Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.
Artykuł metodologiczny
Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obecność zanieczyszczających tkanek nienowotworowych w tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) może znacznie podważyć badania genomiczne. W tym miejscu opisujemy makrodysekcję, metodę mającą na celu zwiększenie procentowej zawartości guza w próbce tkanki poprzez usunięcie i wyeliminowanie niechcianej tkanki przed wykonaniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Bloki tkankowe FFPE podzielono na sekcje w celu wytworzenia skrawków tkanek montowanych na szkiełku o grubości 4-5 μm. Reprezentatywny wycinek został przedłożony do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie poddany przeglądowi przez certyfikowanego patologa. Podczas przeglądu patolog zidentyfikował i oznaczył obszary tkanki nowotworowej w H&E. Po zakończeniu, oznaczone H&E zostało użyte do przeprowadzenia resekcji seryjnych niebarwionych odcinków z tego samego bloku tkanki. Aby zademonstrować efekty makrodysekcji, RNA wyekstrahowane z dopasowanych makrowypreparowanych i niewypreparowanych chłoniaków rozlanych dużych komórek B (DLBCL) przeprowadzono na cyfrowym teście ekspresji genów zdolnym do określenia podtypu DLBCL i statusu translokacji BCL2. Wyniki wykazały, że makrodysekcja zmieniła podtyp lub wywołania statusu translokacji BCL2 w 60% badanych próbek. Podsumowując, makrodysekcja jest prostą i skuteczną metodą wzbogacania guza przed ekstrakcją kwasów nukleinowych, której produkt może być następnie z pewnością wykorzystany w dalszych badaniach genomicznych.
Wprowadzenie
Tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie, zebrane w ramach normalnego procesu diagnostyki klinicznej i przechowywane w klinicznych repozytoriach tkanek, stanowią ogromne źródło do badań na ludziach, w tym badań nad rakiem1. W miarę pogłębiania się naszej wiedzy na temat chorób u ludzi staje się coraz bardziej jasne, że choroby, wcześniej uważane za pojedyncze jednostki oparte na cechach morfologicznych i immunofenotypowych, w rzeczywistości składają się z odrębnych podtypów molekularnych, które wymagają molekularnych testów podtypowania. W związku z tym coraz ważniejsze stają się testy genomowe o wysokiej czułości, zdolne do rozpoznania tych podtypów2. Chociaż tkanki FFPE są znane z tego, że są słabo kompatybilne z technikami genomicznymi ze względu na problemy związane z fiksacją, wraz z rozwojem technologii i protokołów, techniki te stają się coraz bardziej kompatybilne z tym klinicznie wszechobecnym formatem tkanki3,4,5. Jednak tkanki FFPE są często domieszkami materiałów tkankowych nowotworowych i nienowotworowych, w których obecność materiału nienowotworowego jest często niepożądana i może, jeśli występuje w dużej proporcji, znacznie podważyć i wpłynąć na wyniki analiz genomicznych6. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często stosowana do takich analiz, w których tkanki, które nie spełniają tego progu, mogą zostać wykluczone, mimo że w przeciwnym razie spełniają kryteria badania7. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku chorób rzadkich, gdzie tkanki pacjentów są cenne i trudne do pobrania w dużych ilościach.
Makrodysekcja to metoda, która minimalizuje skutki niskiej zawartości guza poprzez zmniejszenie ilości normalnej tkanki3. Usunięcie takiego mylącego materiału nienowotworowego przed ekstrakcją kwasu nukleinowego może znacznie zwiększyć procentową zawartość guza, a tym samym czystość guza ekstrahowanych kwasów nukleinowych. Resekcja tkanki opiera się na specjalistycznej ocenie patologicznej, w której obszar guza jest identyfikowany i zakreślany na świeżo wygenerowanym skrawku tkanki barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) przez certyfikowanego patologa8. Zakreślony H&E jest następnie używany do kierowania usuwaniem i zbieraniem odpowiednio niechcianych i docelowych tkanek. Protokół ten opisuje etapy makrodysekcji od oceny patologicznej do pobrania tkanek, które są wykonywane w Technicznym Laboratorium Podstawowym Zasobów Próbek AIDS i Raka (ACSR) w Klinice Mayo.
Protokół
Wszystkie próbki zostały pobrane i użyte zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IRB Mayo Clinic (PR16-000507 i PR2207-02).
1. Przygotowanie próbki
- Włącz kąpiel wodną z unoszeniem się tkanek. Ustaw temperaturę na 39 °C i pozwól, aby woda osiągnęła odpowiednią temperaturę. Namocz drewniane patyczki do zbierania w kąpieli wodnej.
- Zidentyfikuj i odzyskaj bloki tkanek FFPE, które mają zostać poddane sekcji.
- Wstępnie oznacz szkiełka mikroskopowe za pomocą markera permanentnego klasy histologicznej, który jest odporny na mycie rozpuszczalnikiem.
- Użyj mikrotomu, aby pokroić bloki FFPE. Wytnij co najmniej 2 sekcje pełnopowierzchniowe o grubości 4-5 μm na sekcję dla każdego bloku (Rysunek 1A).
