Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Summary

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Abstract

Wzrost częstości występowania chorób konformacyjnych chorób neurodegeneracyjnych białek (PCD) przyczynił się do dużego zainteresowania tym tematem na przestrzeni lat. W związku z tym zwrócono na nie większą uwagę i wezwano do dywersyfikacji i ulepszenia modeli zwierzęcych zdolnych do odtwarzania fenotypów chorobowych obserwowanych u ludzi z PCD. Chociaż modele mysie okazały się nieocenione, są drogie i wiążą się z pracochłonnymi, niskoprzepustowymi metodami. Wykorzystanie modelu nicieni Caenorhabditis elegans do badania PCD jest uzasadnione jego względną łatwością konserwacji, niskimi kosztami i krótkim czasem wytwarzania, co pozwala na zastosowania o wysokiej przepustowości. Dodatkowo, wysoka zachowalność między C. elegans a ludzkim genomem sprawia, że model ten jest nieocenionym narzędziem odkrywczym. Nicienie, które wykazują ekspresję fluorescencyjnie znakowanych tkanek specyficznych dla tkanki odcinków poliglutaminy (polyQ), wykazują agregację zależną od wieku i długości polyQ, charakteryzującą się ogniskami fluorescencyjnymi. Takie reportery są często wykorzystywane jako proxy do monitorowania zmian w proteostazie w tkankach. Ręczna kwantyfikacja zagregowana jest czasochłonna, co ogranicza przepustowość eksperymentalną. Co więcej, ręczna kwantyfikacja ognisk może wprowadzać błąd systematyczny, ponieważ zagregowana identyfikacja może być wysoce subiektywna. W tym przypadku protokół składający się z hodowli robaków, akwizycji obrazu i przetwarzania danych został ustandaryzowany w celu wsparcia wysokoprzepustowej zagregowanej kwantyfikacji przy użyciu C. elegans, które wyrażają specyficzny dla jelita polyQ. Dzięki wdrożeniu potoku przetwarzania obrazu opartego na C. elegans przy użyciu CellProfiler, oprogramowania do analizy obrazu, metoda ta została zoptymalizowana pod kątem oddzielania i identyfikowania poszczególnych robaków oraz wyliczania ich odpowiednich agregatów. Chociaż koncepcja automatyzacji nie jest całkowicie wyjątkowa, potrzeba standaryzacji takich procedur w celu zapewnienia odtwarzalności, eliminacji odchyleń spowodowanych ręcznym liczeniem i zwiększenia przepustowości jest wysoka. Przewiduje się, że metody te mogą drastycznie uprościć proces badań przesiewowych dużych bibliotek bakteryjnych, genomicznych lub leków przy użyciu modelu C. elegans.

Introduction

Zależne od wieku choroby konformacyjne białek neurodegeneracyjnych (PCD), takie jak choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, czy stwardnienie zanikowe boczne, charakteryzują się nieprawidłowym fałdowaniem białek, które prowadzi do agregacji, śmierci komórek i degeneracji tkanek¹. Chociaż za winowajcę uznaje się nieprawidłowe fałdowanie białek, etiologia tych chorób nie jest jasna. W związku z tym rozwój skutecznych terapii jest utrudniony przez brak wiedzy na temat czynników i warunków, które przyczyniają się do wystąpienia i postępu choroby. Ostatnie badania sugerują, że zmiany w mikrobiomie wpływają na początek, progresję i nasilenie PCDs^2,3,4. Jednak złożoność ludzkiego, a nawet mysiego mikrobiomu utrudnia przeprowadzenie badań, które ujawniłyby dokładny wpływ drobnoustrojów na ich gospodarza. Dlatego prostsze organizmy, takie jak Caenorhabditis elegans, są często używane jako narzędzie do odkrywania^5,6,7,8. W ostatnich badaniach wykorzystano C. elegans do zbadania wpływu bakterii na proteostazę gospodarza i patogenezę choroby^9,10. Kolonizacja bakteryjna, hormeza i zmiany genomowe należą do przykładowych warunków, które wpływają na agregację traktów poliglutaminy (polyQ)^9,11,12. Dodatkowo, te nieprawidłowo sfałdowane klastry białek wykazują zależną od długości i wieku akumulację polyQ w organizmie gospodarza i są związane z upośledzoną ruchliwością^9,13. Stosunkowo proste podejście polegające na ilościowym oznaczaniu znakowanych fluorescencyjnie puncta może wygenerować ważne dane na temat warunków, czynników lub leków, które wpływają na fałdowanie i agregację białek.

