Artykuł metodologiczny

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62972

⸱

3 września 2021

 ,  ,  , 
1The Jackson Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Streszczenie

Płodność kobiet i długość życia reprodukcyjnego zależą od jakości i ilości rezerwy oocytów jajnika. Szacuje się, że 80% żeńskich komórek rozrodczych wchodzących do mejotycznej profazy I jest eliminowanych podczas utraty komórek jajowych płodu (FOA) i w pierwszym tygodniu życia pourodzeniowego. Trzy główne mechanizmy regulują liczbę oocytów, które przeżywają podczas rozwoju i tworzą rezerwę jajnikową u samic wchodzących w okres dojrzewania. W pierwszej fali utraty oocytów 30-50% oocytów jest eliminowanych podczas wczesnego FOA, zjawiska, które przypisuje się wysokiej ekspresji długiego przeplatanego pierwiastka jądrowego-1 (LINE-1). Druga fala utraty oocytów polega na eliminacji oocytów z defektami mejozy za pomocą mejotycznego punktu kontroli jakości. Trzecia fala utraty komórek jajowych występuje okołoporodowo podczas tworzenia pęcherzyków pierwotnych, gdy niektóre oocyty nie są w stanie utworzyć pęcherzyków. Nie jest jasne, co reguluje każdą z tych trzech fal utraty oocytów i jak kształtują one rezerwę jajnikową u myszy lub ludzi.

Immunofluorescencja i wizualizacja 3D otworzyły nową drogę do obrazowania i analizowania rozwoju oocytów w kontekście całego jajnika, a nie w mniej pouczających sekcjach 2D. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół barwienia immunologicznego całego jajnika i oczyszczania optycznego, dający przygotowania do obrazowania przy użyciu mikroskopii wielofotonowej i modelowania 3D przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania. Pokazano, w jaki sposób można wykorzystać tę metodę do pokazania dynamiki zaniku oocytów podczas rozwoju jajników u myszy C57BL/6J i ilościowego określenia utraty oocytów podczas trzech fal eliminacji oocytów. Protokół ten można zastosować do jajników prenatalnych i wczesnopoporodowych w celu wizualizacji i kwantyfikacji oocytów, a także innych podejść ilościowych. Co ważne, protokół został strategicznie opracowany, aby umożliwić wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które może zaspokoić potrzeby w zakresie toksykologii, diagnostyki klinicznej i testów genomowych funkcji jajników.

Wprowadzenie

Większość samic ssaków rodzi się ze skończoną liczbą meiotycznie zatrzymanych oocytów przechowywanych w pierwotnych pęcherzykach, tworzących rezerwę jajnikową (OR)1,2. OR określa ogólną długość życia reprodukcyjnego i zdrowie samic3. Sala operacyjna zwykle zmniejsza swój rozmiar wraz z wiekiem i może zostać przedwcześnie uszczuplona pod wpływem niektórych czynników genotoksycznych (radioterapia/chemioterapia) i stresu środowiskowego (niedożywienie), co prowadzi do niepłodności4,5,6. Idiopatyczna niepłodność żeńska może być często przypisywana genetycznej i fizjologicznej jakości komórek jajowych rozwijających się z sali operacyjnej i pozostaje słabo poznana7,8. Ponieważ wyposażenie żeńskich pęcherzyków jest w dużej mierze z góry zdeterminowane przez urodzenie, konieczne jest zrozumienie mechanizmów regulacyjnych związanych z powstawaniem i utrzymywaniem sali operacyjnej.

U myszy tworzenie OR rozpoczyna się wraz z określeniem pierwotnych komórek rozrodczych (PGC) około dnia embrionalnego (E) 7.52. PGC migrują do grzbietów narządów płciowych, gdzie będą przebywać w przybliżeniu E10.59. Poniższa ekstensywna proliferacja występuje z niepełną cytokinezą, co skutkuje powstawaniem torbieli, które zostaną rozłożone w późniejszym etapie rozwoju10,11. Przy około E12,5 określa się płeć goad, a proliferacja PGC zatrzymuje się w jajnikach. U samic PGC, obecnie oocyty, wchodzą w profazę mejotyczną I (MPI) w przybliżeniu E13.512,13. Oocyty przechodzą przez rozszerzony MPI i zatrzymują się na etapie dyktowania w czasie porodu. W pierwszym tygodniu po urodzeniu każdy zatrzymany oocyt jest otoczony komórkami ziarnistymi, tworząc w ten sposób pierwotny pęcherzyk.

Liczba pierwotnych pęcherzyków na sali operacyjnej kobiety zależy od tego, ile oocytów przeżyło fale eliminacji oocytów, które występują przed i podczas zatrzymania MPI przez apoptozę, autofagię lub martwicę14,15. Pierwsza fala występuje podczas rozwoju płodu i jest znana jako FOA. FOA to ewolucyjnie konserwatywny proces u samic (ssaków i innych ssaków), w którym szacuje się, że 50-80% oocytów jest eliminowanych w zależności od gatunku żeńskiego16,17,18,19. U myszy FOA występuje w okresie od E15.5 do E18.5 i przypisuje się go reaktywacji i ekspresji sekwencji retrotranspozonu LINE-1 powodujących śmierć oocytów20,21. Druga fala eliminacji oocytów odbywa się poprzez mejotyczny punkt kontrolny, który eliminuje oocyty z defektami mejotycznymi, takimi jak nienaprawione pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB)22,23. Kolejna fala eliminacji oocytów następuje podczas rozpadu torbieli, a jej kulminacją jest tworzenie pierwotnych pęcherzyków, z których każdy zawiera pojedynczy oocyt10,11,24,25.

U myszy, pierwotna rezerwa pęcherzyków jest w dużej mierze tworzona przez okres dojrzewania, po czym zmniejsza się, ponieważ pierwotne pęcherzyki są aktywowane do wzrostu podczas regularnych cykli rozrodczych. Rozmiar sali operacyjnej różni się u poszczególnych kobiet i między różnymi szczepami genetycznymi myszy; jednak genetyczna regulacja rozmiaru OR nie jest dobrze poznana26,27,28,29. Badania genetyczne nad regulacją OR są utrudnione przez brak ustandaryzowanych protokołów do badania fal eliminacji oocytów podczas rozwoju prenatalnego i postnatalnego. U myszy opracowano kilka metodologii kwantyfikacji oocytów, z których najczęstszą i najczęściej stosowaną jest histomorfometryczna ocena przekrojów histologicznych30,31. W tej technice oocyty są identyfikowane na seryjnych odcinkach z barwnikami histologicznymi, takimi jak hematoksylina i eozyna (H&E) oraz kwas okresowy Schiffa (PAS) lub markery fluorescencyjne. Technika ta jest niezawodna, jeśli wszystkie warunki pozostają stałe, w tym grubość przekroju, skuteczne odzyskiwanie wszystkich skrawków w jajniku oraz schematy liczenia poszczególnych laboratoriów. Jednak liczby podawane przez różne laboratoria często znacznie się różnią, a zatem nie są łatwe do porównania.

Ponadto, biorąc pod uwagę różnice genetyczne, użycie różnych szczepów myszy może również wpływać na liczbę oocytów. Dodatkowe podejścia obliczeniowe zostały opracowane do oceny histomorfometrycznej i obejmują automatyczne wykrywanie oocytów przy użyciu metody frakcjonowania, automatyczne liczenie przy użyciu algorytmów obliczeniowych oraz rekonstrukcję 3D obrazów histologicznych w celu zapobieżenia wielokrotnemu liczeniu tego samego oocytu31,32,33,34,35,36. Nawet po tych ulepszeniach dodanych do oceny histomorfometrycznej, technika ta jest stosunkowo pracochłonna, szczególnie w przypadku badań na dużą skalę i o wysokiej przepustowości. Zebrane dane mogą nie być odtwarzalne i porównywalne między badaniami ze względu na różnice w schematach liczenia, algorytmach komputerowych i używanym oprogramowaniu.

Ostatnio, przyspieszone przez rozwój nowych metod mikroskopii wielofotonowej i świetlnej o średniej rozdzielczości oraz optycznego oczyszczania tkanek, techniki modelowania i analizy 3D dla nienaruszonych jajników stają się metodą z wyboru do efektywnego określania liczby oocytów oraz badania lokalizacji i dynamiki białek37,38. Te metody 3D są zazwyczaj korzystne w porównaniu z metodami histologicznymi, ponieważ tkanki i narządy są lepiej zachowane i zachowane w stanie nienaruszonym. Co więcej, analiza i modelowanie 3D zapewniają dodatkowy wgląd w funkcje i interakcje w obrębie i między niszami komórkowymi lub podstrukturami w narządzie, które mogą zostać pominięte w analizie 2D.

