Artykuł metodologiczny

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

DOI:

10.3791/62985

⸱

16 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drogi oddechowe są w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym i wymagają precyzyjnie regulowanego układu odpornościowego, aby zapewnić ochronę, jednocześnie tłumiąc niepożądane reakcje na antygeny środowiskowe. W płucach znajduje się kilka populacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które zapewniają nadzór immunologiczny, ale także pośredniczą w ochronnych odpowiedziach immunologicznych. Komórki te, które utrzymują zdrowy płucny układ odpornościowy w równowadze, uczestniczą również w kilku stanach patologicznych, takich jak astma, infekcje, choroby autoimmunologiczne i rak. Selektywna ekspresja białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych zapewnia komórkom odpornościowym płuc unikalne właściwości immunofenotypowe. W związku z tym cytometria przepływowa odgrywa zasadniczą rolę w identyfikacji takich populacji komórek w stanie stacjonarnym i patologicznym. W artykule przedstawiono protokół, który opisuje spójną i powtarzalną metodę identyfikacji komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy w warunkach stanu stacjonarnego. Jednak protokół ten może być również wykorzystany do identyfikacji zmian w tych populacjach komórek w różnych modelach choroby, aby pomóc w identyfikacji specyficznych dla choroby zmian w krajobrazie immunologicznym płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi układ oddechowy zawiera unikalny układ odpornościowy odpowiedzialny za zwalczanie patogenów i utrzymanie homeostazy immunologicznej. Płucny układ odpornościowy składa się z populacji komórkowych o znacznej niejednorodności fenotypu, funkcji, pochodzenia i lokalizacji. Rezydentne makrofagi pęcherzykowe (AM), pochodzące głównie z monocytów płodowych, znajdują się w świetle pęcherzyków płucnych < klasie sup = "xref">1, podczas gdy makrofagi śródmiąższowe pochodzące ze szpiku kostnego (IM) znajdują się w miąższu płuc < klasie sup = "xref">2. IM mogą być dalej klasyfikowane według wyrażenia CD206. CD206+ IM wypełniają obszar okołooskrzelowy i okołonaczyniowy, podczas gdy CD206- IM znajdują się w śródmiąższu pęcherzykowym3. Ostatnio zaproponowano kilka podklasyfikacji IMs3,4,5,6. Chociaż IM są mniej przebadane niż AM, najnowsze dowody potwierdzają ich kluczową rolę w regulacji układu odpornościowego lung7. Ponadto CD206 jest również wyrażony w alternatywnie aktywowanej klasie AMs8.

Płucne komórki dendrytyczne (DC) to kolejna niejednorodna grupa komórek odpornościowych płuc pod względem ich właściwości funkcjonalnych, lokalizacji i pochodzenia. W płucach opisano cztery podkategorie DC: konwencjonalne DC CD103+ (znane również jako cDC1), konwencjonalne DC CD11b+ (znane również jako cDC2), DC pochodzące z monocytów (MoDCs) i plazmocytoidalne DCs9,10,11,12,13. Pierwsze trzy podklasy można zdefiniować jako główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plazmocytoidalne DC wyrażają MHC II i są pośrednio dodatnie dla CD11c, ale wyrażają wysokie poziomy B220 i PDCA-19,13,16. W płucach nieleczonych myszy DC CD103 i DC CD11b znajdują się w śródmiąższu dróg oddechowych, podczas gdy plazmocytoidalne DC znajdują się w śródmiąższu pęcherzykowym pęcherzykowym 17.

Dwie główne populacje monocytów znajdują się w płucach w stanie równowagi: monocyty klasyczne i monocyty nieklasyczne. Klasyczne monocyty to Ly6C+ i mają kluczowe znaczenie dla początkowej odpowiedzi zapalnej. Natomiast nieklasyczne monocyty to Ly6C- i są powszechnie postrzegane jako komórki przeciwzapalne3,16,18. Niedawno opisano dodatkową populację monocytów CD64 + CD16.2 +, które pochodzą z monocytów Ly6C- i dają początek CD206 + IMs3.

Eozynofile pojawiają się głównie w płucach podczas infekcji robakami pasożytniczymi lub stanów alergicznych. Jednak w miąższu płucnym w stanie stacjonarnym występuje niewielka liczba eozynofili, znanych jako eozynofile rezydentne. W przeciwieństwie do rezydujących eozynofili, zapalne eozynofile znajdują się w śródmiąższu płuc i popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL). W mysich modelach roztoczy kurzu domowego (HDM) zapalne eozynofile są rekrutowane do płuc po stymulacji za pośrednictwem antygenu. Zaproponowano, że rezydujące eozynofile mogą odgrywać rolę regulacyjną w alergii poprzez hamowanie uczulenia T helper 2 (Th2) na HDM19.