- Przenieś świeżo przeciętą wstęgę skrawków tkanki do wstępnie podgrzanej kąpieli flotacyjnej tkanek w celu zamontowania na szkiełku (Rysunek 1B, C).
UWAGA: Ciepła woda pomaga "wyprasować" zmarszczki na odcinkach (Rysunek 1C). - Obsługując każdą sekcję sekwencyjnie, użyj kleszczyków, aby oderwać pojedynczą sekcję od wstążki (Rysunek 1D).
- Zbierz pojedynczą sekcję na wstępnie oznaczonym szkiełku mikroskopowym.
- Zanurz szkiełko mikroskopowe pod kątem pod sekcją, ustawiając szkiełko tak, aby krawędź przekroju tkanki dotykała szkiełka (Rysunek 1E).
- Po zetknięciu się z sekcją tkanki powoli wyciągnij szkiełko z kąpieli flotacyjnej, aby umożliwić wyprostowanie się części tkanki równo ze szkiełkiem, gdy wynurza się z wody (Rysunek 1F).
- Zamontuj 1 fragment tkanki na szkiełku i powtarzaj, aż wszystkie skrawki zostaną zebrane.
- Pozwól mocowanym na szkiełku skrawkom chusteczki dokładnie wyschnąć w temperaturze pokojowej (RT).
2. Przegląd patologiczny
- Wykonaj barwienie H&E na jednym reprezentatywnym fragmencie tkanki dla każdego bloku9.
- Prześlij świeżo zabarwione H&E do oceny patologicznej przez certyfikowanego patologa.
UWAGA: Podczas przeglądu patolog określa i rejestruje procentową zawartość guza w każdej tkance i zakreśla obszar guza na każdym szkiełku H&E (patrz Rysunek 2 i Rysunek 3, wiersz 1). Tabela 1 przedstawia procentową zawartość guza według komórkowości określoną podczas przeglądu patologicznego H&E dla próbek A-E pokazanych w Rysunek 3, wiersz 1. Sekcje z zawartością guza <60% wymagają makro-dyssekcji7. Liczba odcinków potrzebnych do ekstrakcji kwasu nukleinowego zależy od wielkości zakreślonego obszaru guza. Jeśli w sekcji 1 protokołu wycięto niewystarczającą ilość odcinków i możliwe są dalsze cięcia, może być konieczne wycięcie dodatkowych sekcji.
3. Deparafinizacja
- W dygestorii napełnij dwa szklane naczynia do barwienia nierozcieńczonym d-limonenem klasy histologicznej lub rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu i 1 szklane naczynie do barwienia nierozcieńczonym 200-procentowym etanolem molekularnym.
UWAGA: Unikać kontaktu d-limonenu ze skórą i oczami, unikać wdychania oparów lub mgły oraz trzymać z dala od źródeł zapłonu. Przechowywać etanol z dala od źródeł ciepła, iskier i otwartego ognia, unikać rozlewania i kontaktu ze skórą lub oczami, dobrze wentylować i unikać wdychania oparów.
UWAGA: Napełnij naczynia na tyle, aby zanurzyć szkiełka z kolumnami ( Rysunek 4A); Do napełnienia pokazanych 20-szkiełkowych naczyń do barwienia potrzeba 250 ml. Wymieniaj płyny do płukania d-limonenem i etanolem po każdych 40 szkiełkach. D-limonen (C10H16) jest alternatywnym, podobnie skutecznym i mniej toksycznym środkiem odparafinującym ksylen, który staje się coraz bardziej powszechny w metodologiach histologicznych i daje dobrej jakości kwas nukleinowy po ekstrakcji10,11,12,13,14. Chociaż protokół ten może być wykonywany przy użyciu bardziej przyjaznych dla biotechnologii alternatyw15, ich wpływ, jeśli w ogóle, na jakość ekstrahowanych kwasów nukleinowych pozostaje do ustalenia. - Umieść niebarwione szkiełka z bibułą FFPE w szklanych stojakach na prowadnice Coplin (Rysunek 4A, wstawka).
- Zanurzyć szkiełka w kratkach w myciu d-limonenem 1 na 2 minuty; delikatnie mieszać przez pierwsze 20 s.
UWAGA: Aby zminimalizować przenoszenie między praniami, podczas wyjmowania stojaka na szkiełka z prania poczekaj, aż ruszt na chwilę spunie, a następnie delikatnie przetrzyj spód rusztu bibułą, aby usunąć nadmiar prania. - Zanurz szkiełka podstawowe w nierozcieńczonym roztworze D-limonenu 2 na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij, osusz i ponownie przetrzyj ruszt.
- Zanurz szkiełka w stojaku w roztworze do płukania etanolem na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij stojak i umieść go na chłonnej chusteczce, aby odsączyć. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10 minut, ale nie dłużej niż 2 godziny.