Analiza 3D całych narządów wymaga optymalizacji protokołów fiksacji, barwienia immunologicznego i optycznego oczyszczania dla poszczególnych narządów, takich jak jajniki, bez zniekształceń i uszkodzeń tkanek. Dodatkowa optymalizacja mocowania próbki do obrazowania jest wymagana w przypadku mikroskopii o wysokiej rozdzielczości i może zależeć od dostępnej platformy obrazowania. Wreszcie, obrazowanie całego nienaruszonego jajnika generuje dużą ilość danych do późniejszych analiz obliczeniowych. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania ustandaryzowanych metod 3D liczenia oocytów do badań porównawczych i na różnych etapach rozwoju.

Ten protokół wykorzystuje standardowe metody barwienia immunologicznego i wcześniej zgłoszone protokoły oczyszczania, koncentrując się na prostym, przyjaznym dla użytkownika i wysokowydajnym podejściu38,39,40,41. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem analizy dużej liczby jajników prenatalnych i pourodzeniowych do 28 dnia po urodzeniu (P28) oraz różnych rozmiarów jajników z różnych środowisk genetycznych myszy. Etapy barwienia immunologicznego są podobne dla wszystkich etapów; jednak protokoły oczyszczania różnią się dla jajników w okresie dojrzewania ze względu na ich większy rozmiar, ScaleS4(0) i CUBIC odpowiednio dla małych i dużych jajników40,41. Ponadto perfuzja całego ciała jest wykonywana u myszy P28 przed utrwaleniem, aby zapobiec autofluorescencji z komórek krwi. Mikroskop wielofotonowy został zbudowany na platformie Leica DIVE/4Tune jako alternatywa dla mikroskopii arkuszowej światła do pozyskiwania obrazów, a do tego protokołu wybrano oprogramowanie IMARIS 3D Visualization and Analysis z różnymi narzędziami analitycznymi. Ten protokół jest prosty do naśladowania i mniej praktyczny, co pozwala zaoszczędzić czas. Co więcej, kwantyfikacja oocytów jest stosunkowo szybka, w zależności od wielkości jajnika i ułożenia oocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie użyte myszy były szczepu genetycznego C57BL/6J (zobacz Tabelę Materiałów). Szczep ten został w pełni zsekwencjonowany i jest standardem w wielu badaniach nad strukturą i funkcją jajników. Myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi NIH, a wykonywane procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w The Jackson Laboratory. Odczynniki i kompozycje stosowane w tym protokole są wymienione odpowiednio w Tabeli materiałów i Tabeli 1.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Utrwalacz: Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Na przykład dla 24 próbek (0,5 ml / próbka = 12 ml całkowitej objętości) dodaj 3 ml 16% PFA do mikroskopii elektronowej PFA do 9 ml 1x PBS.
  2. Bufor przepuszczalności
    1. Odmierz alkohol poliwinylowy (PVA) do plastikowej zlewki o pojemności 250 ml zawierającej 1x PBS na dzień przed potrzebą buforu permeabilizacyjnego. Mieszaj roztwór przez noc, aby PVA całkowicie się rozpuścił.
    2. Dodać borowodorek sodu do rozpuszczonego PVA i pozostawić mieszaninę do homogenizacji przez około 3-5 minut. Spodziewaj się, że roztwór się spieni.
    3. Dodaj Triton X-100 do roztworu i użyj buforu po rozpuszczeniu Triton X-100.
      UWAGA: PVA rozpuszcza się długo (co najmniej 3 godziny), a przenikanie przeciwciała zależy od tego, jak dobrze się rozpuszcza. W przypadku większych jajników ważne jest, aby całkowicie rozpuścić PVA.
  3. Bufor blokujący
    1. Odmierz albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do zlewki z 1x PBS. Mieszać roztwór, aż BSA się rozpuści.
    2. Dodaj glicynę, Triton X-100, penicylinę-streptomycynę i azydek sodu. Mieszaj, aż roztwór się zhomogenizuje. Przenieść bufor do butelki i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem dodać normalną surowicę kozią.
  4. Bufor do mycia: Odmierzyć PVA do zlewki zawierającej 1x PBS. Mieszaj roztwór przez noc, aby PVA się rozpuścił. Dodaj Triton X-100 i azydek sodu. Po wymieszaniu buforu przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  5. ScaleS4(0) roztwór (pH 8,1): Rozpuścić D-sorbitol w PBS w zlewce, mieszając w temperaturze ≤100 °C. Dodać mocznik do roztworu, a gdy mocznik się rozpuści, wyłączyć ogień i pozostawić roztwór do mieszania aż do całkowitego rozpuszczenia. Dodać glicerol i dimetylosulfotlenek i mieszać, aż roztwór się ujednolici. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Roztwór ScaleS4(0) musi być świeży w pierwszym dniu oczyszczania jajników.
  6. Rozwiązanie ScaleCUBIC-1
    1. Rozpuścić mocznik w zlewce zawierającej PBS, mieszając w temperaturze ≤100 °C. Odmierzyć N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminę do oddzielnej zlewki, następnie dodać rozpuszczony mocznik i mieszać w temperaturze ≤100 °C, aż odczynniki całkowicie się rozpuszczą. Gdy wszystkie odczynniki znajdą się w roztworze, wyłącz ogrzewanie i ostudź w temperaturze pokojowej. Przechowywać w ciemności.
    2. Odgazowuje roztwór, przenosząc go do kolby filtrującej. Podłączyć kolbę do odkurzacza z rurką, przykryć kolbę i włączyć próżnię, aż pęcherzyki w roztworze znikną. Użyj roztworu po tym odgazowaniu.
      UWAGA: Roztwór można przechowywać w ciemności do użycia przez okres do miesiąca.
  7. Roztwór sacharozy: Rozpuść sacharozę w 1x PBS, a następnie odgazuj roztwór przed użyciem.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować na świeżo przed użyciem.
  8. Rozwiązanie ScaleCUBIC-2
    1. Rozpuścić sacharozę w zlewce zawierającej PBS, mieszając w temperaturze ≤100 °C. Dodać mocznik i mieszać w temperaturze ≤100 °C, aż mocznik się rozpuści. Wyłącz ogrzewanie.
    2. Dodaj trietanoloaminę i Triton X-100. Mieszaj, aż roztwór się zhomogenizuje. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i przechowuj w ciemności. Odgazuj roztwór przed użyciem.
      UWAGA: Roztwór można przechowywać w ciemności do użycia przez okres do miesiąca.