W przeciwieństwie do reszty komórek szpiku płuc, neutrofile wyrażają Ly6G, ale nie CD68 i charakteryzują się sygnaturą immunofenotypu CD68-Ly6G+16,20,21. Badania wizualizacyjne wykazały, że w stanie stacjonarnym płuca rezerwują pulę neutrofili w przedziale wewnątrznaczyniowym i są gospodarzami znacznej liczby neutrofili zewnątrznaczyniowych22. Podobnie jak eozynofile, neutrofile nie występują w BAL w stanie stacjonarnym; jednak kilka form stymulacji immunologicznej, takich jak prowokacja LPS, astma lub zapalenie płuc, kieruje neutrofile do światła pęcherzyków płucnych, co skutkuje ich obecnością w BAL21,22,23.

Znaczna liczba komórek CD45+ płuc reprezentuje natural killer (NK), limfocyty T i limfocyty B i jest ujemna dla większości markerów szpikowych24. W płucach naiwnych myszy te trzy typy komórek można zidentyfikować na podstawie ekspresji CD11b i MHC II18. Około 25% komórek CD45+ w płucach to komórki B, podczas gdy odsetek komórek NK jest wyższy w płucach niż w innych tkankach limfoidalnych i nielimfatycznych24,25,26. Wśród limfocytów T płuc znaczną frakcję stanowi CD4-CD8- i odgrywa ważną rolę w infekcjach dróg oddechowych26.

Ponieważ płuca posiadają bardzo złożony i unikalny układ odpornościowy, opracowano i opisano kilka strategii bramkowania do identyfikacji komórek odpornościowych płuc16,18,20,27. Opisana w niniejszym dokumencie strategia bramkowania zapewnia kompleksowy i powtarzalny sposób identyfikacji do 12 różnych pulmonoidowych i nieszpikowych populacji immunologicznych przy użyciu 9 markerów. Do walidacji wyników użyto dodatkowych markerów. Ponadto przedstawiono szczegółową metodę przygotowania zawiesiny jednokomórkowej, która minimalizuje śmierć komórki i umożliwia identyfikację najbardziej kompletnego profilu przedziału komórek odpornościowych w płucach. Należy zauważyć, że identyfikacja nieimmunologicznych komórek płuc, takich jak komórki nabłonkowe (CD45-CD326+CD31-), komórki śródbłonka (CD45-CD326-CD31+) i fibroblasty wymagają innego podejścia28,29. Identyfikacja takich populacji nie jest zawarta w opisanym tu protokole i metodzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania i eksperymenty opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Beth Israel Deaconess Medical Center. Do opracowania tego protokołu wykorzystano myszy C57BL / 6 obu płci w wieku od sześciu do dziesięciu tygodni.

1. Wycięcie chirurgiczne i przygotowanie tkanek

  1. Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1 ml tribromoetanolu (przygotowanego zgodnie ze standardowym protokołem; Tabela materiałów).
    UWAGA: W badaniach płuc należy unikać uduszenia CO2 , ponieważ może ono spowodować uszkodzenie płuc i zmienić cechy i właściwości komórek odpornościowych płuc. Należy również unikać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ może ono spowodować mechaniczne uszkodzenie płuc.
  2. Przenieś mysz do czystego i przeznaczonego do tego miejsca do operacji chirurgicznej.
  3. Ustabilizuj mysz grzbietową stroną do dołu za pomocą igieł lub taśmy na czterech kończynach. Użyj 70% etanolu do odkażenia skóry w okolicy brzusznej.
  4. Wykonaj nacięcie skóry, od szyi do brzucha. Ostrożnie usuń skórę z okolicy klatki piersiowej.
  5. Ostrożnie usuń mostek i żebra.
  6. Przepłukać płuca, wstrzykując 10 ml zimnego PBS bezpośrednio do prawej komory za pomocą igły 18-21 G, aż płuca staną się całkowicie białe.
  7. Ostrożnie usuń grasicę i serce, nie dotykając płuc.
  8. Delikatnie odłączyć płuca od otaczających tkanek i przenieść je do probówki z zimnym buforem BSA (Tabela 1).
    UWAGA: Należy dołożyć starań, aby usunąć cały sąsiedni tłuszcz z płuc przed dalszym przygotowaniem zawiesiny jednokomórkowej, ponieważ może to zniekształcić odczyty.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

