Artykuł metodologiczny

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62983

⸱

13 października 2021

 , 
1Department of Biology, Howard Hughes Medical Institute, Department of Biology, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

Streszczenie

~Neurony są precyzyjnie połączone, tworząc obwody niezbędne do prawidłowego funkcjonowania mózgu. Układ węchowy Drosophila stanowi doskonały model do badania tego procesu, ponieważ 50 typów neuronów receptorów węchowych (ORN) z czułków i palpów szczękowych rzutuje swoje aksony na 50 możliwych do zidentyfikowania kłębuszków nerkowych w płacie czułkowym i tworzy połączenia synaptyczne z dendrytami z 50 typów neuronów projekcyjnych drugiego rzędu (PN). Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na identyfikacji ważnych cząsteczek, które regulują precyzyjne celowanie w obwodzie węchowym za pomocą utrwalonych tkanek. W tym miejscu opisano system eksplantacji czułkowo-mózgowy, który podsumowuje kluczowe kamienie milowe rozwoju tworzenia obwodów węchowych w kulturze. Poprzez preparowanie zewnętrznego naskórka i czyszczenie nieprzezroczystych ciałek tłuszczowych pokrywających rozwijający się mózg poczwarki, za pomocą mikroskopii dwufotonowej można uzyskać wysokiej jakości obrazy pojedynczych neuronów z żywych mózgów. Pozwala to na obrazowanie poklatkowe pojedynczego aksonu ORN z żywej tkanki. Podejście to pomoże w ujawnieniu ważnych kontekstów biologicznych komórek i funkcji wcześniej zidentyfikowanych ważnych genów oraz w zidentyfikowaniu mechanizmów leżących u podstaw dynamicznego procesu składania obwodów.

Wprowadzenie

Neurony są precyzyjnie połączone, tworząc obwody niezbędne do prawidłowego funkcjonowania mózgu. Przez ponad 100 lat neuronaukowcy próbowali zrozumieć, w jaki sposób neuryty rozciągają się w kierunku swoich celów pośrednich i końcowych z niezwykłą precyzją. W rezultacie zidentyfikowali ważne geny, które kodują wskazówki dotyczące rozwoju procesów neuronalnych1. Układ węchowy Drosophila stanowi doskonały model do badania tego procesu, ponieważ neurony receptorów węchowych (ORN, główne neurony czuciowe) rzutują na 50 możliwych do zidentyfikowania kłębuszków nerkowych o stereotypowym rozmiarze, kształcie i względnym położeniu, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z dendrytami z 50 typów neuronów projekcyjnych drugiego rzędu (PN), z których każdy wysyła dendryty do jednego z 50 kłębuszków nerkowych2 (Rysunek 1A). Dlatego stosunkowo łatwo jest zidentyfikować zmutowane fenotypy w rozdzielczości synaptycznej (kłębuszkowej) w układzie węchowym muchy. Doprowadziło to do odkrycia ważnych genów, które regulują tworzenie obwodów węchowych3.

Montaż obwodu węchowego muchy opiera się na czasowo i przestrzennie skoordynowanych procesach rozwojowych3. ORN i PN uzyskują odrębne losy komórek, które konfigurują program pod kątem ich specyfiki okablowania. Następnie, dendryty PN wstępnie modelują płat anteny (Rysunek 1B). Aksony ORN następnie okrążają ipsilateralny płat czułkowy i przekraczają linię środkową mózgu, aby dotrzeć do przeciwległego płata czułkowego. Następnie aksony ORN atakują zarówno ipsi-, jak i przeciwległe płaty czułkowe i tworzą synapsy z dendrytami ich partnerskich PN w określonych kłębuszkach nerkowych. Ten zgrubny model montażu obwodów węchowych został zaproponowany w oparciu o charakterystykę stałych próbek z pośrednich punktów czasowych podczas rozwoju. Słaba rozdzielczość czasowa i niezdolność do śledzenia tych samych procesów neuronalnych w całym rozwoju z utrwalonej tkanki ograniczają mechanistyczne zrozumienie procesu składania obwodów.