3. Makrodysekcja
- Na stole napełnij słoik ze szkła Coplin 50 ml 3% glicerolu w wodzie wolnej od DNaz/RNaz
UWAGA: Płyn do płukania glicerolem należy wymieniać co 40 szkiełek. - Wstępnie oznaczyć i napełnić mikroprobówki o pojemności 1,5 ml 160 μl buforu do trawienia tkankowego na mikroprobówkę.
UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych wykonywane po makrodysekcji wykorzystywały zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE (tabela materiałów). Tak więc bufor trawienia tkankowego zastosowany w tym protokole składał się z 10 μl proteinazy K i 150 μl buforu PKD. - Prześledź patologiczne oznaczenia na H&E na odwrocie szkiełek tkankowych odparafinowanych.
UWAGA: W porównaniu z tkankami nieodparafinowanymi ( Rysunek 3, rząd 2 i Rysunek 4B), odparafinowane tkanki są białe i dobrze widoczne ( Rysunek 3, Wiersz 3 i Rysunek 4C). To właśnie ta zwiększona widoczność i dostrzegalność cech odparafinizowanych tkanek umożliwia makrodysekcję. Umieść H&E twarzą do dołu na ławce i umieść przód odparafinowanego szkiełka na plecach dopasowanego patologa recenzowanego H&E (Rysunek 4D). Wyrównaj zdeparafinową tkankę z tkanką H&E (Rysunek 4E). Śledzenie oznaczeń patologa jest krytycznym krokiem w procesie makrodysekcji i należy zadbać o jak najdokładniejsze odtworzenie tych oznaczeń. Może to być szczególnie trudne w przypadku małych i/lub niepołączonych tkanek, takich jak próbki B, D i E (Rysunek 3, Figura 4E i Figura 4E wstawka i). Aby ułatwić śledzenie, należy użyć atramentowego markera z cienką lub bardzo cienką końcówką (Rysunek 4E, wstawka ii) do śledzenia oznaczeń narysowanych przez patologa. Chusteczki z etanolem mogą być przydatne do usuwania błędów i umożliwiania ponownego śledzenia, jeśli zajdzie taka potrzeba. - Obróć teraz oznaczoną odparafinowaną szkiełko chusteczką do góry i obrysuj linię markera rogiem czystej żyletki, aby wstępnie przyciąć krawędzie obszaru guza .
- Obsługując każde szkiełko sekwencyjnie, zanurz odparafinizowane szkiełka w 3% roztworze glicerolu. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona przed powolnym wyjęciem szkiełka (Rysunek 4F).
UWAGA: Celem dipu glicerolowego jest zwilżenie tkanki, aby ułatwić zbieranie tkanek, ale także zmniejszyć gromadzenie się ładunku statycznego, który może powodować odpychanie między tkanką a plastikową mikrorurką, w której należy umieścić pobraną tkankę. - Delikatnie przetrzyj tylną część szkiełka chusteczką, aby usunąć nadmiar roztworu glicerolu, i połóż szkiełko na ławce, wycieraną stroną do dołu. Pozostaw chusteczki do krótkiego wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 minuty.
UWAGA: Przeniesienie nadmiaru glicerolu do procesu ekstrakcji może negatywnie wpłynąć na wydajność i jakość ekstrakcji kwasami nukleinowymi. Tkanki powinny być lekko wilgotne, ale nie widocznie mokre po zebraniu. - W zależności od tego, gdzie na szkiełku znajduje się obszar zainteresowania guza, użyj płaskiej krawędzi żyletki, aby (a) bezpośrednio zebrać tkankę nowotworową, używając brzytwy do zeskrobania/zebrania interesującej tkanki ze szkiełka, lub (b) najpierw usunąć i wyrzucić tkankę nienowotworową przed pobraniem interesującej tkanki nowotworowej (Rysunek 3).
UWAGA: Zebrana tkanka ma tendencję do gromadzenia się lub zwijania na dnie ostrza (Rysunek 4G) - Użyj drewnianego patyczka, aby usunąć zebraną tkankę z ostrza (Rysunek 4H i wkładka) i przenieś ją do odpowiedniej, wstępnie oznaczonej i wstępnie napełnionej mikroprobówki (Rysunek 4I).
UWAGA: Bufor wytrawiający służy do "wciągnięcia" tkanki z drewnianego kilofa do płynu. - Przejdź do ekstrakcji kwasów nukleinowych.
UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych zakończono przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA/RNA FFPE zgodnie z instrukcjami producenta, a otrzymane kwasy nukleinowe określono ilościowo za pomocą spektrofotometru UV-vis. Uzyskany RNA przeprowadzono na cyfrowym teście DLBCL90 opartym na profilowaniu ekspresji genów16.
Wyniki
Przecięto łącznie 5 bloków tkanek FFPE z chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL), a uzyskane skrawki poddano makrodysekcji lub nie przed ekstrakcją kwasów nukleinowych. Wyekstrahowane RNA poddano analizie DLBCL9016. Próbki poddane makrodysekcji analizowano dwukrotnie: raz przy użyciu 5 µL stężonego roztwoku RNA, ale z całkowitą ilością RNA nieprzekraczającą 300 ng, a drugi raz przy użyciu 5 µL roztwoku RNA rozcieńczonego tak, aby dopasować ilość RNA do odpowiadających im próbek niepoddanych dysekcji. Wyniki DLBCL90 przedstawiono w Tabeli 2.
