Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Streszczenie

Tomografia krioelektronowa całych komórek (cryo-ET) to potężna technologia, która jest używana do wytwarzania struktur o rozdzielczości nanometrowej makrocząsteczek obecnych w kontekście komórkowym i zachowanych w stanie zbliżonym do natywnego zamrożonego i uwodnionego. Istnieją jednak wyzwania związane z hodowlą i/lub przyleganiem komórek do siatek TEM w sposób odpowiedni do tomografii przy jednoczesnym zachowaniu komórek w ich stanie fizjologicznym. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący wykorzystania mikrowzorców do kierowania i promowania wzrostu komórek eukariotycznych na siatkach TEM. Podczas mikrowzorcowania wzrost komórek jest kierowany poprzez osadzanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w określonych wzorach i pozycjach na folii siatki TEM, podczas gdy inne obszary pozostają pokryte warstwą przeciwporostową. Elastyczność w doborze powłoki powierzchniowej i projektowania wzoru sprawia, że mikrotworzenie wzorów ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie typów komórek. Mikrowzorce są przydatne do badań struktur w obrębie pojedynczych komórek, a także do bardziej złożonych systemów eksperymentalnych, takich jak interakcje gospodarz-patogen lub zróżnicowane społeczności wielokomórkowe. Mikrowzorce można również zintegrować z wieloma dalszymi procesami pracy cryo-ET dla całych komórek, w tym z korelacyjną mikroskopią świetlną i elektronową (cryo-CLEM) oraz mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB).

Wprowadzenie

Wraz z rozwojem, rozszerzeniem i wszechstronnością mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), naukowcy przebadali szeroki zakres próbek biologicznych w stanie zbliżonym do natywnego od makromolekularnej (~1 nm) do wysokiej (~2 A) rozdzielczości. Techniki krio-EM i dyfrakcji elektronów jednocząsteczkowych najlepiej stosować odpowiednio do oczyszczonych makrocząsteczek w roztworze lub w stanie krystalicznym^1,2. Natomiast krioelektronowa tomografia (cryo-ET) jest wyjątkowo przydatna do niemal natywnych badań strukturalnych i ultrastrukturalnych dużych, heterologicznych obiektów, takich jak bakterie, wirusy pleomorficzne i komórki eukariotyczne³. W cryo-ET trójwymiarowe (3D) informacje uzyskuje się poprzez fizyczne przechylenie próbki na stoliku mikroskopu i uzyskanie serii obrazów przez próbkę pod różnymi kątami. Obrazy te, lub serie pochylenia, często obejmują zakres +60/-60 stopni w krokach co jeden do trzech stopni. Seria pochylenia może być następnie obliczeniowo zrekonstruowana w objętość 3D, znaną również jako tomogram⁴.

Wszystkie techniki krio-EM wymagają, aby próbka była osadzona w cienkiej warstwie amorficznego, niekrystalicznego, szklistego lodu. Jedną z najczęściej stosowanych technik kriofiksacji jest zamrażanie wgłębne, w którym próbka jest nakładana na siatkę EM, osuszana i szybko zanurzana w ciekłym etanie lub mieszaninie ciekłego etanu i propanu. Technika ta jest wystarczająca do witryfikacji próbek o grubości od <100 nm do ~10 μm, w tym hodowanych komórek ludzkich, takich jak HeLa cells^5,6. Grubsze próbki, takie jak mini-organoidy lub biopsje tkanek, o grubości do 200 μm, mogą być zeszklone przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem⁷. Jednak ze względu na zwiększone rozpraszanie elektronów w grubszych próbkach, grubość próbki i lodu dla cryo-ET jest ograniczona do ~0,5 - 1 μm w transmisyjnych mikroskopach elektronowych 300 kV. W związku z tym krio-ET dla całych komórek wielu komórek eukariotycznych jest ograniczony do obrzeży komórek lub przedłużeń komórek, chyba że stosuje się dodatkowe etapy przygotowania próbki, takie jak kriosekcja⁸ lub mielenie wiązki jonów skupionych9^,10,11.

Ograniczeniem wielu eksperymentów z obrazowaniem krio-ET na całych komórkach jest przepustowość zbierania danych¹². W przeciwieństwie do krio-EM-pojedynczej cząstki, gdzie tysiące izolowanych cząstek można często obrazować z pojedynczego kwadratu siatki TEM, komórki są duże, rozproszone i muszą być hodowane w wystarczająco niskiej gęstości, aby umożliwić zachowanie komórek w cienkiej warstwie szklistego lodu. Często obszar zainteresowania jest ograniczony do określonej funkcji lub podobszaru komórki. Dodatkowym ograniczeniem przepustowości jest skłonność komórek do wzrostu w obszarach, które nie nadają się do obrazowania TEM, takich jak na paskach siatki TEM lub w ich pobliżu. Ze względu na nieprzewidywalne czynniki związane z hodowlą komórkową na siatkach TEM, konieczne jest osiągnięcie postępu technologicznego w celu poprawy dostępności próbek i przepustowości do pozyskiwania danych.

Mikrowzorzec substratu z przylegającymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest dobrze znaną techniką mikroskopii świetlnej żywych komórek do kierowania wzrostem komórek na sztywnych, trwałych i optycznie przezroczystych powierzchniach, takich jak szkło i inne podłoża do hodowli tkankowych^13,14. Mikrowzory zostały również wykonane na miękkich i/lub trójwymiarowych (3D) powierzchniach. Takie techniki pozwoliły nie tylko na precyzyjne pozycjonowanie komórek; Wspierali również tworzenie sieci wielokomórkowych, takich jak wzorzyste obwody komórek nerwowych¹⁵. Wprowadzenie mikrowzorców do cryo-ET nie tylko zwiększy przepustowość, ale może również otworzyć nowe badania nad badaniem złożonych i dynamicznych mikrośrodowisk komórkowych.

Ostatnio, kilka grup zaczęło stosować techniki mikrowzorcowania na siatkach TEM za pomocą wielu podejść^16,17. W tym miejscu opisano zastosowanie techniki fotomodelowania bez maski dla siatek TEM przy użyciu systemu mikromodelowania Alvéole PRIMO, który charakteryzuje się bezdotykowym wzornictwem o wysokiej rozdzielczości. W tym systemie mikrowzorcowania na wierzch podłoża nakładana jest warstwa przeciwporostowa, a następnie nakładany jest fotokatalizator i ablacja warstwy przeciwporostowej w zdefiniowane przez użytkownika wzory za pomocą lasera UV. Białka ECM można następnie dodać do wzorców dla odpowiedniej hodowli komórkowej. Metoda ta została wykorzystana przez kilka grup do badań krio-ET nabłonka barwnikowego siatkówki-1 (RPE1), nerki psa Madin-Darby-II (MDCKII), ludzkiego fibroblastu napletka (HFF) i linii komórek śródbłonka^16,17,18. Ten system mikrowzorów jest kompatybilny z wieloma podłożami warstw przeciwporostowych, a także z płynnym lub żelowym odczynnikiem fotokatalizatora. Można wybierać różne białka ECM i dostosowywać je do specyfiki linii komórkowej, zapewniając użytkownikowi wszechstronność.

Mikrowzorcowanie zostało z powodzeniem zastosowane w wielu projektach w laboratorium¹⁹. W tym miejscu przedstawiono protokół mikrowzorców, w tym specyficzne adaptacje do badania hodowanych komórek HeLa, komórek BEAS-2B zakażonych syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) oraz pierwotnych neuronów larwalnych Drosophila melanogaster²⁰.

Protokół

Opisany tutaj protokół jest kompilacją metod hodowli komórkowych, mikrowzorów i obrazowania używanych przez laboratorium Wrighta i Centrum Badawcze Cryo-EM na Uniwersytecie Wisconsin w Madison. Przepływ pracy jest przedstawiony w Rysunek 1. Dodatkowe materiały szkoleniowe i instruktażowe są dostępne na następujących stronach: https://cryoem.wisc.edu lub https://wrightlab.wisc.edu

1. Przygotowanie siatek do tworzenia wzorów

1. Przenieś siatki TEM na czyste szkiełko podstawowe stroną węglową do góry (standardowa grubość folii węglowej to 12 nm). Za pomocą parownika węglowego ACE600 odparuj 5-8 nm dodatkowego węgla na kratki, aby zwiększyć ogólną trwałość filmu węglowego.
   UWAGA: Ten krok nie jest konieczny w przypadku siatek SiO₂. Ten krok można również wykonać z wyprzedzeniem; Powlekane kratki należy przechowywać w środowisku o niskiej wilgotności, takim jak eksykator próżniowy.
2. Przenieś kratki do uchwytu do przygotowania kratki i rozładowuj żar kratki stroną węglową do góry. Za pomocą systemu rozładowania jarzeniowego rozładowywanie jarzenia przez 60 s przy natężeniu 10 mA przy odległości roboczej 80 mm i podciśnieniu 1,0 x ^10-3 mbar. Zrób to w ciągu 15-30 minut od następnego kroku.
   UWAGA: Uchwyty do przygotowania siatki można kupić komercyjnie lub domowej roboty za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej na małej szalce Petriego.

