Artykuł metodologiczny

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

DOI:

10.3791/62977

⸱

7 grudnia 2021

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoreceptory pręcików to wysoce spolaryzowane neurony czuciowe z wyraźnymi przedziałami. Pręciki myszy są długie (~80 μm) i cienkie (~2 μm) i są bocznie upakowane w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki, warstwie fotoreceptorów, co powoduje wyrównanie analogicznych przedziałów subkomórkowych. Tradycyjnie, styczne przecięcie zamrożonej płasko zamontowanej siatkówki było wykorzystywane do badania ruchu i lokalizacji białek w różnych przedziałach pręcików. Jednak wysoka krzywizna siatkówki myszy z dominacją pręcików sprawia, że przekroje styczne są trudne. Zmotywowani badaniem transportu białek między przedziałami, opracowaliśmy dwie metody obierania, które niezawodnie izolują zewnętrzny segment pręcika (ROS) i inne przedziały subkomórkowe dla zachodnich plam. Nasze stosunkowo szybkie i proste techniki dostarczają wzbogacone i specyficzne dla subkomórek frakcje do ilościowego pomiaru rozmieszczenia i redystrybucji ważnych białek fotoreceptorowych w normalnych pręcikach. Co więcej, te techniki izolacji można również łatwo dostosować do izolowania i ilościowego badania składu białek innych warstw komórkowych zarówno w zdrowych, jak i zwyrodniałych siatkówkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki fotoreceptorów pręcikowych, ciasno upakowane w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki nerwowej, są integralną częścią widzenia w słabym świetle. Aby funkcjonować jako wierne liczniki fotonów, pręciki wykorzystują szlak sygnałowy oparty na białku G, zwany fototransdukcją, do generowania szybkich, wzmocnionych i powtarzalnych odpowiedzi na wychwytywanie pojedynczych fotonów. Ta reakcja na światło ostatecznie wyzwala zmianę prądu na błonie plazmatycznej, a następnie jest sygnalizowana reszcie układu wzrokowego1. Jak sama nazwa wskazuje, każda komórka pręcikowa ma wyraźny kształt przypominający pręcik i wykazuje wysoce spolaryzowaną morfologię komórkową, składającą się z segmentu zewnętrznego (OS), segmentu wewnętrznego (IS), ciała komórki (CB) i zakończenia synaptycznego (ST). Każdy przedział subkomórkowy ma specyficzną maszynerię białkową (związaną z błoną i rozpuszczalną), cechy biomolekularne i kompleksy białkowe, które odgrywają kluczowe role, takie jak fototransdukcja wzrokowa, ogólne porządkowanie i synteza białek oraz transmisja synaptyczna2,3.

Ponad 30 lat temu, po raz pierwszy zaobserwowano zależny od światła ruch odwrotny białek subkomórkowych, w szczególności transducyny (z dala od OS) i aresztyny (w kierunku OS)4,5,6,7. Na początku zaobserwowane zjawisko zostało przyjęte ze sceptycyzmem, częściowo ze względu na podatność immunohistochemii na maskowanie epitopów8. Na początku 2000 roku translokacja białek zależna od bodźca została potwierdzona przy użyciu rygorystycznej i żmudnej techniki fizycznego cięcia9. Seryjne przekroje styczne zamrożonych, płasko zamontowanych siatkówk gryzoni, a następnie immunoblotting ujawniły, że transducin9,10, arrestin11,12, i recoverin13 wszystkie ulegają redystrybucji subkomórkowej w odpowiedzi na światło. Uważa się, że sterowana światłem translokacja tych kluczowych białek sygnałowych nie tylko reguluje czułość kaskady fototransdukcji9,14,15, ale może również działać neuroprotekcyjnie przeciwko uszkodzeniom spowodowanym światłem16,17,18. Ponieważ transport białek napędzany światłem w pręcikach wydaje się być bardzo istotny dla biologii i fizjologii komórek pręcików, techniki, które pozwalają na izolację różnych przedziałów subkomórkowych w celu określenia dystrybucji białek, są cennymi narzędziami badawczymi.