2. Rozwarstwienie i unieruchomienie jajników prenatalnych (Rysunek 1A)

  1. Kryj dorosłe samice (≥8 tygodni) i samce zgodnie z zatwierdzonym protokołem instytucjonalnym. Codziennie rano sprawdzaj, czy nie ma zatyczek dopochwowych.
    UWAGA: Poranek w dniu założenia czopa dopochwowego jest oznaczony jako 0,5 dnia po stosunku (d.p.c) lub E0,5.
  2. W dniu sekcji należy przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) i podwielokrotność ~0,5 ml do probówek mikrowirówek, umieszczonych po stronie stołu (~4 na ciężarną samicę).
    UWAGA: PFA jest substancją niebezpieczną i należy się z nią obchodzić pod maską chemiczną.
  3. Przygotuj trzy płytki o średnicy 100 mm zawierające ~10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dla każdej ciężarnej samicy (do pobrania macicy, do wypreparowania kompleksu mesonenerco-jajnika i izolacji jajników).
  4. Poddaj eutanazji ciężarne samice, które noszą zarodki w preferowanym stadium rozwoju i przystąp do sekcji. Eutanazja nie więcej niż 1-2 samice na raz. Należy stosować zatwierdzony protokół eutanazji ciężarnych myszy (np. narażenie na CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
  5. Gdy samica zostanie poddana eutanazji, spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą kleszczy unieś skórę brzucha i nożyczkami wykonaj nacięcie w kształcie litery V przez brzuch i ścianę ciała. Przeciąć wzdłuż dwóch stron nacięcia i oderwać skórę z powrotem, aby odsłonić narządy wewnętrzne i płody w macicy.
  6. Za pomocą kleszczy i nożyczek przetnij i oddziel macicę z płodami od brzusznej tkanki tłuszczowej oraz tętnic i żył jajnikowych. Usuń macicę i umieść ją w 100-milimetrowej płytce zawierającej 1x PBS. Uwolnij płód do PBS, przecinając ścianę macicy i nakłuwając woreczek żółtkowy. Przeciąć pępowinę.
    UWAGA: W przypadku płodów w wieku poniżej 15 dni eutanazja matki i usunięcie z macicy zapewnia szybką śmierć płodu. Płody starsze niż 15 dni w okresie ciąży do urodzenia muszą zostać poddane eutanazji przez dekapitację.
  7. Przenieś płód na nowy talerz ze świeżym 1x PBS. Aby odciąć głowę płodowi E15,5, delikatnie rozsuń dwie tylne kończyny na płytce za pomocą kleszczy, aby unieruchomić płód. Używając drugiej pary kleszczy trzymanych w dominującej ręce, przytrzymaj szyję między zębami kleszczy i ściśnij, aby odciąć głowę płodu, lub użyj nożyczek, aby przeciąć szyję.
  8. Dominującymi kleszczami ręcznymi przetnij poniżej kończyn przednich i delikatnie odciągnij górną część ciała. Następnie włóż jeden punkt końcowy dominujących kleszczy ręcznych do jamy otrzewnej pionowo do otworu okolicy brzucha, podczas gdy drugi punkt końcowy kleszczy pozostaje na zewnątrz. Zamknij kleszcze, ściśnij ścianę ciała, aby ją przeciąć i odsłoń narządy wewnętrzne.
  9. Tymi samymi kleszczami delikatnie usuń narządy, w tym jelita i wątrobę, aż nerki i narządy rozrodcze staną się widoczne. Określ płeć płodu: w E15.5 jajniki mają wydłużony kształt przypominający kiełbasę, podczas gdy jądra są owalne.
    UWAGA: Na wcześniejszych etapach może być konieczne genotypowanie w celu określenia płci.
  10. Używając jednej pary kleszczy, przytrzymaj płód płci żeńskiej, a drugimi kleszczami chwyć każdy kompleks mezononeryczno-jajnikowy i delikatnie oddziel go od nerek i przewodów Müllera. Umieść jajniki na nowej płytce z 1x PBS, pozostaw śródnerce przyczepione, ale usuń otaczające tkanki, aby upewnić się, że jajniki są odsłonięte. Umieścić oba jajniki w ~0,5 ml 4% PFA w probówkach do mikrowirówek i utrwalić w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia zastąp PFA 70% etanolem.
  11. W celu wypreparowania i utrwalenia jajników E18.5 należy oddzielić płody od macicy, jak opisano powyżej, a następnie postępować zgodnie z protokołem dla szczeniąt przed okresem dojrzewania opisanym w sekcji 3 (Ryc. 1B).

3. Rozwarstwienie i unieruchomienie jajników przed okresem dojrzewania (Rysunek 1B)

  1. Przygotuj 4% PFA i podwielokrotność ~0,5 ml do probówek o pojemności 1,5 ml i umieść je po stronie ławki (~ jedna probówka na szczenię). Przygotuj płytki 35 mm z 1x PBS (~ jeden na szczeniak). Poddaj szczenięta eutanazji przy użyciu zatwierdzonego protokołu instytucjonalnego.
    UWAGA: Dekapitacja jest preferowaną metodą eutanazji u myszy w wieku 8 dni lub młodszych. Nowonarodzone myszy można ścinać za pomocą nożyczek preparacyjnych 3-4" lub nożyczek Mayo 5-7".
  2. Określ płeć szczeniąt, mierząc odległość odbytu i narządów płciowych, która jest większa u samców niż u samic. Użyj ostrych nożyczek do dekapitacji, aby odciąć głowę szczeniętom. Ułóż ciało otwartą stroną do dołu na ręczniku papierowym, aby odsączyć krew (~5-10 s).
  3. Zabezpiecz szczeniaka na plecach, umieszczając szpilkę w opuszku łapy każdej stopy. Spryskaj brzuch 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby utrzymać skórę szczeniaka z dala od ciała i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w kształcie litery V w skórze dolnej części brzucha.
  4. Włóż nożyczki do nacięcia pod skórą i przetnij po obu stronach brzucha. Użyj kleszczy, aby delikatnie odkleić skórę i odsłonić dolną część brzucha. Delikatnie przesuń jelito do góry i zlokalizuj rogi macicy obok pęcherza. Podążaj za każdym rogiem macicy w kierunku nerki i zlokalizuj jajnik z otaczającą tkanką tłuszczową poniżej każdej nerki.
  5. Aby wypreparować jajniki, przytrzymaj róg macicy poniżej jajnika i jajowodu za pomocą jednej pary kleszczy (kleszcze A, Ryc. 1B) i delikatnie unieś go z ciała. Używając innej pary kleszczyków (kleszczy B), delikatnie chwyć pod pierwszą parą kleszczy tak, aby jajnik i jajowód w poduszce tłuszczowej były widoczne nad drugą parą kleszczy. Następnie przetnij nożyczkami poniżej drugiej pary kleszczy lub ostrożnie pociągnij, aby odłączyć jajniki i przyczepione tkanki.
  6. Umieść izolowane narządy na płytce z 1x PBS. Odetnij dodatkową tkankę tłuszczową, jajowód i róg macicy, aby oczyścić i odizolować jajnik. Delikatnie otwórz kaletkę otaczającą jajnik i odsłoń cały jajnik.
  7. Przytnij błonę kaletki bez uszkadzania jajnika i pozostaw tkankę wokół wnęki (struktura podobna do więzadła między jajnikiem a układem rozrodczym), aby poradzić sobie z jajnikiem, jak pokazano na Rysunek 1B, P5. Po przycięciu jajników umieść je w 4% PFA i utrwal jajniki w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia zastąp 4% PFA 70% etanolem i przechowuj jajniki w temperaturze 4 °C do momentu zakończenia protokołu barwienia immunologicznego.

4. Perfuzja, rozwarstwienie i unieruchomienie jajników w okresie dojrzewania (Rysunek 1C)

  1. Perfuzję myszy zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami z myszą w głębokim znieczuleniu w chemicznym okapie. Przygotować sprzęt do perfuzji i odczynniki. Zobacz szczegółowy protokół na stronie 42.
    UWAGA: Perfuzja to nieuleczalna procedura eutanazji, która polega na zastąpieniu krwi w całym układzie naczyniowym stabilizatorem tkankowym.
  2. Zważyć samicę myszy w okresie dojrzewania (P28) i zapisać wagę myszy (zwykle od 13 g do 15 g). Obliczyć ilość zatwierdzonego środka znieczulającego, który należy zastosować.
    UWAGA: W tym protokole użyto 0,35 ml tribromoetanolu na 10 g masy ciała.
  3. Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 20 G należy napełnić strzykawkę zatwierdzonym środkiem znieczulającym. Zastąp igłę 20 G igłą 26 G x 3/8.
  4. Ostrożnie przytrzymuj mysz, jedną ręką muskając skórę grzbietu szyi. Odwróć mysz, aby odsłonić brzuch. Wstrzyknąć wcześniej obliczoną ilość środka znieczulającego do jamy otrzewnej. Umieść mysz w pojemniku z pokrywą, aż znieczulenie zacznie działać (tj. mysz przestanie się poruszać).
  5. Gdy mysz przestanie się poruszać, delikatnie uszczypnij jej stopy, aby sprawdzić, czy nie ma odpowiedzi i upewnij się, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem perfuzji. Umieść i zabezpiecz mysz na plecach, delikatnie przypinając wszystkie cztery nogi przez opuszki łap do deski. Upewnij się, że nogi są przypięte w zrelaksowanej pozycji, nie są nadmiernie rozciągnięte.
  6. Spryskaj mysz 70% etanolem od brzucha do klatki piersiowej. Użyj kleszczy, aby delikatnie uszczypnąć i podnieść skórę brzucha, a następnie użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w kształcie litery V przez skórę i ścianę ciała.
  7. Zdejmij płatek skóry z jamy ciała i włóż nożyczki poniżej skóry i ściany ciała. Przetnij skórę i ścianę ciała prosto w kierunku głowy do krawędzi klatki piersiowej przy mostku.
  8. Otwórz klatkę piersiową, ostrożnie przecinając żebra po obu stronach mostka tuż poniżej łopatki. Uważaj, aby nie przebić płuc poniżej klatki piersiowej. Chwyć płaty skóry/żeber kleszczami i przypnij je, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
  9. Delikatnie przytnij wszelkie tkanki, takie jak grasica, które mogą utrudniać wyraźny dostęp do serca. Odsłonięte wszystkie narządy, w tym przewód pokarmowy, aby umożliwić wizualne potwierdzenie, że całe ciało jest ukrwione, w tym dolna część brzucha.
  10. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć prawy przedsionek serca i uwolnić krew z systemu. Delikatnie przytrzymaj serce kleszczami i włóż igłę perfuzyjną (podłączoną do sterownika pompy perystaltycznej) do lewej komory.
  11. Pompuj ~10 ml PBS, z delikatnym, ale stałym naciskiem, aż tkanki takie jak wątroba, nerki i drogi rozrodcze (Rysunek 1E,F) zmienią kolor z różowego na biały. Następnie zastąp PBS świeżo przygotowanym 1% PFA i kontynuuj perfuzję około 10 ml PFA lub do momentu, gdy wystąpi drganie w dolnej części ciała myszy (np. ogonie).
    UWAGA: Te drżenia fiksacyjne wskazują na udaną perfuzję.
  12. Po zakończeniu perfuzji zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową z jajnikami poniżej nerki i delikatnie rozwarstwij cały układ rozrodczy, w tym poduszeczkę tłuszczową, jajniki i rogi macicy, a następnie umieść przewód w fiolce z 4% PFA. Napraw jajniki w temperaturze pokojowej przez noc (~16-24 h). Następnie zastąp 4% PFA 70% etanolem na co najmniej jeden dzień i przytnij jajniki (Rysunek 1E,F), jak opisano powyżej, przed rozpoczęciem protokołu barwienia immunologicznego.

