Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Plaquing wirusów opryszczki pospolitej

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62962

⸱

5 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Towson University Herpes Virus Lab, Department of Biological Sciences, Towson University, 2Towson University Department of Chemistry, Towson University, 3Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Molecular Biology, Biochemistry, and Bioinformatics Program, Towson University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Plaquing to rutynowa metoda używana do ilościowego oznaczania żywych wirusów w populacji. Chociaż plaqueing jest często nauczany w różnych programach nauczania mikrobiologii z bakteriami i bakteriofagami, plaqueing wirusów ssaków jest bardziej złożony i czasochłonny. Protokół ten opisuje procedury, które działają niezawodnie w przypadku regularnej pracy z wirusami opryszczki pospolitej.

Streszczenie

Istnieje wiele opublikowanych protokołów do zwalczania wirusów, w tym odniesienia do metodologii w podstawowej literaturze. Jednak plakowanie wirusów może być trudne do wykonania, wymagając skupienia się na jego specyfikacjach i udoskonaleniu. Jest to niezwykle trudna metoda do opanowania dla nowych uczniów, głównie dlatego, że wymaga skrupulatnej dbałości o najdrobniejsze szczegóły. Ta demonstracja plakowania wirusów opryszczki pospolitej powinna pomóc tym, którzy przez lata zmagali się z wizualizacją metody, zwłaszcza jej niuansów. Chociaż manuskrypt ten opiera się na tych samych zasadach standardowej metodologii plaquingu, różni się tym, że zawiera szczegółowy opis (1) najlepszego obchodzenia się z komórkami gospodarza, aby uniknąć zakłóceń podczas procesu, (2) bardziej użytecznego lepkiego podłoża niż agaroza w celu ograniczenia dyfuzji wirionów oraz (3) prostej procedury utrwalania i barwienia, która daje wiarygodne, powtarzalne wyniki. Co więcej, dołączony film pomaga zademonstrować subtelne różnice w procesie, które często są pomijane podczas instruowania innych na temat przeprowadzania testów płytki nazębnej.

Wprowadzenie

Początki testów płytek wirusowych sięgają pierwszych odkryć wirusów w latach 90. XIX wieku1. Wirus mozaiki tytoniu został najpierw wyizolowany i przekazany na liściach tytoniu, gdzie poszczególne miejsca infekcji można było rozpoznać i określić ilościowo jako pochodzące z pojedynczej, żywej jednostki wirusa2, później zidentyfikowanej jako virion2. Późniejsze badania nad bakteriami i bakteriofagami udoskonaliły techniki stosowane do plazelizacji tych wirusów, w tym bakterie w środkowej fazie wzrostu, seryjne rozcieńczanie próbek bakteriofagów i górny agar z późniejszą wizualizacją dosłownych (zwanych blaszkami) w bakteryjnym trawniku3.

Plaquing wirusów zwierzęcych opóźniał ekscytujące badania prowadzone na bakteriofagach, głównie dlatego, że metody wymagane do hodowli komórek ssaków w hodowli nie zostały opracowane aż do lat 40. XX wieku4. Jednak pojawienie się rosnących komórek mysich pod nieobecność całego organizmu gospodarza4 zapoczątkowało nową erę w zdolności do hodowli i liczenia wirusów. Prace te zostały rozszerzone o namnażanie i oznaczanie ilościowe wirusa zachodniego zapalenia mózgu i rdzenia koni w komórkach kurczaka oraz wirusa polio w komórkach ludzkich5,6. Wraz z rozwojem sfery komórek ssaków nadających się do hodowli, mnogość różnych komórek gospodarza dla różnych infekcji wirusowych dała światu róg obfitości możliwości badania wszelkiego rodzaju wirusów7. Obejmowało to namnażanie i kwantyfikację ludzkich herpeswirusów, w szczególności wirusa opryszczki pospolitej-1 (HSV-1) i -2 (HSV-2), które powodują zmiany śluzówkowo-skórne8. Co ważne, wszystkie testy płytek miażdżycowych są zależne od istnienia żywych wirionów, które mogą wnikać do komórek gospodarza w sposób zapośredniczony przez receptor w próbce9. Niezależnie od wszechobecności i mnogości publikacji na temat wykonywania testów płytki nazębnej5,10,11,12,13,14,15,16, te metody dla HSV-1/-2 są mieszanką zarówno sztuki, jak i nauki; Nie można przeprowadzić testu bez należytej dbałości o każdy szczegół w protokole, ani nie można wykonać udanego testu bez krytycznego oka do subtelności w procesie. Manuskrypt ten przedstawia jedną z najbardziej konsekwentnie odtwarzalnych metod oznaczania płytek HSV-1/-2, z precyzyjnymi szczegółami dotyczącymi sztuki testu, które są rzadko omawiane.

