Artykuł metodologiczny

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62992

⸱

13 września 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 2Cryo-Electron Microscopy Research Center, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 3Midwest Center for Cryo-Electron Tomography, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison, 4Department of Chemistry, University of Wisconsin, Madison, 5Morgridge Institute for Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Streszczenie

Tomografia krioelektronowa całych komórek (cryo-ET) to potężna technologia, która jest używana do wytwarzania struktur o rozdzielczości nanometrowej makrocząsteczek obecnych w kontekście komórkowym i zachowanych w stanie zbliżonym do natywnego zamrożonego i uwodnionego. Istnieją jednak wyzwania związane z hodowlą i/lub przyleganiem komórek do siatek TEM w sposób odpowiedni do tomografii przy jednoczesnym zachowaniu komórek w ich stanie fizjologicznym. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący wykorzystania mikrowzorców do kierowania i promowania wzrostu komórek eukariotycznych na siatkach TEM. Podczas mikrowzorcowania wzrost komórek jest kierowany poprzez osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w określonych wzorach i pozycjach na folii siatki TEM, podczas gdy inne obszary pozostają pokryte warstwą przeciwporostową. Elastyczność w doborze powłoki powierzchniowej i projektowania wzoru sprawia, że mikrotworzenie wzorów ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie typów komórek. Mikrowzorce są przydatne do badań struktur w obrębie pojedynczych komórek, a także do bardziej złożonych systemów eksperymentalnych, takich jak interakcje gospodarz-patogen lub zróżnicowane społeczności wielokomórkowe. Mikrowzorce można również zintegrować z wieloma dalszymi procesami pracy cryo-ET dla całych komórek, w tym z korelacyjną mikroskopią świetlną i elektronową (cryo-CLEM) oraz mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB).

Wprowadzenie

Wraz z rozwojem, rozszerzeniem i wszechstronnością mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), naukowcy przebadali szeroki zakres próbek biologicznych w stanie zbliżonym do natywnego od makromolekularnej (~1 nm) do wysokiej (~2 A) rozdzielczości. Techniki krio-EM i dyfrakcji elektronów jednocząsteczkowych najlepiej stosować odpowiednio do oczyszczonych makrocząsteczek w roztworze lub w stanie krystalicznym1,2. Natomiast krioelektronowa tomografia (cryo-ET) jest wyjątkowo przydatna do niemal natywnych badań strukturalnych i ultrastrukturalnych dużych, heterologicznych obiektów, takich jak bakterie, wirusy pleomorficzne i komórki eukariotyczne3. W cryo-ET trójwymiarowe (3D) informacje uzyskuje się poprzez fizyczne przechylenie próbki na stoliku mikroskopu i uzyskanie serii obrazów przez próbkę pod różnymi kątami. Obrazy te, lub serie pochylenia, często obejmują zakres +60/-60 stopni w krokach co jeden do trzech stopni. Seria pochylenia może być następnie obliczeniowo zrekonstruowana w objętość 3D, znaną również jako tomogram4.

Wszystkie techniki krio-EM wymagają, aby próbka była osadzona w cienkiej warstwie amorficznego, niekrystalicznego, szklistego lodu. Jedną z najczęściej stosowanych technik kriofiksacji jest zamrażanie wgłębne, w którym próbka jest nakładana na siatkę EM, osuszana i szybko zanurzana w ciekłym etanie lub mieszaninie ciekłego etanu i propanu. Technika ta jest wystarczająca do witryfikacji próbek o grubości od <100 nm do ~10 μm, w tym hodowanych komórek ludzkich, takich jak HeLa cells5,6. Grubsze próbki, takie jak mini-organoidy lub biopsje tkanek, o grubości do 200 μm, mogą być zeszklone przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem7. Jednak ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów w grubszych próbkach, grubość próbki i lodu dla cryo-ET jest ograniczona do ~0,5 - 1 μm w transmisyjnych mikroskopach elektronowych 300 kV. W związku z tym krio-ET dla całych komórek wielu komórek eukariotycznych jest ograniczony do obrzeży komórek lub przedłużeń komórek, chyba że stosuje się dodatkowe etapy przygotowania próbki, takie jak kriosekcja8 lub mielenie wiązki jonów skupionych9,10,11.

Ograniczeniem wielu eksperymentów z obrazowaniem krio-ET na całych komórkach jest przepustowość zbierania danych12. W przeciwieństwie do krio-EM-pojedynczej cząstki, gdzie tysiące izolowanych cząstek można często obrazować z pojedynczego kwadratu siatki TEM, komórki są duże, rozproszone i muszą być hodowane w wystarczająco niskiej gęstości, aby umożliwić zachowanie komórek w cienkiej warstwie szklistego lodu. Często obszar zainteresowania jest ograniczony do określonej funkcji lub podobszaru komórki. Dodatkowym ograniczeniem przepustowości jest skłonność komórek do wzrostu w obszarach, które nie nadają się do obrazowania TEM, takich jak na paskach siatki TEM lub w ich pobliżu. Ze względu na nieprzewidywalne czynniki związane z hodowlą komórkową na siatkach TEM, konieczne jest osiągnięcie postępu technologicznego w celu poprawy dostępności próbek i przepustowości do pozyskiwania danych.

Mikrowzorzec substratu z przylegającymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest dobrze znaną techniką mikroskopii świetlnej żywych komórek do kierowania wzrostem komórek na sztywnych, trwałych i optycznie przezroczystych powierzchniach, takich jak szkło i inne podłoża do hodowli tkankowych13,14. Mikrowzory zostały również wykonane na miękkich i/lub trójwymiarowych (3D) powierzchniach. Takie techniki pozwoliły nie tylko na precyzyjne pozycjonowanie komórek; Wspierali również tworzenie sieci wielokomórkowych, takich jak wzorzyste obwody komórek nerwowych15. Wprowadzenie mikrowzorców do cryo-ET nie tylko zwiększy przepustowość, ale może również otworzyć nowe badania nad badaniem złożonych i dynamicznych mikrośrodowisk komórkowych.

Ostatnio, kilka grup zaczęło stosować techniki mikrowzorcowania na siatkach TEM za pomocą wielu podejść16,17. W tym miejscu opisano zastosowanie techniki fotomodelowania bez maski dla siatek TEM przy użyciu systemu mikromodelowania Alvéole PRIMO, który charakteryzuje się bezdotykowym wzornictwem o wysokiej rozdzielczości. W tym systemie mikrowzorcowania na wierzch podłoża nakładana jest warstwa przeciwporostowa, a następnie nakładany jest fotokatalizator i ablacja warstwy przeciwporostowej w zdefiniowane przez użytkownika wzory za pomocą lasera UV. Białka ECM można następnie dodać do wzorców dla odpowiedniej hodowli komórkowej. Metoda ta została wykorzystana przez kilka grup do badań krio-ET nabłonka barwnikowego siatkówki-1 (RPE1), nerki psa Madin-Darby-II (MDCKII), ludzkiego fibroblastu napletka (HFF) i linii komórek śródbłonka16,17,18. Ten system mikrowzorów jest kompatybilny z wieloma podłożami warstw przeciwporostowych, a także z płynnym lub żelowym odczynnikiem fotokatalizatora. Można wybierać różne białka ECM i dostosowywać je do specyfiki linii komórkowej, zapewniając użytkownikowi wszechstronność.

Mikrowzorcowanie zostało z powodzeniem zastosowane w wielu projektach w laboratorium19. W tym miejscu przedstawiono protokół mikrowzorców, w tym specyficzne adaptacje do badania hodowanych komórek HeLa, komórek BEAS-2B zakażonych syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) oraz pierwotnych neuronów larwalnych Drosophila melanogaster20.

Protokół

Opisany tutaj protokół jest kompilacją metod hodowli komórkowych, mikrowzorów i obrazowania używanych przez laboratorium Wrighta i Centrum Badawcze Cryo-EM na Uniwersytecie Wisconsin w Madison. Przepływ pracy jest przedstawiony w Rysunek 1. Dodatkowe materiały szkoleniowe i instruktażowe są dostępne na następujących stronach: https://cryoem.wisc.edu lub https://wrightlab.wisc.edu

1. Przygotowanie siatek do tworzenia wzorów

  1. Przenieś siatki TEM na czyste szkiełko podstawowe stroną węglową do góry (standardowa grubość folii węglowej to 12 nm). Za pomocą parownika węglowego ACE600 odparuj 5-8 nm dodatkowego węgla na kratki, aby zwiększyć ogólną trwałość filmu węglowego.
    UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku siatek SiO2. Ten krok można również wykonać z wyprzedzeniem; Powlekane kratki należy przechowywać w środowisku o niskiej wilgotności, takim jak eksykator próżniowy.
  2. Przenieś kratki do uchwytu do przygotowania kratki i rozładowuj żar kratki stroną węglową do góry. Za pomocą systemu rozładowania jarzeniowego rozładowywanie jarzenia przez 60 s przy natężeniu 10 mA przy odległości roboczej 80 mm i podciśnieniu 1,0 x 10-3 mbar. Zrób to w ciągu 15-30 minut od następnego kroku.
    UWAGA: Uchwyty do przygotowania siatki można kupić komercyjnie lub domowej roboty za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej na małej szalce Petriego.

2. Nakładanie warstwy przeciwporostowej

UWAGA: Podczas obchodzenia się z kratkami należy stosować właściwą technikę sterylną, a wszystkie roztwory powinny być sterylne i/lub sterylizowane przez filtr.