5. Barwienie immunologiczne całego jajnika (Rysunek 2A)

UWAGA: Stosuj sterylne techniki podczas protokołu barwienia immunologicznego, zwłaszcza podczas zmiany, aby zapobiec skażeniu podczas długich okresów inkubacji.

  1. Wykonaj wszystkie etapy barwienia immunologicznego na płytce 24-dołkowej, jak pokazano na Rysunek 2A. Dostosuj objętości odczynników do innych formatów. Ostrożnie zmieniaj, aby uniknąć utraty małych jajników prenatalnych i przedpokwitaniowych.
    UWAGA: Można stosować inne formaty, takie jak płytki 48- i 96-dołkowe, ale głębsze dołki i węższe otwory utrudniają zasysanie bez utraty lub uszkodzenia jajników.
  2. Dzień 1
    1. Odpipetować 1 ml PBS/studzienkę do liczby potrzebnych dołków na czystej 24-dołkowej płytce. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby zrobić szeroki otwór i użyj jej do delikatnego przeniesienia jajników przed okresem dojrzewania z probówek o pojemności 1,5 ml z 70% etanolem do studzienek. W przypadku jajników w okresie dojrzewania należy użyć końcówki do pipety o pojemności 1000 μl z odciętą końcówką do transferu.
      UWAGA: Szerszy otwór końcówki zapobiega uszkodzeniom tkanek podczas przenoszenia.
    2. Gdy wszystkie próbki zostaną przeniesione do studzienek, użyj nowej końcówki do zasysania PBS i zastąp ją świeżym 0,8 ml PBS / studzienkę. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością ~100-150 obr./min przez noc. Rozpocząć przygotowanie buforu do permeabilizacji (patrz Tabela 1 i sekcja 1).
      UWAGA: Nowa końcówka zapobiega przywieraniu jajników do końcówki, a etap inkubacji PBS pozwala jajnikom zrównoważyć się w PBS i nawodnić się przed barwieniem.
  3. Dzień 2
    1. Zakończyć przygotowanie buforu permeabilizacyjnego. Odessać PBS ze studzienek i zastąpić go 0,8 ml buforu permeabilizacji na studzienkę. Umieścić płytki z powrotem na wytrząsarce i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
    2. Po 4 godzinach inkubacji całkowicie odessać bufor permeabilacyjny i zastąpić go 0,5 ml buforu blokującego (patrz tabela 1 i sekcja 1). Uszczelnić płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu, umieścić w bezpiecznie przykrytym pojemniku na wytrząsarce i inkubować próbki z delikatnym mieszaniem w buforze blokującym przez noc (16-24 h) w temperaturze pokojowej.
  4. Dzień 3
    1. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe przez rozcieńczenie w buforze blokującym. Do wizualizacji oocytów należy użyć markerów oocytów, np. szczurzej kwasowej peptydazy jądrowej przeciw komórkom rozrodczym (GCNA)/TRA98 zarówno dla jajników prenatalnych, jak i przedpokwitaniowych oraz helikazy anty-DEAD-box 4 (DDX4)/mysiego homologu wazów (MVH) zarówno dla jajników przedpokwitaniowych, jak i pokwitaniowych. Do ilościowego określenia ekspresji LINE-1 ORF1p w jajnikach prenatalnych należy użyć króliczego przeciwciała anty-LINE-1 ORF1p lub innego dostępnego przeciwciała.
      UWAGA: Sygnał GCNA/TRA98 nie jest wykrywalny w jajnikach dojrzewania.
    2. Odessać bufor blokujący z próbek i zastąpić go 0,5 ml rozcieńczonych przeciwciał pierwszorzędowych. Uszczelnij płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu. Umieścić płytki w pojemniku z pokrywą, aby zapobiec wysychaniu próbek podczas inkubacji. Umieść pojemnik na wytrząsarce i inkubuj próbki przez 3-4 dni w temperaturze pokojowej.
  5. Dzień 7
    1. Delikatnie usunąć parafilm z płytek i odessać mieszaninę przeciwciał pierwotnych z próbek. Mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych należy przechowywać w temperaturze 4 °C (przez okres do miesiąca lub trzech zastosowań) i użyć ich ponownie później, uzupełniając je świeżymi przeciwciałami (np. 2 μl podwielokrotności świeżych przeciwciał na 5 ml poprzednio użytej mieszaniny).
    2. Dodać 1 ml buforu do przemywania (patrz tabela 1 i sekcja 1) na studzienkę do próbek i delikatnie kołysać płytkami przez kilka sekund, aby wypłukać resztki przeciwciał. Ostrożnie odessać i zastąpić bufor myjący 0,8 ml świeżego buforu do płukania i wstrząsnąć płytkami w temperaturze pokojowej przez noc.
  6. Dzień 8
    1. Odessać nocny bufor myjący, zastąpić go 0,8 ml świeżego buforu do płukania i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powtórzyć etap płukania ze świeżym buforem myjącym przez kolejne 2 godziny.
    2. Po ostatnim płukaniu należy zastąpić bufor płuczący 0,5 ml wtórnych mieszanin przeciwciał rozcieńczonych w buforze blokującym, np. kozi anty-szczur Alexa Fluor 555 i kozi anty-królik Alexa Fluor 647 w rozcieńczeniu 1:1,000. Przygotuj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych na świeżo do każdego eksperymentu barwienia immunologicznego.
    3. Uszczelnij płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu podczas inkubacji. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności lub na płytkach pokrytych folią aluminiową, delikatnie mieszając przez 3 dni.
      UWAGA: Ten krok i wszystkie kolejne kroki odbywają się w ciemności lub z folią aluminiową.
  7. Dzień 11
    1. Odessać mieszaninę przeciwciał drugorzędowych i przeprowadzić wstępne płukanie 1 ml buforu do mycia. Delikatnie kołysz płytkami przez kilka sekund, aby wypłukać resztki przeciwciał drugorzędowych.
    2. Odessać bufor myjący, zastąpić go 0,8 ml świeżego buforu płuczącego i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z wytrząsaniem, chroniąc przed światłem. Powtórz krok prania 2 razy, co daje w sumie 3 prania. Po trzecim praniu przejdź do etapu oczyszczania (sekcja 6).

6. Oczyszczanie jajników z całego wierzchowca wybarwionych immunologicznie (Rysunek 2A).

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki czyszczenia w ciemności, owijając płytki folią aluminiową lub umieszczając je w nieprzezroczystych pojemnikach. Etapy oczyszczania różnią się w przypadku jajników przed i w okresie dojrzewania.