Obecnie istnieje kilka metod mających na celu izolację subkomórkowych przedziałów pręcików. Jednak metody te mogą być długotrwałe i trudne do odtworzenia lub wymagać znacznej ilości izolatu siatkówki. Preparaty zewnętrznego segmentu pręcików (ROS) za pomocą wirowania w gradimencie gęstości19, na przykład, są powszechnie stosowane do oddzielania ROS od homogenatu siatkówki. Ta metoda jest szeroko stosowana w przypadku western blot, ale procedura jest bardzo czasochłonna i wymaga co najmniej 8-12 mysich siatkówk < sup class="xref">20. Z drugiej strony, seryjne przekroje styczne zamrożonych siatkówk myszy i szczurów zostały z powodzeniem zaimplementowane w izolowaniu klas OS, IS, CB i ST9,11,13. Jednak ta metoda jest technicznie trudna ze względu na konieczność pełnego spłaszczenia małej i bardzo zakrzywionej mysiej siatkówki w celu wyrównania warstw siatkówki przed sekcją styczną. Ponieważ istnieje mnóstwo modeli myszy i myszy transgenicznych rekapitulujących choroby układu wzrokowego, stworzenie techniki, która niezawodnie, szybko i łatwo oddziela poszczególne przedziały pręcików, jest obiecujące w ujawnieniu procesów fizjologicznych zachodzących w każdym wyspecjalizowanym przedziale oraz mechanizmów, które leżą u podstaw procesów wzrokowych w zdrowiu i chorobie.

Aby ułatwić te badania, opisujemy dwie metody obierania, które izolują subkomórkowe przedziały pręcików łatwiej niż obecne protokoły. Pierwsza metoda peelingu, zaadaptowana z techniki naświetlania znakowanych fluorescencyjnie komórek dwubiegunowych w celu nagrania patch clamp21, wykorzystuje celulozową bibułę filtracyjną do sekwencyjnego usuwania ROS z żywej, izolowanej mysiej siatkówki (Rysunek 1). Druga metoda, zaadaptowana z procedury, która izoluje trzy pierwotne warstwy komórek siatkówki od siatkówki chick22 i frog23 siatkówki, wykorzystuje taśmę klejącą do usunięcia ROS i wewnętrznego segmentu pręcika (RIS) z liofilizowanej siatkówki (Rysunek 2). Obie procedury można wykonać w ciągu 1 godziny i są one bardzo przyjazne dla użytkownika. Zapewniamy walidację skuteczności tych dwóch protokołów separacji dla western blot, wykorzystując przystosowane do ciemności i wystawione na światło siatkówki myszy C57BL / 6J, aby zademonstrować indukowaną światłem translokację pręcików transducyny (GNAT1) i aresztyny (ARR1). Ponadto, korzystając z metody peelingu taśmowego, dostarczamy dodatkowych dowodów na to, że nasza technika może być wykorzystana do badania i rozwiązywania niespójności między danymi dotyczącymi lokalizacji białek uzyskanymi przez immunocytochemię (ICC) a zachodnimi plamami. W szczególności nasza technika wykazała, że: 1) izoforma kinazy białkowej C-alfa (PKCα) jest obecna nie tylko w komórkach dwubiegunowych, ale także w mysich ROS i RIS, aczkolwiek w niskich stężeniach24,25, oraz 2) kinaza rodopsyny (GRK1) jest obecna głównie w izolowanej próbce OS. Dane te pokazują skuteczność naszych dwóch technik peelingu w oddzielaniu i ilościowym określaniu określonych białek pręcików i siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi komitetu ds. badań nad zwierzętami z Uniwersytetu Południowej Kalifornii (USC).