Ten obecny protokół niezawodnie uzyskuje liczbę żywych jednostek tworzących płytki nazębne (PFU) dla HSV-1 i -2. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu komórek Vero (przekształconych komórek nabłonka nerki afrykańskiej zielonej małpy) przy niskim pasażu (poniżej pasażu numer 155) i rutynowo hodowanych w alpha-MEM17 uzupełnionych 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), L-alanylo-L-glutaminą i mieszaniną antybiotykowo-przeciwgrzybiczą18. Komórki Vero są standardowo rozmnażane w tym pożywce dwa do trzech razy w tygodniu w rozcieńczeniu 1/5 za każdym razem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z komórkami Vero i żywymi wirusami opryszczki zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Towson. Uogólniony schemat tych procedur jest przedstawiony w Rysunek 1.

1. Zasiewanie komórek Vero

  1. Dzień przed rozpoczęciem testu płytki miażdżycowej trypsynizuj komórki Vero i ponownie zawieś je w zwykłym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) i uzupełnij zgodnie ze standardową metodologią hodowli komórek19. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w 10 ml DMEM na kolbę T-75 zlewających się komórek Vero (~107 komórek).
    UWAGA: DMEM jest używany do testów płytek miażdżycowych zamiast alfa-MEM, ponieważ nieznacznie spowalnia tempo wzrostu komórek i sprzyja lepszym wynikom testów płytkowych.
  2. Policz komórki preferowaną metodą (np. standardowym hemocytometrem z wykluczeniem błękitu trypanowego)19.
  3. Wysiewaj komórki w 4 x 106 komórek/płytkę; w przypadku HSV-2 użyj 6-dołkowych płytek z 2,5 ml DMEM (z suplementami) na dołek; a w przypadku HSV-1 użyj 12-dołkowych płytek z 1,25 ml DMEM (z suplementami) na dołek.
    UWAGA: Liczba komórek powinna być stała niezależnie od użytej płytki, chociaż rozmiar studzienek ma znaczenie dla dokładności testu płytki. Istotne jest, aby komórki były równomiernie rozmieszczone, co można najskuteczniej osiągnąć, przesuwając płytkę do przodu i do tyłu, a nie w sposób okrężny.
  4. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    UWAGA: Wilgotność utrzymuje się za pomocą garnka z wodą destylowaną zawierającą algicyd na dnie inkubatora.

2. Rozcieńczenie próbki

  1. Zakończ rozcieńczanie próbki i dodawanie wirusa do komórek podczas jednej sesji laboratoryjnej.
    UWAGA: HSV-1 i -2 są zakaźne dla ludzi i muszą być traktowane w odpowiednim zabezpieczeniu biologicznym (BSL-2). Wszystkie materiały, które mają kontakt z wirusem, należy przechowywać oddzielnie i zdezynfekować czynnikiem czwartorzędowym o rozcieńczeniu 1/256 (patrz Tabela materiałów), jodoforem, wybielaczem lub silnym detergentem jonowym (np. SDS) przed wyjęciem ich z komory bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Dzień po wysiewie komórek Vero, seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę wirusa, która ma zostać umieszczona w 1x PBS; zazwyczaj stosuje się 10-krotne rozcieńczenia w celu najbardziej precyzyjnego śledzenia.
  3. Rozcieńczenia te należy przeprowadzić przez 10-4 (dla niskich stężeń wirusów) lub przez 10-9 (dla oczekiwanych próbek o wyższym mianie), pozostawiając co najmniej 1 ml każdej próbki do samego testu płytki.
  4. Przechowywać wszystkie rozcieńczenia wirusa na lodzie (nie dłużej niż 1 godzinę) do momentu, gdy będą gotowe do dodania tych rozcieńczonych próbek wirusa do komórek.