Chociaż kwantyfikacja fluorescencyjnej puncta okazała się wiarygodną i stosunkowo prostą procedurą, wyzwaniem pozostaje opracowanie protokołu, który ułatwiłby badania przesiewowe na dużą skalę związków, bakterii lub warunków wpływających na agregację białek. Koncepcja zautomatyzowanego przetwarzania obrazów C. elegans i kwantyfikacji punktowej nie jest całkowicie nowa, ponieważ opracowano szereg praktycznych narzędzi pomocniczych^14,15. Jednak integracja hodowli, akwizycji obrazu i procesu przetwarzania jest niezbędna do wyeliminowania zmienności wyników i umożliwienia badań przesiewowych o większej przepustowości.

W związku z tym, intencją tego manuskryptu jest standaryzacja procedury używanej do ilościowego oznaczania agregacji polyQ u C. elegans jako proxy do wykrywania zmian w proteostazie. Zadanie to zostało zrealizowane dzięki zastosowaniu CellProfiler, oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym¹⁶ zdolnego do automatycznej identyfikacji robaków i agregatów, i jest zintegrowane z większym protokołem do hodowli robaków, pozyskiwania obrazów i przetwarzania danych.

Protocol

Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi bezpieczeństwa, które zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Florydy. Podjęto odpowiednie środki bezpieczeństwa biologicznego w celu ograniczenia ryzyka narażenia na bakterie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.

UWAGA: We wszystkich eksperymentach, C. elegans musi być rozmnażany i utrzymywany na płytkach z pożywką dla nicieni (NGM) wysianych Escherichia coli OP50.

1. Przygotowanie płyt NGM 10 cm

1. Połączyć 3 g NaCl, 2,5 g tryptykazy-peptonu i 17 g agaru w kolbie o pojemności 2 l i napełnić do 1 l wodą podwójnie destylowaną (_ddH2O). Dodaj mieszadło magnetyczne przed autoklawowaniem.
2. Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie przez 45 minut w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 21 psi. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 50 °C w łaźni wodnej.
3. Stosując techniki aseptyki, dodać następujące sterylne roztwory: 1 ml 1 M CaCl_2·2H₂O, 1 ml 1 M MgSO_4·7H₂O, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu rozpuszczonego w 100% etanolu (podgrzanym do temperatury pokojowej) i 25 ml 1 M KH₂PO₄ (pH = 6,0). Wymieszaj za pomocą magnetycznej płytki mieszającej. Mieszanie można prowadzić przez 1 minutę przy 700 obr./min.
4. Wlewać, aż mieszanina wypełni cały 10 cm talerz. Alternatywnie, użyć pipety serologicznej z podziałką, aby dodać około 20 ml mieszaniny na płytkę.
5. Pozostawić płytki do wyschnięcia na 24 godziny w temperaturze pokojowej przed wysiewem z bakteriami lub przechowywać gładkie płytki w temperaturze 4 °C po wysuszeniu.
   UWAGA: Ze wszystkimi elementami mediów należy obchodzić się przy użyciu technik aseptycznych. Kroki 1.3-1.4 należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym.