  1. Przenieś kratki (stroną węglową do góry) na czyste szkiełko lub szkiełko nakrywkowe z zachowaniem co najmniej 1 cm odstępu między kratkami. Odpipetować 10 μl 0,05% poli-L-lizyny (PLL) na każdą siatkę. Inkubować kratki w wilgotnej komorze, takiej jak dołączone plastikowe pudełko z wilgotnymi ręcznikami papierowymi, przez co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Ten krok można przedłużyć do nocy. Upewnij się, że poziom wilgotności w komorze jest wystarczający, aby zapobiec wysychaniu kratek.
  2. Umyj każdą kratkę trzykrotnie 15 μl 0,1 M HEPES pH 8,5. Przy każdym praniu usuń większość płynu z siatki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia kratki. Dodać 15 μl świeżego buforu, inkubować przez co najmniej 30 s i powtórzyć. Pozostawić każdą siatkę w 15 μl 0,1 M HEPES po końcowym praniu.
    UWAGA: Na tym etapie i w kolejnych krokach ważne jest, aby siatka była mokra i unikała kontaktu pipety z siatką.
  3. Przygotować 10 μl 100 mg/ml glikolu polietylenowego i walerianianu sukcynimidylu (PEG-SVA) w 0,1 M HEPES pH 8,5 dla każdej siatki. PEG-SVA szybko się rozpuszcza po delikatnym zmieszaniu, co daje klarowny roztwór.
    UWAGA: Nie należy wcześniej przygotowywać roztworu PEG-SVA. PEG-SVA ma okres półtrwania wynoszący 10 minut przy pH 8,5. Należy unikać wystawiania półproduktu na nadmierne działanie wilgoci poprzez przechowywanie go w eksykatorze lub suchym środowisku w temperaturze -20 °C i ogrzanie go do temperatury pokojowej przed otwarciem.
  4. Natychmiast po przygotowaniu roztworu PEG-SVA należy usunąć 15 μL kropli HEPES pH 8,5 z każdej siatki (uważając, aby nie wysuszyć siatki) i dodać 10 μL kropli roztworu PEG-SVA. Inkubować kratki w wilgotnej komorze przez co najmniej 1 godz.
    UWAGA: Ten krok można przedłużyć do nocy. Upewnij się, że wilgotność w komorze jest wystarczająca, aby zapobiec wysychaniu kratek.
  5. Umyj każdą kratkę trzykrotnie 15 μl sterylnej wody. Przy każdym praniu usunąć większość płynu z siatki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki, dodać 15 μl świeżej wody, inkubować przez co najmniej 30 s i powtórzyć. Po ostatnim praniu pozostaw każdą kratkę w 15 μl wody.

3. Nakładanie żelu PLPP

  1. Przygotuj czyste szkiełko nakrywkowe mikroskopu dla każdej siatki. Wykonaj następujące kroki dla każdej siatki, po jednej siatce na raz, aby zminimalizować ryzyko wyschnięcia siatki.
  2. Umieść kroplę wody o pojemności 1,0 μl na środku szkiełka nakrywkowego, aby pomóc w umieszczeniu siatki na szkiełku nakrywkowym i utrzymaniu mokrej siatki. Ostrożnie przenieś siatkę z kropli wody o pojemności 15 μl do kropli wody o pojemności 1,0 μl na szkiełku nakrywkowym. Pamiętaj, aby umieścić siatkę stroną z włókna węglowego do góry.
  3. Ostrożnie umieść szablon z polidimetylosiloksanu (PDMS) na siatce, uważając, aby siatka była wyśrodkowana i zminimalizować kontakt szablonu z folią węglową siatki.
  4. Dodać 1,0 μl żelu chlorku 4-benzoilobenzylotrimetyloamoniowego (PLPP) na siatkę. Delikatnie odpipetować do wymieszania (nie dotykać siatki końcówką pipety).
  5. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatką w ciemne miejsce do wyschnięcia. Żel wyschnie w około 15-30 minut.

4. Kalibracja i projektowanie mikrowzoru

  1. Pokoloruj jedną stronę szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą zakreślacza. Dodaj czarne linie z markera permanentnego z cienką końcówką, aby ułatwić ustawianie ostrości. Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie tak, aby kolorowa strona była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Korzystając z trybu jasnego pola, skoncentruj się na zakreślaczu.
  2. Upewnij się, że mikroskop i system mikrowzorów są włączone i ustawiona jest prawidłowa ścieżka światła. Otwórz Micromanager i oprogramowanie Leonardo (Wtyczki > Leonardo) na komputerze mikroskopu.
  3. Wybierz opcję kalibracji i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby obraz rzutowany na szkiełko był ostry. Może być konieczne skrócenie czasu ekspozycji. Po kalibracji wybierz opcję Wzorzec teraz.
  4. Zapisz stosunek mikrometr/piksel (μm/px) podany pod danymi kalibracyjnymi w lewym górnym oknie programu (Rysunek 2, obszar 1). Użyj tego współczynnika, aby określić liczbę pikseli, które mają być używane na mikrometr podczas projektowania wzoru.
  5. Po kalibracji upewnij się, że oprogramowanie jest teraz otwarte z widokiem jasnego pola na żywo z mikroskopu. Załaduj przygotowaną siatkę na szkiełko nakrywkowe (sekcja 3) na stolik tak, aby siatka była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Ustaw stół montażowy i dostosuj ostrość tak, aby siatka była widoczna w oknie oprogramowania.
  6. Zmierz rozmiar kwadratów siatki i pasków siatki w mikrometrach. Oprogramowanie zawiera linijkę aktywowaną przyciskiem w lewym dolnym rogu do pomiaru siatki ( Rysunek 2, obszar 2). Na przykład wzory użyte tutaj dla siatki 200 odpowiadają kwadratom siatki ~87 × 87 μm i paskom siatki ~36 μm.
    UWAGA: Oprogramowanie oferuje elastyczność w zmianie rozmiaru wzorów w locie, dzięki czemu drobne niedokładności w pomiarze mogą być tolerowane.
  7. Na podstawie powyższych pomiarów i proporcji utwórz wzory za pomocą dowolnego oprogramowania do tworzenia obrazów. Minimalny rozmiar obiektu przy obiektywie 20× wynosi 1,2 μm. Wzorce powinny być zapisywane jako nieskompresowane 8-bitowe pliki .tiff.
    1. Upewnij się, że oprogramowanie nie skaluje obrazów do innego rozmiaru piksela podczas zapisywania. Wzór powinien zmieścić się w polu o wymiarach od 800 × 800 pikseli, wystarczającym do pokrycia czterech kwadratów siatki.
      UWAGA: Piksele o wartości 255 (biały) zostaną wymodelowane z największą intensywnością (całkowita dawka lasera), a piksele o wartości zero () nie zostaną wymodelowane. Wszystkie piksele o wartości pośredniej zostaną oznaczone wzorem dawki około (X/255)*dawki całkowitej. W Rysunek 3A, wartości pikseli 255 i 129 zostały użyte dla wzorów w skali szarości. Po zaprojektowaniu wzoru można go zapisać i ponownie wykorzystać bez modyfikacji.

5. Mikrowzory

  1. Po kalibracji upewnij się, że oprogramowanie jest teraz otwarte z widokiem jasnego pola na żywo z mikroskopu. Załaduj przygotowaną siatkę na szkiełko nakrywkowe (sekcja 3) na stolik tak, aby siatka była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Ustaw stolik montażowy i dostosuj ostrość, aby zobaczyć siatkę w oprogramowaniu.
  2. Na początku zaprojektuj nowy szablon. W oprogramowaniu wybierz Dodaj ROI (nie pokazano, w lokalizacji Rysunek 2 obszar 3) i wybierz okrąg o wielkości 3,000 μm. Ustaw okrągły zwrot z inwestycji nad siatką, korzystając z obrazu w jasnym polu na ekranie jako przewodnika. Naciśnij kłódkę, aby zabezpieczyć zwrot z inwestycji.
  3. Po zablokowaniu zwrotu z inwestycji w miejscu wybierz Dodaj wzorzec (nie pokazano, w lokalizacji Rysunek 2 obszar 3). Wybierz wzór zaprojektowany w sekcji 4. Podziel siatkę na sześć regionów, aby umożliwić niezależne ustawianie ostrości i pozycjonowanie w każdym regionie, aby uwzględnić nierówne siatki. Kwadratowy obszar siatki o wymiarach od 8 × 8 do 8 dla każdego rogu siatki oraz kwadratowy region siatki o wymiarach od 2 × 8 po każdej stronie środka, pozostawiając cztery kwadraty siatki bez wzoru (Rysunek 2, środkowy obraz).
  4. Użyj opcji replikacji (Rysunek 2, obszar 4), aby wygenerować kopie początkowego wzorca, aby osiągnąć żądaną liczbę całkowitych kopii wzorca. W razie potrzeby dostosuj odstępy między kopiami, aby dopasować je do odstępów między kwadratami siatki.
  5. Ustaw dawkę całkowitą dla wzorca. 30 mJ/mm2 to dobry punkt wyjścia. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.
  6. W obszarze Opcje eksperckie (Rysunek 2, obszar 4) dostosuj kąt obszaru tak, aby pasował do kąta kwadratów siatki. Położenie regionów można zmieniać za pomocą myszy. Proporcje (rozmiar) wzorów można również dostosować. Iteruj po dostosowaniu kąta, położenia, odstępu między i proporcji wzoru, aż wzorce zrównają się z kwadratami siatki. Przesuń stolik mikroskopu, aby zmienić obszar siatki na wyświetlaczu jasnego pola na żywo.
  7. Naciśnij przycisk Zablokuj, aby zapisać zmiany wprowadzone w regionie.
  8. Aby skopiować region, kliknij przycisk Duplikuj (Rysunek 2, obszar 5, ikona dwóch arkuszy papieru) obok jego nazwy w panelu Operacje po lewej stronie. Aby zmienić położenie, nazwę lub edytować kopię, kliknij jej nazwę w panelu Sterowanie.
  9. W razie potrzeby powtórz kroki 5.4-5.9, aby wypełnić wszystkie żądane obszary.
  10. Po zaprojektowaniu i umieszczeniu kompletnego szablonu zapisz plik szablonu w oprogramowaniu (Rysunek 2, obszar 6, pasek z ikoną strzałki w górę na górnym pasku narzędzi).
  11. Podczas wczytywania wcześniej zapisanego szablonu (pasek z ikoną strzałki w dół) wyśrodkuj ROI nad siatką i naciśnij Zablokuj. Kliknij każdy region w panelu sterowania, aby zmienić plik kąta, położenia, dawki i/lub wzoru.
  12. Po umieszczeniu szablonu i wzorów odznacz wszystkie regiony oprócz jednego w Panelu sterowania w oprogramowaniu.
  13. Użyj stolika mikroskopu, aby przejść do tego obszaru i skup się na folii węglowej. Kliknięcie ikony gałki ocznej w panelu Operacja (Rysunek 2, obszar 5) spowoduje włączenie lub wyłączenie wyświetlania nakładki wzoru.
  14. Gdy siatka jest ostra, zamknij migawkę jasnego pola i naciśnij ikonę Odtwórz w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć proces tworzenia wzorów, który można monitorować na żywo.
  15. Na panelu sterowania zaznacz pole wyboru następnego regionu. Otwórz migawkę w jasnym polu tak, aby siatka była widoczna, i wyśrodkuj ten obszar za pomocą stolika mikroskopu. Powtórz kroki 5.13-5.14 dla każdego regionu w Panelu sterowania.
  16. Zdjąć szkiełko nakrywkowe z siatką z mikroskopu i natychmiast odpipetować 10 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na siatkę.
  17. Po 10 minutach usuń szablon pęsetą, a następnie umyj siatkę 3x 15 μL PBS. Po ostatnim umyciu umieść każdą kratkę w 15 μl PBS i przenieś kratki w ciemne miejsce.