2. Nakładanie warstwy przeciwporostowej

UWAGA: Podczas obchodzenia się z kratkami należy stosować właściwą technikę sterylną, a wszystkie roztwory powinny być sterylne i/lub sterylizowane przez filtr.

1. Przenieś kratki (stroną węglową do góry) na czyste szkiełko lub szkiełko nakrywkowe z zachowaniem co najmniej 1 cm odstępu między kratkami. Odpipetować 10 μl 0,05% poli-L-lizyny (PLL) na każdą siatkę. Inkubować kratki w wilgotnej komorze, takiej jak dołączone plastikowe pudełko z wilgotnymi ręcznikami papierowymi, przez co najmniej 30 minut.
   UWAGA: Ten krok można przedłużyć do nocy. Upewnij się, że poziom wilgotności w komorze jest wystarczający, aby zapobiec wysychaniu kratek.
2. Umyj każdą kratkę trzykrotnie 15 μl 0,1 M HEPES pH 8,5. Przy każdym praniu usuń większość płynu z siatki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia kratki. Dodać 15 μl świeżego buforu, inkubować przez co najmniej 30 s i powtórzyć. Pozostawić każdą siatkę w 15 μl 0,1 M HEPES po końcowym praniu.
   UWAGA: Na tym etapie i w kolejnych krokach ważne jest, aby siatka była mokra i unikała kontaktu pipety z siatką.
3. Przygotować 10 μl 100 mg/ml glikolu polietylenowego i walerianianu sukcynimidylu (PEG-SVA) w 0,1 M HEPES pH 8,5 dla każdej siatki. PEG-SVA szybko się rozpuszcza po delikatnym zmieszaniu, co daje klarowny roztwór.
   UWAGA: Nie należy wcześniej przygotowywać roztworu PEG-SVA. PEG-SVA ma okres półtrwania wynoszący 10 minut przy pH 8,5. Należy unikać wystawiania półproduktu na nadmierne działanie wilgoci poprzez przechowywanie go w eksykatorze lub suchym środowisku w temperaturze -20 °C i ogrzanie go do temperatury pokojowej przed otwarciem.
4. Natychmiast po przygotowaniu roztworu PEG-SVA należy usunąć 15 μL kropli HEPES pH 8,5 z każdej siatki (uważając, aby nie wysuszyć siatki) i dodać 10 μL kropli roztworu PEG-SVA. Inkubować kratki w wilgotnej komorze przez co najmniej 1 godz.
   UWAGA: Ten krok można przedłużyć do nocy. Upewnij się, że wilgotność w komorze jest wystarczająca, aby zapobiec wysychaniu kratek.
5. Umyj każdą kratkę trzykrotnie 15 μl sterylnej wody. Przy każdym praniu usunąć większość płynu z siatki za pomocą pipety, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki, dodać 15 μl świeżej wody, inkubować przez co najmniej 30 s i powtórzyć. Po ostatnim praniu pozostaw każdą kratkę w 15 μl wody.

3. Nakładanie żelu PLPP

1. Przygotuj czyste szkiełko nakrywkowe mikroskopu dla każdej siatki. Wykonaj następujące kroki dla każdej siatki, po jednej siatce na raz, aby zminimalizować ryzyko wyschnięcia siatki.
2. Umieść kroplę wody o pojemności 1,0 μl na środku szkiełka nakrywkowego, aby pomóc w umieszczeniu siatki na szkiełku nakrywkowym i utrzymaniu mokrej siatki. Ostrożnie przenieś siatkę z kropli wody o pojemności 15 μl do kropli wody o pojemności 1,0 μl na szkiełku nakrywkowym. Pamiętaj, aby umieścić siatkę stroną z włókna węglowego do góry.
3. Ostrożnie umieść szablon z polidimetylosiloksanu (PDMS) na siatce, uważając, aby siatka była wyśrodkowana i zminimalizować kontakt szablonu z folią węglową siatki.
4. Dodać 1,0 μl żelu chlorku 4-benzoilobenzylotrimetyloamoniowego (PLPP) na siatkę. Delikatnie odpipetować do wymieszania (nie dotykać siatki końcówką pipety).
5. Przenieś szkiełko nakrywkowe z siatką w ciemne miejsce do wyschnięcia. Żel wyschnie w około 15-30 minut.

4. Kalibracja i projektowanie mikrowzoru

1. Pokoloruj jedną stronę szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą zakreślacza. Dodaj czarne linie z markera permanentnego z cienką końcówką, aby ułatwić ustawianie ostrości. Umieść szkiełko nakrywkowe na mikroskopie tak, aby kolorowa strona była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Korzystając z trybu jasnego pola, skoncentruj się na zakreślaczu.
2. Upewnij się, że mikroskop i system mikrowzorów są włączone i ustawiona jest prawidłowa ścieżka światła. Otwórz Micromanager i oprogramowanie Leonardo (Wtyczki > Leonardo) na komputerze mikroskopu.
3. Wybierz opcję kalibracji i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby obraz rzutowany na szkiełko był ostry. Może być konieczne skrócenie czasu ekspozycji. Po kalibracji wybierz opcję Wzorzec teraz.
4. Zapisz stosunek mikrometr/piksel (μm/px) podany pod danymi kalibracyjnymi w lewym górnym oknie programu (Rysunek 2, obszar 1). Użyj tego współczynnika, aby określić liczbę pikseli, które mają być używane na mikrometr podczas projektowania wzoru.
5. Po kalibracji upewnij się, że oprogramowanie jest teraz otwarte z widokiem jasnego pola na żywo z mikroskopu. Załaduj przygotowaną siatkę na szkiełko nakrywkowe (sekcja 3) na stolik tak, aby siatka była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Ustaw stół montażowy i dostosuj ostrość tak, aby siatka była widoczna w oknie oprogramowania.
6. Zmierz rozmiar kwadratów siatki i pasków siatki w mikrometrach. Oprogramowanie zawiera linijkę aktywowaną przyciskiem w lewym dolnym rogu do pomiaru siatki ( Rysunek 2, obszar 2). Na przykład wzory użyte tutaj dla siatki 200 odpowiadają kwadratom siatki ~87 × 87 μm i paskom siatki ~36 μm.
   UWAGA: Oprogramowanie oferuje elastyczność w zmianie rozmiaru wzorów w locie, dzięki czemu drobne niedokładności w pomiarze mogą być tolerowane.
7. Na podstawie powyższych pomiarów i proporcji utwórz wzory za pomocą dowolnego oprogramowania do tworzenia obrazów. Minimalny rozmiar obiektu przy obiektywie 20× wynosi 1,2 μm. Wzorce powinny być zapisywane jako nieskompresowane 8-bitowe pliki .tiff.
   1. Upewnij się, że oprogramowanie nie skaluje obrazów do innego rozmiaru piksela podczas zapisywania. Wzór powinien zmieścić się w polu o wymiarach od 800 × 800 pikseli, wystarczającym do pokrycia czterech kwadratów siatki.
      UWAGA: Piksele o wartości 255 (biały) zostaną wymodelowane z największą intensywnością (całkowita dawka lasera), a piksele o wartości zero () nie zostaną wymodelowane. Wszystkie piksele o wartości pośredniej zostaną oznaczone wzorem dawki około (X/255)*dawki całkowitej. W Rysunek 3A, wartości pikseli 255 i 129 zostały użyte dla wzorów w skali szarości. Po zaprojektowaniu wzoru można go zapisać i ponownie wykorzystać bez modyfikacji.

