniem. Takie tkanki można wypreparować przy użyciu wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takich jak mikrodysekcja laserowa. Rzeczywiście, wykazano, że mikrodysekcja pod kontrolą cyfrową daje wyższy procent zawartości guza w porównaniu z ręczną makrodysekcją w tkankach raka trzustki²³. Jednak wady tych wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takie jak potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu i wysoko wykwalifikowanych osób, utrudniają ich włączenie do przepływów pracy. Badanie przeprowadzone przez de Bruin i wsp., porównujące wpływ makrodysekcji i mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) na profilowanie ekspresji genów, wykazało, że próbki LCM miały niską całkowitą wydajność RNA (średnio 30 ng) i wymagały dwóch rund amplifikacji mRNA, aby osiągnąć próg wejściowy przygotowania biblioteki cDNA²⁴. Autorzy stwierdzili, że uzyskane profile ekspresji genów LCM były bardziej dotknięte przez rundy amplifikacji mRNA niż profile makrowypreparowane były dotknięte wkładem zrębu nienowotworowego i doszli do wniosku, że makrodysekcja może być odpowiednio wykorzystana do generowania wiarygodnych danych dotyczących ekspresji genów²⁴.

Istotną zaletą cyfrowego profilowania ekspresji genów NanoString, szczególnie podczas pracy z wysoce zdegradowanym RNA pochodzącym z FFPE, jest to, że nie wymaga ono procesów zależnych od enzymów, takich jak amplifikacja RNA lub przygotowanie bibliotek cDNA. Jednak testy są zwykle optymalizowane pod kątem danych wejściowych między 50-300 ng całkowitego RNA^25,26, które, w oparciu o wyniki de Bruin i wsp.24, mogą nie być kompatybilne z mikrowypreparowanymi tkankami bez zwiększenia wkładu tkankowego; Jest to niekorzystny popyt w epoce, w której próbki tkanek są coraz częściej pobierane w postaci małych biopsji, a nie resekcji chirurgicznych. Dane wejściowe RNA użyte do testu DLBCL90 wahały się od 68,5 do 300 ng zarówno dla makrowypreparowanych, jak i niewypreparowanych tkanek. Wyniki pokazują, że makrodysekcja spowodowała zmiany wywołania w 60% badanych próbek i że zmiany te obserwowano niezależnie od wprowadzenia RNA do makrowypreparowanych próbek. Jednak prawdopodobieństwo COO dla niskiego wejścia RNA przekroczyło próg wywołania prawdopodobieństwa COO GCB/UNC, gdzie progi wynoszą od 0 do <0,1 dla GCB, 0,1-0,9 dla UNC i >0,9 do 1,0 dla połączeń ABC²⁰. Głównymi podtypami COO DLBCL są GCB i ABC, które stanowią 41% i 44% wszystkich przypadków DLBCL, przy czym UNC stanowi grupę pośrednią z tych dwóch, a ABC jest najbardziej agresywną^20,27. Tak więc, podczas gdy zmiana wywołania COO po makrodysekcji próbki C nie spowodowała jawnej zmiany podtypu COO z GCB na ABC, zmiana z GCB na UNC może sugerować przesunięcie w kierunku bardziej agresywnej choroby. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że podtyp UNC nie jest po prostu podtypem pośrednim i że może potencjalnie posiadać cechy specyficzne dla podtypu, które można wykorzystać terapeutycznie²⁸. Podobnie, makrodysekcja próbek A i E nie spowodowała szczerych zmian w wywołaniach DHITsig z DH ujemnych na DH dodatnich lub odwrotnie. Jednak przemieszczenia próbki GCB (próbki A) z NEG do UNCLASS i próbki ABC (próbki E) z UNCLASS do NEG po makrodysekcji są biologicznie odpowiednie, ponieważ translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 są zgłaszane jako zjawisko wyłącznie GCB¹⁹. Chociaż translokacje są tradycyjnie i powszechnie wykrywane przez FISH w warunkach klinicznych, rośnie tempo poszukiwania alternatywnej, mniej skomplikowanej i czasochłonnej metody ich wykrywania. Test DLBCL90 jest ważnym narzędziem, które odpowiada na tę potrzebę, a uzasadnienie jego stosowania jest wzmocnione przez ustalenie, że test ten jest w stanie wykryć translokacje tajemnicze do sond FISH stosowanych w diagnostyce klinicznej²⁹.

Opisany powyżej protokół makrodysekcji przedstawia prostą metodę, która umożliwia naukowcom zwiększenie zawartości guza w próbkach tkanek, które zwykle spadłyby poniżej powszechnie stosowanych progów kryteriów włączenia do badania. Włączenie makrodysekcji do przebiegu badania umożliwia naukowcom uratowanie tkanek o niskiej gęstości guza przed wykluczeniem z badania poprzez zwiększenie ich zawartości guza. To z kolei pozwala na zwiększenie pewności, że powstałe eluaty RNA i DNA reprezentują guz poddany badaniom genomicznym. Chociaż istnieją inne, bardziej precyzyjne metody preparacji tkanek, w przypadku guzów, które rosną w bardziej ekspansywny, nienaciekający, przypominający arkusz lub w sposób stały, makrodysekcja jest prawdopodobnie wystarczająca. Przedstawione tutaj wyniki podkreślają znaczenie czystości guza w testach genomicznych i makrodysekcji jako niezawodnego narzędzia do osiągnięcia tego celu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
200-procentowy etanol	Decon	2701
Zestaw AllPrep DNA/RNA FFPE	Qiagen	80234	Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE
Doniczki z kopliny	Różne
DLBCL90	NanoString	różne	Cyfrowe profilowanie ekspresji genów na podstawie testu DLBCL90
d-Limonen	VWR	89376-092
Kleszcze	Różne	x
Szkiełka mikroskopowe	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Zestawy główne	NanoString	różne
Mikrotomy	Leica	RM2265
Mikrorurki	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	do jakościowania DNA, RNA i białek
nCounter	NanoString	x	Cyfrowa platforma do profilowania ekspresji genów używana do przeprowadzenia testu DLBCL90
Marker permanentny	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Dozownik żyletki	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Żyletki	Mikroskop Electrib Nauki	71985-23
Bufor do trawienia tkanek	Qiagen	80234
Woda ultraczysta	VWR	SH30538.02
Trójkąt do kąpieli wodnej	Nauki biomedyczne	TFB-120
Drewniany kij	FisherBrand	22363158