6. Osadzanie białek ECM

  1. W przypadku hodowanych komórek wykonaj kroki 6.2-6.5; w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila wykonaj kroki 6.6-6.10.
  2. Przygotować co najmniej 15 μl ECM dla każdej siatki. W przypadku komórek BEAS-2B należy przygotować końcowe stężenie 0,01 mg/ml fibronektyny bydlęcej i 0,01 mg/ml fibrynogenu sprzężonego z fluoroforem w sterylnym PBS. W przypadku komórek HeLa należy przygotować 0,01 mg/ml kolagenu bydlęcego I i 0,1 mg/ml fibrynogenu sprzężonego z fluoroforem w sterylnym PBS.
  3. Usunąć większość PBS z każdej siatki i nałożyć 15 μl ECM. Inkubować siatkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h.
    UWAGA: Ten etap może zostać przedłużony do nocy w temperaturze 4 °C.
  4. Po inkubacji w ECM umyć każdą siatkę 5x sterylnym PBS. Przy każdym praniu usuń większość płynu pipetą, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki, dodaj 15 μl świeżego PBS, inkubuj przez co najmniej 30 s i powtórz. Pozostaw każdą siatkę w PBS po ostatnim praniu.
    UWAGA: Kratki mogą być przechowywane do tygodnia w PBS w temperaturze 4 °C bez obserwowanego pogorszenia jakości.
  5. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć fluorofor w ECM, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostała nienaruszona. Kilka połamanych kwadratów jest ogólnie tolerowanych.
  6. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila przenieś wzorzyste siatki do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 30 mm zawierającego sterylny PBS.
  7. Odessać PBS z naczynia i nałożyć 2 ml 0,5 mg/ml sprzężonej z fluoroforem konkanawaliny A. Inkubować przez noc w temperaturze 25 °C w sterylnym środowisku.
  8. Usuń roztwór konkanawaliny A z naczynia (bez suszenia kratek) i umyj kratki 3x PBS. Do każdego prania dodawaj i usuwaj 2 ml PBS z naczynia.
  9. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć fluorofor w ECM, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostała nienaruszona. Kilka połamanych kwadratów jest ogólnie tolerowanych.
  10. Po ostatnim umyciu wyjmij PBS z naczynia ze szklanym dnem i dodaj 2 ml świeżo przygotowanej, sterylnie przefiltrowanej, uzupełnionej Schneider's Drosophila media21, zawierającej 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml insuliny, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Inkubować w temperaturze 25 °C w sterylnym środowisku, aż neurony będą gotowe do poszczepienia.

7. Przygotowanie pierwotnych komórek Drosophila przed siewem

  1. Wysterylizuj naczynie do rozwarstwiania o średnicy 55 mm z 70% EtOH, a następnie dodaj do naczynia 2-3 ml sterylnie przefiltrowanego 1× soli fizjologicznej (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH2PO4, 0,22 mM KH2PO4, 3,3 mM glukozy, 43,8 mM sacharozy)21.
  2. Delikatnie wybierz 30-40 larw w trzecim stadium rozwojowym z pożywienia za pomocą pęsety.
  3. Umieścić larwy w probówce z 1× PBS, a następnie przenieść je do drugiej probówki z 1× PBS, aby umyć larwy.
  4. Przenieś larwy do probówki z 70% EtOH, aby zmyć PBS, a następnie przenieś je do drugiej probówki z 70% EtOH. Pozostaw larwy w drugiej probówce na 2-3 minuty, aby wysterylizować larwy.
  5. Przenieś larwy do probówki z 1× soli fizjologicznej, a następnie natychmiast przenieś je do drugiej probówki z solą fizjologiczną o
    6. stężeniu 1×.
  6. Przenieść pojedyncze larwy na naczynie preparacyjne zawierające 1× soli fizjologicznej. Za pomocą kleszczy i mikroskopu preparacyjnego szybko rozerwij każdą larwę, aby wydobyć mózg i przenieś go do trzeciej probówki z 1× soli fizjologicznej. Powtarzaj, aż wszystkie mózgi zostaną wyekstrahowane.
  7. Odwirować probówkę zawierającą mózgi o masie 300 x g przez 1 minutę.
  8. Odrzucić supernatant i przemyć 1 ml soli fizjologicznej z rozwarstwienia 1× i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  9. Odrzucić supernatant do momentu, aż w probówce pozostanie 200-250 μl i dodać 20 μl 2,5 mg/ml liberazy do 1x sól fizjologiczna.
  10. Obracać probówkę na rotatorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; w ciągu tej godziny pipetować roztwór 25-30 razy co 10 minut. Pod koniec roztwór powinien być lekko nieprzezroczysty.
  11. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
  12. Odrzucić sklarowany osad, a następnie dodać 1 ml uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30 razy, aby wymieszać.
  13. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
  14. Odrzucić supernatant i przemyć osad komórkowy, dodając 1 ml uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30 razy, aby wymieszać.
  15. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
  16. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy z 300 μl uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30-40 razy, aby wymieszać.

8. Hodowla i zakażenie RSV komórek BEAS-2B i HeLa

  1. Utrzymywać komórki HeLa i komórki BEAS-2B w kolbach T75 w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Komórki pasażowe co 3-4 dni osiągają około 80% konfluencji. Utrzymuj komórki HeLa w DMEM + 10% FBS + 1× antybiotyk-antybiotyk. Utrzymanie BEAS-2B w RPMI + 10% FBS + 1× Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy6,22,23.
  2. Aby uzyskać informacje na temat wysiewu niezainfekowanych komórek, przejdź do sekcji 9. Komórki BEAS-2B i HeLa są podatne na zakażenie RSV; Komórki BEAS-2B wykorzystano we wszystkich eksperymentach z udziałem RSV pokazanych tutaj.
    UWAGA: Wszystkie kroki BSL-2 należy wykonać zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, używając odpowiedniej szafki bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i środków ochrony osobistej (PPE).
  3. Przed zakażeniem komórek RSV należy przejść od 5 ×10 4 komórek na studzienkę do płytki 6-dołkowej (powierzchnia ~ 9,6 cm2) z 2 ml pożywki wzrostowej i inkubować przez noc.
  4. Trypsynizuj i policz jedną studzienkę komórek. Aby dokonać trypsynizacji, odessać pożywkę z jednego dołka i przemyć 2 ml sterylnego PBS bez Mg2+ i Ca2+ w celu usunięcia resztek pożywki. Dodać 500 μl 0,25% roztworu trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min. Okresowo sprawdzaj komórki, aby zobaczyć, czy zostały uwolnione z powierzchni. Po uwolnieniu komórek dodaj 1,5 ml pożywki hodowlanej.
  5. Wymieszaj 100 μl komórek trypsynizowanych ze 100 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl rozcieńczonych komórek do hemocytometru. Policz komórki i oblicz liczbę komórek na studzienkę. Użyj tej liczby, aby obliczyć MOI poniżej.
  6. Przygotuj rozcieńczenie RSV-A2mK+24 w pożywce wzrostowej, aby osiągnąć MOI 10 na studzienkę w 750 μl pożywki. MOI RSV-A2mK+ można obliczyć na podstawie miana fluorescencyjnych jednostek ogniskowych (FFU) w zbiorniku podstawowym (na przykład: dla 1,0 × 105 komórek na studzienkę i zapasu RSV 1,0 ×10 8 FFU/ml, rozcieńczyć zapas wirusa 1:75 do 1 × 106 FFU/750 μL lub 1,33 × 106 FFU/ml).
  7. Odessać pożywkę z komórek w naczyniu 6-dołkowym i dodać 750 μl roztworu wirusa z góry do każdej studzienki.
  8. Kołysz talerzem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  9. Po upływie 1 godziny zwiększyć całkowitą objętość na studzienkę do 2 ml za pomocą pożywki wzrostowej wstępnie podgrzanej do 37 °C i umieścić płytkę w inkubatorze nastawionym na 37 °C z 5% CO2 na 6 godzin.
  10. Trypsynizuj komórki, aby je uwolnić i przystąp do wysiewu, jak opisano poniżej. Po wysianiu należy inkubować kratki przez dodatkowe 18 godzin przed zamrożeniem wgłębnym (łącznie 24 godziny po zakażeniu).