Jest technicznie trudne, aby na żywo zobaczyć procesy ORN i PN in vivo, ponieważ proces okablowania zachodzi w pierwszej połowie fazy poczwarki, gdy płat czułka jest otoczony nieprzezroczystym ciałem tłuszczowym wewnątrz obudowy poczwarki. W związku z tym niemożliwe jest bezpośrednie zobrazowanie rozwijającego się obwodu węchowego z nienaruszonych poczwarek. Wypreparowane tkanki hodowane ex vivo mogą obejść zmętnienie tkanek i są z powodzeniem wykorzystywane do badania rozwoju neuronalnego4,5,6. Wyzwaniem związanym z zastosowaniem podobnej strategii hodowli eksplantatów ex vivo do badania okablowania neuronalnego w mózgu poczwarki jest to, czy odzwierciedla ona precyzyjne celowanie neuronów w warunkach hodowli. Na podstawie wcześniej opisanych warunków hodowli ex vivo dla kompleksu oko-mózg muchy7, niedawno opracowano eksplantat, który zawiera nienaruszony cały mózg poczwarki, czułki i łączące nerwy czułkowe, który zachowuje precyzyjne ukierunkowanie obwodu węchowego i może być poddawany obrazowaniu na żywo opartemu na mikroskopii dwufotonowej przez maksymalnie 24 godziny z częstotliwością co 20 minut8. Tutaj opisano szczegółowy protokół hodowli eksplantatów i obrazowania. System eksplantatów stanowi potężną metodę badania montażu obwodu węchowego i potencjalnie innych obwodów w centralnym mózgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole są wykonywane w temperaturze pokojowej (20-25 °C), chyba że wyjaśniono inaczej.

  1. Aby przygotować naczynie hodowlane do unieruchomienia eksplantatu podczas obrazowania poklatkowego, połóż Sylgard o grubości 0,5 cm (przed użyciem dokładnie wymieszaj dwa płynne składniki w stosunku 10:1) na dolnej powierzchni szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i pozwól jej utwardzić się przez 48 godzin w temperaturze pokojowej (Rysunek 2A, określany jako płytka Sylgarda w poniższym tekście).
  2. Aby przygotować mikroszpilki do unieruchamiania eksplantatu na tej płytce, użyj pary kleszczyków, aby przykleić wiele mikro szpilek do taśmy z ostrymi końcami wyrównanymi po jednej stronie (Rysunek 2B). Użyj nożyczek, aby odciąć ~2 mm od ostrych końców mikro szpilek (Rysunek 2B'). Użyj kleszczyków, aby przytrzymać wycięte mikroszpilki i włóż je w warstwę Sylgard gotowej płytki Sylgard (Rysunek 2C). Dwa mikro piny służą do unieruchomienia jednego eksplantatu.
  3. Za pomocą pędzla zebrać białe poczwarki, które tworzą poczwarkę w ciągu 1 godziny, od hsFLP, kamyczk-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP8 genotypu i przenieść je do nowych fiolek. Szok termiczny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 40 minut w celu wywołania rzadkich klonów ORN z losowych typów. Po szoku cieplnym umieścić fiolki w temperaturze 25 °C na 30 godzin, w wyniku czego poczwarki dojrzewają po 30 godzinach od powstania poczwarki (APF).
  4. Aby przygotować pożywkę hodowlaną do eksplantatu, dodaj 5 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml) do 500 ml pożywki Schneider's Drosophila Medium. Przefiltrować pożywkę i przygotować 45 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Pożywkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.
  5. W dniu obrazowania należy pobrać jedną probówkę zawierającą 45 ml pożywki Drosophila firmy Schneider i dodać 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (10% v/v), 125 μl roztworu podstawowego insuliny ludzkiej o stężeniu 4 mg/ml (stężenie końcowe 10 μg/ml), 50 μl roztworu podstawowego 20-hydroksyekdyzonu o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonym w etanolu (stężenie końcowe 1 μg/ml). Dobrze wymieszaj i przenieś 15 ml pełnego podłoża do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozostałą część pełnego podłoża można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień. Płodowa surowica bydlęca, roztwór podstawowy insuliny ludzkiej i roztwór podstawowy 20-hydroksyekdyzonu są podawane i przechowywane w temperaturze -20 °C.
  6. Natlenić pełne 15 ml pożywki, pompując pęcherzyki tlenu z butli tlenowej pod powierzchnią cieczy przez sterylną końcówkę pipety o pojemności 5 ml z szybkością jednego pęcherzyka/s przez 20-30 minut. Użyj folii parafinowej, aby zakryć otwór rurki podczas tego procesu.
  7. Wysterylizuj powierzchnię studzienki rozwarstwiającej i płytkę Sylgard (z mikroszpilkami umieszczonymi na warstwie Sylgard, przygotowanymi w krokach A1 i A2) 70% etanolem. Pozwól im wyschnąć przed użyciem.