DLBCL składa się z 3 odrębnych podtypów w zależności od komórki pochodzenia (COO) o różnej odpowiedzi na leczenie, mianowicie GCB, ABC oraz grupy pośredniej znanej jako niezaklasyfikowana lub UNC17,18. Translokacje obejmujące MYC, BCL2 i/lub BCL6, pojedynczo lub w kombinacji (double hit lub triple hit), są również często obserwowane w DLBCL, szczególnie w podtypie GCB19. Test DLBCL90 jest rozwinięciem jego poprzednika, testu klinicznego Lymph2Cx, i w związku z tym umożliwia wyznaczenie podtypu COO w DLBCL, ale został opracowany przede wszystkim w celu identyfikacji próbek zawierających translokacje typu double hit (DH) obejmujące BCL2, wykorzystując cyfrową ekspresję genów jako alternatywę dla hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH)16,20. Wyniki przedstawione w Tabeli 2 pokazują, że makrodysekcja zmieniła ocenę statusu COO lub DHITsig w 60% (3/5) badanych próbek.
Makrodyssekcja próbki A nie miała wpływu na wynik COO, ale zmieniła wynik DHITsig z NEG na UNCLASS; zmiana ta była obserwowana niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji i przy podobnych wynikach prawdopodobieństwa (0,224, 0,254). W przeciwieństwie do tego, makrodyssekcja próbki C nie miała wpływu na wynik DHITsig, ale zmieniła wynik COO z GCB na UNC. Ponownie, zmiana ta była obserwowana niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji. Jednakże, przy wartości 0,117, prawdopodobieństwo wyniku COO było bliższe progu odcięcia 0,1 dla próbki poddanej makrodyssekcji z mniejszą ilością wprowadzonego RNA. Podobnie jak w przypadku próbki A, makrodyssekcja próbki E nie miała wpływu na wynik COO, ale zmieniła wynik DHITsig. Jednak w przypadku próbki E wynik zmienił się z UNCLASS na NEG i stało się to niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji, przy dość podobnych wynikach prawdopodobieństwa (0,849, 0,833). Co istotne, zmiana tego wyniku na DHITsig NEG ma sens biologiczny, biorąc pod uwagę, że próbka E została zidentyfikowana jako ABC-DLBCL, a translokacje double hit obejmujące BCL2 są raportowane jako występujące wyłącznie w GCB-DLBCL19.
Rycina 1: Przygotowanie skrawków tkanek na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu mikrotomu. (A) Blok tkanki FFPE unieruchomiony w uchwycie mikrotomu i cięty w celu uzyskania wstęgi sekwencyjnych skrawków tkanki FFPE. (B) Przy użyciu uprzednio namoczonych drewnianych patyczków wstęga jest pobierana z mikrotomu i przenoszona do ciepłej kąpieli wodnej. (C) Ciepło wody pomaga wyprostować zagniecenia w wstędze tkankowej. (D) Poszczególne skrawki tkanki FFPE są oddzielane od wstęgi poprzez umieszczenie zamkniętej pęsety na styku dwóch skrawków i delikatne otwarcie pęsety, co powoduje ich rozdzielenie. (E) Skrawki są pobierane z wody poprzez zanurzenie szkiełka przedmiotowego pod kątem i delikatne przesuwanie go w stronę skrawka tkanki, aż krawędź skrawka dotknie szkiełka. (F) Po zetknięciu się szkiełka i skrawka, należy powoli wyjąć szkiełko z wody, pozwalając skrawkowi tkanki przylgnąć płasko do powierzchni szkiełka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Analiza patomorfologiczna i histologiczna skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). (A,B) Skrawki tkanki barwione H&E poddawane są ocenie mikroskopowej przez certyfikowanego patologa. (C,D) Po obejrzeniu całej tkanki i stwierdzeniu, że nie składa się ona w 100% z tkanki nowotworowej, patolog zaznacza markerem obszar nowotworu w tkance. (E,F) Przyłożenie zaznaczonego preparatu H&E do oryginalnego bloku tkankowego FFPE pokazuje, że nie cała tkanka jest materiałem nowotworowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Próbki tkanek. Na obrazie przedstawiono: barwienia H&E z recenzją patomorfologiczną i zaznaczonym guzami (Rząd 1), nieprzetworzone przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 2), odparafinowane przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 3), odparafinowane przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach z naniesionymi na odwrocie szkiełka oznaczeniami patomorfologicznymi (Rząd 4) oraz odparafinowane i makrodysekcyjne przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 