9. Wysiewanie komórek na siatkach z mikrowzorami

  1. W przypadku hodowanych komórek wykonaj kroki 9.2-9.8; w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila postępuj zgodnie z 9.9-9.11.
  2. Trypsynizuj komórki, aby je uwolnić (patrz krok 4 w sekcji 8 powyżej). Aby zmniejszyć agregację komórek, trypsynizuj komórki przy 60% lub mniejszej konfluencji.
  3. Wymieszaj 100 μl komórek trypsynizowanych ze 100 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl rozcieńczonych komórek, wymieszać do hemocytometru i policzyć komórki.
  4. Rozcieńczyć komórki w pożywce do 2 × 104 komórek/ml.
  5. Dodaj 1 μl podłoża na środek naczynia ze szklanym dnem o średnicy 30 mm, aby pomóc w umieszczeniu kratki i zapobiec jej wyschnięciu. Przenieś siatkę z PBS na szkiełku nakrywkowym na środek naczynia ze szklanym dnem. Dodać 10 μl roztworu komórkowego do siatki.
  6. Za pomocą mikroskopu jasnego pola obserwuj przyleganie komórek do siatki po 5 minutach. Jeśli większość wzorów pozostaje niezajęta, dodaj dodatkowe 10 μl kropli roztworu komórkowego. Podczas inkubacji utrzymywać siatki i roztwór komórkowy w temperaturze 37 °C.
  7. Powtarzaj krok 9.6 do momentu, gdy większość wzorców zostanie zajęta lub wiele zajętych wzorców zacznie mieć wiele komórek. Inkubować siatkę przez 2 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
  8. Zalać naczynie 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża i inkubować przez noc (37 °C, 5% CO2 ).
  9. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila usuń pożywkę z naczynia zawierającego siatkę i ułóż komórki na szalce.
  10. Odczekaj 30-60 minut, aż komórki się przyczepią, a następnie dodaj 2 ml uzupełnionej pożywki Schneidera.
  11. Hodować neurony w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez co najmniej 2-3 dni przed zamrożeniem.

10. Obrazowanie i witryfikacja siatek wzorzystych

  1. Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające wzorzystą siatkę i hodowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  2. Uzyskuj obrazy siatki za pomocą jasnego pola i odpowiednich kanałów fluorescencyjnych, aby wykryć wzór i wszelkie inne oznaczenia w komórkach. Upewnij się, że gęstość i położenie komórek są odpowiednie do dalszego obrazowania i analizy.
    UWAGA: Obrazy jasnego pola i fluorescencji zostały przetworzone w pakiecie oprogramowania FIJI25.
  3. Przygotuj zamrażarkę do zamrażania kriogenicznego; rodzaj urządzenia do zamrażania będzie zależał od dostępności, kosztów i funkcji, które są najbardziej odpowiednie dla próbki.
    UWAGA: Pierwotne neurony Drosophila przygotowano na automatycznej zamrażarce wgłębnej, a komórki BEAS-2B przygotowano przy użyciu półautomatycznej zamrażarki wgłębnej.
  4. Nałóż złote fiducials na próbki, aby uzyskać prawidłowe wyrównanie serii pochylenia. Osusz próbki, aby usunąć nadmiar pożywki, a następnie zanurz je w kriogenie, takim jak ciekły etan chłodzony ciekłym azotem. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila osuszaj przez 4 sekundy od tyłu. W przypadku komórek HeLa i BEAS-2B osuszaj z obu stron przez 4-6 sekund. Zamrożone kratki można następnie przechowywać w ciekłym azocie do czasu dalszego wykorzystania.
  5. Obraz zeszklonych komórek w mikroskopie krioelektronowym, pracującym pod napięciem 300 kV z kamerą bezpośredniego detektora elektronów. Skonfiguruj zbieranie serii pochylenia dla każdego regionu zainteresowania za pomocą oprogramowania, takiego jak SerialEM26 do zbierania danych cryo-EM/cryo-ET.
    UWAGA: Serie nachylenia pierwotnych neuronów Drosophila zebrano na bezpośrednim detektorze elektronów od -60° do 60° dwukierunkowo w krokach co 2° przy rozogniskowaniu -8 μm przy rozmiarze piksela 4,628 A, dla całkowitej dawki 70-75 e-/Å2. Serie BEAS-2B zakażone wirusem RSV zebrano na bezpośrednim detektorze elektronów z filtrem energii (szczelina 20 eV) przy rozogniskowaniu -5 μm o rozmiarze piksela 4,603 A i całkowitej dawce ~80 e-/Å 2.
  6. Przetwórz serię pochylenia, aby zrekonstruować tomogramy.
    UWAGA: Prezentowane tutaj tomogramy zostały zrekonstruowane przy użyciu pakietu IMOD27; Filtrowanie dolnoprzepustowe zostało wykonane za pomocą pakietu oprogramowania EMAN228.

Wyniki

Niniejsza procedura została zastosowana do tworzenia wzorów na siatkach EM na potrzeby eksperymentów kryo-ET całych komórek. Cały proces przedstawiony w tej pracy, obejmujący wstępne przygotowanie kultur komórkowych, mikrowzorowanie (Rycina 1) oraz obrazowanie, trwa od 3 do 7 dni. W celu wytworzenia warstwy zapobiegającej niespecyficznemu wiązaniu (anti-fouling) zastosowano dwuetapową procedurę polegającą na naniesieniu PLL na siatkę, a następnie przyłączeniu PEG poprzez dodanie reaktywnego PEG-SVA. Warstwę tę można również nałożyć w jednym kroku, dodając PLL-g-PEG podczas jednej inkubacji. Żel PLPP służy jako katalizator do mikrowzorowania UV, który jest również dostępny w formie mniej skoncentrowanego roztworu. Żel umożliwia tworzenie wzorów przy znacznie mniejszej dawzy w porównaniu z roztworem, co skutkuje znacznie szybszym procesem. Przy zastosowaniu tego systemu rzeczywisty czas wzorowania pełnej siatki TEM wynosił około 2 minut. Sam proces mikrowzorowania zazwyczaj trwa od 5 do 6 godzin i pozwala jednej osobie na przygotowanie ośmiu siatek do standardowej hodowli komórkowej na siatkach TEM.

Wiele etapów procesu mikrowzorowania wymaga długiego czasu inkubacji (patrz kroki 2.1, 2.3, 6.4). Wygodnym rozwiązaniem jest fakt, że niektóre z tych etapów, takie jak pasywacja PLL (2.1) lub pasywacja PEG-SVA (2.3), można przedłużyć do inkubacji nocnej. Dodatkowo, siatki mogą zostać wzorowane z wyprzedzeniem i przechowywane w roztworze białka ECM lub PBS do późniejszego użycia. W naszym badaniu opcje te były wartościowe w przypadkach, gdy czas przygotowania i wysiewu komórek jest krytyczny, np. w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila oraz infekcji wirusem RSV komórek BEAS-2B.

Siatki przygotowano w ogólnym laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), używając czystych narzędzi oraz sterylnych roztworów, a pożywki do hodowli zawierały antybiotyki/środki przeciwgrzybicze6,22,29,30. W przypadku próbek szczególnie wrażliwych na zanieczyszczenia mikrobiologiczne, warstwę antyadhezyjną oraz ECM można nanosić w komorze do hodowli tkanek lub innym sterylnym środowisku. Dodatkowo siatkę można przemyć etanolem pomiędzy etapem wzorowania a aplikacją ECM. W przypadku pracy z czynnikami zakaźnymi należy dostosować procedurę do odpowiednich protokołów bezpieczeństwa biologicznego.

Niniejszy schemat i przedstawione procedury (Rysunek 1) pozwoliły na wysianie komórek HeLa (Rysunek 4), komórek BEAS-2B zainfekowanych RSV (Rysunek 3, Rysunek 5) oraz pierwotnych neuronów larwalnych Drosophila (Rysunek 6, Rysunek 7) na wzorowane siatki EM w celu optymalnego gromadzenia danych cryo-ET.

Komórki HeLa wysiane na mikrowzorcowane siatki TEM pozostają żywe, co potwierdzono poprzez barwienie fluorescencyjne z zastosowaniem testu żywotności komórek opartego na calcein-AM i etydium homodimerze-1 (Rycina 4A,B). Przy zastosowaniu mieszanej ECM z kolagenu i fibrynogenu, komórki HeLa łatwo przylegają do wzorców na całej powierzchni siatki (Rycina 4A,C). Ogólna morfologia komórek rozrastających się wzdłuż wzorca jest podobna do morfologii komórek hodowanych na siatkach bez wzorców (Rycina 4C,D). W przypadku komórek HeLa całkowita grubość komórek pozostaje na poziomie ~< 10 µm, przy czym obszary w pobliżu peryferii komórki są znacznie cieńsze, osiągając grubość ~< 1 µm (Rycina 4E,F).

W badaniach nad RSV cały obszar pól siatki wzorowano przy użyciu gradientu, stosując niską dawkę na krawędziach oraz wzór o wyższej dawce w kierunku centrum (Rysunek 3A). Wzory gradientowe dawały lepsze wyniki podczas poszukiwania uwalnianych wirusów występujących w pobliżu peryferii komórek. Stwierdzono, że przy zastosowaniu tych wzorów komórki preferencyjnie przylegają do wyższych stężeń ECM, ale są również zdolne do przylegania i wzrostu przy niższych stężeniach ECM. W przypadku stosowania wzorów wymagających wielu dawek konieczna będzie optymalizacja względnej dawki między obszarami. Jeśli dawki, a tym samym stężenia ECM, będą zbyt podobne lub zbyt rozbieżne, efekt zastosowania wielu dawek zostanie utracony.