2. Przygotowanie agaru NGM z FUDR w płytkach 24-dołkowych

1. Wykonaj kroki 1.1-1.3.
2. Uzupełnij NGM 5-fluoro-2′-deoksyurydyną (FUDR) i wymieszaj, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 μg/ml.
   UWAGA: FUDR hamuje replikację DNA, w wyniku czego blokuje rozmnażanie C. elegans poprzez ukierunkowanie na linię zarodkową i embriogenezę, ostatecznie wpływając na długość życia. Dlatego ważne jest, aby umożliwić robakom pełne rozwinięcie się w młode osobniki dorosłe przed przeniesieniem na płytki zawierające FUDR.
   UWAGA: FUDR jest toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z kartą charakterystyki producenta.
3. Za pomocą pistoletu do pipet dozować 1 ml NGM-FUDR do każdej studzienki.
   UWAGA: Proces ten można ułatwić dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego systemu nalewania płyt.
4. Pozostaw szalkę do wyschnięcia na 24 godziny w temperaturze pokojowej przed wysiewem z bakteriami lub przechowywaniem zwykłych talerzy w temperaturze 4 °C.

3. Wysiewanie płytek: OP50 i dodatkowe bakterie testowe

1. Aby przygotować nocną hodowlę E. coli OP50, dodać 200 μl podwielokrotności bakteryjnej z zamrożonego wywaru do 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 250 ml świeżego, sterylnego bulionu Luria (LB).
   UWAGA: Objętość podłoża zależy od liczby płytek, które należy wysiać. Aby przygotować inne kultury bakterii, należy zaszczepić 16 ml probówki hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej bakteriami z zamrożonego wywaru za pomocą sterylnej końcówki mikropipety.
2. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min (obrotów na minutę).
   UWAGA: Używaj wysterylizowanych kolb o co najmniej dwukrotnie większej objętości roboczej pożywki i uszczelnij autoklawowaną folią aluminiową. Wykonaj etap inokulacji i dozowania bakterii przy użyciu technik aseptycznych.
3. Dozuj 1-2 ml nocnej kultury E. coli OP50 na środek każdej 10 cm płytki NGM. Ta kultura nie musi być rozprowadzana wokół płytki NGM.
4. Pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed użyciem/przechowywaniem.
   UWAGA: Talerze wysiewane z założonymi pokrywkami można umieścić w kapturze z przepływem powietrza, aby ułatwić suszenie.

4. Hodowla i siew płytek: płytki 24-dołkowe

1. Przygotuj przez noc hodowlę pożądanych szczepów bakterii, postępując zgodnie z instrukcjami hodowli znajdującymi się w krokach 3.1-3.2.
2. Przenieść 200 μl każdej kultury bakteryjnej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej agar NGM. Objętość bakterii wynosząca 200 μl pokryje cały obszar agaru, maksymalizując ilość pokarmu, aby robaki nie unikały bakteryjnego trawnika.
3. Pozostaw otwarte płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), aby ułatwić suszenie. Okresowo sprawdzaj płytki, aby zapobiec nadmiernemu odwodnieniu i zmieniaj orientację płytek, aby zapewnić równomierny przepływ powietrza i suszenie. Płytki powinny wyschnąć w ciągu 5 godzin
   UWAGA: Wszelkie prace z bakteriami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 muszą być wykonywane w certyfikowanych BSC i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego.

5. Synchronizacja wieku

UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane przy użyciu odpowiednich technik aseptyki (np. praca w pobliżu płomienia lub wewnątrz BSC).