1. Metoda peelingu siatkówki z żywych komórek

  1. Przygotowanie Amesa, bibułek do obierania i naczynia preparacyjnego
    1. Za pomocą nożyczek z końcówką tęczówki (lub równoważnego typu nożyczek) pokrój celulozową bibułę filtracyjną (klasa 413) na prostokąty o wymiarach około 5 mm x 2,5 mm. Przechowuj sadzonki do wykorzystania w przyszłości.
    2. Przygotuj 1 l buforu HEPES Amesa, łącząc jedną butelkę pożywki Amesa, 2,38 g HEPES i 0,877 g NaCl. Rozpuść odczynniki w sterylnej szklanej butelce z destylowaną ultraczystą wodą i dostosuj osmolarność i pH odpowiednio do 280 mOsm i 7,4. Przefiltrować do sterylizacji (wielkość porów 0,2 μm), uszczelnić pokrywkę folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj 1 l buforu wodorowęglanowego Amesa, łącząc jedną butelkę Pożywki Amesa i 1,9 g NaHCO3. Rozpuść odczynniki w sterylnej szklanej butelce z destylowaną ultraczystą wodą i dostosuj osmolarność i pH odpowiednio do 280 mOsm i 7,4. Filtrować do sterylizacji (wielkość porów 0,2 μm), uszczelnić pokrywkę folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: HEPES Amesa i wodorowęglanowe Amesa można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
    4. Na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm utwórz skalpelem wzór kratownicy lub szachownicy (ostrze nr 11, 40 mm).
      UWAGA: Teksturowane dno szalki Petriego utrzymuje izolowane, swobodnie unoszące się oko na miejscu podczas rozwarstwiania siatkówki.
  2. Rozwarstwienie siatkówki
    UWAGA: W celu przeprowadzenia tej procedury bufor należy doprowadzić do temperatury pokojowej (RT) i przechowywać w niej. Odświeżaj bufor wodorowęglanowy Amesa co 15 minut świeżym karbogenowanym buforem wodorowęglanowym Amesa podczas sekcji. Pozwala to utrzymać niezbędne fizjologiczne pH.
    1. Około 15-20 minut przed sekcją należy natlenić bufor HEPES Amesa w butelce laboratoryjnej lub pożywce o pojemności 100 ml wyposażonej w adapter nasadki rurki i bąbelkować bufor wodorowęglanowy Amesa z 95%O2 i 5% CO2 w komorze inkubacji tkanek oraz w 100 ml butelce laboratoryjnej lub pożywce wyposażonej w adapter nasadki rurki.
    2. Poddaj eutanazji równą liczbę myszy C57BL/6J (w wieku 2-3 miesięcy) obu płci przez wdychanie izofluranu lub dwutlenku węgla (CO2), a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Wyłuszczyć oczy zakrzywionymi nożyczkami i umieścić je na teksturowanej szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm wypełnionej bąbelkowym buforem wodorowęglanowym Amesa.
    3. Utwórz muszlę oczną (Rysunek 1A), nakłuwając otwór na połączeniu rogówka-rąbek igłą 18 G. Przetnij wzdłuż obwodu tego skrzyżowania za pomocą nożyczek do mikropreparowania tęczówki, aby usunąć rogówkę z każdego oka. Oddziel soczewkę i ciało szkliste od każdego oka za pomocą pęsety i wyrzuć.
    4. Odizoluj siatkówkę od muszli ocznej, ostrożnie odrywając kompleks nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)-twardówka-naczyniówka od siatkówki nerwowej. Odrzuć kompleks RPE-twardówka-naczyniówka. Upewnij się, że siatkówka nie została uszkodzona podczas sekcji, dotykając tylko krawędzi.
    5. Przenieść izolowane siatkówki za pomocą pipety o szerokim otworze do pokrywy naczynia o wymiarach 60 x 15 mm wypełnionego bąbelkowym buforem wodorowęglanowym Amesa.
    6. Ustaw siatkówkę w kształcie półkuli wklęsłą do góry (fotoreceptory są skierowane w dół w kierunku dna naczynia) i przetnij każdą siatkówkę (przez nerw wzrokowy) za pomocą nożyczek do tęczówki lub skalpela (ostrze nr 10, 40 mm). Przytnij zakrzywione krawędzie każdej połowy siatkówki, aby utworzyć dwa prostokąty (Rysunek 1A).