Na Rysunku 3 przedstawiono siatkę TEM, która została poddana wzorcowaniu, a następnie zasiana zakażonymi RSV komórkami BEAS-2B i wykorzystana do zbierania danych cryo-EM. Rysunek 4A przedstawia obraz fluorescencyjny ECM naniosionej na siatkę TEM w formie wzoru gradientowego. Adhezję i wzrost komórek wzdłuż centralnego obszaru wzoru można zobaczyć na Rysunku 3B jako obraz komórek w świetle przechodzącym 18 godzin po zasianiu. Na Rysunku 3C sygnał fluorescencyjny (czerwony) pochodzący z replikacji RSV-A2mK+ jest nałożony na sygnał z ECM. Większość zakażonych komórek znajduje się wzdłuż obszaru centralnego o wyższej gęstości wzoru gradientowego. Mapa TEM siatki przy niskim powiększeniu po kriofiksacji ujawnia szereg komórek, w tym komórki zakażone RSV, rozmieszczone na folii węglowej w pobliżu centrum kwadratów siatki. Jak wykazano wcześniej dla komórek hodowanych na standardowych siatkach TEM22, serie przechyłów zostały zlokalizowane i zebrane dla wirionów RSV w bliskim sąsiedztwie obwodu zakażonych komórek BEAS-2B hodowanych na siatkach mikrowzorowanych (Rysunek 5A,B). W tomogramach można zidentyfikować wiele strukturalnych białek RSV, w tym nukleokapsyd (N) oraz wirusowe białko fuzji (F) (Rysunek 5C, odpowiednio strzałki niebieska i czerwona).

W badaniach nad pierwotnymi neuronami Drosophila stwierdzono, że wąski wzór, bliski granicy rozdzielczości oferowanej przez oprogramowanie (gdzie grubość wzoru wynosiła 2 µm), pozwalał na wyizolowanie od jednej do kilku komórek w obrębie kwadratu siatki (Rycina 6). Soma neuronalna była w stanie rozwijać neuryty w obrębie wzoru przez okres kilku dni. Umożliwiło to łatwą identyfikację i akwizycję serii przechyłów neurytów w porównaniu z neuronami hodowanymi na siatkach bez wzoru (Rycina 7). Stwierdzono również, że znakowana fluorescencyjnie konkanawalina A, lektyna stosowana jako ECM dla hodowli neuronalnych in vitro Drosophila20,21, nadaje się do tworzenia wzorów.

Drosophila neurony z larw trzeciego stadium zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami20,21,31. Preparaty neuronalne naniesiono na mikrowzorowane siatki do cryo-EM, na których w obrębie wzoru naniesiono konkanawalinę A w celu regulacji rozmieszczenia, rozprzestrzeniania się i organizacji komórek. Neurony na siatkach wzorowanych lub niewzorowanych inkubowano przez minimum 48-72 godziny, po czym siatki poddano szybkiemu zamrażaniu (plunge freezing). Reprezentatywny obraz mikrowzorowanej siatki EM z kilkoma neuronami Drosophila rozmieszczonymi w obszarach wzorowanych przedstawiono na Rysunku 6A. Neurony te, pochodzące z transgenicznej linii much z pan-neuronalną ekspresją GFP w błonie, można łatwo śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej nie tylko dzięki znakowaniu fluorescencyjnemu, ale także ze względu na ich lokalizację w obrębie mikrowzorów. Chociaż neurony hodowane na siatkach niewzorowanych również można śledzić za pomocą sygnału GFP w mikroskopii świetlnej (Rysunek 7A, żółte koło), ich lokalizacja w cryo-EM stała się znacznie trudniejsza ze względu na obecność resztek komórkowych i zanieczyszczeń z pożywki (Rysunek 7B, żółte koło). Zjawisko to było mniej nasilone w przypadku neuronów na siatkach wzorowanych, prawdopodobnie dlatego, że PEG w warstwie antyadhezyjnej regionów niewzorowanych odpychał przylegające resztki komórkowe. Ze względu na wymiary ciała komórki neuronu i rozległe neuryty (Rysunek 6A,B, żółte koło), serie przechyłów cryo-ET zbierano wzdłuż cieńszych regionów komórek (Rysunek 6C,D, czerwone koło). Błona komórkowa neuronu, mitochondrium (cyjan), mikrotubule (fioletowy), filamenty aktynowe (niebieski), struktury pęcherzykowe (pomarańczowy i zielony) oraz makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwony), były dobrze widoczne na montażach obrazów o większym powiększeniu oraz w przekrojach przez tomogram 3D (Rysunek 6E). Choć podobne struktury subkomórkowe można zaobserwować w tomogramach 3D neuronów niewzorowanych (Rysunek 7E), trudność w lokalizowaniu żywotnych celów komórkowych do zbierania danych znacznie obniżyła wydajność procesu.

Na Rysunku 8 zestawiono reprezentatywne obrazy z siatek wykazujących niektóre z tych problemów, aby pomóc w ich identyfikacji i rozwiązywaniu. Po ustaleniu optymalnych warunków mikrowzorowanie stanowi niezawodną i powtarzalną metodę pozycjonowania komórek na siatkach do cryo-TEM.

Proces przygotowania siatki: schemat szczegółowo przedstawiający powlekanie węglem, tworzenie mikrowzorów, wysiew komórek oraz kriokolekcję.
Rysunek 1: Ogólny schemat mikrowzorowania dla cryo-EM. Przebieg prac można podzielić umownie na cztery etapy: przygotowanie siatki, mikrowzorowanie, nanoszenie ECM i wysiew komórek oraz kriopreparatyka i zbieranie danych. Główne kroki każdej sekcji są wymienione pod nagłówkami, a przybliżony czas potrzebny na ukończenie każdej sekcji jest podany po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs laserowej mikrofabrykacji, schemat przedstawiający pozycjonowanie wzoru, ustawienia replikacji oraz wprowadzanie parametrów.
Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania z wzorem rozmieszczonym na siatce.Obszar 1 zawiera przelicznik µm/pix dla projektu wzoru. Obszar 2 to linijka do pomiaru siatki. Obszar 3 służy do dodawania lub zmiany wzorów oraz ROI. Obszar 4 zawiera wszystkie informacje dotyczące pozycjonowania wzoru i dawki. Obszar 5 zawiera opcje dla wzorów, w tym przełączanie nakładek, kopiowanie lub usuwanie wzorów oraz wybieranie wzorów do mikrowzorcowania. Obszar 6 służy do zapisywania i wczytywania szablonów. Poniżej przedstawiono powiększone widoki obszarów 4 i 5 dla większej przejrzystości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Siatka obrazów mikroskopowych; analiza intensywności fluorescencji, badanie fotoniczne, charakterystyka widmowa.
Rycina 3: Komórki BEAS-2B zainfekowane RSV na wzorowanej siatce cryo-TEM. (A) Obraz fluorescencyjny wzorowanej siatki po dodaniu fluorescencyjnie znakowanej ECM. Wzór wejściowy przedstawiono w dolnym lewym rogu. (B) Obraz w polu jasnym komórek BEAS-2B hodowanych na siatce z punktu A. (C) Nałożenie obrazu z punktu A (cyjan) i B (szary) z obrazem fluorescencyjnym komórek zainfekowanych RSV (czerwień) bezpośrednio przed szybkim mrożeniem; komórki zainfekowane wykazują ekspresję mKate-2. Paski skali wynoszą 500 µm. (D) Mapa cryo-TEM siatki z punktu B przy niskim powiększeniu po szybkim mrożeniu. Obrazy fluorescencyjne są w pseudokolorach. Paski skali wynoszą 500 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia kultur komórkowych na podłożu z mikrowzorami w porównaniu do podłoża bez wzorów; porównanie fluorescencji, analiza wzrostu strukturalnego.
Rysunek 4: Barwienie Live/Dead komórek na podłożu z wzorami i bez wzorów. (A) Obraz fluorescencyjny komórek HeLa hodowanych na siatce z wzorami, barwionych kalceiną-AM (barwnik komórek żywych, zielony) i etydinium homodimerem-1 (barwnik komórek martwych, czerwony). (B) Komórki HeLa hodowane na siatce bez wzorów, barwione jak w A. (C) Projekcja stosów z-stack z mikroskopu konfokalnego komórki HeLa na wzorowanej siatce Quantifoil R2/2 z 0,01 mg/mL kolagenu i ECM z fibrynogenu 647 (czerwony). Komórkę barwiono kalceiną-AM (zielony) i Hoechst-33342 (niebieski). (D) Komórki HeLa na siatce bez wzorów inkubowane z 0,01 mg/mL kolagenu i ECM z fibrynogenu 647, inkubowane i barwione kalceiną-AM oraz Hoechst-33342. Obrazy fluorescencyjne zostały nałożone na obraz w świetle przechodzącym (skala szarości). (E) Projekcja X,Z z obrazu C. (F) Projekcja X,Z z obrazu D. Obrazy są w pseudokolorach. Paski skali w (A) i (B) wynoszą 500 µm; paski skali w (C) - (F) wynoszą 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Krio-tomografia elektronowa komórek bakteryjnych, z zaznaczeniem struktur subkomórkowych; obrazy z mikroskopii.
Rysunek 5: Cryo-ET komórki BEAS-2B zainfekowanej RSV na wzorcowanej siatce do krio-TEM. (A) Mapa kwadratu siatki krio-EM komórki BEAS-2B zainfekowanej RSV. Przybliżona granica komórki jest zaznaczona przerywaną zieloną linią. (B) Obraz o wyższej rozdzielczości obszaru zaznaczonego czerwonym prostokątem w (A). Przybliżona granica komórki jest zaznaczona przerywaną zieloną linią. Wiriony RSV są widoczne w pobliżu obwodu komórki (biała strzałka i żółty prostokąt). (C) Pojedynczy przekrój z osi z tomogramu pobranego z obszaru żółtego prostokąta w (B). Czerwone strzałki wskazują białko fuzji F RSV, niebieskie strzałki wskazują kompleks rybonukleoproteinowy (RNP). Paski skali w (A)-(C) są dołączone do obrazu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie w nanotechnologii: A) i B) mikroskopia nanostruktur, C) dyspersja nanocząsteczek, D) i E) komórki w cryo-EM.
Rycina 6: Neurony pierwotne wyizolowane z mózgów larw Drosophila melanogaster w 3rd stadium rozwojowym na wzorcowanej siatce cryo-TEM. (A) Nałożony montaż zdjęć z mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek przedstawiający neurony Drosophila wykazujące ekspresję GFP skierowanego do błony na wzorcowanych polach siatki z 0.5 mg/mL fluorescencyjnej konkanawaliny A. Kolor zielony: neurony Drosophila. Kolor niebieski: fotowzór. (B) Montaż obrazów cryo-EM siatki z (A) po krio-konserwacji. Żółte koło oznacza to samo pole siatki co w (A). (C) Montaż obrazów cryo-EM pola wyróżnionego żółtym kołem w (A) i (B). (D) Obraz o większym powiększeniu obszaru ograniczonego czerwonym kołem w (C), w którym zebrano serię nachyleń (tilt series) neurytów komórki. E. Przekrój tomogramu o grubości 25 nm zrekonstruowany z serii nachyleń uzyskanej z obszaru czerwonego koła w (C). W tomogramie tym widoczne są różne organella, takie jak mitochondria (cyjan), mikrotubule (fiolet), pęcherzyki o gęstym rdzeniu (pomarańcz), pęcherzyki jasne (zielony), retikulum endoplazmatyczne (żółty) oraz aktyna (niebieski). W prawym górnym rogu widoczne są również makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwony). Obrazy fluorescencyjne są w pseudokolorach. Paski skali w (A)-(E) są naniesione na obrazach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy krio-mikroskopii elektronowej; analiza struktur komórkowych i rozkładu cząstek, skala nanometryczna.
Rycina 7: Pierwotne neurony pochodzące z mózgów larw Drosophila melanogaster w 3rd stadium rozwojowym na siatkach bez wzoru. (A) Montaż obrazów z fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek przedstawiający neurony Drosophila wykazujące ekspresję GFP skierowanego do błony na polach siatki z 0,5 mg/mL konkanawaliny A. Kolor zielony: neurony Drosophila. (B) Montaż obrazów z krio-EM tej samej siatki co w (A) po szybkim mrożeniu (plunge-freezing). Żółte koło wskazuje to samo pole siatki co w (A). Zwrócono uwagę na obecność debris komórkowych i zanieczyszczeń z medium, co utrudniło identyfikację celu w porównaniu do siatek z wzorem. (C) Montaż obrazów krio-EM pola zaznaczonego żółtymi kołami na mapach (A) i (B). (D) Obraz o większym powiększeniu obszaru ograniczonego czerwonym kołem w (C), w którym zebrano serię nachyleń (tilt series) neurytów komórki. (E) Przekrój o grubości 25 nm zrekonstruowanego tomogramu z serii nachyleń z (C) i (D). W tomogramie tym widocznych jest wiele organelli, takich jak mikrotubule (fioletowy), aktyna (niebieski), retikulum endoplazmatyczne (żółty) oraz pęcherzyki o gęstym rdzeniu (pomarańczowy). Widoczne są również makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwony). Obrazy fluorescencyjne są przedstawione w pseudokolorach. Paski skali w (A)-(E) są wbudowane w obrazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza wzoru nanostruktury za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, wyniki eksperymentu.
Rycina 8: Przykłady możliwych problemów z tworzeniem wzorów. Obrazy fluorescencyjne znakowanej ECM osadzonej na mikrowzorowanych siatkach. (A) Nierównomierne rozmieszczenie wzoru na siatce spowodowane nierównomierną dystrybucją żelu PLPP. (B) ECM nie może przylegać do obszarów pokrytych szablonem PDMS podczas tworzenia wzoru. (C) Nasycony wzór gradientowy (prawa strona) lub wzór odwrócony (lewa strona) na siatce naświetlonej zbyt wysoką dawką całkowitą. (D) ECM przylega zarówno do prętów siatki, jak i do obszaru wzorowanego z powodu odbić lasera UV podczas tworzenia wzoru. Obrazy są w pseudokolorach; wzór wejściowy pokazano w lewym dolnym rogu; paski skali wynoszą 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