5. Mikrowzory

1. Po kalibracji upewnij się, że oprogramowanie jest teraz otwarte z widokiem jasnego pola na żywo z mikroskopu. Załaduj przygotowaną siatkę na szkiełko nakrywkowe (sekcja 3) na stolik tak, aby siatka była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Ustaw stolik montażowy i dostosuj ostrość, aby zobaczyć siatkę w oprogramowaniu.
2. Na początku zaprojektuj nowy szablon. W oprogramowaniu wybierz Dodaj ROI (nie pokazano, w lokalizacji Rysunek 2 obszar 3) i wybierz okrąg o wielkości 3,000 μm. Ustaw okrągły zwrot z inwestycji nad siatką, korzystając z obrazu w jasnym polu na ekranie jako przewodnika. Naciśnij kłódkę, aby zabezpieczyć zwrot z inwestycji.
3. Po zablokowaniu zwrotu z inwestycji w miejscu wybierz Dodaj wzorzec (nie pokazano, w lokalizacji Rysunek 2 obszar 3). Wybierz wzór zaprojektowany w sekcji 4. Podziel siatkę na sześć regionów, aby umożliwić niezależne ustawianie ostrości i pozycjonowanie w każdym regionie, aby uwzględnić nierówne siatki. Kwadratowy obszar siatki o wymiarach od 8 × 8 do 8 dla każdego rogu siatki oraz kwadratowy region siatki o wymiarach od 2 × 8 po każdej stronie środka, pozostawiając cztery kwadraty siatki bez wzoru (Rysunek 2, środkowy obraz).
4. Użyj opcji replikacji (Rysunek 2, obszar 4), aby wygenerować kopie początkowego wzorca, aby osiągnąć żądaną liczbę całkowitych kopii wzorca. W razie potrzeby dostosuj odstępy między kopiami, aby dopasować je do odstępów między kwadratami siatki.
5. Ustaw dawkę całkowitą dla wzorca. 30 mJ/^mm2 to dobry punkt wyjścia. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać więcej informacji.
6. W obszarze Opcje eksperckie (Rysunek 2, obszar 4) dostosuj kąt obszaru tak, aby pasował do kąta kwadratów siatki. Położenie regionów można zmieniać za pomocą myszy. Proporcje (rozmiar) wzorów można również dostosować. Iteruj po dostosowaniu kąta, położenia, odstępu między i proporcji wzoru, aż wzorce zrównają się z kwadratami siatki. Przesuń stolik mikroskopu, aby zmienić obszar siatki na wyświetlaczu jasnego pola na żywo.
7. Naciśnij przycisk Zablokuj, aby zapisać zmiany wprowadzone w regionie.
8. Aby skopiować region, kliknij przycisk Duplikuj (Rysunek 2, obszar 5, ikona dwóch arkuszy papieru) obok jego nazwy w panelu Operacje po lewej stronie. Aby zmienić położenie, nazwę lub edytować kopię, kliknij jej nazwę w panelu Sterowanie.
9. W razie potrzeby powtórz kroki 5.4-5.9, aby wypełnić wszystkie żądane obszary.
10. Po zaprojektowaniu i umieszczeniu kompletnego szablonu zapisz plik szablonu w oprogramowaniu (Rysunek 2, obszar 6, pasek z ikoną strzałki w górę na górnym pasku narzędzi).
11. Podczas wczytywania wcześniej zapisanego szablonu (pasek z ikoną strzałki w dół) wyśrodkuj ROI nad siatką i naciśnij Zablokuj. Kliknij każdy region w panelu sterowania, aby zmienić plik kąta, położenia, dawki i/lub wzoru.
12. Po umieszczeniu szablonu i wzorów odznacz wszystkie regiony oprócz jednego w Panelu sterowania w oprogramowaniu.
13. Użyj stolika mikroskopu, aby przejść do tego obszaru i skup się na folii węglowej. Kliknięcie ikony gałki ocznej w panelu Operacja (Rysunek 2, obszar 5) spowoduje włączenie lub wyłączenie wyświetlania nakładki wzoru.
14. Gdy siatka jest ostra, zamknij migawkę jasnego pola i naciśnij ikonę Odtwórz w prawym dolnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć proces tworzenia wzorów, który można monitorować na żywo.
15. Na panelu sterowania zaznacz pole wyboru następnego regionu. Otwórz migawkę w jasnym polu tak, aby siatka była widoczna, i wyśrodkuj ten obszar za pomocą stolika mikroskopu. Powtórz kroki 5.13-5.14 dla każdego regionu w Panelu sterowania.
16. Zdjąć szkiełko nakrywkowe z siatką z mikroskopu i natychmiast odpipetować 10 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na siatkę.
17. Po 10 minutach usuń szablon pęsetą, a następnie umyj siatkę 3x 15 μL PBS. Po ostatnim umyciu umieść każdą kratkę w 15 μl PBS i przenieś kratki w ciemne miejsce.

6. Osadzanie białek ECM

1. W przypadku hodowanych komórek wykonaj kroki 6.2-6.5; w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila wykonaj kroki 6.6-6.10.
2. Przygotować co najmniej 15 μl ECM dla każdej siatki. W przypadku komórek BEAS-2B należy przygotować końcowe stężenie 0,01 mg/ml fibronektyny bydlęcej i 0,01 mg/ml fibrynogenu sprzężonego z fluoroforem w sterylnym PBS. W przypadku komórek HeLa należy przygotować 0,01 mg/ml kolagenu bydlęcego I i 0,1 mg/ml fibrynogenu sprzężonego z fluoroforem w sterylnym PBS.
3. Usunąć większość PBS z każdej siatki i nałożyć 15 μl ECM. Inkubować siatkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h.
   UWAGA: Ten etap może zostać przedłużony do nocy w temperaturze 4 °C.
4. Po inkubacji w ECM umyć każdą siatkę 5x sterylnym PBS. Przy każdym praniu usuń większość płynu pipetą, nie dopuszczając do wyschnięcia siatki, dodaj 15 μl świeżego PBS, inkubuj przez co najmniej 30 s i powtórz. Pozostaw każdą siatkę w PBS po ostatnim praniu.
   UWAGA: Kratki mogą być przechowywane do tygodnia w PBS w temperaturze 4 °C bez obserwowanego pogorszenia jakości.
5. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć fluorofor w ECM, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostała nienaruszona. Kilka połamanych kwadratów jest ogólnie tolerowanych.
6. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila przenieś wzorzyste siatki do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 30 mm zawierającego sterylny PBS.
7. Odessać PBS z naczynia i nałożyć 2 ml 0,5 mg/ml sprzężonej z fluoroforem konkanawaliny A. Inkubować przez noc w temperaturze 25 °C w sterylnym środowisku.
8. Usuń roztwór konkanawaliny A z naczynia (bez suszenia kratek) i umyj kratki 3x PBS. Do każdego prania dodawaj i usuwaj 2 ml PBS z naczynia.
9. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć fluorofor w ECM, aby potwierdzić wzór i to, że folia węglowa pozostała nienaruszona. Kilka połamanych kwadratów jest ogólnie tolerowanych.
10. Po ostatnim umyciu wyjmij PBS z naczynia ze szklanym dnem i dodaj 2 ml świeżo przygotowanej, sterylnie przefiltrowanej, uzupełnionej Schneider's Drosophila media²¹, zawierającej 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/ml insuliny, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Inkubować w temperaturze 25 °C w sterylnym środowisku, aż neurony będą gotowe do poszczepienia.

7. Przygotowanie pierwotnych komórek Drosophila przed siewem

1. Wysterylizuj naczynie do rozwarstwiania o średnicy 55 mm z 70% EtOH, a następnie dodaj do naczynia 2-3 ml sterylnie przefiltrowanego 1× soli fizjologicznej (9,9 mM HEPES pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM NaH₂PO₄, 0,22 mM KH₂PO₄, 3,3 mM glukozy, 43,8 mM sacharozy)²¹.
2. Delikatnie wybierz 30-40 larw w trzecim stadium rozwojowym z pożywienia za pomocą pęsety.
3. Umieścić larwy w probówce z 1× PBS, a następnie przenieść je do drugiej probówki z 1× PBS, aby umyć larwy.
4. Przenieś larwy do probówki z 70% EtOH, aby zmyć PBS, a następnie przenieś je do drugiej probówki z 70% EtOH. Pozostaw larwy w drugiej probówce na 2-3 minuty, aby wysterylizować larwy.
5. Przenieś larwy do probówki z 1× soli fizjologicznej, a następnie natychmiast przenieś je do drugiej probówki z solą fizjologiczną o
stężeniu 1×.
6. Przenieść pojedyncze larwy na naczynie preparacyjne zawierające 1× soli fizjologicznej. Za pomocą kleszczy i mikroskopu preparacyjnego szybko rozerwij każdą larwę, aby wydobyć mózg i przenieś go do trzeciej probówki z 1× soli fizjologicznej. Powtarzaj, aż wszystkie mózgi zostaną wyekstrahowane.
7. Odwirować probówkę zawierającą mózgi o masie 300 x g przez 1 minutę.
8. Odrzucić supernatant i przemyć 1 ml soli fizjologicznej z rozwarstwienia 1× i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 1 minutę. Powtórz ten krok jeszcze raz.
9. Odrzucić supernatant do momentu, aż w probówce pozostanie 200-250 μl i dodać 20 μl 2,5 mg/ml liberazy do 1x sól fizjologiczna.
10. Obracać probówkę na rotatorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; w ciągu tej godziny pipetować roztwór 25-30 razy co 10 minut. Pod koniec roztwór powinien być lekko nieprzezroczysty.
11. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
12. Odrzucić sklarowany osad, a następnie dodać 1 ml uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30 razy, aby wymieszać.
13. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
14. Odrzucić supernatant i przemyć osad komórkowy, dodając 1 ml uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30 razy, aby wymieszać.
15. Odwirować komórki o masie 300 × g przez 5 minut.
16. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy z 300 μl uzupełnionej pożywki Schneidera. Odpipetować roztwór 30-40 razy, aby wymieszać.