      UWAGA: Zminimalizowanie krzywizny każdej przekrojonej na pół siatkówki pozwala na lepsze spłaszczenie siatkówki w kolejnych etapach złuszczania i zapewnia dokładne złuszczanie warstwy zewnętrznego segmentu pręcika (ROS).
    7. Przechowuj przepołowione siatkówki w komorze inkubacji tkanek, która jest stale bąbelkowana 95% O2 i 5% CO2,
      UWAGA: Izolowane siatkówki można przechowywać w karbogenowanym buforze wodorowęglanowym Amesa przez ~24 godziny.
  3. Zbieranie zewnętrznego segmentu pręta (ROS) przez peeling bibuły filtracyjnej
    UWAGA: Odświeżaj natleniony bufor AMES' HEPES RT co 15-20 minut podczas procesu peelingu, aby utrzymać niezbędne fizjologiczne pH.
    1. Przenieść jeden prostokąt siatkówki z komory tkankowej za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze i kawałka bibuły filtracyjnej o wymiarach 5 mm x 2,5 mm na szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10 mm wypełnioną buforem HEPES Amesa z pęcherzykami 100%O2.
    2. Ustaw podzieloną siatkówkę wklęsłą do góry i upewnij się, że fotoreceptory są skierowane w dół w kierunku dna naczynia. Lekko chwyć boki przepołowionej siatkówki pęsetą i przesuń ją na bibułę filtracyjną. Gdy siatkówka zostanie wyśrodkowana na bibule filtracyjnej, przesuń bibułę filtracyjną w górę, tak aby przepołowiona siatkówka dotykała bibuły filtracyjnej, aby uzyskać przyczepność ROS do bibuły filtracyjnej (Rysunek 1B).
      UWAGA: Upewnij się, że warstwa fotoreceptora ma bezpośredni kontakt z bibułą filtracyjną.
    3. Ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z dołączoną siatkówką z bufora HEPES Amesa. Umieść dolną stronę bibuły filtracyjnej (stronę bez siatkówki) na ręczniku papierowym i przetrzyj 2-3 razy do wyschnięcia (Rysunek 1B).
    4. Dodaj kroplę HEPES Amesa na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką. Ponownie umieść bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym do wyschnięcia, zgodnie z opisem. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy.
    5. Umieść bibułę filtracyjną z siatkówką z powrotem na szalce Petriego. Za pomocą pęsety delikatnie popchnij wszystkie krawędzie przepołowionej siatkówki do góry i odsuń ją od bibuły filtracyjnej ze wszystkich stron.
    6. Delikatnie oderwij siatkówkę od bibuły filtracyjnej. Podczas procesu peelingu dotykaj tylko skrajnego obwodu siatkówki, aby zachować integralność strukturalną siatkówki.
    7. Wyjmij bibułę filtracyjną z szalki Petriego i usuń nadmiar płynu na ręczniku papierowym. Upewnij się, że strona, która stykała się z siatkówką, nie styka się z ręcznikiem papierowym.
    8. Umieść bibułę filtracyjną z częściową warstwą ROS w oznakowanej tubie na lodzie (Rysunek 1B). Utrzymuj złuszczoną siatkówkę zanurzoną w buforze HEPES Amesa.
    9. Powtórz proces złuszczania tej przepołowionej siatkówki około 7-8 razy, aby usunąć całą warstwę ROS. Po każdym peelingu umieść bibułę filtracyjną w tej samej probówce, która będzie zawierała wyizolowany ROS z jednej połówki siatkówki.
      UWAGA: Uważaj, aby nie rozerwać przepołowionej siatkówki podczas odklejania jej od bibuły filtracyjnej, ponieważ siatkówka staje się cieńsza podczas tego procesu.
    10. Umieścić probówkę zawierającą wszystkie skórki bibuły filtracyjnej wyizolowanego ROS na lodzie do natychmiastowego użycia lub zamrozić bezpośrednio na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    11. Za pomocą pęsety przenieś resztki złuszczonej siatkówki (pozbawionej ROS) do odpowiednio oznakowanej tubki. Umieść probówkę na lodzie do natychmiastowego użycia lub zamroź suchym lodem i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    12. Powtórz proces obierania dla każdej połówki siatkówki i dokładnie oznacz każdą rurkę.