ProblemPotencjalne przyczynyRozwiązywanie problemów
Mikrowzorcowanie
Brak widocznego oświetlenia z lasera PRIMO• Nieprawidłowo ustawiona droga światła• Sprawdzić, czy droga światła w mikroskopie jest ustawiona prawidłowo
• Laser PRIMO jest wyłączony lub zablokowany przez wyłącznik bezpieczeństwa
Wiele uszkodzonych pól siatki• Dotykanie folii siatki pęsetą lub pipetą podczas manipulacji• Operować siatkami z ostrożnością
• Wyschnięcie siatki podczas inkubacji lub płukania• Nie dopuszczać do wyschnięcia siatki podczas płukania i inkubacji
Duże obszary bez wzorca• Niewystarczające pokrycie żelem• Upewnić się, że żel rozprowadza się równomiernie po siatce podczas nakładania
• Folia siatki poza ogniskową podczas wzorkowania• Dodać dodatkowy mikrolitr żelu
• Obszar pokryty szablonem• Sprawdzić ogniskową przed wzorkowaniem każdego regionu
• Dokładnie wycentrować siatkę w szablonie
Wzorzec nasycony lub odwrócony• Nieprawidłowa dawka• Przetestować zakres całkowitych dawek dla wzorca
• Niewystarczające pokrycie żelem• Upewnić się, że siatka jest równomiernie pokryta żelem
• Przetestować różne wartości dla wzorców w skali szarości
Rozmyty wzorzec• Słaba ostrość podczas wzorkowania• Powtórzyć kalibrację PRIMO na tej samej wysokości co próbka
• Nieprawidłowa kalibracja• Ustawić ostrość na folii siatki przed wzorkowaniem
• Podzielić wzorzec na dodatkowe regiony do wzorkowania
Przyleganie ECM poza obszarem wzorca• Odblaski od żelu lub kurz• Upewnić się, że żel jest suchy przed wzorkowaniem
• Upewnić się, że szkiełko nakrywki i obiektyw są czyste
ECM niewidoczny po wzorkowaniu• Fotowyblakanie• Zminimalizować ekspozycję ECM na światło przed obrazowaniem
• Nieprawidłowa dawka podczas wzorkowania• Przetestować zakres wartości całkowitej dawki dla wzorca
• Niewystarczający czas inkubacji ECM• Wydłużyć czas inkubacji ECM
Wysiew komórek
Aglomeracja komórek• Nadmierna digestia• Zastosować niższe stężenie trypsyny lub skrócić czas uwalniania komórek przylegających
• Wysoka gęstość komórek• Pasażować i/lub digestować komórki przy niższym stopniu konfluencji
• Nie wstrząsać komórkami podczas uwalniania
• Delikatnie pipetować zawiesinę komórkową lub użyć sit komórkowych
Komórki nie przylegają do obszarów wzorcowanych• ECM nie jest odpowiedni dla danego typu komórek• Przetestować różne stężenia i składy ECM
• Spadek żywotności komórek przed wysiewem• Upewnić się, że warunki hodowli i uwalniania komórek nie uszkadzają komórek
Komórki nie rozprzestrzeniają się po przyleganiu• ECM lub wzorzec nie jest odpowiedni dla danego typu komórek• Przetestować różne wzorce i ECM
• W niektórych przypadkach bardziej ciągła folia (R1.2/20 zamiast R2/1) może sprzyjać rozprzestrzenianiu się komórek

Tabela 1: Potencjalne problemy podczas mikrowzorcowania. W tej tabeli opisano problemy, które mogą wystąpić podczas mikrowzorcowania lub wysiewania komórek. Dla każdego problemu podano potencjalne przyczyny oraz sposoby rozwiązywania. Reprezentatywne obrazy niektórych problemów przedstawiono na Rysunku 8.

Dyskusja

Nowoczesne, zaawansowane mikroskopy elektronowe i pakiety oprogramowania obsługują teraz usprawnione automatyczne gromadzenie danych cryo-EM i cryo-ET, dzięki czemu w ciągu kilku dni można namierzyć i zobrazować setki do tysięcy pozycji.32,33,34,35. Jednym z istotnych czynników ograniczających przepływy pracy z użyciem krio-ET dla całych komórek było uzyskanie wystarczającej liczby możliwych do zebrania celów na siatkę. Ostatnio wiele grup opracowało protokoły dla siatek mikrowzorcowych dla cryo-EM, a jedną z zalet jest poprawa wydajności zbierania danych 16,17,18. W tym miejscu przedstawiono protokół użycia dostępnego na rynku systemu mikrowzorców do mikrotworzenia siatek TEM do badań krio-ET pierwotnych neuronów Drosophila i hodowanych ludzkich linii komórkowych (niezakażonych lub zakażonych RSV). Ten system mikrowzorców jest wszechstronny, a wiele kroków można zoptymalizować i dostosować do konkretnych celów eksperymentalnych. Użytkownik z doświadczeniem w TEM i mikroskopii fluorescencyjnej może szybko nabrać wprawy w przygotowywaniu siatek i mikrowzorcach. Przy starannej praktyce dobre wyniki powinny być osiągalne po kilku iteracjach. Poniżej omówiono niektóre z dostępnych opcji, rozważania dotyczące użytkowników, potencjalne korzyści i przyszłe zastosowania mikrowzorcowania dla cryo-EM.

