Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fotoreceptory pręcików to wysoce spolaryzowane neurony czuciowe z wyraźnymi przedziałami. Pręciki myszy są długie (~80 μm) i cienkie (~2 μm) i są bocznie upakowane w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki, warstwie fotoreceptorów, co powoduje wyrównanie analogicznych przedziałów subkomórkowych. Tradycyjnie, styczne przecięcie zamrożonej płasko zamontowanej siatkówki było wykorzystywane do badania ruchu i lokalizacji białek w różnych przedziałach pręcików. Jednak wysoka krzywizna siatkówki myszy z dominacją pręcików sprawia, że przekroje styczne są trudne. Zmotywowani badaniem transportu białek między przedziałami, opracowaliśmy dwie metody obierania, które niezawodnie izolują zewnętrzny segment pręcika (ROS) i inne przedziały subkomórkowe dla zachodnich plam. Nasze stosunkowo szybkie i proste techniki dostarczają wzbogacone i specyficzne dla subkomórek frakcje do ilościowego pomiaru rozmieszczenia i redystrybucji ważnych białek fotoreceptorowych w normalnych pręcikach. Co więcej, te techniki izolacji można również łatwo dostosować do izolowania i ilościowego badania składu białek innych warstw komórkowych zarówno w zdrowych, jak i zwyrodniałych siatkówkach.
Wprowadzenie
Komórki fotoreceptorów pręcikowych, ciasno upakowane w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki nerwowej, są integralną częścią widzenia w słabym świetle. Aby funkcjonować jako wierne liczniki fotonów, pręciki wykorzystują szlak sygnałowy oparty na białku G, zwany fototransdukcją, do generowania szybkich, wzmocnionych i powtarzalnych odpowiedzi na wychwytywanie pojedynczych fotonów. Ta reakcja na światło ostatecznie wyzwala zmianę prądu na błonie plazmatycznej, a następnie jest sygnalizowana reszcie układu wzrokowego1. Jak sama nazwa wskazuje, każda komórka pręcikowa ma wyraźny kształt przypominający pręcik i wykazuje wysoce spolaryzowaną mor....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi komitetu ds. badań nad zwierzętami z Uniwersytetu Południowej Kalifornii (USC).
1. Metoda peelingu siatkówki z żywych komórek
- Przygotowanie Amesa, bibułek do obierania i naczynia preparacyjnego
- Za pomocą nożyczek z końcówką tęczówki (lub równoważnego typu nożyczek) pokrój celulozową bibułę filtracyjną (klasa 413) na prostokąty o wymiarach około 5 mm x 2,5 mm. Przechowuj sadzonki do wykorzystania w przyszłości.
- Przygotuj 1 l buforu HEPES Amesa, łącząc jedną butelkę pożywki Amesa, 2,38 g HEPES i 0,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejsze strategie zostały opracowane w celu zapewnienia stosunkowo szybkich i prostych metod izolacji i analizy białek z określonych przedziałów subkomórkowych pręcików pod kątem analizy western blot. Zastosowaliśmy dwie sekwencyjne techniki złuszczania (Rysunek 1 oraz Rysunek 2), a następnie immunoblotting, aby wykazać, że metody te mogą być wiarygodnie wykorzystywane do wykrywania znanego rozkładu transducyny pręcikowej (GNAT1) i arrestyny (ARR1) zarówno u z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wiele chorób siatkówki wpływa na komórki fotoreceptorów pręcików, prowadząc do śmierci pręcików, a ostatecznie do całkowitej utraty wzroku37. Znaczna część genetycznych i mechanistycznych początków ludzkiego zwyrodnienia siatkówki została z powodzeniem zrekapitulowana w wielu modelach mysich na przestrzeni lat. W tym kontekście, zdolność do łatwego i selektywnego oddzielania poszczególnych subkomórkowych przedziałów pręcików od małej siatkówki myszy znacznie poszerzyłaby nasze zrozumienie zlokaliz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH Grant EY12155, EY027193 i EY027387 dla JC. Jesteśmy wdzięczni dr. Spyridonowi Michalakisowi (Caltech, Pasadena, USA) i Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) za korektę manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować dr Sethowi Ruffinsowi (USC, Los Angeles, USA) i dr Janosowi Peti-Peterdiemu (USC, Los Angeles, USA) za udostępnienie niezbędnego sprzętu do zebrania materiałów dostarczonych przez autora. Materiał z: Kasey Rose i wsp., Separacja przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy do analizy białek, Neurodegeneracja molekularna, opublikowana [2017], [Springer Nature].
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Butelka laboratoryjna lub medialna o pojemności 100 ml wyposażona w adapter nasadki rurki | Nie | ||
| 100% zbiornika O2 | N/ | A N/A | |
| 1000 ml Filtr górny do butelki, materiał filtracyjny PES, 0,22 i mu; m | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Bufor do próbek | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 ml Probówka Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% zbiornik O2 i 5% CO2 | N/A | ||
| AMES' Pożywka z L-glutaminą, bez wodorowęglanu | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dwuwodzian) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (bezwodny siarczan wapnia, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Szalka (polistyren, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Naczynie do hodowli tkankowych Falcon Easy-Grip (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Skalpel do piór (nr 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Skalpel do piór (nr 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Tłuczek do pelletu Kimble Kontes | Sigma | z359971 | |
| Kolby do szybkiego zamrażania Labconco | Labconco | N/A | |
| LN2 (ciekły azot) + kolba Dewara lub podobna kolba próżniowa | N/A | /A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/woda dejonizowana | EMD Milipora | N/A | |
| Na2HPO4 (proszek) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (kryształ) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Folia aluminiowa | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Deoksycholan sodu | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Miniwirówka Spectrafuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Komora inkubacji tkanek (zakupiona lub wykonana na zamówienie) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Liofilizator laboratoryjny 2K lub równoważna maszyna | SP Scientific N | /A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (średnica 5,5 cm, rozmiar porów 5 μ m) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 (średnica 9 cm, wielkość porów 11 i mu; m) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Pipeta do przenoszenia o szerokim otworze, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Bibliografia
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