2. Metoda liofilizowanego peelingu siatkówki

  1. , podłoże do obierania, przygotowanie naczynia preparacyjnego i ustawienie liofilizatora
    1. W butelce o pojemności 1 l przygotuj roztwór Ringera, dodając 500 ml destylowanej wody ultraczystej. Rozpuść odczynniki, aby osiągnąć końcowe stężenie 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES i 0,02 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH, dodaj ultraczystą wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 1 l i dostosuj osmolarność do 313 mOsm.
    2. Przed użyciem przefiltrować roztwór Ringera sterylnym filtrem (wielkość porów 0,2 μm), uszczelnić pokrywkę folią parafinową i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Za pomocą nożyczek z końcówką irysa (lub równoważnego typu nożyczek) pokrój celulozową bibułę filtracyjną na prostokąty o wymiarach około 5 mm x 2,5 mm. Użyj ołówka, aby napisać po jednej stronie bibuły filtracyjnej, aby stworzyć unikalną etykietę.
    4. Za pomocą skalpela (ostrze nr 11, 40 mm) stwórz kratownicę lub szachownicę na dnie szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm.
    5. Włącz liofilizator zgodnie ze specyfikacją producenta.
    6. Zaopatrzyć się w ciekły azot w kolbie Dewara lub podobnej izolacyjnej kolbie próżniowej.
  2. Rozwarstwienie siatkówki
    1. Zakończ rozwarstwienie siatkówki zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu (Rysunek 1A). Użyj zimnego roztworu Ringera zamiast bufora Amesa.
    2. Po rozbiorzeniu przechowuj przekrojone na pół, prostokątne siatkówki na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm wypełnionej zimnym roztworem Ringera i umieść na lodzie.
  3. Przygotowanie próbki siatkówki do liofilizacji
    1. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 5 x 2,5 mm i przenieś przepołowioną siatkówkę na teksturowaną szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10 mm wypełnioną zimnym buforem Ringera. Użyj pipety do przenoszenia o szerokim otworze, aby przesunąć każdą siatkówkę między naczyniami.
    2. Użyj pęsety, aby ostrożnie obrócić siatkówkę tak, aby była zorientowana wklęsła do góry (fotoreceptory są skierowane do góry) i przesuń ją tak, aby spoczywała na bibułze filtracyjnej (Rysunek 2A).
      UWAGA: Upewnij się, że fotoreceptory nie stykają się z bibułą filtracyjną (warstwa komórek zwojowych siatkówki powinna mieć bezpośredni kontakt z bibułą filtracyjną) i że widoczna jest unikalna etykieta. Aby łatwo i szybko zidentyfikować izolat siatkówki, zaleca się, aby unikalna etykieta znajdowała się na spodniej stronie bibuły filtracyjnej.
    3. Podnieś bibułę filtracyjną za krawędzie do góry, tak aby przepołowiony kawałek siatkówki dotykał bibuły filtracyjnej i kontynuuj wyjmowanie bibuły filtracyjnej z roztworu Ringera.
    4. Umieść dolną stronę bibuły filtracyjnej (stronę bez siatkówki) na ręczniku papierowym i ostrożnie przetrzyj 2-3 razy, aby usunąć nadmiar płynu (Rysunek 2A).
    5. Podnieś bibułę filtracyjną pęsetą i dodaj kroplę zimnego Ringera na bok bibuły filtracyjnej z siatkówką. Ponownie umieść bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Powtórz proces jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Te naprzemienne etapy zwilżania i suszenia zapewniają, że tkanka jest mocno przymocowana do bibuły filtracyjnej.
    6. Przechowuj każdą przylegającą próbkę siatkówki/bibuły filtracyjnej na szalce Petriego wypełnionej zimnym Ringerem, aż będzie gotowa do zamrożenia wszystkich próbek. Powtórz ten proces dla wszystkich siatkówk przepołowionych.
    7. Uzyskaj czystą i suchą szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10 mm (tylko na dole) i kawałek folii aluminiowej pokrojony w kwadrat o wymiarach 3.5 x 3.5 cala.
    8. Wyjmij każdą próbkę z zimnego bufora Ringera za pomocą pęsety. Upewnij się, że pęseta styka się tylko z krawędziami bibuły filtracyjnej, unikając zmniejszonej o połowę siatkówki.
    9. Połóż dolną stronę każdej bibuły filtracyjnej (stronę bez siatkówki) na ręczniku papierowym i usuń nadmiar płynu.
    10. Dodaj kroplę zimnego 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) na stronę bibuły filtracyjnej, do której przylega siatkówka. Przetrzyj bibułę filtracyjną na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu.
      UWAGA: Upewnij się, że wilgoć z bibuły filtracyjnej została wystarczająco usunięta przed zamrożeniem.