2. Sekcja eksplantacji

  1. Za pomocą pędzla przenieś poczwarki 30 h APF (30 h after formation upral) na papierową chusteczkę i osusz zewnętrzną powierzchnię poczwarki przez 5 min.
  2. Umieść kawałek taśmy dwustronnej na szklanym szkiełku. Ostrożnie przymocuj wysuszone poczwarki do lepkiej powierzchni taśmy stroną grzbietową skierowaną do góry. Delikatnie dociśnij poczwarki szczoteczką, aby brzuszna strona poczwarki dobrze przylegała do taśmy (Rysunek 3A). Nie uszkadzaj poczwarki.
  3. Użyj kleszczy, aby usunąć brązową kopertę poczwarki pokrywającą grzbietową stronę głowy (Rysunek 3A,B). Włóż jedną ostrą końcówkę kleszczy między brązową kopertę poczwarki a poczwarkę od strony bocznej i ostrożnie przełam brązową kopertę poczwarki przez linię do tylnego końca poczwarki (Rysunek 3B,C). Otwórz brązową skrzynkę poczwarki. Użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać poczwarkę i przenieść do dołka preparacyjnego z 1 ml natlenionego pełnego podłoża. Zanurz pływającą poczwarkę na średniej powierzchni, aby pomóc jej opaść na dno studni (Rysunek 3D).
    UWAGA: Nie wkładaj końcówki kleszczy zbyt głęboko do brązowego etui na poczwarkę, aby zapobiec zranieniu poczwarki kleszczami.
  4. Aby wypreparować eksplantat czułkowo-mózgowy z poczwarki, użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać poczwarkę jedną ręką, a drugą ręką użyj mikronożyczek, aby wyciąć mały otwór z tylnej strony poczwarki (Rysunek 3E). Ten mały otwór uwalnia wysokie ciśnienie wewnątrz poczwarki.
  5. Przetnij brzuszną linię środkową poczwarki od otworu do szyi (wąskiej struktury łączącej głowę i klatkę piersiową) za pomocą mikronożyczek (Ryc. 3F). Następnie przeciąć obwód szyi, aby odłączyć głowę od ciała poczwarki (Ryc. 3G). Wyjmij ciało i umieść je w innym dołku.
    UWAGA: Nie przecinaj szyi bezpośrednio od grzbietowej/brzusznej strony poczwarki, która może ścisnąć mózg.
  6. Wytnij przezroczysty naskórek, który pokrywa grzbietową stronę mózgu (Ryc. 3H). Spowoduje to odsłonięcie ciała tłuszczowego na szczycie mózgu. Zachowaj trochę naskórka, do którego przyczepia się siatkówka i czułki. Powtórz tę samą procedurę dla brzusznej strony mózgu.
    UWAGA: Nie wkładaj ostrza nożyczek zbyt głęboko pod naskórek, ponieważ spowoduje to przecięcie nerwów czułkowych łączących czułki z mózgiem (Rysunek 3H').
  7. Użyj pipety P10, aby delikatnie wypłukać tłuszcz pokrywający mózg i czułki, pipetując pożywkę w kierunku otwartych obszarów po grzbietowej i brzusznej stronie głowy (Rysunek 3I).
    UWAGA: Podczas pipetowania pożywki należy zachować ostrożność, ponieważ mózg można łatwo oderwać od naskórka. Upewnij się, że cała tkanka tłuszczowa została usunięta podczas tego kroku. Zahamowanie rozwoju aksonów ORN obserwowano, gdy ciało tłuszczowe nie było dobrze oczyszczone, prawdopodobnie z powodu słabego dostępu tlenu z pożywki.
  8. Aby zbadać interakcję obustronnych aksonów ORN lub aksonów ORN z celowaniem w dendryty PN, na tym etapie należy przeciąć jeden lub dwa nerwy czułkowe za pomocą mikronożyczek8 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3J). Ostrożnie umieść ostrza nożyczek między naskórkiem a mózgiem i odetnij zainteresowane nerwy czułkowe.
  9. Aby przenieść wypreparowany eksplant na płytkę Sylgard, umieść kroplę natlenionej pełnej pożywki (~200 μL) na powierzchni Sylgarda. Pokryj wewnętrzną powierzchnię końcówki pipety z końcówką o szerokości 200 μl tłuszczowym korpusem z wypreparowanego pnia (krok 1.6), kilkakrotnie pipetując tłuszczową masę, co zapobiegnie przyklejaniu się eksplantatów do końcówki pipety podczas przenoszenia. Następnie użyj tej końcówki do pipety z szeroką końcówką, aby przenieść eksplant ze studzienki rozwarstwiającej do pożywki kropelki na płytce hodowlanej (Rysunek 3K).
  10. Użyj kleszczy, aby przypiąć eksplant do warstwy Sylgard w dwóch płatach wzrokowych (Rysunek 3L). Ostrożnie umieścić płytkę Sylgard na stacji obrazowania i unieruchomić płytkę za pomocą taśm. Powoli dodać 10 ml natlenionej pożywki do płytki Sylgard za pomocą pipety P1000.
    UWAGA: Unikaj przerywania eksplantatu podczas dodawania pożywki do płytki Sylgard.