1. Zmyć grawitaryty z 10 cm płytek OP50 za pomocą wysterylizowanego przez filtr roztworu M9 (5,8 g Na₂HPO_4·7H₂O, 3,0 g KH₂PO₄, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO₄·7H₂O, w 1 L ddH₂O).
   1. Kilkakrotnie odpipetować roztwór M9 na płytkę za pomocą sterylnej szklanej lub plastikowej pipety serologicznej, aby usunąć robaki z trawnika bakteryjnego.
   2. Zebrać zawiesinę ślimakową i przenieść roztwór do stożkowej probówki polistyrenowej o pojemności 15 ml.
2. Wirować przy 270 x g, temperaturze pokojowej (RT, ~23 °C), przez 2 min.
3. Odessać za pomocą kolby pułapki próżniowej i odrzucić supernatant, pozostawiając osad robaka w spokoju.
   1. Zawiesić osad w 5-10 ml M9, aby umyć robaki i powtórzyć kroki 5.2-5.3 dwukrotnie.
4. Dodaj 5 ml 20% roztworu wybielającego (8,25 ml ddH₂O, 3,75 ml 1M NaOH, 3,0 ml niebakteriobójczego wybielacza) do probówki i odwracaj w sposób ciągły, aby rozpuścić robaki. Robaki są gotowe do wirowania, gdy prawie całkowicie się rozpuszczą.
   UWAGA: Czas wybielania i objętość roztworu wybielającego będą zależeć od wielkości próbki. Nadmierne i niedostateczne wybielanie to częste błędy. W związku z tym proces ten na ogół wymaga optymalizacji w celu określenia, kiedy próbka jest gotowa do wirowania.
5. Wirować przez 2 minuty przy 423 x g i odrzucić supernatant.
6. Dodać 10 ml sterylnego M9 w celu ponownego zawieszenia granulki jaj.
   1. Wirować probówkę przez 2 minuty przy 423 x g, aby ogranulować jaja. Usunąć supernatant za pomocą kolby aspiratora.
   2. Powtórz kroki 5.6-5.6.1.
7. Zawiesić osad jajeczny w 5 ml sterylnego M9 i umieścić go na noc w nutatorze w żądanej temperaturze.
   UWAGA: Larwy L1 zsynchronizowane z wiekiem będą gotowe do przeniesienia na płytki następnego dnia.

6. Przygotowanie robaka po synchronizacji wieku

1. Odwirować zsynchronizowane z wiekiem robaki przy 270 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (~23 °C).
2. Zassać supernatant w czystym środowisku, takim jak okap przepływowy lub obok palnika Bunsena. Pozostawić około 200 μl supernatantu i ponownie zawiesić robaki.
3. Za pomocą mikropipety przenieś zagęszczoną zawiesinę ślimakową na 10 cm płytki NGM, które zostały wcześniej wysiane OP50.
   UWAGA: Każdy talerz może pomieścić 1,500 robaków bez wyczerpania jedzenia; Jednak stężenie to może wymagać dostosowania w zależności od gęstości trawnika bakteryjnego i temperatury wzrostu. Zaleca się używanie wielu płytek, aby zapobiec głodzeniu robaków. Należy pamiętać, że tabliczki te nie mogą zawierać FUDR.
4. Pozostawić płytki do wyschnięcia, następnie odwrócić i przechowywać w temperaturze 25 °C przez 48 godzin
   UWAGA: W zależności od stanu ekranu, robaki z kroku 6.1 można umieścić bezpośrednio na płytkach testowych (zawierających bakterie, leki lub związki testowe). Jeśli pożądane warunki testowe wpływają na rozwój, robaki powinny być hodowane na NGM zawierającym OP50 aż do młodych dorosłych (~48 godzin) przed wystawieniem ich na warunki testowe.
5. Po 48 godzinnej inkubacji umyć robaki z płytek sterylnym roztworem M9 i umieścić je w stożkowych probówkach.
   UWAGA: Dorosłe robaki opadną na dno rurki. Dokładny czas będzie się różnić w zależności od liczby robaków odzyskanych z 10-centymetrowych płytek. W tych warunkach robaki osiadają w ciągu 10 minut.
6. Przeprowadzić oględziny w celu określenia czasu osiadania, tak aby usunąć wszelkie resztki jaj lub wyklute larwy.
7. Dodaj dodatkowe 10 ml M9, aby wypłukać resztki bakterii z ciał robaków.
   1. Odwirowywać robaki przez 2-3 minuty w temperaturze 270 x g w temperaturze 23 °C.
   2. Wykonaj krok prania dodatkowo 3 razy. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, po ostatnim praniu pozostaw około 1-1,5 ml roztworu M9 w probówce.
   3. Przenieść 10 μl zawiesiny ślimakowej na szkiełko podstawowe i policzyć liczbę robaków.
   4. Dostosuj gęstość robaków do około 150 robaków na 10 μl M9. Stężenie robaków w zawiesinie można regulować, usuwając lub dodając roztwór M9 po odwirowaniu.
   5. Potwierdź, że żądane stężenie zostało ustalone, uśredniając liczby z kilku różnych kropli. Zaleca się uśrednienie liczb z co najmniej trzech kropli.
8. Stosując techniki aseptyczne, przenieść 10 μl zawiesiny robaków zawierającej około 150 robaków do każdej studzienki płytki testowej.
9. Sprawdź studzienki pod mikroskopem, aby upewnić się, że każda z nich ma wystarczającą liczbę robaków. Przed inkubacją można dodać dodatkowe robaki.
10. Pozostawić płytki do wyschnięcia na około 10 minut, a następnie odwrócić i przenieść do inkubatora w temperaturze 25 °C na 72 godziny
    UWAGA: Końcowy okres inkubacji można dostosować do potrzeb eksperymentu. Czas inkubacji wynoszący 72 godziny jest wystarczający do utrzymania wzrostu 150 zwierząt żywiących się bakteriami o wielkości 200 μl na 24-dołkowej płytce w temperaturze 25 °C.