  1. Dzień 11 [Jajniki prenatalne i przedpokwitaniowe są oczyszczane w jednoetapowym protokole]
    1. Po ostatnim płukaniu odessać bufor płuczący i zastąpić go 0,8 ml świeżo przygotowanego roztworu ScaleS4(0) (patrz tabela 1 i sekcja 1). Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować próbki w ciemności, wytrząsając w temperaturze pokojowej przez trzy do czterech dni przed obrazowaniem.
    2. W razie potrzeby codziennie zastępować roztwór ScaleS4(0) świeżym roztworem; Zachowaj ostrożność podczas wymiany roztworów, ponieważ oczyszczone jajniki stają się przezroczyste i są trudne do zauważenia. Po oczyszczeniu przystąp do konfiguracji próbki i obrazowania (sekcja 7).
      UWAGA: Zmiana rozwiązań nie poprawiła znacząco jakości obrazu. Codzienne zmiany zwiększają prawdopodobieństwo utraty małych i w większości przezroczystych próbek.
  2. Dni 11-15 [Jajniki pokwitania są oczyszczane w dwuetapowym protokole]
    1. Po ostatnim płukaniu immunologicznym należy odessać bufor płuczący i zastąpić go 0,8 ml ScaleCUBIC-1 (patrz Tabela 1 i punkt 1). Uszczelnić płytkę parafilmem i delikatnie wstrząsać próbkami w temperaturze 37 °C przez 3 dni w ciemności. Codziennie zastępuj roztwór ScaleCUBIC-1 świeżym roztworem.
    2. W dniu 15 przemyć próbki 3 razy przez 10 minut za każdym razem w 0,8 ml PBS w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem. Zastąp PBS 0,8 ml odgazowanej 20% sacharozy przygotowanej świeżo z PBS. Wstrząsaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    3. Zastąp 20% roztwór sacharozy 0,8 ml roztworu ScaleCUBIC-2 (patrz Tabela 1 i sekcja 1), uszczelnij płytkę parafilmem i delikatnie wstrząsaj w temperaturze pokojowej z codzienną wymianą roztworu ScaleCUBIC-2. Wyczyść przez 4-5 dni i przejdź do obrazu. Należy zachować ostrożność podczas wymiany roztworów, aby uniknąć utraty próbki, ponieważ oczyszczone jajniki są przezroczyste i trudne do zobaczenia. Przejdź do konfiguracji próbki i obrazowania (sekcja 7).

7. Konfiguracja próbki i obrazowanie za pomocą mikroskopu wielofotonowego

UWAGA: Wszystkie kroki opisane poniżej zostały wykonane za pomocą Leica DIVE/4TUNE/FALCON z dwoma wielofotonowymi laserami Ti:Sapphire z możliwością regulacji i synchronizacją trygonów o czasie trwania impulsu 120 fs z obiektywem multi-immersion 16x/NA0.6 (ciecz zanurzeniowa = glicerol) o maksymalnej odległości roboczej 2,2 mm. Szczegółowe informacje na temat oprogramowania do akwizycji obrazów można znaleźć w Tabeli materiałów. Tabela uzupełniająca S1 i rysunek uzupełniający S1 pokazują ustawienia używane dla tego protokołu. W przypadku innych platform do obrazowania należy skonsultować się z rdzeniem mikroskopowym lub postępować zgodnie ze specyfikacjami/zaleceniami producenta.

  1. Przykładowa konfiguracja
    1. Przygotuj zestaw do montażu próbek. Na przykład użyj lepkiej i elastycznej uszczelki silikonowej, aby dobrze przygotować klej. Umieść dobrze przylepny na jednym mikroszkiełku nakrywkowym o wymiarach 25 mm x 25 mm nr 1,5, aby stworzyć studzienkę, w której zostaną umieszczone jajniki (Rysunek 2B).
      UWAGA: Uszczelka o grubości 1 mm mieści jajniki wszystkich rozmiarów. Ta konfiguracja jest zalecana, ponieważ eliminuje ruchy jajników podczas obrazowania, które mogą wystąpić, gdy jajniki są umieszczone w mocowaniu w naczyniu ze szklanym dnem.
    2. Za pomocą końcówki pipety z odciętą końcówką (20 μl dla prenatalnej i przedpokwitaniowej), przenieś jajniki z ~ 5-10 μl roztworu ScaleS4(0) do środka dobrze kleju, jak pokazano na Rysunek 2B. W przypadku jajników w okresie dojrzewania należy użyć końcówki do pipety o pojemności 200 μl z końcówką odciętą wystarczająco daleko, aby przenieść jajniki. Dodaj ~15-20 μL roztworu ScaleCUBIC-2 do środka studzienki klejowej.
      UWAGA: Zbyt duża ilość roztworu może spowodować wyciek na stolik mikroskopu, a zbyt mała ilość roztworu spowoduje pogorszenie jakości obrazu. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby przenieść próbki, ponieważ oczyszczone jajniki stają się przezroczyste i są trudne do zobaczenia.
    3. Gdy jajniki zostaną przeniesione do indywidualnych studzienek z kroplą roztworu klarującego, delikatnie umieść kolejne szkło nakrywkowe na studzience klejącej, dociśnij, aby utworzyć uszczelnienie i utrzymuj próbki na miejscu w małej kałuży roztworu klarującego umieszczonej między dwoma szkiełkami nakrywkowymi (Rysunek 2B). Aby obrazować, umieść szkiełko nakrywkowe "kanapkę" w wydrukowanym w 3D szkiełku adaptera mikroskopu (np. 43 ).
      UWAGA: Studzienki adhezyjne nadają się do wielokrotnego użytku po rozebraniu "kanapki" i umyciu wodą.
  2. Obrazowanie (tabela uzupełniająca S1 i rysunek uzupełniający S1)
    1. Włącz mikroskop i oprogramowanie zgodnie z wytycznymi rdzenia mikroskopowego lub producenta. Umieść zamontowane próbki na stoliku mikroskopu i spójrz przez okular, aby zlokalizować próbkę oświetloną świetlówką LED o małej mocy.
    2. Po zlokalizowaniu próbek włącz laser (lasery) i przypisz każdy detektor do określonego barwnika/markera Alexa Fluor. W przypadku wielu laserów umożliwiają sekwencyjną akwizycję obrazu. Zdobądź cały stos przed zmianą laserów.
      UWAGA: W tym protokole użyto jednego lasera do akwizycji obrazu zarówno fluoroforów 555 nm, jak i 647 nm.
    3. Ustaw parametry akwizycji obrazu zgodnie ze specyfikacją rdzenia mikroskopowego lub producenta. Użyj dwukierunkowej akwizycji obrazu, jeśli jest dostępna, aby skrócić czas skanowania i poprawić wydajność. Dostosuj inne ustawienia, w tym średnią liniową (1), średnią klatek (1) i akumulację klatek (1).
      UWAGA: Dwukierunkowa akwizycja obrazu umożliwia laserom skanowanie w obu kierunkach podczas ruchu wokół osi X.
    4. Skonfiguruj Z-Stack, identyfikując początek (spód próbki/dolna szklana pokrywa) i pozycję końcową (górna część próbki/górna szklana pokrywa). Wybierz rozmiar kroku Z wynoszący 2 μm dla jajników przed okresem dojrzewania i 5 μm dla jajników w okresie dojrzewania.
    5. Aktywuj funkcję kompensacji Z, a w ramach tej funkcji aktywuj wzmocnienie wzbudzenia. Ustaw kompensację Z dla dolnej i górnej części próbki, wybierając intensywność lasera zarówno dla dolnego (niska intensywność), jak i górnego stosu (wysoka intensywność). Patrz rysunek uzupełniający S1, Liniowa kompensacja Z, gdzie wybrane jest pole wzmocnienia wzbudzenia, a intensywność lasera dla dołu (0) i góry (347.75) jest ustawiona odpowiednio na 10 i 12.
    6. Trybu kafelkowania należy używać w przypadku większych próbek, których nie można uchwycić w jednym polu widzenia. Aktywuj nawigator obrazów i wskaż liczbę kafelków potrzebnych do przechwycenia całej próbki za pomocą prostokątnego narzędzia do znakowania.
    7. Rozpocznij pobieranie obrazu. W przypadku obrazów z wieloma kafelkami rozpocznij pobieranie obrazów za pomocą nawigatora, aby przechwycić wszystkie kafelki. Po zakończeniu akwizycji obrazu najpierw zapisz wszystkie obrazy, a jeśli uzyskano wiele kafelków, uruchom narzędzie do scalania mozaiki, aby scalić kafelki w jeden obraz.
    8. Zapisz scalone pliki w osobnym folderze projektu, aby ułatwić pracę z obrazami o rozmiarze gigabajtów. Przesyłaj pliki do przetwarzania obrazu za pomocą oprogramowania do wizualizacji i analizy obrazów 3D. Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne obrazy wykonane na różnych etapach za pomocą dwóch markerów (GCNA i DDX4).