8. Hodowla i zakażenie RSV komórek BEAS-2B i HeLa

1. Utrzymywać komórki HeLa i komórki BEAS-2B w kolbach T75 w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ . Komórki pasażowe co 3-4 dni osiągają około 80% konfluencji. Utrzymuj komórki HeLa w DMEM + 10% FBS + 1× antybiotyk-antybiotyk. Utrzymanie BEAS-2B w RPMI + 10% FBS + 1× Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy^6,22,23.
2. Aby uzyskać informacje na temat wysiewu niezainfekowanych komórek, przejdź do sekcji 9. Komórki BEAS-2B i HeLa są podatne na zakażenie RSV; Komórki BEAS-2B wykorzystano we wszystkich eksperymentach z udziałem RSV pokazanych tutaj.
   UWAGA: Wszystkie kroki BSL-2 należy wykonać zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, używając odpowiedniej szafki bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i środków ochrony osobistej (PPE).
3. Przed zakażeniem komórek RSV należy przejść od 5 ×^{10 4} komórek na studzienkę do płytki 6-dołkowej (powierzchnia ~ 9,6 cm²) z 2 ml pożywki wzrostowej i inkubować przez noc.
4. Trypsynizuj i policz jedną studzienkę komórek. Aby dokonać trypsynizacji, odessać pożywkę z jednego dołka i przemyć 2 ml sterylnego PBS bez Mg²⁺ i Ca²⁺ w celu usunięcia resztek pożywki. Dodać 500 μl 0,25% roztworu trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min. Okresowo sprawdzaj komórki, aby zobaczyć, czy zostały uwolnione z powierzchni. Po uwolnieniu komórek dodaj 1,5 ml pożywki hodowlanej.
5. Wymieszaj 100 μl komórek trypsynizowanych ze 100 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl rozcieńczonych komórek do hemocytometru. Policz komórki i oblicz liczbę komórek na studzienkę. Użyj tej liczby, aby obliczyć MOI poniżej.
6. Przygotuj rozcieńczenie RSV-A2mK+²⁴ w pożywce wzrostowej, aby osiągnąć MOI 10 na studzienkę w 750 μl pożywki. MOI RSV-A2mK+ można obliczyć na podstawie miana fluorescencyjnych jednostek ogniskowych (FFU) w zbiorniku podstawowym (na przykład: dla 1,0 × 10⁵ komórek na studzienkę i zapasu RSV 1,0 ×^{10 8} FFU/ml, rozcieńczyć zapas wirusa 1:75 do 1 × 10⁶ FFU/750 μL lub 1,33 × 10⁶ FFU/ml).
7. Odessać pożywkę z komórek w naczyniu 6-dołkowym i dodać 750 μl roztworu wirusa z góry do każdej studzienki.
8. Kołysz talerzem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
9. Po upływie 1 godziny zwiększyć całkowitą objętość na studzienkę do 2 ml za pomocą pożywki wzrostowej wstępnie podgrzanej do 37 °C i umieścić płytkę w inkubatorze nastawionym na 37 °C z 5% CO₂ na 6 godzin.
10. Trypsynizuj komórki, aby je uwolnić i przystąp do wysiewu, jak opisano poniżej. Po wysianiu należy inkubować kratki przez dodatkowe 18 godzin przed zamrożeniem wgłębnym (łącznie 24 godziny po zakażeniu).

9. Wysiewanie komórek na siatkach z mikrowzorami

1. W przypadku hodowanych komórek wykonaj kroki 9.2-9.8; w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila postępuj zgodnie z 9.9-9.11.
2. Trypsynizuj komórki, aby je uwolnić (patrz krok 4 w sekcji 8 powyżej). Aby zmniejszyć agregację komórek, trypsynizuj komórki przy 60% lub mniejszej konfluencji.
3. Wymieszaj 100 μl komórek trypsynizowanych ze 100 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl rozcieńczonych komórek, wymieszać do hemocytometru i policzyć komórki.
4. Rozcieńczyć komórki w pożywce do 2 × 10⁴ komórek/ml.
5. Dodaj 1 μl podłoża na środek naczynia ze szklanym dnem o średnicy 30 mm, aby pomóc w umieszczeniu kratki i zapobiec jej wyschnięciu. Przenieś siatkę z PBS na szkiełku nakrywkowym na środek naczynia ze szklanym dnem. Dodać 10 μl roztworu komórkowego do siatki.
6. Za pomocą mikroskopu jasnego pola obserwuj przyleganie komórek do siatki po 5 minutach. Jeśli większość wzorów pozostaje niezajęta, dodaj dodatkowe 10 μl kropli roztworu komórkowego. Podczas inkubacji utrzymywać siatki i roztwór komórkowy w temperaturze 37 °C.
7. Powtarzaj krok 9.6 do momentu, gdy większość wzorców zostanie zajęta lub wiele zajętych wzorców zacznie mieć wiele komórek. Inkubować siatkę przez 2 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO_{2 ).}
8. Zalać naczynie 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża i inkubować przez noc (37 °C, 5% CO₂ ).
9. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila usuń pożywkę z naczynia zawierającego siatkę i ułóż komórki na szalce.
10. Odczekaj 30-60 minut, aż komórki się przyczepią, a następnie dodaj 2 ml uzupełnionej pożywki Schneidera.
11. Hodować neurony w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez co najmniej 2-3 dni przed zamrożeniem.

10. Obrazowanie i witryfikacja siatek wzorzystych

1. Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające wzorzystą siatkę i hodowane komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Uzyskuj obrazy siatki za pomocą jasnego pola i odpowiednich kanałów fluorescencyjnych, aby wykryć wzór i wszelkie inne oznaczenia w komórkach. Upewnij się, że gęstość i położenie komórek są odpowiednie do dalszego obrazowania i analizy.
   UWAGA: Obrazy jasnego pola i fluorescencji zostały przetworzone w pakiecie oprogramowania FIJI²⁵.
3. Przygotuj zamrażarkę do zamrażania kriogenicznego; rodzaj urządzenia do zamrażania będzie zależał od dostępności, kosztów i funkcji, które są najbardziej odpowiednie dla próbki.
   UWAGA: Pierwotne neurony Drosophila przygotowano na automatycznej zamrażarce wgłębnej, a komórki BEAS-2B przygotowano przy użyciu półautomatycznej zamrażarki wgłębnej.
4. Nałóż złote fiducials na próbki, aby uzyskać prawidłowe wyrównanie serii pochylenia. Osusz próbki, aby usunąć nadmiar pożywki, a następnie zanurz je w kriogenie, takim jak ciekły etan chłodzony ciekłym azotem. W przypadku pierwotnych neuronów Drosophila osuszaj przez 4 sekundy od tyłu. W przypadku komórek HeLa i BEAS-2B osuszaj z obu stron przez 4-6 sekund. Zamrożone kratki można następnie przechowywać w ciekłym azocie do czasu dalszego wykorzystania.
5. Obraz zeszklonych komórek w mikroskopie krioelektronowym, pracującym pod napięciem 300 kV z kamerą bezpośredniego detektora elektronów. Skonfiguruj zbieranie serii pochylenia dla każdego regionu zainteresowania za pomocą oprogramowania, takiego jak SerialEM²⁶ do zbierania danych cryo-EM/cryo-ET.
   UWAGA: Serie nachylenia pierwotnych neuronów Drosophila zebrano na bezpośrednim detektorze elektronów od -60° do 60° dwukierunkowo w krokach co 2° przy rozogniskowaniu -8 μm przy rozmiarze piksela 4,628 A, dla całkowitej dawki 70-75 e^-/Ų. Serie BEAS-2B zakażone wirusem RSV zebrano na bezpośrednim detektorze elektronów z filtrem energii (szczelina 20 eV) przy rozogniskowaniu -5 μm o rozmiarze piksela 4,603 A i całkowitej dawce ~80 e^{-/Å 2}.
6. Przetwórz serię pochylenia, aby zrekonstruować tomogramy.
   UWAGA: Prezentowane tutaj tomogramy zostały zrekonstruowane przy użyciu pakietu IMOD²⁷; Filtrowanie dolnoprzepustowe zostało wykonane za pomocą pakietu oprogramowania EMAN2²⁸.

Wyniki

Ta procedura została użyta do stworzenia wzoru siatek EM dla eksperymentów z całokomórkowymi krio-ET. Cały przebieg pracy przedstawiony w tym badaniu, w tym wstępne przygotowanie hodowli komórkowych, mikrowzorce (Rysunek 1) i obrazowanie, obejmuje 3-7 dni. Zastosowano dwuetapową procedurę w celu wytworzenia warstwy przeciwporostowej poprzez nałożenie PLL na siatkę, a następnie połączenie PEG poprzez dodanie reaktywnego PEG-SVA. Warstwę przeciwporostową można również nakładać w jednym kroku, dodając PLL-g-PEG w jednej inkubacji. Żel PLPP jest katalizatorem do mikromodelowania UV, który jest również dostępny w postaci mniej skoncentrowanej cieczy. Żel pozwala na modelowanie w znacznie zmniejszonej dawce w porównaniu z płynem, co skutkuje znacznie szybszym modelowaniem. W przypadku tego systemu rzeczywisty czas tworzenia wzoru pełnej siatki TEM wynosił ~2 minuty. Sam przepływ pracy mikrowzorów trwa zazwyczaj 5-6 godzin i pozwala osobie na modelowanie ośmiu siatek dla standardowej hodowli komórkowej na siatkach TEM.

Wiele etapów procesu mikrotworzenia wymaga długiego czasu inkubacji (zobacz kroki 2.1, 2.3, 6.4). Dogodnie, niektóre z tych etapów, takie jak pasywacja PLL (2.1) lub pasywacja PEG-SVA (2.3), mogą być rozszerzone do inkubacji przez noc. Dodatkowo, siatki mogą być wcześniej wzorowane i przechowywane w roztworze białka ECM lub PBS do późniejszego wykorzystania. W naszym badaniu opcje te były cenne w przypadkach, w których czas przygotowania i wysiewu komórek ma kluczowe znaczenie, takich jak pierwotne neurony Drosophila i zakażenie RSV komórek BEAS-2B.