    11. Umieść wszystkie kawałki bibuły filtracyjnej na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm. Użyj niestrzępiącej się bibuły, aby usunąć nadmiar płynu otaczającego bibułę filtracyjną.
      UWAGA: Nie przepełniaj szalki Petriego próbkami. Jeśli używa się więcej niż czterech mysich oczu, rozważ użycie większej szalki Petriego lub wielu mniejszych szalek Petriego do przechowywania próbek siatkówki/bibuły filtracyjnej.
    12. Szczelnie owiń całe naczynie folią aluminiową. Upewnij się, że krawędzie folii aluminiowej są zabezpieczone i płynnie wciśnięte w dno szalki Petriego. Przebij garść otworów o średnicy 0,1-0,2 mm w pokrywie z folii aluminiowej (Rysunek 2A).
    13. Za pomocą metalowych szczypiec stopniowo zanurzaj pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego do ciekłego azotu. Próbki należy przechowywać w ciekłym azocie (<10 min) do momentu, gdy będą gotowe do liofilizacji.
  4. Liofilizacja
    1. Umieść pokrytą folią aluminiową szalkę Petriego w kolbie do liofilizacji i podłącz ją do liofilizatora zgodnie z protokołem producenta. Liofilizować siatkówki przez 30 min.
    2. Odłączyć kolbę od liofilizatora i wyłączyć maszynę zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Usuń folię aluminiową i albo pracuj z liofilizowanymi próbkami tego samego dnia, albo przechowuj je w odpowiednio oznakowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1 ml. Umieścić te probówki w pojemniku (takim jak stożkowa probówka o pojemności 50 ml) wypełnionym bezwodnym środkiem osuszającym i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.
  5. Zbieranie segmentów zewnętrznych i wewnętrznych pręta za pomocą odklejania taśmy klejącej.
    1. Wytnij paski przezroczystej taśmy klejącej (1-2 cm) i przechowuj paski na krawędzi dyspensera taśmy/ławki laboratoryjnej/itp. w celu szybkiego użycia.
    2. Przenieść jedną próbkę siatkówki na pokrywkę plastikowej szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm w celu obierania. Upewnij się, że chwytasz tylko najbardziej zewnętrzne krawędzie bibuły filtracyjnej i unikaj dotykania siatkówki.
    3. Za pomocą nożyczek tęczówkowych z końcówką (lub równoważnego typu nożyczek) przytnij mały prostokątny kawałek taśmy do przybliżonego rozmiaru tkanki (1,5 x 2,5 mm).
    4. Ostrożnie połóż mały kawałek taśmy na wierzchu liofilizowanej siatkówki (Rysunek 2B) i lekko dociśnij pęsetą, aby upewnić się, że łączy się z warstwą fotoreceptora (górna warstwa zabarwiona na pomarańczowo/różowo).
    5. Powoli odklej taśmę. Zarówno zewnętrzny segment pręta (ROS), jak i wewnętrzny segment pręta (RIS) zostaną przyklejone do taśmy (Rysunek 2B).
    6. Upewnij się, że na pękniętej powierzchni znajduje się cienka biała warstwa. Służy to RIS.To oddzielenia RIS, przyłóż kolejny kawałek taśmy i dociśnij taśmę do pękniętej powierzchni (Rysunek 2B).
      UWAGA: Usunięcie całej cienkiej białej warstwy może zająć więcej niż jeden kawałek taśmy.
    7. Umieść kawałek taśmy z tylko pomarańczową/różową warstwą w probówce mikrowirówki oznaczonej +ROS.
    8. Umieść taśmę lub kawałki taśmy z cienką białą warstwą w probówce do mikrowirówki oznaczonej +RIS.
      UWAGA: Oddzielenie liofilizowanej siatkówki taśmą wymaga praktyki. Wielkość nacisku wywieranego na taśmę będzie miała wpływ na frakcjonowanie liofilizowanej próbki. Jeśli na taśmie zostanie nałożony zbyt duży nacisk na próbkę, cała liofilizowana siatkówka oderwie się od bibuły filtracyjnej i przyklei się do taśmy. Jeśli do taśmy zostanie dodany zbyt mały nacisk, pomarańczowo-różowa warstwa wierzchnia (+ROS) nie przyklei się do taśmy.
    9. Zebrać resztki tkanki siatkówki (pozbawionej warstw ROS i RIS, -OIS) znajdującej się na bibule filtracyjnej, odklejając grubą, białą warstwę z bibuły filtracyjnej za pomocą taśmy. Umieść izolat w probówce oznaczonej -OIS.
    10. Powtórz te czynności dla każdej próbki siatkówki zmniejszonej o połowę.
    11. Przechowywać wyizolowane warstwy z liofilizowanych siatkówek w temperaturze pokojowej w przypadku przeprowadzania kwantyfikacji białek, elektroforezy żelowej i immunoblotów białkowych tego samego dnia lub przechowywać w pojemniku (takim jak stożkowa probówka o pojemności 50 ml) wypełnionym bezwodnym środkiem osuszającym w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Przygotowanie próbki Western blot do izolacji peelingowych