Jednym z ważnych czynników branych pod uwagę przy stosowaniu cryo-ET na całych komórkach jest wybór siatki EM. Siatki EM składają się z dwóch części: ramy siatkowej (lub wspornika konstrukcyjnego) i folii (lub folii), która jest ciągłą lub dziurawą powierzchnią folii, na której będą rosły komórki. Siatki miedziane są powszechnie stosowane do krio-EM białek i izolowanych kompleksów. Nie nadają się jednak do krio-ET całokomórkowych ze względu na cytotoksyczność miedzi. Zamiast tego złota siatka jest powszechnie stosowana w tomografii komórkowej. Inne opcje obejmują nikiel lub tytan, które mogą zapewniać korzyści w porównaniu ze złotem, takie jak zwiększona sztywność16. Siatki EM są dostępne z różnymi wymiarami siatki, aby obsługiwać szereg zastosowań. Większe rozmiary oczek zapewniają więcej miejsca na wzrost komórek między prętami siatki i więcej obszarów, które można zbierać w serii pochylania, choć kosztem zwiększonej ogólnej kruchości próbki. Najczęściej stosowaną folią jest perforowany lub dziurawy amorficzny węgiel, taki jak Quantifoils lub siatki C-flat. Cele biologiczne mogą być obrazowane albo przez otwory w węglu, albo przez węgiel przezroczysty elektronowo. Siatki takie jak R 2/1 lub R 2/2, w których otwory mają szerokość 2 μm i są oddalone od siebie odpowiednio o 1 i 2 μm, zapewniają dużą liczbę otworów, a tym samym dużą liczbę potencjalnych obszarów do gromadzenia danych. Jednak niektóre komórki mogą lepiej rosnąć i rozszerzać się na bardziej jednolitych powierzchniach, takich jak siatki R 1,2/20 lub ciągły węgiel. W przypadku dalszego przetwarzania próbki za pomocą mielenia wiązką jonów (cryo-FIB), folia jest usuwana poprzez mielenie, co zmniejsza obawy o ciągłą obecność folii znajdującej się pod spodem. Podobnie jak w przypadku siatki, dostępne są również folie z innych materiałów, przy czym przedstawiony tutaj protokół wzoru jest równie odpowiedni dla siatek SiO2 . Powszechnie stosowane siatki obejmują złote siatki Quantifoil, ciągły węgiel lub siatkę SiO2 o oczkach 200 (odstęp ~ 90 μm między prętami siatki) do krio-ET dla całych komórek.

Podczas projektowania wzoru należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Większość tych decyzji zależy od typu komórki i celu eksperymentu. Dobrym punktem wyjścia jest wybór wzoru, który jest zbliżony do kształtu i wymiarów komórek w hodowli. Wiele badań wykazało znaczący wpływ kształtu wzoru na wzrost komórek i układ cytoszkieletu 13,36,37. Należy zachować szczególną ostrożność podczas projektowania wzoru, jeśli mogłoby to spowodować zmianę interesującego go celu. Przetestowano kilka wzorców dla każdego typu komórek, aby określić, które wzorce sprzyjają adhezji i wzrostowi komórek. Elastyczność systemu mikrowzorców pozwala na testowanie wielu wzorców na jednej siatce i zmianę wzorców dla różnych siatek w ramach jednego eksperymentu. Większe wzory (~50-90 μm), takie jak te zastosowane tutaj, zwiększają prawdopodobieństwo, że wiele komórek przylega do jednego obszaru wzoru i pozwala komórkom rozszerzać się i wydłużać po adhezji. Bardziej ograniczone wzorce (20-30 μm) mogą być odpowiednie w eksperymentach, w których izolacja komórek jest bardziej krytyczna niż ekspansja komórek, takich jak eksperymenty z mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB). W przypadku zastosowań tomograficznych może być konieczne rozważenie wpływu osi wychylenia. Jeśli wzór jest umieszczony w taki sposób, że wszystkie komórki rosną równolegle do siebie w jednym kierunku, możliwe jest, że wszystkie komórki będą prostopadłe do osi nachylenia po załadowaniu na stolik mikroskopu, co spowoduje niższą jakość danych.

Na siatkach bez wzoru komórki często preferencyjnie przylegają do pasków siatki, gdzie nie mogą być zobrazowane przez TEM. Nawet na wzorzystych siatkach często obserwuje się, że komórki są umieszczone w rogach kwadratów siatki, częściowo zarówno na wzorzystej folii węglowej, jak i na pasku siatki. Ostatnio zastosowano mikrowzory, aby celowo umieścić część komórki nad paskiem siatki18. Można to uwzględnić w eksperymentach, w których nie jest krytyczne, aby całe obrzeże komórki znajdowało się na folii. Może to być szczególnie ważne w przypadku komórek, które mogą rosnąć większe niż pojedynczy kwadrat siatki, takich jak neurony pierwotne rosnące przez wiele dni.

Istnieje wiele narzędzi, które można wykorzystać do zaprojektowania wzoru. W tym przypadku wzór był ograniczony do mniej niż 800 pikseli w dowolnym wymiarze, dzięki czemu wzór można obrócić pod dowolnym kątem i nadal mieścić się w maksymalnym obszarze, który można utworzyć w jednej projekcji za pomocą tego systemu mikrowzorów. Dzięki temu użytkownik może obracać wzór w celu prawidłowej orientacji z siatką, niezależnie od orientacji siatki na mikroskopie. W tym miejscu siatka została podzielona na sześć obszarów wzoru. Przede wszystkim umożliwia to regulację ostrości między różnymi obszarami siatki. W szczególności złote kratki są bardzo plastyczne i mogą nie układać się całkowicie płasko na szkle. Właściwa ostrość jest niezbędna do uzyskania czystych, wyrafinowanych rezultatów wzoru. Korzystając z wzorów podzielonych na segmenty, należy dokonać tylko niewielkich korekt pozycji wzoru, jeśli siatka nieznacznie się przesunie podczas procesu tworzenia wzorów, chociaż zwykle nie stanowi to problemu w przypadku używania żelu PLPP z szablonami PDMS. Wreszcie, cztery środkowe kwadraty siatki pozostały niewzorzec. Dzięki temu użytkownik jest w stanie wyraźnie zidentyfikować środek siatki, co jest bardzo przydatne w eksperymentach z obrazowaniem korelacyjnym.

Oprogramowanie do tworzenia wzorów dla tego systemu mikrowzorów, Leonardo, ma również bardziej zaawansowane funkcje, takie jak zszywanie i możliwość importowania wzorów w formacie PDF, które wykraczają poza zakres tego protokołu. Oprogramowanie to obejmuje również wykrywanie mikrostruktury i automatyczne pozycjonowanie wzorców, które można wykorzystać na siatkach TEM. Ta funkcja jest najbardziej przydatna, gdy siatka jest bardzo płaska i można ją tworzyć bez konieczności dostosowywania ostrości między różnymi obszarami.

Wybór białka ECM może mieć znaczący wpływ na adhezję i ekspansję komórek. Wiadomo, że niektóre komórki ulegają zmianom fizjologicznym, gdy są hodowane na określonych podłożach38. Przetestowano wiele białek i stężeń ECM pod kątem każdego nowego typu komórek w oparciu o wcześniejsze prace opisane w literaturze. Laminina, fibrynogen, fibronektyna i kolagen są szeroko stosowane w hodowlanych komórkach i mogą być używane jako punkt wyjścia, jeśli inne dane nie są dostępne. Należy jednak również wziąć pod uwagę inne białka ECM, jeżeli powszechnie stosowane białka ECM nie nadają komórkom odpowiednich właściwości przylegania. Było to szczególnie prawdziwe w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila , ponieważ wysokie stężenie roślinnej lektyny konkanawaliny A było niezbędne do prawidłowego przylegania komórek. Kompatybilność adhezji komórkowej i wzrostu z ECM można przetestować poprzez narysowanie wzoru na szklanych szalkach lub szkiełkach przed przejściem do siatek TEM. To podejście polegające na wstępnej selekcji jest efektywne czasowo i kosztowo, jeśli konieczne jest zbadanie dużej liczby kombinacji. Włączenie fluorescencyjnie sprzężonego białka ECM jest cenne dla oceny sukcesu i jakości modelowania.

Wysiewanie komórek jest jednym z najważniejszych etapów dla cryo-ET dla całych komórek, zarówno z mikrowzorcami, jak i bez 6,16,39. W przypadku pierwotnych Drosophila lub innych neuronów, które są kruche, niestabilne w zawiesinie i mogą mieć ograniczoną ilość, preferowane są metody pojedynczego wysiewu zamiast monitorowanego, sekwencyjnego siewu komórek. Pojedynczy etap wysiewu przy zoptymalizowanej gęstości komórek, jak opisano w protokole dla neuronów Drosophila, jest realną opcją dla większości typów komórek. Możliwe jest jednak również wysiewanie komórek na substrat przy niższym stężeniu początkowym i dodawanie większej liczby komórek w monitorowany sposób, jak opisano tutaj i w innej literaturze18. To sekwencyjne rozsiewanie może w niektórych przypadkach zapewnić bardziej spójne wyniki. Podobnie jak w przypadku standardowej hodowli komórkowej, należy zawsze zachować ostrożność, aby utrzymać żywotność komórek i zminimalizować zlepianie się komórek podczas izolacji.

Kiedy po raz pierwszy zaczynasz przygodę z mikrowzorami, istnieje kilka potencjalnych pułapek, które są szkodliwe dla końcowego wyniku. Staranne obchodzenie się z siatką i sterylna technika, równomierne rozprowadzenie żelu PLPP, właściwa dawka i skupienie podczas modelowania oraz utrzymanie żywotności komórek przed wysiewem to jedne z najważniejszych czynników decydujących o sukcesie. Listę niektórych potencjalnych problemów oraz ich rozwiązań zebrano w tabeli 1.

Siatki z mikrowzorami mogą być używane do pomocy w pozycjonowaniu komórek w celu ustalenia stałej gęstości komórek w całej siatce oraz do pozycjonowania obszarów zainteresowania w obszarach odpowiednich do zbierania serii pochylenia16,18. Rozmieszczenie i pozycjonowanie komórek może być wykorzystane jako markery odniesienia do korelacji w eksperymentach krio-CLEM, zmniejszając potrzebę stosowania delikatnych siatek szukacza i fluorescencyjnych markerów odniesienia. Należy jednak zauważyć, że takie markery referencyjne mogą być nadal przydatne do korelacji dokładności submikrometrowej29,40. Co więcej, równomierny rozkład izolowanych komórek jest również bardzo korzystny w eksperymentach z mieleniem wiązką jonów (cryo-FIB) w celu maksymalizacji liczby komórek, z których można wyciąć lamelę16.