Siatki zostały przygotowane w warunkach laboratoryjnych ogólnego poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) przy użyciu czystych narzędzi, sterylnych roztworów i zawierały antybiotyki/leki przeciwgrzybicze w pożywce wzrostowej^6,22,29,30. W przypadku próbek szczególnie wrażliwych na zanieczyszczenie mikrobiologiczne warstwę przeciwporostową i ECM można zastosować w kapturze do hodowli tkanek lub w innym sterylnym środowisku. Dodatkowo siatkę można myć w etanolu między modelowaniem a aplikacją ECM. W przypadku pracy z czynnikami zakaźnymi ważne jest, aby dostosować procedurę tak, aby była zgodna z odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.

Ten przepływ pracy i przedstawione procedury (Rysunek 1) pozwoliły komórkom HeLa (Rysunek 4), komórkom BEAS-2B zakażonym wirusem RSV (Rysunek 3, Rysunek 5), oraz pierwotnym neuronom larwalnym Drosophila (Rysunek 6, Rysunek 7) zostały zasiane na wzorzystych siatkach EM w celu optymalnego zbierania danych krio-ET.

Komórki HeLa wysiane na mikrowzorcowych siatkach TEM zachowują żywotność, zgodnie z ustaleniami barwienia fluorescencyjnego przy użyciu testu żywotności komórek opartego na kalceinie-AM i etydynie-1 (Rysunek 4A,B). Używając mieszanego ECM kolagenu i fibrynogenu, komórki HeLa łatwo przylegają do wzorców w całej siatce (Rysunek 4A, C). Ogólna morfologia komórek, które rozszerzają się zgodnie ze wzorcem, jest podobna do morfologii komórek rosnących na niewzorzystych siatkach (Rysunek 4C, D). W przypadku komórek HeLa całkowita grubość komórki wynosi ~< 10 μm ze znacznie cieńszymi obszarami o grubości ~< 1 μm w pobliżu obwodu komórki (Rysunek 4E,F).

Dla badań nad RSV, wzorowaliśmy całe kwadraty siatki za pomocą gradientu, z ekspozycją na niską dawkę na krawędziach i wzorem wyższej dawki w kierunku środka (Rysunek 3A). Wzorce gradientowe przyniosły lepsze wyniki podczas poszukiwania uwolnionych wirusów obecnych w pobliżu peryferii komórek. Stwierdzono, że dzięki tym wzorcom komórki preferencyjnie przylegają do wyższego stężenia ECM, ale są również w stanie przylegać i rosnąć przy niższych stężeniach ECM. Dawka względna między obszarami będzie musiała zostać zoptymalizowana w przypadku stosowania wzorców, które wymagają wielu dawek. Jeżeli dawki, a tym samym stężenia ECM, są zbyt podobne lub zbyt różne, efekt stosowania wielu dawek zostanie utracony.

W Rysunek 3, siatka TEM została utworzona, a następnie obsiana komórkami BEAS-2B zakażonymi wirusem RSV i użyta do zbierania danych krio-EM. Rysunek 4A to fluorescencyjny obraz ECM naniesiony na siatkę TEM za pomocą gradientowego wzoru. Adhezja i wzrost komórek wzdłuż centralnego obszaru wzoru można zobaczyć na Rysunek 3B jako obraz komórek w jasnym polu 18 godzin po wysiewie. W Rysunek 3C, sygnał fluorescencyjny (czerwony) z replikacji RSV-A2mK+ jest nałożony na sygnał z ECM. Większość zainfekowanych komórek jest umieszczona wzdłuż centralnego obszaru gradientu o większej gęstości. Mapa TEM o małej magności siatki po kriofiksacji ujawnia szereg komórek, w tym komórki zakażone RSV, umieszczone na folii węglowej w pobliżu środka kwadratów siatki. Jak wykazano wcześniej dla komórek hodowanych na standardowych siatkach TEM²², zlokalizowano i zebrano serie nachylenia wirionów RSV w bliskiej odległości od peryferii zainfekowanych komórek BEAS-2B hodowanych na mikrowzorcowych siatkach (Rysunek 5A,B). Wiele białek strukturalnych RSV można zidentyfikować na tomogramach, w tym nukleokapsyd (N) i białko fuzji wirusa (F) (Ryc. 5C, odpowiednio niebieska i czerwona strzałka).

Dla głównych badań neuronów Drosophila stwierdzono, że wąski wzór, bliski limitowi rozdzielczości oferowanemu przez oprogramowanie (gdzie grubość wzoru wynosiła 2 μm), pozwalał na wyizolowanie od jednej do kilku komórek w kwadracie siatki (Rysunek 6). Soma neuronalna była w stanie rozciągnąć swoje neuryty w ciągu kilku dni w obrębie wzorca. Pozwoliło to na łatwą identyfikację i akwizycję serii nachylenia neurytów w porównaniu z neuronami hodowanymi na niewzorzystych siatkach (Ryc. 7). Stwierdzono również, że znakowana fluorescencyjnie konkanawalina A, lektyna, która została użyta jako ECM dla kultur neuronalnych Drosophila in vitro^20,21, jest podatna na wzorce.

Neurony Drosophila z larw trzeciego stadium rozwojowego zostały wyizolowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami^20,21,31. Preparaty neuronalne zastosowano do mikrowzorcowych siatek krio-EM, w których konkanawalina A została osadzona na wzorze w celu regulacji rozmieszczenia, rozprzestrzeniania się i organizacji komórek. Neurony na wzorzystych lub niewzorzystych siatkach pozostawiono do inkubacji przez co najmniej 48-72 godziny, a następnie siatki zamrożono w zanurzeniu. Reprezentatywny obraz mikrowzorzystej siatki EM z kilkoma neuronami Drosophila rozmieszczonymi w regionach wzorzystych jest pokazany na Rysunek 6A. Neurony te, pochodzące z transgenicznego szczepu muchy, który ma panneuronalną ekspresję GFP w błonie, można łatwo śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej nie tylko ze względu na jego fluorescencyjne znakowanie, ale także ze względu na jego lokalizację w mikrowzorcach. Podczas gdy neurony hodowane na niewzorzystych siatkach mogą być również śledzone przez sygnalizację GFP za pomocą mikroskopii świetlnej (Figura 7A, żółte kółko), zlokalizowanie ich w krio-EM stało się znacznie trudniejsze ze względu na obecność szczątków komórkowych i zanieczyszczenia z pożywki (Figura 7B, żółte kółko). Taka obecność była zmniejszona w przypadku neuronów na wzorzystych siatkach, prawdopodobnie ze względu na PEG w warstwie przeciwporostowej regionów niewzorzystych, które odpychają resztki komórek przed przyleganiem. Ze względu na wymiary ciała komórki neuronalnej i rozszerzone neuryty (Rysunek 6A, B, żółte kółko), serie nachylenia cryo-ET zebrano wzdłuż cieńszych obszarów komórek (Rysunek 6C, D, czerwone kółko). Błona komórkowa neuronów, mitochondrium (cyjan), mikrotubule (fioletowy), włókna aktyny (niebieskie), struktury pęcherzykowe (pomarańczowy i zielony) oraz makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwony) były dobrze rozdzielone w montażach obrazów o większym powiększeniu i przekrojach przez tomogram 3D (Rysunek 6E). Podczas gdy podobne cechy subkomórkowe można zaobserwować na tomogramach 3D neuronów bez wzorca (Rysunek 7E), trudność w zlokalizowaniu żywotnych celów komórkowych do zbierania danych znacznie zmniejszyła przepustowość.

W Rysunek 8, reprezentatywne obrazy z siatek, w których występują niektóre z tych problemów, zostały zestawione, aby pomóc w ich identyfikacji i rozwiązywaniu problemów. Po określeniu optymalnych warunków, mikrowzorcowanie jest niezawodną i powtarzalną metodą pozycjonowania komórek na siatkach do krio-TEM.