8. Przetwarzanie obrazu

UWAGA: Wszystkie kroki opisane poniżej zostały opracowane i wykonane przy użyciu oprogramowania do wizualizacji i analizy obrazów 3D IMARIS.

  1. Zaimportuj obraz (obrazy) do oprogramowania do wizualizacji i analizy obrazów 3D i, jeśli to konieczne, przekonwertuj pliki z oryginalnego formatu (np. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) na format .ims.
  2. W razie potrzeby przetwórz obrazy za pomocą filtra gaussowskiego, aby zredukować pikselizację (Rysunek 4A). Korzystając z funkcji widoku 3D, ustaw obraz i usuń zaznaczenie opcji ramki (aby usunąć ramkę).
    UWAGA: Istnieją inne opcjonalne filtry, których można również użyć do zmniejszenia pikselizacji i zmniejszenia intensywności tła.
  3. Powiększ obraz do określonej skali i użyj funkcji Migawka. Ustaw preferencje w następujący sposób: wybierz 300 DPI, zapisz jako obraz TIFF i Przezroczyste tło. Zrób migawkę obrazu i zapisz ją. Rysunek 3 pokazuje kompletnie złożone obrazy.

9. Kwantyfikacja oocytów

UWAGA: Immunofluorescencja całego jajnika oraz wizualizacja i analiza obrazu 3D mogą być wykorzystane do oszacowania liczby oocytów w całych jajnikach (Rysunek 3 i Rysunek 4) przy użyciu funkcji Spot. Sygnał GCNA może być wykorzystany do ilościowego określenia oocytów w jajnikach prenatalnych i przedpokwitaniowych, jak pokazano na Rysunek 4 (P5). W jajnikach w okresie dojrzewania użyj sygnału DDX4 do ilościowego określenia dwóch populacji oocytów w nierosnących pęcherzykach (struktura przypominająca pierścień, zamknięta strzałka) i rosnących pęcherzykach (duże struktury, otwarta strzałka, Rysunek 4, P28).

  1. Określ wielkość oocytów, która będzie używana jako parametr do ilościowego oznaczania oocytów za pomocą funkcji Plamki w kroku 9.2.
    1. Otwórz obraz i wybierz opcję Plasterek, aby otworzyć obraz stosu Z.
    2. Wybierz opcję Linia w panelu Zmierz i zmierz odległość, rysując linię od jednej krawędzi oocytu/markera do drugiej krawędzi w najszerszym punkcie, aby określić średnicę XY typu/rozmiaru oocytu, który ma zostać policzony. Przejdź przez stos i uzyskaj zakres średnic dla wielu oocytów tego samego typu. Użyj najkrótszej długości jako kryterium wyboru rozmiaru dla liczby oocytów.
  2. Funkcja Spoty: Wybierz opcję Widok 3D i aktywuj funkcję Dodaj nowe punkty w panelu Scena, aby otworzyć panel Algorytm. Usuń zaznaczenie wszystkich ustawień algorytmu, ponieważ zostanie użyty filtr wyboru rozmiaru z rozmiarem oocytu uzyskanym w kroku 9.1.
    1. Kliknij pojedynczą strzałkę do przodu, aby przejść do kanału źródłowego. Wybierz kanał z preferowanym znacznikiem i wpisz Szacowaną średnicę XY uzyskaną w kroku 9.1. Na przykład użyj szacowanej średnicy XY wynoszącej 7 μm dla oocytów prenatalnych i 11 μm dla oocytów P5 (GCNA = zielony sygnał; Rysunek 3 i Rysunek 4A).
    2. Użyj 30 μm dla sygnału DDX4, aby oszacować liczbę oocytów w rosnących pęcherzykach w jajnikach P5 (DDX4 = sygnał magenta; Rysunek 3 i Rysunek 4A). W przypadku jajników w okresie dojrzewania użyj sygnału DDX4 do oceny ilościowej oocytów. Na przykład, użyj średnic XY 15 μm i 80 μm, aby zidentyfikować oocyty odpowiednio w nierosnących pęcherzykach i rosnących pęcherzykach, jak pokazano na Rysunek 4A.
      UWAGA: Wybrany rozmiar może się różnić w zależności od kryteriów pozyskiwania obrazu i typu używanego mikroskopu. Selekcja może się również różnić w zależności od szczepów genetycznych, ponieważ jajniki z większą liczbą oocytów będą wymagały selekcji o mniejszym rozmiarze w celu lepszego automatycznego wykrywania oocytów.
    3. Po wybraniu rozmiaru aktywuj Model wydłużenia PSF i Odejmowanie tła, które są określane automatycznie. Wybierz pojedynczą strzałkę do przodu, aby przejść do panelu Filtruj plamy. Dodaj filtr Jakość i określ próg. Aby zapewnić dokładne oszacowanie liczby oocytów, powiększ obraz w miarę dostosowywania progu, aby wybrać wartość progową, która wybiera większość oocytów. Kliknij podwójną strzałkę, aby zakończyć automatyczne liczenie.
    4. Ręcznie sprawdź wybrane oocyty za pomocą zakładki Edycja, aby zaznaczyć pominięte oocyty lub odznaczyć cząstki inne niż oocyty wybrane przez automatyczny próg. Zapisz dane na karcie Statystyki w zakładce Ogólne w celu dalszej analizy.
      UWAGA: Parametry używane do zliczania plamek można zapisać i wykorzystać dla innego zestawu próbek, ale zaleca się przeprowadzenie ręcznej kontroli przed uruchomieniem analizy wsadowej.
    5. Aby zapisać parametry, kliknij kartę Tworzenie i kliknij Zapisz parametry dla Batch.
      UWAGA: Markery jądrowe (oocyty GCNA+, Rysunek 4A) są łatwe do zidentyfikowania przez funkcję punktową i mogą nie wymagać dużej ręcznej regulacji. Jednak marker cytoplazmatyczny (oocyt DDX4+, Rysunek 3 (P28, zamknięta strzałka) i Figura 4A) będzie wymagał bardziej ręcznej regulacji, aby zapewnić identyfikację prawidłowego rozmiaru/typu oocytów.

10. Kwantyfikacja ekspresji białek w jajnikach

UWAGA: Istnieje kilka sposobów ilościowego określania ekspresji określonych markerów w oocytach, korzystając zarówno z funkcji Plamki (sekcja 9 i krok 10.1), jak i funkcji Powierzchnie (krok 10.2). Funkcja Spots może być używana dla białek o wyraźnych wzorcach lokalizacji, takich jak markery jądrowe (GCNA), a funkcja Surfaces może być używana dla białek o niejednorodnych wzorcach lokalizacji, jak pokazano na Figura 5A, gdzie zmierzono intensywność LINE-1 ORF1p w jajnikach E15.5 i E18.5. Aby obliczyć i porównać intensywność białka będącego przedmiotem zainteresowania między dwiema próbkami (np. punktami czasowymi, zabiegami lub genotypami), zbierz obrazy o tych samych właściwościach. Należy użyć próbek o bardziej intensywnym sygnale, aby określić parametry, które mogą być przechowywane i używane dla innych próbek.