5) dla 5 próbek (A-E) wykorzystanych do zademonstrowania niniejszego protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Deparafinizacja i makrosekcja przekrojów tkankowych FFPE: (A) W dygestorium tkanki FFPE umieszczone w kasecie do szkiełek są płukane w dwóch kąpielach z d-limonenem i jednej kąpieli z etanolem. (B,C) Po płukaniu cała parafina została usunięta, a na szkiełku pozostała jedynie tkanka, która jest teraz biała i bardzo widoczna w porównaniu do stanu przed płukaniem. (D) Deparafinizowany przekrój tkanki na szkiełku jest kładziony stroną z tkanką do dołu na odwrocie odpowiadającego mu, oznakowanego preparatu H&E. (E) Oznaczenia obszaru guza na preparacie H&E są następnie odwzorowywane na odwrocie deparafinizowanego szkiełka za pomocą permanentnego markera z cienką lub ultracialką końcówką. (F) Oznakowany deparafinizowany przekrój tkanki na szkiełku jest następnie zanurzany w glicerolu, aby nawilżyć tkankę przed pobraniem. Szkiełko jest powoli wyjmowane z glicerolu, a jego odwrotna strona jest wycierana chusteczką w celu usunięcia nadmiaru glicerolu przed położeniem szkiełka stroną z tkanką do góry na blacie. (G) Za pomocą płaskiej strony czystego ostrza żyletki przeprowadza się makrosekcję tkanki; tkanka niepożądana, znajdująca się poza oznaczeniami patologa, jest odrzucana przed pobraniem tkanki docelowej, która gromadzi się wzdłuż krawędzi ostrza. (H) Do usunięcia zebranej tkanki z krawędzi ostrza używa się drewnianego patyczka. (I) Tkanka jest następnie przenoszona do wcześniej oznakowanej mikroprobówki wypełnionej buforem do trawienia tkanek i jest gotowa do ekstrakcji kwasów nukleinowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
| Identyfikator próbki | Cała tkanka (a) | Zakreślony obszar tkanki (b) | Całkowita zawartość guza w całej tkance (c) | Wielokrotność wzrostu zawartości guza w makrodissekcji (d) | Bez makrodysekcji (e) | Makrodissekcja (f) | ||||
| % żywotnego guza | % Inne | % żywych komórek nowotworu | % Inne | liczba 5 µm wyekstrahowane preparaty | stężenie RNA (ng/µL) | liczba 5 µm wyekstrahowane preparaty | stężenie RNA (ng/µL) | |||
| Próbka A | 60 | 40 | 75 | 25 | 45 | 1.7 | 2 | 19.0 | 4 | 58.3 |
| Próbka B | 60 | 40 | 65 | 35 | 39 | 1.7 | 1 | 34.0 | 2 | 60.0 |
| Próbka C | 40 | 60 | 65 | 35 | 26 | 2.5 | 1 | 13.7 | 2 | 46.2 |
| Próbka D | 35 | 65 | 90 | 10 | 32 | 2.9 | 1 | 57.3 | 2 | 60.0 |
| Próbka E | 20 | 80 | 30 | 70 | 6 | 5.0 | 3 | 25.2 | 3 | 44.6 |
Tabela 1: Dane z przeglądu patomorfologicznego. Tabela przedstawia (a) procent żywej tkanki nowotworowej w całym przekroju tkanki w zależności od powierzchni, (b) procent żywej tkanki nowotworowej w obszarze zakreślonym/oznaczonym przez patologa podczas przeglądu w zależności od komórkowości, (c) szacowaną całkowitą komórkowość nowotworu w całej tkance (a x b), (d) szacowany stopień zwiększenia komórkowości nowotworu osiągnięty dzięki makrodysekcji, (e i f) liczbę wyekstrahowanych niebarwionych przekrojów tkanki o grubości 5 µm zamontowanych na szkiełkach FFPE oraz wynikające z tego stężenia RNA dla dopasowanych próbek niepoddanych makrodysekcji oraz poddanych makrodysekcji. % Inne odnosi się do wszystkich pozostałych tkanek obecnych w danej próbce, które nie są tkanką nowotworową i mogą obejmować tkankę łączną, fibroblasty zrębu, naczynia krwionośne, a także inne wrodzone elementy zrębu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
| ID próbki | Ilość RNA wejściowego (ng) | Klasyfikacja COO DLBCL90 | Prawdopodobieństwo klasyfikacji DLBCL90 | Klasyfikacja DHITsig | Prawdopodobieństwo wyniku dodatniego DHITsig | Prawdopodobieństwo wyniku ujemnego DHITsig | |
| Bez makrodysekcji | Próbka A | 95.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.135 | 0.865 |
| Próbka B | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.032 | 0.968 | |
| Próbka C | 68.5 | GCB | 0.028 | NEG | 0.033 | 0.967 | |
| Próbka D | 286.5 | ABC | 0.998 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Próbka E | 126.0 | ABC | 0.989 | UNCLASS | 0.212 | 0.788 | |
| Makrodysekcjonowane | Próbka A_M | 291.7 | GCB | 0.000 | UNCLASS | 0.224 | 0.776 |