  1. Przenieś płuca na pustą szalkę Petriego i zmiel je dwoma drobnymi skalpelami. Przenieść wszystkie kawałki rozdrobnionego płuca do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Użyć 5 ml buforu wytrawiającego do umycia płytki i dodać ją do 50 ml probówki zawierającej rozdrobnione płuco (Tabela 1).
    UWAGA: Bufor do wytrawiania należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Użyj 5 mg/ml kolagenazy28. Połączenie 1 lub 5 mg kolagenazy z buforem BSA lub PBS bez białka nie poprawiło wyników (rysunek uzupełniający S1).
  2. Zabezpieczyć pokrywę probówki i trawić płuca przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml zimnego buforu BSA.
  3. Po strawieniu użyj igły 18 G, aby wymieszać i rozpuścić kawałki płuc. Umieść sitko filtra o pojemności 70 μm na górze nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Użycie mniejszego filtra mikronowego może spowodować utratę głównych populacji szpiku.
  4. Powoli przenieś strawioną mieszaninę płuc bezpośrednio na sitko. Użyj gumowej strony tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby rozbić pozostałe kawałki płuc na filtrze. Umyj przetworzony materiał na filtrze buforem BSA.
  5. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o masie 350 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy ACK. Dobrze wymieszać za pomocą pipety o pojemności 1 ml i inkubować przez 90 s w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać 10 ml zimnego buforu BSA w celu zatrzymania reakcji i odwirować przy 350 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze barwiącym w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru.
  8. Zawiesić komórki w stężeniu 5 × 106 komórek/ml i użyć ich do barwienia powierzchni (patrz punkt 3).
    UWAGA: W tym celu umieść komórki w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem, a następnie wytnij przeciwciała i przepłucz. Jeśli wirówka płytkowa nie jest dostępna, zamiast płytek należy użyć probówek przepływowych. Dzięki temu protokołowi od 6-10-tygodniowej myszy C57BL/6 średniej wielkości można uzyskać ~15-20 × 10 6 komórek na płuco.

3. Powierzchniowe barwienie przeciwciał

  1. Przenieś 1 × 106 komórek w 200 μl na studzienkę na płytkę 96-dołkową. Odwirować płytkę o masie 350 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie należy przygotować roztwór bloku Fc, rozcieńczając przeciwciało anty-16/32 (1:100) w buforze barwiącym (Tabela 1).
  2. Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego roztworu blokującego Fc (tabela materiałów) i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
  3. Dodać 150 μl buforu barwiącego i odwirować płytkę o stężeniu 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W międzyczasie przygotuj koktajl przeciwciał powierzchniowych, rozcieńczając przeciwciała powierzchniowe (1:100; Tabela 2) w buforze do barwienia.
    UWAGA: (i) Przeciwciało anty-16/32 do blokowania Fc może być stosowane z przeciwciałami powierzchniowymi w tej samej mieszaninie. (ii) Jeśli używany jest barwnik utrwalający żywotność, dodać go do powierzchniowego koktajlu przeciwciał w rozcieńczeniu 1:1,000.
  4. Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego powierzchniowego koktajlu przeciwciał i inkubować przez 30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Dwukrotnie umyj komórki buforem barwiącym.
    UWAGA: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, ponownie zawieś komórki w 200 μl buforu barwiącego i przystąp bezpośrednio do pozyskiwania danych na cytometrze przepływowym. Alternatywnie, ogniwa mogą być utrwalone i przechowywane w temperaturze 4 °C w celu późniejszego pobrania. Zalecamy użycie komórek do cytometrii przepływowej w ciągu 24 godzin.