  1. Aby uzyskać ekspresję białka za pomocą funkcji Spots, najpierw zidentyfikuj oocyty jako podświetlone (sekcja 9).
    1. Następnie w sekcji Miejsca wybierz zakładkę Statystyki, a następnie zakładkę Szczegółowe. Kliknij strzałkę w dół i wybierz Określone wartości, co spowoduje otwarcie kolejnej zakładki pod nią zawierającej różne pomiary. Wybierz średnią intensywności kanału używanego do generowania powierzchni (lub wybierz inne pomiary intensywności, takie jak mediana intensywności).
    2. Aby uzyskać informacje statystyczne o łącznej/średniej, należy wybrać kryterium Wartości średnie. Po zakończeniu wyeksportuj i zapisz dane do dalszej analizy.
  2. Aby uzyskać ekspresję białka za pomocą funkcji Powierzchnie, otwórz obraz, wybierz opcję Widok 3D i aktywuj funkcję Dodaj nowe powierzchnie w panelu Scena, aby otworzyć panel Algorytm. Odznacz wszystkie ustawienia algorytmu, jeśli nie są potrzebne, i kliknij pojedynczą strzałkę do przodu, aby przejść do kanału źródłowego.
    1. Wybierz kanał z sygnałem przeciwciała do pomiaru. Inne właściwości, które należy wybrać, to opcje specyficzne dla użytkownika. W tym przypadku jako znacznik użyto sygnału LINE-1. Wartości Szczegóły powierzchni i Odejmowanie tła (kontrast lokalny) zostały zachowane na poziomie domyślnym odpowiednio 1,42 i 5,33.
    2. Kliknij strzałkę do przodu, aby przejść do panelu Próg. Wybierz wartość progową, która jest porównywalna w obu próbkach (np. w tym przypadku wyrażenie LINE-1 w E18.5 zostało użyte do wybrania progu). Wybierz opcję Włącz z domyślną średnicą punktów początkowych wynoszącą 7,10 (ta wartość została uznana za optymalną dla obrazów, ale może zależeć od oczekiwanego rozmiaru obiektów w pikselach).
    3. Kliknij strzałkę do przodu, aby przejść do panelu Filtruj powierzchnie. Użyto filtra jakości i oprzyj wartość, podobnie jak w przypadku wartości progowej, na ekspresji białek w obu próbkach jajników. Po wybraniu właściwości filtru kliknij podwójną strzałkę do przodu, aby zakończyć generowanie powierzchni.
    4. Aby uzyskać wartości intensywności, wybierz zakładkę Statystyki, a następnie zakładkę Szczegółowe. Kliknij strzałkę w dół i wybierz Określone wartości, co spowoduje otwarcie kolejnej zakładki pod nią zawierającej różne pomiary.
    5. Wybierz średnią intensywności kanału używanego do generowania powierzchni (lub wybierz inne pomiary intensywności, takie jak mediana intensywności).
    6. Aby uzyskać informacje statystyczne o łącznej/średniej, należy wybrać kryterium Wartości średnie. Po zakończeniu wyeksportuj i zapisz dane do dalszej analizy (Rysunek 5C).

11. Oszacowanie całkowitej liczby oocytów w uszkodzonym jajniku z korektą obliczeniową

UWAGA: Jeśli podczas sekcji dojdzie do niewielkiego uszkodzenia jajnika, możliwe jest obliczeniowe oszacowanie całkowitej liczby oocytów. Zaleca się użycie nienaruszonych jajników z tego samego szczepu i etapu rozwoju do oszacowania liczby oocytów, jak pokazano na Rysunek 6. Symulacje przeprowadzone na jajnikach w E15.5 wskazują, że korekta o ≥30% ubytku powoduje znaczne odchylenie od rzeczywistych liczb (Rysunek 6C).

  1. Otwórz obrazy nienaruszonych jajników za pomocą IMARIS i wybierz funkcję Ramka. W obszarze Ustawienia ramki wybierz etykiety Pole, Siatka, Znaczniki i Oś. Na karcie Position X/Y/Z wybierz 200 μm, aby wygenerować znaczniki z odstępami 200 μm we wszystkich pozycjach X/Y/Z.
    UWAGA: Znaczniki wyboru tworzą siatkę/linijkę w płaszczyznach X, Y i Z w celu identyfikacji oocytów w określonym regionie.
  2. Aktywuj funkcję Spots, aby zidentyfikować oocyty, jak zaznaczono w sekcji 9 (Rysunek 4). Utwórz model 3D, korzystając z oocytów zidentyfikowanych we wszystkich nienaruszonych jajnikach używanych do symulacji, wybierając opcję Sfera na karcie Styl/jakość punktów w funkcji Plamy.
    UWAGA: Szerokość w pikselach można również zmienić na karcie Styl/Jakość punktów.
  3. Za pomocą pola wygenerowanego w kroku 11.1 wyrównaj modele 3D nienaruszonych jajników w tej samej orientacji, jak pokazano na Rysunek 6A.
  4. Korzystając ze znaczników 200 μm (krok 11.1), wybierz oocyty, które mieszczą się w 50% objętości każdego jajnika. Kliknij funkcję Plamy i wybierz opcję Edytuj etykiety, aby sklasyfikować oocyty, które mieszczą się w regionie 50% według koloru, jak pokazano w Rysunek 6A.
    UWAGA: Po sklasyfikowaniu oocytów w regionie zostanie podana liczba oocytów należących do każdej klasy.
  5. Powiększ obszar 50% i zmień znaczniki z 200 μm na 50 μm, aby utworzyć mniejszą linijkę do identyfikacji oocytów. Zachowaj % powiększenia na wszystkich obrazach. Mając znaczniki 50 μm jako wskazówkę, podziel obszar 50% na pięć równych części.
    UWAGA: oocyty w każdej części będą reprezentować 10% objętości, jak podkreślono w Rysunek 6A, gdzie nienaruszony jajnik pokazuje oocyty w górnej połowie jajnika sklasyfikowane według pięciu różnych kolorów, z których każdy kolor reprezentuje oocyty w 10% obszarze wolumetrycznym.
  6. Zapisz liczbę oocytów w każdym regionie 10%, jak pokazano w Rysunek 6A,B. Oblicz średnią liczbę oocytów dla przyrostów 10, 20, 30, 40 i 50%.
  7. Użyj podświetlonych w krokach od 11.1 do 11.6, aby uzyskać liczbę oocytów w uszkodzonym częściowym jajniku. Ustaw uszkodzony jajnik w tej samej orientacji co nienaruszone jajniki i oszacuj brakującą objętość/procent, jak opisano powyżej.
  8. Aby oszacować całkowitą liczbę oocytów w całym jajniku, dodaj średnią liczbę oocytów obliczoną dla podobnej objętości do liczby uzyskanej z częściowego jajnika (Figura 6B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Barwienie immunologiczne i obrazowanie całego jajnika umożliwia wizualizację i kwantyfikację oocytów lub ekspresji białek w jajnikach na różnych etapach rozwoju przy użyciu tej samej techniki i markerów (Rysunek 3). Protokół ten został opracowany na potrzeby dużego projektu, w którym wymagana była analiza jajników na wielu etapach i z wielu szczepów myszy. W tym miejscu prezentujemy dane zebrane dla szczepu C57BL6/J, standardowego szczepu do analizy genetycznej. Przedstawiona tutaj technika jest prost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół barwienia immunologicznego i obrazowania 3D dla jajników prenatalnych i postnatalnych do wysokoprzepustowych i porównawczych badań ilościowych komórek rozrodczych i lokalizacji białek. Opracowaliśmy ten protokół do analizy liczby oocytów w jajnikach (N = 6-12) w sześciu punktach czasowych rozwoju w 10-16 różnych szczepach, w których zwykle przetwarzane są jednocześnie 2-4 24-dołkowe płytki. Metodę tę można dostosować do innych narządów lub markerów komórkowych. Na przykład pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (R01 HD093778 dla E.B-F i T32 HD007065 dla R.B). Dziękujemy Zachary'emu Boucherowi za pomoc w eksperymencie z promieniowaniem. Dziękujemy Mary Ann Handel za krytyczną lekturę rękopisu. Wyrażamy wdzięczność za wkład Sonii Erattupuzha i Microscopy Core Service w The Jackson Laboratory za fachową pomoc w pracach mikroskopowych opisanych w tej publikacji oraz Jarka Trapszo z Scientific Instrument Services w The Jackson Laboratory za zaprojektowanie wydrukowanego w 3D suwaka adaptacyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator laboratoryjnyBenchmark ScientificH2200-H37 ° C inkubator
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR97061-416
C57BL/6JJackson Laboratory000664mysi wsobny szczep
dimetylosulfotlenku (DMSO)Sigma-AldrichD1435Materiał niebezpieczny
D-SorbitolSigma-AldrichS6021
Dumont #5 KleszczeFST91150-20
FastWells Bariery odczynnikoweGraceBio664113Lepka i elastyczna uszczelka silikonowa (dobrze adhezyjna)
Drobne nożyczkiFST91460-11
GlicerolSigma-AldrichG2025
GlicynaThermoFisher ScientificBP381-500
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21246Rozcieńczenie 1:1000
Kozie przeciwciało wtórne anty-szczurze IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555InvitrogenA-21434Rozcieńczenie 1:1000
Surowica koziaSigma-AldrichG9023
IMARISSoftware OxfordInstruments Wersja 9.7.0Oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów
Insight X3Spectra-PhysicsInSight  X3 Przestrajalny ultraszybki laser laserowydo obrazowania wielofotonowego
Oprogramowanie LASXLeicaWersja 3.5.6Oprogramowanie do akwizycji obrazów
Leica DIVE/4TUNE/FALCONLeicaLeica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406Mikroskop wielofotonowy
MaiTai HPSpectra-PhysicsMai Tai DeepSee One Box Ultraszybki laser laserowydo obrazowania wielofotonowego
Sterownik pompy MasterflexModel przemysłowy SPW: 7553-50Pompa perystaltyczna do perfuzji
Nożyczki Mayo FST14010-175 "– 7" /nożyczki do dekapitacji
Okulary Micro Cover Glass, Kwadratowe, Nr 1,5 25x25mmVWR48366-249
Mini BioMixerBenchmark ScientificB3D1020wytrząsarka/nutator do 37 & stopni; Inkubator C
Nikon Ergonomiczny SMZ1270Leica  SMZ1270mikroskop stereoskopowy
Paraformaldehyd 16% (wodny roztwór formaldehydu)Mikroskopia elektronowaNauki 15710Materiał niebezpieczny
PBS Tabletki, sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher ScientificBP2944100Rozpuszczanie w wodzie Milli-Q
Penicylina-Streptomycyna, 200x, Podwójny roztwór antybiotykuThermoFisher ScientificICN1670249
Alkohol poliwinylowy (PVA)Sigma-AldrichP8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-hydroksypropyloetylenodiamina)Sigma-Aldrich122262
Królik anty-DDX4/MVHAbcamab27591Rozcieńczenie 1:500
Królik anty-LINE-1 ORF1pAbcamab216324Rozcieńczenie 1:500
Szczur anty-TRA98 / GCNAAbcamab82527Rozcieńczenie 1:500
Azydek soduSigma-AldrichS2002Materiał niebezpieczny
Borowodorek soduSigma-Aldrich452882Materiał niebezpieczny
Sacharoza WytrząsarkaThermoFisher ScientificS0389
Wytrząsarka orbitalnaTekmar BimedisVXR-S10do temperatury pokojowej
TrietanoloaminaSigma-Aldrich90279
Triton X-100Sigma-AldrichX100
UNOLOK Zestaw infuzyjnyMYCO Medical7001-23igły do perfuzji
MocznikAmresco97061-920
X-Cite 120LEDExcelitasS/N XT640-W-0147świetlówka LED małej mocy
orbitalna