| Próbka B_M | 300.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.016 | 0.984 | |
| Próbka C_M | 231.2 | UNCLASS | 0.210 | NEG | 0.015 | 0.985 | |
| Próbka D_M | 300.0 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Próbka E_M | 223.2 | ABC | 0.987 | NEG | 0.151 | 0.849 | |
| Makrodysekcjonowane i RNA rozcieńczone | Próbka A_M | 95.0 | GCB | 0.000 | UNCLASS | 0.254 | 0.746 |
| Próbka B_M | 170.0 | GCB | 0.000 | NEG | 0.023 | 0.977 | |
| Próbka C_M | 68.5 | UNCLASS | 0.117 | NEG | 0.027 | 0.973 | |
| Próbka D_M | 286.5 | ABC | 0.999 | NEG | 0.002 | 0.998 | |
| Próbka E_M | 126.0 | ABC | 0.995 | NEG | 0.167 | 0.833 | |
Tabela 2: Wyniki cyfrowego badania ekspresji genów DLBCL90. Pięć próbek (A-E) nie zostało poddanych makrodissekcji lub zostało poddanych makrodissekcji przed przeprowadzeniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Uzyskane RNA poddano badaniu DLBCL90, dla którego maksymalna objętość wejściowa RNA wynosi 5 µL. Próbki bez makrodissekcji analizowano przy użyciu 5 µL roztworu RNA. Każda próbka po makrodissekcji była analizowana dwukrotnie z użyciem (a) 5 µL roztworu RNA, chyba że możliwe było przygotowanie aliquotów 60 ng/µL oraz (b) 5 µL roztworu RNA rozcieńczonego tak, aby dopasować stężenia/ilość wejściową do odpowiadających im próbek bez makrodissekcji. Przyrostek _M oznacza, że próbka została poddana makrodissekcji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Tkanki FFPE są często heterogenicznymi domieszkami tkanek nowotworowych i nienowotworowych. Testy genomowe o wysokiej czułości stają się coraz bardziej powszechne zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, ale mogą być mylone przez obecność zanieczyszczającej tkanki nienowotworowej. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często zalecana w badaniach genomicznych. Procent guza można określić na podstawie obszaru tkanki zajętego przez materiał nowotworowy lub na podstawie proporcji komórek nowotworowych w tkance. Chociaż guz według obszaru jest powszechnie używanym wskaźnikiem czystości guza, nie zawsze przedstawia dokładny opis tkanki. Rozważmy dwie tkanki, obie z 1000 komórek, z których 500 to komórki nowotworowe. W tkance A 500 komórek nienowotworowych to komórki zrębu o objętości podobnej do objętości komórki nowotworowej. W tej tkance procent guza można uznać za 50% zarówno pod względem komórkowości, jak i obszaru. W tkance B 500 komórek nienowotworowych to komórki tłuszczowe o objętości 4 razy większej niż komórka nowotworowa. W tej tkance odsetek guza wynosi nadal 50% pod względem komórkowości, ale 20% pod względem powierzchni. Trzecia tkanka, tkanka C, składa się z 500 komórek nowotworowych plus 400 komórek tłuszczowych i 800 komórek zrębu o objętościach odpowiednio 4 i 0,5 razy większych niż komórki nowotworowe. Biorąc pod uwagę, że 100 komórek tłuszczowych równa się objętości 800 komórek zrębu, procent guza C wynosi 29% pod względem komórkowości (500/1700), ale nadal 20% pod względem powierzchni. Tkanka D składa się również z komórek guza, tłuszczu i zrębu o proporcjach objętości 1x, 4x i 0,1x. Jednak liczba komórek wynosi odpowiednio 400, 10 i 720. Tak więc procent guza tkanki D wynosi 35% pod względem komórkowości (400/1130), ale 78% pod względem powierzchni. Przykłady te są nadmiernie uproszczone i nie odzwierciedlają rzeczywistego składu tkanek, ale wyraźnie pokazują znaczenie składu tkanek i różnicę między zawartością guza w zależności od obszaru i komórkowości. Co ważne, jeśli chodzi o wzbogacanie zawartości guza w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych, komórkowość guza jest ważniejszym atrybutem ze względu na zwiększony potencjał mylący ekstrakcji materiału genomowego z większej liczby komórek nienowotworowych niż komórek nowotworowych. Podkreśla to nie tylko potrzebę oceny zawartości guza w tkankach pod względem procentowej komórkowości, ale także potrzebę wycięcia niechcianej tkanki w celu zminimalizowania wszelkich potencjalnych negatywnych skutków tkanki nienowotworowej. Dostępnych jest kilka metod wzbogacania tkanek, z których główne to makrodysekcja i mikrodysekcja.