Dodanie mikrowzorców do przepływów pracy krio-EM spowoduje wymierną poprawę przepustowości danych i potencjalnie umożliwi przeprowadzenie nowych eksperymentów. Wraz z dalszym wdrażaniem i rozwojem tej techniki, bardziej zaawansowane zastosowania mikrowzorów, w tym gradienty ECM, wielokrotne osadzanie ECM i składanie mikrostruktur, jeszcze bardziej rozszerzą możliwości cryo-ET w zakresie badania celów i procesów biologicznych w pełnym kontekście komórkowym.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Jill Wildonger, dr Sihui Z. Yang i pani Josephine W. Mitchell z Wydziału Biochemii Uniwersytetu Wisconsin, Madison za hojne podzielenie się elav-Gal4, UAS-CD8::GFP szczep muchy (Bloomington stock center, #5146). Chcielibyśmy również podziękować dr Aurélienowi Duboinowi, panu Laurentowi Siquierowi i pani Marie-Charlotte Manus z Alvéole oraz panu Serge'owi Kaddourze z Nanoscale Labs za ich hojne wsparcie podczas tego projektu. Praca ta była częściowo wspierana przez University of Wisconsin w Madison, Wydział Biochemii Uniwersytetu Wisconsin w Madison oraz granty publicznej służby zdrowia R01 GM114561, R01 GM104540, R01 GM104540-03W1 i U24 GM139168 dla E.R.W. i R01 AI150475 dla P.W.S. z NIH. Część tych badań była wspierana przez grant NIH U24 GM129547 i przeprowadzona w PNCC w OHSU i dostępna za pośrednictwem EMSL (grid.436923.9), DOE Office of Science User Facility sponsorowanego przez Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych. Jesteśmy również wdzięczni za korzystanie z urządzeń i oprzyrządowania w Centrum Badawczym Cryo-EM na Wydziale Biochemii Uniwersytetu Wisconsin w Madison.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% (w/v) Poli-L-LizynaSigmaP8920-100ML
0,22 &mikro; m filtry strzykawkowe Membrana PVDFGenesee25-240
22x60-1 Szkiełko nakrywkoweFisher12545F
5/15 PęsetaEMS (Dumont)0203-5/15-PO
Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (100X)ThermoFisher (Gibco)15240096
Komórki BEAS-2BATCCCRL-9609
Kolagen I, bydlęcyThermoFisher ( Gibco)A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 ConjugateThermoFisher (Invitrogen)C11254
DMEMFisher (Lonza)BW12-604F
EtOHFisher (Decon Labs)22-032-600
Płodowa surowica bydlęcaATCC30-2020
Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 647 SprzężonyThermoFisher ( Invitrogen)F35200
Fibronektyna Białko bydlęce, PlasmaThermoFisher (Gibco)33010018
Naczynie ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-20-C
GlukozaVWR0643-1KG
Uchwyt do przygotowania siatkiEMS71175-01
Komórki HeLaHemacytometr ATCCCCL-2
Fisher (SKC, Inc.)
HEPESFisher (ACROS Organics)AC172572500
Hoechst 33342ThermoFisher (Invitrogen)H3570
InsulinaFisher (Sigma Aldrich)NC0520015
KClMP Bio194844
KH2PO4Fisher (ACROS Organics)AC212595000
Leica-DMi8Leica MicrosystemsMożna dostosować za pomocą przystawek do kamery, stolika i obiektywu
LeonardoAlvé https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research GradeFisher (Supply Solutions)50-100-3280
ŻYWY/MARTWY Zestaw żywotności/cytotoksycznościThermoFisher (Invitrogen)L3224
Kamera mikroskopowaHammamatsuC13440-20CU
Zmotoryzowany stageMä RZH&AUML; użytkownik Wetzlar00-24-599-0000
NaClFisher (Fisher BioReagents)BP358-1
NaH2PO4Fisher (ACROS Organics)AC207802500
NaOHFisher (Alfa Aesar)AAA1603736
PBSCorning21-040-CV
Szablony PDMSnanoscaleLABSPDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVAnanoscaleLABSPEG-SVA-1GRmPEG-Succinimidyl Valerianian, MW 5,000
PenicylinaFisher (Research Products International Corp)50-213-641
Paski pHFisher (Millipore Sigma)M1095350001również użyć sondy pH
PLPPnanoscaleLABSPLPP-GEL-300ULhttps://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMOAlvé https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC zawierający antygenomiczne cDNA RSV A2-mK+ )BEI ResourcesNR-36460https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Siatki QuantifoilEMS (Quantifoil)Q2100AR12 &mikro; m otwory rozstawione co 1 i mikro; m od siebie, dostępne są inne wymiary
RPMIFisher (Lonza)BW12-702F
RSV A2-mK+patrz wpis dla pSynkRSV-19F-Opisanyw Hotard et al. [22]. Może być wygenerowany z pSynkRSV-ll9F
Schneider's MediaThermoFisher (Gibco)21720-024
SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Pęseta prostaEMS (Dumont)72812-D
StreptomycynaFisher (Fisher BioReagents)BP910-50
SacharozaAvantor4097-04
TetracyklinaSigmaT8032-10MG
Mikroskop elektronowy Titan KriosThermoFisher300kV, z kamerą bezpośredniego detektora elektronów i filtrem energii
TrypsynaThermoFisher (Gibco)15090046
Rewolwer/Rotatorlampowy Fisher (Thermo Scientific)11676341
UAS: mcD8: GFP Szczep muchyDrosophila Bloomington Drosophila Stock Center5146http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html
22600100 ole Można ole

Bibliografia

  1. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  2. Martynowycz, M. W., Gonen, T. From electron crystallography of 2D crystals to MicroED of 3D crystals. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 34, 9-16 (2018).
  3. Wagner, J., Schaffer, M., Fernandez-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography-the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. 591 (17), 2520-2533 (2017).
  4. Wan, W., Briggs, J. A. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods in Enzymology. 579, 329-367 (2016).
  5. Bäuerlein, F. J., Pastor-Pareja, J. C., Fernández-Busnadiego, R. Cryo-electron tomography of native Drosophila tissues vitrified by plunge freezing. bioRxiv. , 437159(2021).
  6. Hampton, C. M., et al. Correlated fluorescence microscopy and cryo-electron tomography of virus-infected or transfected mammalian cells. Nature Protocols. 12 (1), 150-167 (2017).
  7. Hsieh, C. E., Leith, A., Mannella, C. A., Frank, J., Marko, M. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: Electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. Journal of Structural Biology. 153 (1), 1-13 (2006).
  8. Al-Amoudi, A., Norlen, L. P., Dubochet, J. Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues. Journal of Structural Biolology. 148 (1), 131-135 (2004).
  9. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  10. Gorelick, S., et al. PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy. Elife. 8, 45919(2019).
  11. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  12. Turk, M., Baumeister, W. The promise and the challenges of cryo-electron tomography. FEBS Letters. 594 (20), 3243-3261 (2020).
  13. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  14. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  15. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Analyst. 139 (13), 3256-3264 (2014).
  16. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  17. Engel, L., et al. Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (11), (2019).
  18. Engel, L., et al. Lattice micropatterning for cryo-electron tomography studies of cell-cell contacts. bioRxiv. , 272237(2021).
  19. Sibert, B. S., Kim, J. Y., Yang, J. E., Wright, E. R. Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids. bioRxiv. , 447251(2021).
  20. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  21. Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. Kinesin-1-powered microtubule sliding initiates axonal regeneration in Drosophila cultured neurons. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1296-1307 (2015).
  22. Ke, Z., et al. The morphology and assembly of respiratory syncytial virus revealed by cryo-electron tomography. Viruses. 10 (8), (2018).
  23. Stobart, C. C., et al. A live RSV vaccine with engineered thermostability is immunogenic in cotton rats despite high attenuation. Nature Communications. 7, 13916(2016).
  24. Hotard, A. L., et al. A stabilized respiratory syncytial virus reverse genetics system amenable to recombination-mediated mutagenesis. Virology. 434 (1), 129-136 (2012).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  27. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  28. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  29. Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. , 107709(2021).
  30. Ke, Z., et al. Promotion of virus assembly and organization by the measles virus matrix protein. Nature Communications. 9 (1), 1736(2018).
  31. Kim, J., Yang, S., Wildonger, J., Wright, E. A new in situ neuronal model for cryo-ET. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 130-132 (2020).
  32. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957(2021).
  33. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  34. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visual Experiments. (169), e62383(2021).
  35. Chreifi, G., Chen, S., Jensen, G. J. Rapid tilt-series method for cryo-electron tomography: Characterizing stage behavior during FISE acquisition. Journal of Structural Biology. 213 (2), 107716(2021).
  36. Anderson, D. E., Hinds, M. T. Endothelial cell micropatterning: methods, effects, and applications. Annals of Biomedical Engineering. 39 (9), 2329-2345 (2011).
  37. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  38. Kleinman, H. K., Luckenbill-Edds, L., Cannon, F. W., Sephel, G. C. Use of extracellular matrix components for cell culture. Analytical Biochemistry. 166 (1), 1-13 (1987).
  39. Fassler, F., Zens, B., Hauschild, R., Schur, F. K. M. 3D printed cell culture grid holders for improved cellular specimen preparation in cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 212 (3), 107633(2020).
  40. Schellenberger, P., et al. High-precision correlative fluorescence and electron cryo microscopy using two independent alignment markers. Ultramicroscopy. 143, 41-51 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikrowzorowanie siatek TEMkriotomografia elektronowa całych komórek (cryo-ET)macierz pozakomórkowakriokorelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (cryo-CLEM)frezowanie cryo-FIBadhezja komórekmikroskopia fluorescencyjnawzorowany wzrost komórek
Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.