Rysunek 1: Ogólny przebieg mikrowzorców dla cryo-EM. Przepływ pracy można z grubsza podzielić na cztery części: przygotowanie siatki, mikrowzory, ECM i wysiewanie komórek oraz krioprzygotowanie i gromadzenie danych. Główne kroki każdej sekcji są wymienione poniżej nagłówków, a przybliżony czas ukończenia każdej sekcji jest pokazany po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zrzut ekranu oprogramowania z wzorem umieszczonym na siatce. Obszar 1 zawiera stosunek μm/pix do projektowania wzoru. Obszar 2 to linijka do pomiaru siatki. Obszar 3 to miejsce, w którym można dodawać lub zmieniać wzorce i zwroty z inwestycji. Obszar 4 zawiera wszystkie informacje dotyczące umiejscowienia wzorca i dawki. Obszar 5 zawiera opcje dla wzorów, w tym przełączanie nakładek, kopiowanie lub usuwanie wzorów oraz wybieranie wzorów do mikrowzorów. Obszar 6 to miejsce, w którym można zapisywać i ładować szablony. Większe widoki obszarów 4 i 5 są pokazane poniżej dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Komórki BEAS-2B zakażone wirusem RSV na wzorzystej siatce cryo-TEM. (A) Fluorescencyjny obraz wzorzystej siatki po dodaniu fluorescencyjnie znakowanego ECM. Wzorzec wejściowy jest pokazany w lewym dolnym rogu. (B) Obraz w jasnym polu komórek BEAS-2B hodowanych na siatce w A. (C) Połączenie obrazu w A (cyjan) i B (szary) z fluorescencyjnym obrazem komórek zakażonych RSV (czerwony) bezpośrednio przed zamrożeniem wgłębnym; zakażone komórki wykazują ekspresję mKate-2. Podziałka wynosi 500 μm. (D) Mapa krio-TEM siatki w B w małym powiększeniu po zamrożeniu wgłębnym. Obrazy fluorescencyjne są pseudokolorowe. Podziałka skali wynosi 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Żywe/martwe barwienie komórek wzorzystych i niewzorzystych. (A) Fluorescencyjny obraz komórek HeLa wyhodowanych na wzorzystej siatce i wybarwionych kalceiną-AM (barwienie żywych komórek, zielone) i homodimerem etydyny-1 (barwienie martwych komórek, czerwone). (B) Komórki HeLa wyhodowane na niewzorzystej siatce i wybarwione jak w A. (C) Projekcja konfokalnych stosów Z komórki HeLa na wzorzystą siatkę Quantifoil R2 / 2 z 0,01 mg / ml kolagenu i fibrynogenu 647 ECM (czerwony). Komórka została wybarwiona kalceiną-AM (zielony) i Hoechst-33342 (niebieski). (D) Komórki HeLa na siatce bez wzoru inkubowane z kolagenem 0,01 mg / ml i fibrynogenem 647 ECM, inkubowane i barwione kalceiną-AM i Hoecsht-33342. Obrazy fluorescencyjne zostały połączone ze światłem przechodzącym (skala szarości). (E) Projekcja X,Z C. (F) Projekcja X,Z D. Obrazy są pseudokolorowe. Podziałka w (A) i (B) wynosi 500 μm; Podziałka skali w (C) - (F) wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Cryo-ET komórki BEAS-2B zainfekowanej RSV na wzorzystej siatce cryo-TEM. (A) Kwadratowa mapa siatki Cryo-EM komórki BEAS-2B zakażonej wirusem RSV. Przybliżona granica komórki jest oznaczona przerywaną zieloną linią. (B) Obraz obszaru oznaczonego na czerwono w (A) o wyższej rozdzielczości. Przybliżona granica komórki jest oznaczona przerywaną zieloną linią. Wiriony RSV można zobaczyć w pobliżu obrzeży komórki (biała strzałka i żółta ramka). (C) Pojedynczy plasterek Z z tomogramu zebrany w obszarze żółtego pola w (B). Czerwone strzałki wskazują na białko fuzyjne RSV F, niebieskie strzałki wskazują na kompleks rybonukleoproteiny (RNP). Paski skali w punktach od (A)-(C) są osadzone w obrazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Pierwotne neurony pochodzące z mózgów larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium na wzorzystej siatce krio-TEM. (A) Nałożony montaż siatki mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek neuronów Drosophila wyrażających GFP ukierunkowany na błonę na wzorzystych kwadratach siatki z fluorescencyjną konkanawaliną 0,5 mg / mL A. Zielony: Neurony Drosophila. Niebieski: Fotowzór. (B) Montaż obrazu Cryo-EM siatki w (A) po kriokonserwacji. Żółte kółko oznacza ten sam kwadrat siatki, co w (A). (C) Montaż obrazu Cryo-EM kwadratu podświetlonego żółtym okręgiem w (A) i (B). (D) Obraz w większym powiększeniu obszaru ograniczonego czerwonym okręgiem w (C), gdzie zebrano serię nachylenia na neurytach komórki. E. Gruby na 25 nm wycinek tomogramu zrekonstruowany z serii przechyłów uzyskanej z czerwonego okręgu w (C). Na tym tomogramie można zobaczyć różne organelle, takie jak mitochondria (cyjan), mikrotubule (fioletowy), gęste pęcherzyki rdzeniowe (pomarańczowy), jasne pęcherzyki (zielony), retikulum endoplazmatyczne (żółty) i aktyna (niebieski). Makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwone), można również zobaczyć w prawym górnym rogu. Obrazy fluorescencyjne są pseudokolorowe. Paski skali w punktach od (A)-(E) są osadzone w obrazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Pierwotne neurony pochodzące z mózgów larw Drosophila melanogaster w trzecim stadium na niewzorzystych siatkach. (A) Montaż siatki mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek neuronów Drosophila wyrażających GFP ukierunkowany na błonę na kwadratach siatki z 0,5 mg / ml konkanawaliny A. Zielony: Neurony Drosophila. (B) Montaż siatki Cryo-EM tej samej siatki w (A) po zamrożeniu wgłębnym. Żółte kółko pokazuje ten sam kwadrat siatki, co w (A). Zwróć uwagę na obecność szczątków komórkowych i zanieczyszczenia mediów, co utrudniało identyfikację celu w porównaniu z wzorzystymi siatkami. (C) Montaż obrazu Cryo-EM kwadratu podświetlonego żółtymi okręgami na mapach (A) i (B). (D) Obraz w większym powiększeniu obszaru ograniczonego czerwonym okręgiem w (C), gdzie zebrano serię nachylenia na neurytach komórki. (E) Gruby na 25 nm wycinek zrekonstruowanego tomogramu z serii tilt z (C) i (D). Na tym tomogramie widocznych jest wiele organelli, takich jak mikrotubule (fioletowy), aktyna (niebieska), retikulum endoplazmatyczne (żółte) i gęste pęcherzyki rdzeniowe (pomarańczowe). Można również zobaczyć makrocząsteczki, takie jak rybosomy (czerwony). Obrazy fluorescencyjne są pseudokolorowe. Paski skali w punktach od (A)-(E) są osadzone w obrazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Przykłady możliwych problemów z wzorcami. Fluorescencyjne obrazy oznakowanego ECM osadzonego na mikrowzorzystych siatkach. (A) Nierównomierny wzór w poprzek siatki spowodowany nierównomiernym rozprowadzeniem żelu PLPP. (B) ECM nie może przylegać do obszarów pokrytych szablonem PDMS podczas tworzenia wzoru. (C) Nasycony wzór gradientu (prawa strona) lub odwrócony wzór (po lewej) na siatce ze wzorem o zbyt wysokiej dawce całkowitej. (D) ECM przylega do obszarów na paskach siatki, a także do obszaru wzoru z powodu odbić lasera UV podczas modelowania. Obrazy są pseudokolorowe; wzorzec wejściowy jest pokazany w lewym dolnym rogu; Podziałka skali wynosi 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

problem	Potencjalna przyczyna (przyczyny)	Rozwiązywanie problemów
Mikrowzorywanie
Nie widać oświetlenia z lasera PRIMO	• Ścieżka światła nie jest prawidłowo ustawiona	• Sprawdź, czy ścieżka światła mikroskopu jest prawidłowo ustawiona
	• Laser PRIMO nie jest włączony lub laser jest zablokowany
Wiele zepsutych kwadratów siatki	• Dotykanie folii siatkowej pęsetą lub pipetą podczas przenoszenia	• Ostrożnie obchodź się z kratkami
	• Kratka wysuszona podczas inkubacji lub mycia	• Nie dopuścić do wyschnięcia rusztu podczas prania i inkubacji
Duże obszary bez wzorców	• Niewystarczające pokrycie żelem	• Upewnij się, że żel równomiernie rozprowadza się na siatce podczas dodawania
	• Folia siatkowa nieostra podczas tworzenia wzoru	• Dodaj dodatkowy mikrolitr żelu
	•Obszar pokryty szablonem	• Sprawdź ostrość przed utworzeniem wzoru dla każdego regionu
		• Ostrożnie wyśrodkuj siatkę w szablonie
Nasycony lub odwrócony wzór	• Nieprawidłowa dawka	• Wypróbuj różne całkowite dawki dla wzorca
	• Niewystarczające pokrycie żelem	• Upewnij się, że siatka jest równomiernie pokryta żelem
		• Wypróbuj różne wartości dla wzorów w skali szarości
Rozmyty wzór	• Słaba ostrość podczas tworzenia wzorów	• Powtórz kalibrację PRIMO na tej samej wysokości co próbka
	• Nieprawidłowa kalibracja	• Skoncentruj się na folii siatkowej przed wykonaniem wzoru
		• Podziel wzór na dodatkowe regiony do tworzenia wzorów
ECM przylegający poza wzorcem	• Odbicia od żelu lub kurzu	• Upewnij się, że żel jest suchy przed modelowaniem
		• Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe i soczewka obiektywu są czyste
ECM nie jest widoczny po narysowaniu wzorca	• Wybielanie fotograficzne	• Zminimalizuj ekspozycję na światło ECM przed obrazowaniem
	• Nieprawidłowa dawka podczas modelowania	• Wypróbuj zakres całkowitych wartości dawki dla wzorca
	• Niewystarczający czas inkubacji ECM	• Wydłużenie czasu inkubacji dla ECM
Wysiewanie komórek
Zbijanie się komórek	• Nadmierne trawienie	• Używaj niższego procentu trypsyny lub czasu na uwolnienie przylegających komórek
	• Wysoka gęstość komórek	• Pasaż i/lub trawienie komórek przy niższym zbieganiu
		• Nie mieszaj komórek podczas uwalniania
		• Delikatnie pipetować roztwór komórkowy lub używać sitek do komórek
Komórki nie przylegają do obszarów ze wzorem	• ECM nie jest odpowiedni dla typu ogniwa	• Wypróbuj różne stężenia i skład ECM
	• Żywotność komórek jest zmniejszona przed siewem	• Upewnij się, że hodowla komórkowa i warunki uwalniania komórek nie uszkadzają komórek
Komórki nie rozszerzają się po adhezji	• ECM lub wzorzec nieodpowiedni dla typu komórki	• Wypróbuj różne wzorce i ECM
		• W niektórych przypadkach bardziej ciągła folia (R1.2/20 vs R2/1) może sprzyjać ekspansji komórek

Tabela 1: Potencjalne problemy podczas mikromodelowania. W tej tabeli opisano niektóre problemy, które użytkownik może napotkać podczas tworzenia mikrowzorów lub wysiewu komórek. Dla każdego problemu podano potencjalne przyczyny i rozwiązywanie problemów. Reprezentatywne obrazy niektórych problemów można zobaczyć w Rysunek 8.