Makrodysekcja, metoda opisana w tym protokole, jest stosunkowo szybka, prosta i nie wymaga kosztownego ani specjalistycznego sprzętu. Chociaż makrodysekcja może znacznie poprawić zawartość guza, ważne jest, aby zrozumieć, że nie eliminuje całkowicie materiału nienowotworowego. Celem makrodysekcji jest wystarczające wzbogacenie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania poprzez wykluczenie niechcianej tkanki w celu zmniejszenia "szumu" wynikającego z niechcianej tkanki, co z kolei może wzmocnić sygnał zainteresowania ze strony tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Tak więc wzbogacanie guza za pośrednictwem makrodysekcji jest sposobem na zwiększenie stosunku sygnału do szumu w celu lepszego wykrywania markerów będących przedmiotem zainteresowania, w szczególności markerów molekularnych specyficznych dla nowotworu o niskiej liczebności lub słabej ekspresji. Jednak makrodysekcja ma ograniczenia ze względu na brak precyzji oferowanej przez grube narzędzia, takie jak żyletki, i jest podatna na problemy z precyzją wynikające z grubości linii markera patologa, a także potencjalne błędy podczas śledzenia granic H&E patologów. Jak wspomniano powyżej, nie jest możliwe osiągnięcie 100% czystości guza ze względu na obecność nieodłącznych i indukujących nowotwór elementów zrębu (tj. tkanki łącznej, fibroblastów zrębu, naczyń krwionośnych, łagodnych reaktywnych limfocytów, makrofagów) osadzonych w samym guzie. Rzeczywiście, wiele inwazyjnych lub rozlanych nowotworów złośliwych indukuje silną desmoplastyczną odpowiedź zrębu, w wyniku czego powstają skupiska komórek nowotworowych, które są ściśle zmieszane z fibroblastami zrębu i innymi typami komórek nienowotworowych; gdzie nowotwory związane z tym wzorcem reakcji zrębu, takie jak tkanki raka trzustki21, mogą odnieść większe korzyści z cyfrowo sterowanej mikrodysekcji niż ręcznej makrodysekcji.
Ręczna mikrodysekcja jest wykonywana pod mikroskopem w celu ułatwienia identyfikacji, rozwarstwienia i izolacji tkanek określonych komórek lub populacji za pomocą igły lub skalpela i ma tę zaletę, że jest bardziej precyzyjna w porównaniu z makrodysekcją22. Jednak ręczna mikrodysekcja jest pracochłonnym procesem, któremu brakuje finezji potrzebnej w przypadku złożonych tkanek o niskiej zawartości guza lub skomplikowanych cechach, które są niekompatybilne z ręcznym rozwarstwieniem. Takie tkanki można wypreparować przy użyciu wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takich jak mikrodysekcja laserowa. Rzeczywiście, wykazano, że mikrodysekcja pod kontrolą cyfrową daje wyższy procent zawartości guza w porównaniu z ręczną makrodysekcją w tkankach raka trzustki23. Jednak wady tych wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takie jak potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu i wysoko wykwalifikowanych osób, utrudniają ich włączenie do przepływów pracy. Badanie przeprowadzone przez de Bruin i wsp., porównujące wpływ makrodysekcji i mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) na profilowanie ekspresji genów, wykazało, że próbki LCM miały niską całkowitą wydajność RNA (średnio 30 ng) i wymagały dwóch rund amplifikacji mRNA, aby osiągnąć próg wejściowy przygotowania biblioteki cDNA24. Autorzy stwierdzili, że uzyskane profile ekspresji genów LCM były bardziej dotknięte przez rundy amplifikacji mRNA niż profile makrowypreparowane były dotknięte wkładem zrębu nienowotworowego i doszli do wniosku, że makrodysekcja może być odpowiednio wykorzystana do generowania wiarygodnych danych dotyczących ekspresji genów24.
Istotną zaletą cyfrowego profilowania ekspresji genów NanoString, szczególnie podczas pracy z wysoce zdegradowanym RNA pochodzącym z FFPE, jest to, że nie wymaga ono procesów zależnych od enzymów, takich jak amplifikacja RNA lub przygotowanie bibliotek cDNA. Jednak testy są zwykle optymalizowane pod kątem danych wejściowych między 50-300 ng całkowitego RNA25,26, które, w oparciu o wyniki de Bruin i wsp.24, mogą nie być kompatybilne z mikrowypreparowanymi tkankami bez zwiększenia wkładu tkankowego; Jest to niekorzystny popyt w epoce, w której próbki tkanek są coraz częściej pobierane w postaci małych biopsji, a nie resekcji chirurgicznych. Dane wejściowe RNA użyte do testu DLBCL90 wahały się od 68,5 do 300 ng zarówno dla makrowypreparowanych, jak i niewypreparowanych tkanek. Wyniki pokazują, że makrodysekcja spowodowała zmiany wywołania w 60% badanych próbek i że zmiany te obserwowano niezależnie od wprowadzenia RNA do makrowypreparowanych próbek. Jednak prawdopodobieństwo COO dla niskiego wejścia RNA przekroczyło próg wywołania prawdopodobieństwa COO GCB/UNC, gdzie progi wynoszą od 0 do <0,1 dla GCB, 0,1-0,9 dla UNC i >0,9 do 1,0 dla połączeń ABC20. Głównymi podtypami COO DLBCL są GCB i ABC, które stanowią 41% i 44% wszystkich przypadków DLBCL, przy czym UNC stanowi grupę pośrednią z tych dwóch, a ABC jest najbardziej agresywną20,27. Tak więc, podczas gdy zmiana wywołania COO po makrodysekcji próbki C nie spowodowała jawnej zmiany podtypu COO z GCB na ABC, zmiana z GCB na UNC może sugerować przesunięcie w kierunku bardziej agresywnej choroby. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że podtyp UNC nie jest po prostu podtypem pośrednim i że może potencjalnie posiadać cechy specyficzne dla podtypu, które można wykorzystać terapeutycznie28. Podobnie, makrodysekcja próbek A i E nie spowodowała szczerych zmian w wywołaniach DHITsig z DH ujemnych na DH dodatnich lub odwrotnie. Jednak przemieszczenia próbki GCB (próbki A) z NEG do UNCLASS i próbki ABC (próbki E) z UNCLASS do NEG po makrodysekcji są biologicznie odpowiednie, ponieważ translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 są zgłaszane jako zjawisko wyłącznie GCB19. Chociaż translokacje są tradycyjnie i powszechnie wykrywane przez FISH w warunkach klinicznych, rośnie tempo poszukiwania alternatywnej, mniej skomplikowanej i czasochłonnej metody ich wykrywania. Test DLBCL90 jest ważnym narzędziem, które odpowiada na tę potrzebę, a uzasadnienie jego stosowania jest wzmocnione przez ustalenie, że test ten jest w stanie wykryć translokacje tajemnicze do sond FISH stosowanych w diagnostyce klinicznej29.