4. Utrwalanie komórek i barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Przygotować bufor do utrwalania/permeabilizacji (bufor do utrwalania/trwałej ondulacji) mieszając trzy części koncentratu do utrwalania/permeabilizacji i 1 część rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności zestawu barwiących FoxP3/czynnik transkrypcyjny (Tabela 1).
  2. Zawiesić komórki w 50 μl wstępnie przygotowanego buforu Fix/Perm na basenik płytki 96-dołkowej, na której komórki zostały posiane zgodnie z opisem w sekcji 3, i inkubować je przez 20-25 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Rozcieńczyć 10x bufor permeabilizacji w stosunku 1: 10 w oczyszczonej wodzie dejonizowanej, aby przygotować 1x bufor permeabilizacji.
  4. Umyj komórki raz 1x buforem do przepuszczalności. W międzyczasie przygotuj wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała wewnątrzkomórkowe (1:100) w 1 ml buforu permeabilizacji.
  5. Zawiesić komórki, używając 50 μl uprzednio przygotowanego powierzchniowego koktajlu przeciwciał na komórkę 96-dołkowej płytki i inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Umyj komórki raz buforem do permeabilizacji, a raz buforem barwiącym. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego.
    UWAGA: Jeśli cytometr przepływowy z czytnikiem płytek nie jest dostępny, przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
  7. Pobrać co najmniej 1,5 × 106 komórek na próbkę cytometru przepływowego.
    UWAGA: W przypadku pojedynczych kolorów i niebarwionych próbek kontrolnych wystarczy 0,5-1 × 106 komórek na próbkę. Zaleca się mianowanie poszczególnych stosowanych przeciwciał w celu uzyskania optymalnego barwienia i obniżenia kosztów. Niniejszy protokół został zoptymalizowany przy użyciu bufora Fix/Perm przygotowanego przy użyciu zestawu barwiących FoxP3. Ponieważ CD68 jest markerem cytoplazmatycznym, a nie jądrowym, inne roztwory przepuszczalności, takie jak niskie stężenie paraformaldehydu lub zestawy cytofix / cytoperm od różnych dostawców, mogą być wystarczające.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia bramkowania
Pierwszym krokiem naszej strategii bramkowania jest wykluczenie gruzu i dubletów (Rysunek 1A). Staranne wykluczenie dubletów ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia populacji fałszywie dodatnich (rysunek uzupełniający S2). Następnie komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą CD45 +, markera dla komórek krwiotwórczych (Rysunek 1B). Można dodać żywą martwą plamę, aby wykluczyć martwe komórki. Jednak protokół t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja komórek odpornościowych płuc może być trudna ze względu na wiele typów komórek odpornościowych znajdujących się w płucach i ich unikalne cechy immunofenotypowe w porównaniu z ich odpowiednikami znajdującymi się w innych tkankach. W kilku stanach patologicznych w płucach pojawiają się komórki o wyraźnych cechach fenotypowych. Na przykład uszkodzenie płuc wywołane bleomycyną powoduje rekrutację krążących makrofagów pochodzących z monocytów w przestrzeni pęcherzykowej, gdzie mogą one pozostawać nawet przez rok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B. posiada patenty na ścieżkę PD-1 licencjonowane przez Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis i Dako. Autorzy deklarują brak innych konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01CA238263 i R01CA229784 (VAB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tłok strzykawki 10 mlEXELINT26265
18 G igłaBD Precision Glide305165
igły 21 GIgła BD Precision Glide305195
50 ml rurki stożkoweFalcon3520
70 μ m sitko komórkoweThermoFisher22363548
96-dołkowe płytkiFalcon/corning3799
ACK Bufor lizującyThermoFisherA10492-01
anty-mysie CD11bBiolegend101215Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
anty-mysz CD11cBiolegend117339 / 117337Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
anty-mysz CD45Biolegend103115Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
Anty-mysi CD64Biolegend139319Szczegóły w Tabeli 2
Anty-mysie CD68Biolegend137009Szczegóły w Tabeli 2
Anty-mysie GR-1Biolegend108433Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
Anty-mysi Siglec FBiolegend155503Szczegóły w Tabeli 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
CD24Biolegend138503Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
CD3Biolegend100205Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
Wirówka
Kolagenaza typu 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
DNaza IMilipore Sigma10104159001
Etanol
F4/80Biolegend123133Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 2
Surowica bydlęcapłodu R& D Systems
Kleszcze drobno ząbkowaneRoboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoThermoFisher00-5523-00
Bezpieczny skalpel FuturaMerit Medical SystemsSMS210
Żywy/martwy zestaw do usuwania martwych komórek z dalekiego odczytuThermoFisherL34973Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2
MERTKBiolegend151505Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2
MHC-IIBiolegend107621Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2
NK1.1Biolegend108705Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2
Wytrząsarka orbitalnaVWRModel 200
szalka PetriegoFalcon351029
Wirówka stołowa z chłodzeniemSORVAL ST 16R
Małe zakrzywione nożyczkiRoboz Surgical Instrument Co

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowakom rki odporno ciowe p ucidentyfikacja kom rek odporno ciowychkom rki odporno ci wrodzonejzawiesina pojedynczych kom rekstrategia bramkowaniamarkery powierzchniowep ucny uk ad odporno ciowy

Powiązane artykuły