Dyskusja

Nowoczesne, zaawansowane mikroskopy elektronowe i pakiety oprogramowania obsługują teraz usprawnione automatyczne gromadzenie danych cryo-EM i cryo-ET, dzięki czemu w ciągu kilku dni można namierzyć i zobrazować setki do tysięcy pozycji.^32,33,34,35. Jednym z istotnych czynników ograniczających przepływy pracy z użyciem krio-ET dla całych komórek było uzyskanie wystarczającej liczby możliwych do zebrania celów na siatkę. Ostatnio wiele grup opracowało protokoły dla siatek mikrowzorcowych dla cryo-EM, a jedną z zalet jest poprawa wydajności zbierania danych 16,17,18. W tym miejscu przedstawiono protokół użycia dostępnego na rynku systemu mikrowzorców do mikrotworzenia siatek TEM do badań krio-ET pierwotnych neuronów Drosophila i hodowanych ludzkich linii komórkowych (niezakażonych lub zakażonych RSV). Ten system mikrowzorców jest wszechstronny, a wiele kroków można zoptymalizować i dostosować do konkretnych celów eksperymentalnych. Użytkownik z doświadczeniem w TEM i mikroskopii fluorescencyjnej może szybko nabrać wprawy w przygotowywaniu siatek i mikrowzorcach. Przy starannej praktyce dobre wyniki powinny być osiągalne po kilku iteracjach. Poniżej omówiono niektóre z dostępnych opcji, rozważania dotyczące użytkowników, potencjalne korzyści i przyszłe zastosowania mikrowzorcowania dla cryo-EM.

Jednym z ważnych czynników branych pod uwagę przy stosowaniu cryo-ET na całych komórkach jest wybór siatki EM. Siatki EM składają się z dwóch części: ramy siatkowej (lub wspornika konstrukcyjnego) i folii (lub folii), która jest ciągłą lub dziurawą powierzchnią folii, na której będą rosły komórki. Siatki miedziane są powszechnie stosowane do krio-EM białek i izolowanych kompleksów. Nie nadają się jednak do krio-ET całokomórkowych ze względu na cytotoksyczność miedzi. Zamiast tego złota siatka jest powszechnie stosowana w tomografii komórkowej. Inne opcje obejmują nikiel lub tytan, które mogą zapewniać korzyści w porównaniu ze złotem, takie jak zwiększona sztywność¹⁶. Siatki EM są dostępne z różnymi wymiarami siatki, aby obsługiwać szereg zastosowań. Większe rozmiary oczek zapewniają więcej miejsca na wzrost komórek między prętami siatki i więcej obszarów, które można zbierać w serii pochylania, choć kosztem zwiększonej ogólnej kruchości próbki. Najczęściej stosowaną folią jest perforowany lub dziurawy amorficzny węgiel, taki jak Quantifoils lub siatki C-flat. Cele biologiczne mogą być obrazowane albo przez otwory w węglu, albo przez węgiel przezroczysty elektronowo. Siatki takie jak R 2/1 lub R 2/2, w których otwory mają szerokość 2 μm i są oddalone od siebie odpowiednio o 1 i 2 μm, zapewniają dużą liczbę otworów, a tym samym dużą liczbę potencjalnych obszarów do gromadzenia danych. Jednak niektóre komórki mogą lepiej rosnąć i rozszerzać się na bardziej jednolitych powierzchniach, takich jak siatki R 1,2/20 lub ciągły węgiel. W przypadku dalszego przetwarzania próbki za pomocą mielenia wiązką jonów (cryo-FIB), folia jest usuwana poprzez mielenie, co zmniejsza obawy o ciągłą obecność folii znajdującej się pod spodem. Podobnie jak w przypadku siatki, dostępne są również folie z innych materiałów, przy czym przedstawiony tutaj protokół wzoru jest równie odpowiedni dla siatek SiO₂ . Powszechnie stosowane siatki obejmują złote siatki Quantifoil, ciągły węgiel lub siatkę SiO₂ o oczkach 200 (odstęp ~ 90 μm między prętami siatki) do krio-ET dla całych komórek.

Podczas projektowania wzoru należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Większość tych decyzji zależy od typu komórki i celu eksperymentu. Dobrym punktem wyjścia jest wybór wzoru, który jest zbliżony do kształtu i wymiarów komórek w hodowli. Wiele badań wykazało znaczący wpływ kształtu wzoru na wzrost komórek i układ cytoszkieletu 13,36,37. Należy zachować szczególną ostrożność podczas projektowania wzoru, jeśli mogłoby to spowodować zmianę interesującego go celu. Przetestowano kilka wzorców dla każdego typu komórek, aby określić, które wzorce sprzyjają adhezji i wzrostowi komórek. Elastyczność systemu mikrowzorców pozwala na testowanie wielu wzorców na jednej siatce i zmianę wzorców dla różnych siatek w ramach jednego eksperymentu. Większe wzory (~50-90 μm), takie jak te zastosowane tutaj, zwiększają prawdopodobieństwo, że wiele komórek przylega do jednego obszaru wzoru i pozwala komórkom rozszerzać się i wydłużać po adhezji. Bardziej ograniczone wzorce (20-30 μm) mogą być odpowiednie w eksperymentach, w których izolacja komórek jest bardziej krytyczna niż ekspansja komórek, takich jak eksperymenty z mieleniem wiązki jonów (cryo-FIB). W przypadku zastosowań tomograficznych może być konieczne rozważenie wpływu osi wychylenia. Jeśli wzór jest umieszczony w taki sposób, że wszystkie komórki rosną równolegle do siebie w jednym kierunku, możliwe jest, że wszystkie komórki będą prostopadłe do osi nachylenia po załadowaniu na stolik mikroskopu, co spowoduje niższą jakość danych.

Na siatkach bez wzoru komórki często preferencyjnie przylegają do pasków siatki, gdzie nie mogą być zobrazowane przez TEM. Nawet na wzorzystych siatkach często obserwuje się, że komórki są umieszczone w rogach kwadratów siatki, częściowo zarówno na wzorzystej folii węglowej, jak i na pasku siatki. Ostatnio zastosowano mikrowzory, aby celowo umieścić część komórki nad paskiem siatki¹⁸. Można to uwzględnić w eksperymentach, w których nie jest krytyczne, aby całe obrzeże komórki znajdowało się na folii. Może to być szczególnie ważne w przypadku komórek, które mogą rosnąć większe niż pojedynczy kwadrat siatki, takich jak neurony pierwotne rosnące przez wiele dni.

Istnieje wiele narzędzi, które można wykorzystać do zaprojektowania wzoru. W tym przypadku wzór był ograniczony do mniej niż 800 pikseli w dowolnym wymiarze, dzięki czemu wzór można obrócić pod dowolnym kątem i nadal mieścić się w maksymalnym obszarze, który można utworzyć w jednej projekcji za pomocą tego systemu mikrowzorów. Dzięki temu użytkownik może obracać wzór w celu prawidłowej orientacji z siatką, niezależnie od orientacji siatki na mikroskopie. W tym miejscu siatka została podzielona na sześć obszarów wzoru. Przede wszystkim umożliwia to regulację ostrości między różnymi obszarami siatki. W szczególności złote kratki są bardzo plastyczne i mogą nie układać się całkowicie płasko na szkle. Właściwa ostrość jest niezbędna do uzyskania czystych, wyrafinowanych rezultatów wzoru. Korzystając z wzorów podzielonych na segmenty, należy dokonać tylko niewielkich korekt pozycji wzoru, jeśli siatka nieznacznie się przesunie podczas procesu tworzenia wzorów, chociaż zwykle nie stanowi to problemu w przypadku używania żelu PLPP z szablonami PDMS. Wreszcie, cztery środkowe kwadraty siatki pozostały niewzorzec. Dzięki temu użytkownik jest w stanie wyraźnie zidentyfikować środek siatki, co jest bardzo przydatne w eksperymentach z obrazowaniem korelacyjnym.