Opisany powyżej protokół makrodysekcji przedstawia prostą metodę, która umożliwia naukowcom zwiększenie zawartości guza w próbkach tkanek, które zwykle spadłyby poniżej powszechnie stosowanych progów kryteriów włączenia do badania. Włączenie makrodysekcji do przebiegu badania umożliwia naukowcom uratowanie tkanek o niskiej gęstości guza przed wykluczeniem z badania poprzez zwiększenie ich zawartości guza. To z kolei pozwala na zwiększenie pewności, że powstałe eluaty RNA i DNA reprezentują guz poddany badaniom genomicznym. Chociaż istnieją inne, bardziej precyzyjne metody preparacji tkanek, w przypadku guzów, które rosną w bardziej ekspansywny, nienaciekający, przypominający arkusz lub w sposób stały, makrodysekcja jest prawdopodobnie wystarczająca. Przedstawione tutaj wyniki podkreślają znaczenie czystości guza w testach genomicznych i makrodysekcji jako niezawodnego narzędzia do osiągnięcia tego celu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez NIH finansowany przez NIH AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) w ramach programu badań nad próbkami biologicznymi. Film został nakręcony, a montaż postprodukcyjny został wykonany przez Mayo Clinic Media Services.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 200-procentowy etanol | Decon | 2701 | |
| Zestaw AllPrep DNA/RNA FFPE | Qiagen | 80234 | Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE |
| Doniczki z kopliny | Różne | ||
| DLBCL90 | NanoString | różne | Cyfrowe profilowanie ekspresji genów na podstawie testu DLBCL90 |
| d-Limonen | VWR | 89376-092 | |
| Kleszcze | Różne | x | |
| Szkiełka mikroskopowe | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Glycerol | VWR | 0854-1L | |
| Zestawy główne | NanoString | różne | |
| Mikrotomy | Leica | RM2265 | |
| Mikrorurki | Ambion | AM12400 | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | do jakościowania DNA, RNA i białek |
| nCounter | NanoString | x | Cyfrowa platforma do profilowania ekspresji genów używana do przeprowadzenia testu DLBCL90 |
| Marker permanentny | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Dozownik żyletki | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
| Żyletki | Mikroskop Electrib Nauki | 71985-23 | |
| Bufor do trawienia tkanek | Qiagen | 80234 | |
| Woda ultraczysta | VWR | SH30538.02 | |
| Trójkąt do kąpieli wodnej | Nauki biomedyczne | TFB-120 | |
| Drewniany kij | FisherBrand | 22363158 |
Bibliografia
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).
- Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).
- Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), 0178706(2017).
- Oh, E., et al. Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples. PLoS One. 10 (12), 0144162(2015).
- Holley, T., et al. Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples. PLoS One. 7 (11), 50586(2012).
- Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers (2021).
- Javey, M., et al. Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment. Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).
- Kim, Y. W., et al. Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).
- Foti, C., et al. Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician. Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).
- Meuse, C. W., Barker, P. E. Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).
- Schmeller, J., et al. Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA. Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).
- Prema, V., et al. Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).
- Ennishi, D., et al. Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).
- Rosenwald, A., et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).
- Scott, D. W., et al. High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology. Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).
- Scott, D. W., et al. Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).
- Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).
- Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. Tissue microdissection. Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).
- Geiersbach, K., et al. Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors. Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).
- de Bruin, E. C., et al. Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles. BMC Genomics. 6, 142(2005).
- Ramsower, C. A., et al. Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma. Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).
- Maguire, A., et al. Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature. International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).
- Rosenwald, A., Staudt, L. M. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).
- Wright, G. W., et al. A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications. Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).
- Hilton, L. K., et al. The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH. Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).
Przedruki i uprawnienia