3. Obrazowanie na żywo oparte na mikroskopii dwufotonowej

  1. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe, użyj mikroskopu dwufotonowego, lasera Ti:Sapphire, obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (1,0 NA) i oprogramowania do obrazowania. Użyj długości fali wzbudzenia przy 920 nm do obrazowania białek GFP. Dostosuj czas zatrzymania piksela na 10 μs.
  2. Dostosuj położenie stacji obrazowania tak, aby eksplantaty znajdowały się mniej więcej pod obiektywem. Użyj 70% etanolu do sterylizacji soczewki przed obrazowaniem. Powoli opuść obiektyw pod podłożem w pobliżu eksplantatów. Sprawdź, czy na soczewce obiektywu nie ma pęcherzyków.
    1. Jeśli tak, podnieś obiektyw nad medium i powtarzaj to, aż bańka zniknie. Znajdź eksplantaty za pomocą okularu i wyśrodkuj jeden eksplantat na polu.
  3. Aby zapewnić eksplant z kilkoma ORN słabo oznakowanymi do obrazowania poklatkowego, za każdym razem rozetnij ~10 eksplantatów i wyrównaj na osi y na płytce hodowlanej. Przesiewaj wszystkie eksplantaty, przesuwając obiektyw wzdłuż osi y i wybierz eksplantat, w którym kilka pojedynczych aksonów ORN właśnie dotarło do płata anteny do obrazowania (Rysunek 4A).
    1. Rozpoznaj płat anteny po jego owalnym kształcie i aksonach ORN, które zaczynają go okrążać. Zobrazuj obszar ~150 μm x 150 μm w płaszczyźnie xy (3-krotny zoom z obiektywem 20x). Oszacuj granicę dwóch płatów antenowych i wyśrodkuj je w obszarze obrazowania.
  4. Wybierz początkowy obszar obrazowania wzdłuż osi z, definiując dolną i górną sekcję skanowania. Ustaw obszar obrazowania wzdłuż osi z. Ustaw najgłębszy odcinek z sygnałami aksonów ORN jako pierwszą sesję obrazowania, a sesję 100 μm powyżej (bardziej powierzchowna strona) jako ostatnią sesję obrazowania (Rysunek 4B).
    UWAGA: Pozostawia to niektóre sekcje na górze (powierzchownej) aksonów ORN i pozwala uniknąć przesuwania aksonów ORN w górę poza obszar obrazowania z powodu wzrostu mózgu podczas hodowli.
    1. Obraz w odstępach co 2 μm. Ustaw automatyczne skanowanie obrazowe z częstotliwością co 20 minut za pomocą oprogramowania do obrazowania.
  5. Przesuń obszar obrazowania o 20 μm w górę wzdłuż osi z po pierwszych 4 godzinach obrazowania i kolejne 20 μm w górę wzdłuż osi z po 16 godzinach obrazowania. Można to osiągnąć, ustawiając skrypt i różne stosy z w oprogramowaniu do obrazowania.
  6. Hodować eksplant przez dodatkowy okres po obrazowaniu (do 24 godzin ex vivo) przed utrwaleniem i barwieniem N-kadheryną, markerem neuropilowym, w celu ujawnienia tożsamości genetycznej każdego pojedynczego ORN przez kłębuszki nerkowe, do których jest skierowany.