  1. Przygotować bufor do lizy RIPA
    1. W butelce o pojemności 100 ml dodaj odczynniki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS i 1 mM EDTA. Dodaj 100 ml dejonizowanej ultraczystej wody i dokładnie wymieszaj.
      UWAGA: Bufor do lizy RIPA może być przechowywany w temperaturze 2-8 °C przez 2-3 tygodnie. W przypadku dłuższego przechowywania porcjować i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    2. W dniu eksperymentu dodaj koktajl inhibitorów proteazy (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotyniny i 1:1000 Leupeptyny) do buforu do lizy RIPA i trzymaj na lodzie.
  2. Bibuła filtracyjna, preparat lizatu peelingującego do western blot
    1. Upewnij się, że probówki zawierające skórki bibuły filtracyjnej i resztki obranych siatek są przechowywane na lodzie (do eksperymentu tego samego dnia) lub wyjęte z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieszczone na lodzie.
    2. Usunąć nadmiar płynu z dna probówek do mikrowirówek zawierających peelingi bibuły filtracyjnej. Szybko wiruj w mini wirówce przez 2-4 sekundy i wylej pozostały płyn.
    3. Odpipetować 45-55 μl zimnego buforu RIPA do probówek zawierających izolat bibuły filtracyjnej.
    4. Homogenizować każdą próbkę za pomocą czystego, autoklawizowanego miksera tłuczkowego przez 1 minutę. Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje w kontakcie z mikserem tłuczkowym. Trzymaj bibułę filtracyjną z boku każdej probówki, a nie na dole.
    5. Za pomocą pęsety przesuń bibuły filtracyjne na bok każdej probówki i wiruj w mini wirówce przez 2-4 sekundy. Spowoduje to usunięcie bufora RIPA z bibuły filtracyjnej.
    6. Usuń wysuszoną bibułę filtracyjną i w razie potrzeby powtórz dla wszystkich bibuł filtracyjnych w każdej probówce.
    7. Przenieść homogenat do nowej probówki i odpowiednio go oznaczyć.
      UWAGA: Jest to najbardziej czasochłonny krok, a jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo, duża część próbki zostanie wchłonięta przez bibułę filtracyjną.
    8. Odpipetować 60-80 μl zimnego buforu RIPA do poszczególnych probówek z resztkami obranych siatkówk.
    9. Homogenizować każdą próbkę za pomocą czystego, autoklawizowanego miksera tłuczkowego przez 1 minutę.
  3. Peeling taśmowy Lizat preparat na western blot
    1. Umieścić próbki liofilizowane w temperaturze pokojowej RT lub próbki w temperaturze -80 °C na lodzie.
    2. Odpipetować 50-70 μL zimnego buforu RIPA do każdej probówki zawierającej peelingi taśmowe +ROS i +RIS.
    3. Odpipetować 60-80 μl buforu do lizy na zimno do probówek -OIS zawierających pozostałą liofilizowaną siatkówkę, z usuniętymi ROS i RIS.
    4. Homogenizować każdą próbkę czystym mikserem tłuczkowym przez 1 minutę. Upewnij się, że taśma w poszczególnych probówkach pozostaje w kontakcie z mieszalnikiem tłuczkowym i buforem do lizy.
    5. Za pomocą wysterylizowanej pęsety przesuń taśmę na bok probówek i wiruj mini wirówką przez 2-4 s. Spowoduje to usunięcie płynu z taśmy. Usuń zaschniętą taśmę z tub.
      UWAGA: W tym momencie możesz połączyć dwa izolaty połówki siatkówki z tej samej siatkówki w celu zastosowania metody "peelingu bibuły filtracyjnej" lub "peelingu taśmy", aby upewnić się, że masz wystarczającą objętość do wykonania testu kwasu bicinchoninowego (BCA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne strategie zostały opracowane w celu zapewnienia stosunkowo szybkich i prostych metod izolowania i analizowania białek wśród specyficznych subkomórkowych przedziałów pręcików do analizy western blot. Zastosowaliśmy dwie sekwencyjne techniki peelingu (Rysunek 1 i Rysunek 2), a następnie