3. Dodanie wirusa do komórek

  1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z jednego lub dwóch dołków za pomocą pipety.
    UWAGA: Nie używaj aspiratora, ponieważ usuwa on zbyt dużo płynu z monowarstwy komórek i wysusza komórki. Jedną z kluczowych kwestii jest zapewnienie, że monowarstwa komórkowa pozostaje nawodniona przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli komórki wyschną, w ostatnim kroku zmyją płytkę i wygenerują bezużyteczne dane. Dlatego przetwarzaj tylko jedną lub dwie studzienki na raz, aby zmniejszyć tę możliwość.
  2. Ostrożnie dodać rozcieńczoną próbkę wirusa (100-400 μl i 50-200 μl próbki wirusa stosuje się odpowiednio do płytek 6-dołkowych i 12-dołkowych) kroplami do każdej monowarstwy, dodając krople po boku każdej studzienki. Powtarzaj proces dla każdego jednego lub dwóch dołków, aż cała płytka zostanie wypełniona próbkami wirusa, które są płytkowane.
    UWAGA: Dodanie kropli do środka studzienki może nieumyślnie złuszczyć komórki z podłoża.
  3. Delikatnie kołysz ręcznie całą płytkę, aby upewnić się, że PBS zawierający wirusa pokrywa całą monowarstwę komórek w każdym dołku, a następnie umieść płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
  4. Co 10 minut w ciągu 1 godziny wyjmować płytkę z inkubatora, delikatnie ją ponownie kołysać, aby wirus rozprzestrzeniał się bardziej równomiernie w każdym dołku, a następnie umieszczać ją z powrotem w inkubatorze.
    UWAGA: Każdy eksperyment będzie dyktował liczbę powtórzeń i jakie rozcieńczenia są używane; Preferencje czytelnika dyktują tę decyzję.
  5. Aby zmniejszyć możliwość przypadkowego zliczenia niewchłoniętego inokulum, należy usunąć próbkę wirusa ze studzienek za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1000 μl i umieścić ją w zlewce na odpady.
    UWAGA: Ponownie, ta procedura jest przeprowadzana tylko z jednym lub dwoma dołkami na raz, aby utrzymać nawodnienie monowarstwy komórkowej.
  6. Umieścić 2,5 ml nakładki metylocelulozowej (rozpuścić 5% metylocelulozy w/w w 100 ml PBS, autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 15 psi w cyklu cieczowym, następnie dodać 375 ml DMEM plus 25 ml FBS).
  7. Gdy cała płytka zawiera nakładkę, umieść ją z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić wzrost przez dwa dni.
    UWAGA: Jeśli wirus i komórki mogą rosnąć przez trzy dni, nawet w DMEM plus suplementy, może dojść do znacznej utraty komórek w monowarstwie, co zagrozi ostatecznym danym.
  8. Zdezynfekuj zlewkę na odpady, zwykle z dodatkiem wybielacza, jodoforu lub podobnego środka wirusobójczego, przed wyjęciem jej z szafki bezpieczeństwa biologicznego.

4. Barwienie blaszek miażdżycowych

  1. Po dwudniowej inkubacji usunąć nakładkę metylocelulozy za pomocą pipety, ponownie po jednym lub dwóch dołkach na raz i umieścić ją w zlewce na odpady.
  2. Dodaj ~ 2 ml 1% fioletu krystalicznego (patrz Tabela materiałów) w 50% etanolu do każdego dołka, aby zabarwić płytki.
    UWAGA: Nie jest konieczne usuwanie każdej ostatniej kropli nakładki.
  3. Inkubować płytkę ze wszystkimi studzienkami wypełnionymi plamą przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W tym momencie należy zdezynfekować zlewkę na odpady, jak opisano powyżej w kroku 3.8.
  4. Energicznie umyj talerze wodą z kranu, aż spływ będzie czysty.
    UWAGA: Delikatny strumień wody nie jest wystarczająco energiczny; Wymagane jest pełne ciśnienie z uchwytu zlewozmywaka laboratoryjnego.
  5. W tym momencie należy upewnić się, że istnieją około 10-krotne różnice w liczbie blaszek w każdej serii rozcieńczeń.
  6. Pozostaw płytki do wyschnięcia przez noc do góry nogami, po czym można policzyć poszczególne płytki.