Bibliografia

  1. Pelosi, E., Forabosco, A., Schlessinger, D. Genetics of the ovarian reserve. Frontiers in Genetics. 6, 308(2015).
  2. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  3. Wilkosz, P., Greggains, G. D., Tanbo, T. G., Fedorcsak, P. Female reproductive decline is determined by remaining ovarian reserve and age. PLoS One. 9 (10), 108343(2014).
  4. Richardson, M. C., Guo, M., Fauser, B. C. J. M., Macklon, N. S. Environmental and developmental origins of ovarian reserve. Human Reproduction Update. 20 (3), 353-369 (2014).
  5. Spears, N., et al. Ovarian damage from chemotherapy and current approaches to its protection. Human Reproduction Update. 25 (6), 673-693 (2019).
  6. Morgan, S., Anderson, R. A., Gourley, C., Wallace, W. H., Spears, N. How do chemotherapeutic agents damage the ovary. Human Reproduction Update. 18 (5), 525-535 (2012).
  7. Wesevich, V., Kellen, A. N., Pal, L. Recent advances in understanding primary ovarian insufficiency. F1000Research. 9, (2020).
  8. Biswas, L., et al. Meiosis interrupted: the genetics of female infertility via meiotic failure. Reproduction. 161 (2), 13-35 (2021).
  9. Tam, P. P., Snow, M. H. Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 64, 133-147 (1981).
  10. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125 (17), 3323-3328 (1998).
  11. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Developmental Biology. 234 (2), 339-351 (2001).
  12. Adams, I. R., McLaren, A. Sexually dimorphic development of mouse primordial germ cells: switching from oogenesis to spermatogenesis. Development. 129 (5), 1155-1164 (2002).
  13. McLaren, A., Southee, D. Entry of mouse embryonic germ cells into meiosis. Developmental Biology. 187 (1), 107-113 (1997).
  14. Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How is the number of primordial follicles in the ovarian reserve established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111(2015).
  15. Tilly, J. L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2 (11), 838-848 (2001).
  16. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 158, 417-433 (1963).
  17. Baker, T. G. A quantitative and cytological study of oogenesis in the rhesus monkey. Journal of Anatomy. 100, Pt 4 761-776 (1966).
  18. Kurilo, L. F. Oogenesis in antenatal development in man. Human Genetics. 57 (1), 86-92 (1981).
  19. Matova, N., Cooley, L. Comparative aspects of animal oogenesis. Developmental Biology. 231 (2), 291-320 (2001).
  20. Malki, S., vander Heijden, G. W., O'Donnell, K. A., Martin, S. L., Bortvin, A. A role for retrotransposon LINE-1 in fetal oocyte attrition in mice. Developmental Cell. 29 (5), 521-533 (2014).
  21. Tharp, M. E., Malki, S., Bortvin, A. Maximizing the ovarian reserve in mice by evading LINE-1 genotoxicity. Nature Communications. 11 (1), 330(2020).
  22. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA damage checkpoint eliminates mouse oocytes with chromosome synapsis failure. Molecular Cell. 67 (6), 1026-1036 (2017).
  23. Bolcun-Filas, E., Rinaldi, V. D., White, M. E., Schimenti, J. C. Reversal of female infertility by Chk2 ablation reveals the oocyte DNA damage checkpoint pathway. Science. 343 (6170), 533-536 (2014).
  24. Pepling, M. E. Follicular assembly: mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  25. Tingen, C., Kim, A., Woodruff, T. K. The primordial pool of follicles and nest breakdown in mammalian ovaries. Molecular Human Reproduction. 15 (12), 795-803 (2009).
  26. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 8772(2010).
  27. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  28. Nelson, S. M., Anderson, R. A. Prediction of premature ovarian insufficiency: foolish fallacy or feasible foresight. Climacteric. , 1-10 (2021).
  29. Wood, M. A., Rajkovic, A. Genomic markers of ovarian reserve. Seminars in Reproductive Medicine. 31 (6), 399-415 (2013).
  30. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).
  31. Winship, A. L., Sarma, U. C., Alesi, L. R., Hutt, K. J. Accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (164), e61782(2020).
  32. Fiorentino, G., Parrilli, A., Garagna, S., Zuccotti, M. Three-dimensional imaging and reconstruction of the whole ovary and testis: a new frontier for the reproductive scientist. Molecular Human Reproduction. 27 (3), 007(2021).
  33. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 121(2020).
  34. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-generated ovaries to assist follicle counting experiments. PLoS One. 10 (3), 0120242(2015).
  35. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499(2018).
  36. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G. M., Ebling, F. J. P., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  37. Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72(2018).
  38. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E., Schimenti, J. C. Pharmacological inhibition of the DNA damage checkpoint prevents radiation-induced oocyte death. Genetics. 206 (4), 1823-1828 (2017).
  39. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biology of Reproduction. 93 (5), 113(2015).
  40. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  41. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  42. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).
  43. Microscope slide (25x75) with inset for coverslips (22x22). NIH 3D Print Exchange. Capel Lab at Duke University Medical Center. , Available from: https://3dprint.nih.gov/discover/3DPX-009765 (2018).
  44. Niu, W., Spradling, A. C. Two distinct pathways of pregranulosa cell differentiation support follicle formation in the mouse ovary. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (33), 20015-20026 (2020).
  45. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  46. Carroll, J., Marangos, P. The DNA damage response in mammalian oocytes. Frontiers in genetics. 4, 117(2013).
  47. McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovary. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
  48. McKey, J., Anbarci, D. N., Bunce, C., Capel, B. Integration of mouse ovary morphogenesis with developmental dynamics of the oviduct, ovarian ligaments, and rete ovarii. bioRxiv. , (2021).
  49. Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. -W., Hadjantonakis, A. -K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
  50. Di Giovanna, A. P., et al. Tailored sample mounting for light-sheet fluorescence Microscopy of clarified specimens by polydimethylsiloxane casting. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 35(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie oocyt wutlenianie optycznep cherzyk pierwotnyatrycja kom rek linii zarodkowejobrazowanie jajnik w 3Drozw j jajnika myszymarkery oocyt w

Powiązane artykuły