immunoblotting, aby pokazać, że te metody można niezawodnie wykorzystać do wykrycia znanego rozkładu transducyny pręcikowej (GNAT1) i aresztyny (ARR1) zarówno u zwierząt przystosowanych do cie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele chorób siatkówki wpływa na komórki fotoreceptorów pręcików, prowadząc do śmierci pręcików, a ostatecznie do całkowitej utraty wzroku37. Znaczna część genetycznych i mechanistycznych początków ludzkiego zwyrodnienia siatkówki została z powodzeniem zrekapitulowana w wielu modelach mysich na przestrzeni lat. W tym kontekście, zdolność do łatwego i selektywnego oddzielania poszczególnych subkomórkowych przedziałów pręcików od małej siatkówki myszy znacznie poszerzyłaby nasze zrozumienie zlokaliz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH Grant EY12155, EY027193 i EY027387 dla JC. Jesteśmy wdzięczni dr. Spyridonowi Michalakisowi (Caltech, Pasadena, USA) i Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) za korektę manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować dr Sethowi Ruffinsowi (USC, Los Angeles, USA) i dr Janosowi Peti-Peterdiemu (USC, Los Angeles, USA) za udostępnienie niezbędnego sprzętu do zebrania materiałów dostarczonych przez autora. Materiał z: Kasey Rose i wsp., Separacja przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy do analizy białek, Neurodegeneracja molekularna, opublikowana [2017], [Springer Nature].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelka laboratoryjna lub medialna o pojemności 100 ml wyposażona w adapter nasadki rurkiNie
100% zbiornika O2N/A N/A
1000 ml Filtr górny do butelki, materiał filtracyjny PES, 0,22 i mu; mGenesee Scientific25-235
4X SDS Bufor do próbekMillipore Sigma70607-3
50 ml Probówka FalconFisher Scientific14-432-22
95% zbiornik O2 i 5% CO2N/A
AMES' Pożywka z L-glutaminą, bez wodorowęglanuSigma-AldrichA1420
CaCl2 (99%, dwuwodzian)SigmaC-3881
Drierite (bezwodny siarczan wapnia, >98% CaSO4, >2% CoCl2)WA Hammond Drierite Co LTD21005
Falcon Easy-Grip Petri Szalka (polistyren, 35 x 10 mm)Falcon-Corning08-757-100A
Naczynie do hodowli tkankowych Falcon Easy-Grip (60 x 15 mm)Falcon-Corning08-772F
Skalpel do piór (nr 10, 40 mm)VWR100499-578
Skalpel do piór (nr 11, 40 mm)VWT100499-580
KCl (99%)SigmaP-4504
Tłuczek do pelletu Kimble KontesSigmaz359971
Kolby do szybkiego zamrażania LabconcoLabconcoN/A
LN2 (ciekły azot) + kolba Dewara lub podobna kolba próżniowaN/A/A
MgCl2SigmaM-9272
Milli-Q/woda dejonizowanaEMD MiliporaN/A
Na2HPO4 (proszek)J.T. Baker4062-01
NaCl (kryształ)EMD MilliporeSx0420-3
NaHCO3Amresco0865
OmniPur EDTAEMD4005
OmniPur HEPES, Free AcidEMD5320
Parafilm MSigma-AldrichP7793
Reynolds Wrap Folia aluminiowaReynolds BrandsN/A
Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m)Scotch-3MN/A
Deoksycholan soduSigma-AldrichD67501
Miniwirówka SpectrafugeLabnet International, IncC1301
Komora inkubacji tkanek (zakupiona lub wykonana na zamówienie)N/AN/A
Tris-HClJ.T.Baker4103-02
Triton X-100Signma-AldrichT8787
VirTis Liofilizator laboratoryjny 2K lub równoważna maszynaSP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (średnica 5,5 cm, rozmiar porów 5 μ m)VWR28310-015
Whatman Grade 1 (średnica 9 cm, wielkość porów 11 i mu; m)Whatman/GE Healthcare1001-090
Pipeta do przenoszenia o szerokim otworze, Global ScientificVWR76285-362
dotyczy N Jakościowa bibuła filtracyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67(2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Photoreceptor IsolationRod Outer SegmentRetina PeelingSubcellular CompartmentTape Peeling MethodLyophilization TechniqueWestern BlotPhotoreceptor Proteins

Powiązane artykuły