5. Liczenie blaszek i określanie miana wirusa

  1. Niezależnie od podejścia (patrz UWAGA poniżej), pomnóż liczbę blaszek przez współczynnik rozcieńczenia (np. jeśli płytki zostałyby policzone w studzience 10-4, liczba blaszek zostałaby pomnożona przez 104).
    UWAGA: Chociaż liczenie w zakresie 10-100 płytek jest przydatne5, liczenie studzienek z 30-300 tabliczkami jest nieco bardziej wiarygodne i uwzględnia rozcieńczenia około 1/2 log zamiast rozcieńczeń pełnych log.
  2. Podziel tę liczbę przez objętość inokulum (jak powyżej w kroku 3.2) i uśrednij wszystkie studzienki, które mają blaszki w podanym zakresie, aby uzyskać najdokładniejsze miano HSV w oryginalnej próbce.
  3. Należy wykonać obliczenia w krokach od 5.3.1 do 5.3.5, biorąc pod uwagę wykorzystanie danych próbnych z tabeli 1.
    1. Rozważ tylko studnie z 30-300 płytkami (krok 5.1). W związku z tym w tabeli 1 należy używać tylko kolumny 10–5 dla powtórzeń 1, 2 i 3.
    2. Weź liczbę blaszek w danym rozcieńczeniu i pomnóż przez odwrotność współczynnika rozcieńczenia. W związku z tym kolumna 10-5 próbki 1 przechodzi od 81 blaszek w rozcieńczeniu 10-5 do 81 blaszek razy 105.
    3. Następnie podziel tę liczbę przez objętość (w ml) rozcieńczenia wirusa dodanego do komórek w tej studzience. Zakładając, że dane dotyczące HSV-1 w Tabeli 1 pochodzą z płytki 12-dołkowej, 0,2 ml byłoby najbardziej odpowiednim pomiarem. Stąd obliczenie z kroku 5.3.2 staje się 81 x 105 podzielone przez 0,2 ml lub 4,0 x 107 PFU/ml HSV-1.
    4. Powtórz ten proces dla wszystkich przydatnych danych i średniej. W związku z tym należy przeprowadzić obliczenia w ppkt 5.3.2-5.3.3 na wszystkich próbkach w kolumnie 10-5, zakładając, że pochodzą one z tej samej próbki wirusa, a kontrpróby biologiczne przeprowadzono w celu uzyskania najdokładniejszego pomiaru miana. W przypadku podanym w tabeli 1 należy uzyskać średnią 4,0 x 107, 2,1 x 107 i 2,6 x 107 PFU/ml, aby uzyskać końcowe średnie miano 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml dla tej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tabela 1 przedstawia eksperyment, który przyniósł optymalne wyniki. Wszystkie rozcieńczenia 10-krotne wykazują w przybliżeniu 10-krotny spadek liczby placków. Tego rodzaju dane można zaobserwować również na Rysunku 2, który przedstawia rzeczywisty test plackowy, w którym policzalna liczba placków w trzech powtórzeniach mieściła się w zakresie 10-4. To samo można zauważyć na Rysunku 3, w górnym rzędzie, gdzie policzalna liczba placków ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż testy płytek miażdżycowych są prawie tak stare, jak sama hodowla komórek ssaków, wydaje się, że każde laboratorium ma swój własny zestaw protokołów do wykonania tego podstawowego testu 5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy niezliczonym studentom w naszych laboratoriach (PJD i BJM), którzy pracowali z nami przez lata, doskonaląc te metody. Specjalne podziękowania dla Stana Persona, pod którego okiem ta metodologia została po raz pierwszy opracowana. Praca ta była częściowo wspierana przez fundusz wsparcia badań licencjackich Towson University Fisher College of Science and Math oraz grant NIGMS Bridges to the Baccalaureate 5R25GM058264. Wyłączną odpowiedzialność za te treści ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 12-dołkoweCorning3512
Płytki 6-dołkoweCorning3516
Alpha-MEMLonza12169F
Antybiotyk/przeciwgrzybiczeGibco15240096
Fiolet krystalicznyAlfa AesarB2193214
DMEMGibco11965092
Dulbecco's PBS (bez Mg++ lub Ca++)Gibco14190144
Płodowa surowica cielęcaMillipore-SigmaTMS-013-B
L-alanyl-L-glutamina (Glutamax)Gibco
Thermo Fisher02-671-54
MetylocelulozaMillipore-Sigma27-441-0
Czynnik czwartorzędowy (Lizol I.C.)Thermo FisherNC9645698
Trypan BlueCorning25900CI
TrypsynaCytivaSH30042.01
Komórki VeroATCCCCL-81
Hemacytometr GS07F161BA

Bibliografia

  1. Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
  2. Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
  3. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  4. Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
  5. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  6. Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
  7. Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
  8. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
  9. Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).
  10. Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
  11. Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
  12. Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
  13. Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
  14. Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
  15. Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
  16. Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
  17. Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
  18. Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).
  19. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
  21. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).
  22. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63(2006).
  23. Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201(2016).
  24. Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
  25. Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
  26. Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
  27. Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
  28. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  29. Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
  30. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
  31. Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
  32. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
  33. Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
  34. Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
  35. Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
  36. Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda p ytkowawirus opryszczki zwyk ejtworzenie plam wirusowychoznaczanie miana wirusanak adka z metylocelulozybarwienie fioletem krystalicznymrozcie czanie seryjnekom rki Veroskuteczno przeciwwirusowamonowarstwa kom rkowa
Plaquing wirusów opryszczki pospolitej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.