Oprogramowanie do tworzenia wzorów dla tego systemu mikrowzorów, Leonardo, ma również bardziej zaawansowane funkcje, takie jak zszywanie i możliwość importowania wzorów w formacie PDF, które wykraczają poza zakres tego protokołu. Oprogramowanie to obejmuje również wykrywanie mikrostruktury i automatyczne pozycjonowanie wzorców, które można wykorzystać na siatkach TEM. Ta funkcja jest najbardziej przydatna, gdy siatka jest bardzo płaska i można ją tworzyć bez konieczności dostosowywania ostrości między różnymi obszarami.

Wybór białka ECM może mieć znaczący wpływ na adhezję i ekspansję komórek. Wiadomo, że niektóre komórki ulegają zmianom fizjologicznym, gdy są hodowane na określonych podłożach³⁸. Przetestowano wiele białek i stężeń ECM pod kątem każdego nowego typu komórek w oparciu o wcześniejsze prace opisane w literaturze. Laminina, fibrynogen, fibronektyna i kolagen są szeroko stosowane w hodowlanych komórkach i mogą być używane jako punkt wyjścia, jeśli inne dane nie są dostępne. Należy jednak również wziąć pod uwagę inne białka ECM, jeżeli powszechnie stosowane białka ECM nie nadają komórkom odpowiednich właściwości przylegania. Było to szczególnie prawdziwe w przypadku pierwotnych neuronów Drosophila , ponieważ wysokie stężenie roślinnej lektyny konkanawaliny A było niezbędne do prawidłowego przylegania komórek. Kompatybilność adhezji komórkowej i wzrostu z ECM można przetestować poprzez narysowanie wzoru na szklanych szalkach lub szkiełkach przed przejściem do siatek TEM. To podejście polegające na wstępnej selekcji jest efektywne czasowo i kosztowo, jeśli konieczne jest zbadanie dużej liczby kombinacji. Włączenie fluorescencyjnie sprzężonego białka ECM jest cenne dla oceny sukcesu i jakości modelowania.

Wysiewanie komórek jest jednym z najważniejszych etapów dla cryo-ET dla całych komórek, zarówno z mikrowzorcami, jak i bez ^6,16,39. W przypadku pierwotnych Drosophila lub innych neuronów, które są kruche, niestabilne w zawiesinie i mogą mieć ograniczoną ilość, preferowane są metody pojedynczego wysiewu zamiast monitorowanego, sekwencyjnego siewu komórek. Pojedynczy etap wysiewu przy zoptymalizowanej gęstości komórek, jak opisano w protokole dla neuronów Drosophila, jest realną opcją dla większości typów komórek. Możliwe jest jednak również wysiewanie komórek na substrat przy niższym stężeniu początkowym i dodawanie większej liczby komórek w monitorowany sposób, jak opisano tutaj i w innej literaturze¹⁸. To sekwencyjne rozsiewanie może w niektórych przypadkach zapewnić bardziej spójne wyniki. Podobnie jak w przypadku standardowej hodowli komórkowej, należy zawsze zachować ostrożność, aby utrzymać żywotność komórek i zminimalizować zlepianie się komórek podczas izolacji.

Kiedy po raz pierwszy zaczynasz przygodę z mikrowzorami, istnieje kilka potencjalnych pułapek, które są szkodliwe dla końcowego wyniku. Staranne obchodzenie się z siatką i sterylna technika, równomierne rozprowadzenie żelu PLPP, właściwa dawka i skupienie podczas modelowania oraz utrzymanie żywotności komórek przed wysiewem to jedne z najważniejszych czynników decydujących o sukcesie. Listę niektórych potencjalnych problemów oraz ich rozwiązań zebrano w tabeli 1.

Siatki z mikrowzorami mogą być używane do pomocy w pozycjonowaniu komórek w celu ustalenia stałej gęstości komórek w całej siatce oraz do pozycjonowania obszarów zainteresowania w obszarach odpowiednich do zbierania serii pochylenia^16,18. Rozmieszczenie i pozycjonowanie komórek może być wykorzystane jako markery odniesienia do korelacji w eksperymentach krio-CLEM, zmniejszając potrzebę stosowania delikatnych siatek szukacza i fluorescencyjnych markerów odniesienia. Należy jednak zauważyć, że takie markery referencyjne mogą być nadal przydatne do korelacji dokładności submikrometrowej^29,40. Co więcej, równomierny rozkład izolowanych komórek jest również bardzo korzystny w eksperymentach z mieleniem wiązką jonów (cryo-FIB) w celu maksymalizacji liczby komórek, z których można wyciąć lamelę¹⁶.

Dodanie mikrowzorców do przepływów pracy krio-EM spowoduje wymierną poprawę przepustowości danych i potencjalnie umożliwi przeprowadzenie nowych eksperymentów. Wraz z dalszym wdrażaniem i rozwojem tej techniki, bardziej zaawansowane zastosowania mikrowzorów, w tym gradienty ECM, wielokrotne osadzanie ECM i składanie mikrostruktur, jeszcze bardziej rozszerzą możliwości cryo-ET w zakresie badania celów i procesów biologicznych w pełnym kontekście komórkowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1% (w/v) Poli-L-Lizyna	Sigma	P8920-100ML
0,22 &mikro; m filtry strzykawkowe Membrana PVDF	Genesee	25-240
22x60-1 Szkiełko nakrywkowe	Fisher	12545F
5/15 Pęseta	EMS (Dumont)	0203-5/15-PO
Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (100X)	ThermoFisher (Gibco)	15240096
Komórki BEAS-2B	ATCC	CRL-9609
Kolagen I, bydlęcy	ThermoFisher ( Gibco)	A1064401
Concanavalin A, Alexa Fluor 350 Conjugate	ThermoFisher (Invitrogen)	C11254
DMEM	Fisher (Lonza)	BW12-604F
EtOH	Fisher (Decon Labs)	22-032-600
Płodowa surowica bydlęca	ATCC	30-2020
Fibrynogen z ludzkiego osocza, Alexa Fluor 647 Sprzężony	ThermoFisher ( Invitrogen)	F35200
Fibronektyna Białko bydlęce, Plasma	ThermoFisher (Gibco)	33010018
Naczynie ze szklanym dnem	MatTek	P35G-1.5-20-C
Glukoza	VWR	0643-1KG
Uchwyt do przygotowania siatki	EMS	71175-01
Komórki HeLa	Hemacytometr ATCC	CCL-2
	Fisher (SKC, Inc.)
HEPES	Fisher (ACROS Organics)	AC172572500
Hoechst 33342	ThermoFisher (Invitrogen)	H3570
Insulina	Fisher (Sigma Aldrich)	NC0520015
KCl	MP Bio	194844
KH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC212595000
Leica-DMi8	Leica Microsystems		Można dostosować za pomocą przystawek do kamery, stolika i obiektywu
Leonardo	Alvé		https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/
Liberase Research Grade	Fisher (Supply Solutions)	50-100-3280
ŻYWY/MARTWY Zestaw żywotności/cytotoksyczności	ThermoFisher (Invitrogen)	L3224
Kamera mikroskopowa	Hammamatsu	C13440-20CU
Zmotoryzowany stage	Mä RZHÄ użytkownik Wetzlar	00-24-599-0000
NaCl	Fisher (Fisher BioReagents)	BP358-1
NaH2PO4	Fisher (ACROS Organics)	AC207802500
NaOH	Fisher (Alfa Aesar)	AAA1603736
PBS	Corning	21-040-CV
Szablony PDMS	nanoscaleLABS		PDMS_STENCILS_EM https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/
PEG-SVA	nanoscaleLABS	PEG-SVA-1GR	mPEG-Succinimidyl Valerianian, MW 5,000
Penicylina	Fisher (Research Products International Corp)	50-213-641
Paski pH	Fisher (Millipore Sigma)	M1095350001	również użyć sondy pH
PLPP	nanoscaleLABS	PLPP-GEL-300UL	https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/
PRIMO	Alvé		https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/
pSynkRSV-I19F (BAC zawierający antygenomiczne cDNA RSV A2-mK+ )	BEI Resources	NR-36460	https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx
Siatki Quantifoil	EMS (Quantifoil)	Q2100AR1	2 &mikro; m otwory rozstawione co 1 i mikro; m od siebie, dostępne są inne wymiary
RPMI	Fisher (Lonza)	BW12-702F
RSV A2-mK+	patrz wpis dla pSynkRSV-19F-Opisany		w Hotard et al. [22]. Może być wygenerowany z pSynkRSV-ll9F
Schneider's Media	ThermoFisher (Gibco)	21720-024
	SerialEM SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Pęseta prosta	EMS (Dumont)	72812-D
Streptomycyna	Fisher (Fisher BioReagents)	BP910-50
Sacharoza	Avantor	4097-04
Tetracyklina	Sigma	T8032-10MG
Mikroskop elektronowy Titan Krios	ThermoFisher		300kV, z kamerą bezpośredniego detektora elektronów i filtrem energii
Trypsyna	ThermoFisher (Gibco)	15090046
Rewolwer/Rotator	lampowy Fisher (Thermo Scientific)	11676341
UAS: mcD8: GFP Szczep muchy	Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center	5146	http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html