4. Przetwarzanie obrazu

  1. Aby przetworzyć obrazy stosu z serii sekcji wykonanych w każdym punkcie czasowym za pomocą oprogramowania Fiji, otwórz serię sekcji obrazu, kliknij Obraz | Stosy | Z projekt [/].
  2. Aby skorygować boczny dryf próbki podczas hodowli, zainstaluj wtyczkę TurboReg na Fidżi.
    1. Otwórz serię obrazów stosu z i pojedynczy obraz stosu z z serii. Otwórz wtyczki | Rejestracja | TurboReg.
    2. Wybierz serię obrazów stosu z w polu Źródło i pojedynczy obraz stosu z w obszarze Cel | Tłumaczenie. Kliknij przycisk Partia, aby zarejestrować wszystkie obrazy z otwartej serii obrazów stosu z.
  3. Aby zmaksymalizować użyteczność obrazowanych próbek, oddziel słabo oznaczone pojedyncze aksony znajdujące się w pobliżu siebie od obrazów stosu z następujących po sekcjach obrazu 3D.
    1. Aby wyodrębnić pojedyncze aksony ORN z kilku aksonów na tym samym obrazie, otwórz serię sekcji obrazów, kliknij Wtyczki | Segmentacja | Edytor segmentacji [/]. Wybierz narzędzie pędzla i zamaskuj zainteresowany akson ORN w oknie roboczym Edytora Segmentacji za pomocą przycisków Wybierz "+" lub "-" na każdej sekcji obrazu.
    2. Kliknij Proces | Kalkulator obrazów [/]. Wybierz "Obraz X" na rysunku 1, "Mnożenie" w operacji, "Obraz X. etykiety" na obrazie 2, [/]. Spowoduje to wygenerowanie nowego pliku serii obrazów tylko z zainteresowanym aksonem. Wykonaj krok 4.1, aby przetworzyć obraz stosu z. Powtórz ten krok dla wszystkich punktów czasu, aby wygenerować plik obrazu szeregów czasowych.
  4. Aby pseudokolorować różne aksony z tego samego obrazu, najpierw wykonaj krok 4.3 w celu wygenerowania pliku obrazu szeregów czasowych dla każdego aksonu osobno. Otwórz pliki obrazów szeregów czasowych dla różnych pojedynczych aksonów z tego samego obrazu danych pierwotnych. Kliknij na Obrazek | Kolor | Scalanie kanałów. Wybierz różne pliki obrazów szeregów czasowych w różnych kanałach kolorów i kliknij przycisk OK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aksony ORN docierają do płata antennego między 18 h a 36 h APF. Następnie nawigują przez płat antenny, przekraczają linię środkową i unerwiają kłębuszki. Wideo 1 jest reprezentatywnym nagraniem pokazującym cały ten proces dla kilku indywidualnie identyfikowalnych aksonów, zarejestrowanym z częstotliwością co 20 min przez 24 h. Przed rejestracją za pomocą TurboReg aksony wykazują pewien dryft boczny w miarę rozwoju mózgu (pierwsza połowa filmu). Po rejestracji dryft zostaje skorygowany (druga połowa filmu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Eksplant czułkowo-mózgowy Drosophila zachowuje normalne ukierunkowanie obwodu węchowego. Zauważyliśmy, że rozwój jest 2 razy wolniejszy ex vivo w porównaniu do in vivo. Należy zauważyć, że system eksplantacyjny nie zachowuje palpa szczęki, w którym znajduje się sześć typów ORN. Aby zapewnić rekapitulację normalnego rozwoju ex vivo, należy unikać rozciągania nerwów czułkowych podczas sekcji eksplantacji. Podczas hodowli ex vivo rozwój bakterii zwykle powoduje zahamowanie rozwoj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy N. Özelowi i R. Hiesingerowi za ich rady dotyczące hodowli eksplantatów; M. Wagnerowi za pomoc techniczną w mikroskopii dwufotonowej; D.J. Luginbuhlowi za generowanie transgenicznych much; D. Friedmannowi za sugestie dotyczące analizy oprogramowania Fidżi; Y. Ge za pomoc w pracy w locie; C. McLaughlin i K.K.L. Wong za komentarze do manuskryptu. L.L. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health 1K99DC01883001 (dla T.L.) i R01-DC005982 (dla L.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20-hydroksyekdyzonSigmaH5142
Chameleon Ti: Szafirowy laserKoherentna koherentnaMRU X1
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific10082147
Insulina ludzkaThermo Fisher Scientific12585014
Oprogramowanie do obrazowaniaPrairie
Micro ScissorsWorld Precision Instruments501778
Minutien PinsFine Science Tools26002-10
Butla tlenowaPraxairOX M-E
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
Schneider' s Drosophila MediumThermo Fisher Scientific21720024
SYLGARD 184 Elastomer silikonowyThermo Fisher ScientificNC0162601
Mikroskopia dwufotonowaObiektyw zanurzeniowy w wodzie Bruker
(20X)Zeiss421452-9800-000

Bibliografia

  1. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).
  2. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  3. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  4. Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
  5. Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).
  6. Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
  7. Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721(2015).
  8. Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
  9. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  10. Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
  11. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  12. Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
  13. Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).
  14. Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System eksplant w Drosophilaeksplant czu ek i m zguneurony receptorowe w choweneurony projekcyjnemikroskopia dwufotonowakierowanie akson wtechnika mikrosekcjimapowanie k bk w

Powiązane artykuły