7. Przygotowanie robaków do obrazowania

1. Aby ułatwić skuteczniejsze osiadanie i zminimalizować utratę próbki, należy unieruchomić robaki przed myciem, aby zapobiec pływaniu.
   UWAGA: W przypadku pracy z niewielką liczbą próbek można to osiągnąć poprzez ekspozycję na lewamizol (100 μM). Jednak w przypadku pracy z dużą liczbą próbek robaki mogą zostać unieruchomione przez zamrożenie. Dodatkowo przedłużone mrożenie (18-24 h) zapobiegnie dalszemu rozwojowi kruszyw polyQ podczas przygotowania.
   1. Umieścić płytki wielodołkowe w temperaturze -20 °C na 15-20 minut lub do momentu, gdy robaki przestaną się poruszać.
   2. Wyjmij próbki z zamrażarki i pozostaw je na 5 minut.
2. Za pomocą mikropipety dodać 1 ml M9, schłodzonego do temperatury 4 °C, do interesującego nas studzienki, kilkakrotnie nacisnąć i wcisnąć tłok 4-6 razy, aby umyć robaki w każdym dołku.
   UWAGA: Czasami robaki mogą przyklejać się do końcówek mikropipet. W związku z tym między każdą studzienką należy stosować różne końcówki, aby zapobiec mieszaniu się robaków.
3. Przenieś zawiesinę ślimakową do probówki mikrowirówki i pozwól robakom opaść na dno.
4. Odessać i wyrzucić supernatant. Umyć próbkę w sumie trzy razy.
5. Po tym, jak robaki osiądą na dnie podczas końcowego mycia, odessać 500 μl supernatantu, pozostawiając 500 μl do ponownego zawieszenia robaków.
6. Przenieść pozostałą zawiesinę ślimakową na nową płaską płytkę 24-dołkową i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 48 godzin
   UWAGA: Zamrażanie robaków zmniejsza fluorescencję tła i umożliwia lepszą wizualizację agregatów.

8. Obrazowanie

1. Wyjmij talerze z zamrażarki i pozwól im się rozmrozić, zetrzyj nadmiar kondensatu i zdejmij pokrywkę przed obrazowaniem.
   UWAGA: Szczegóły przechwytywania obrazu będą się różnić w zależności od używanego sprzętu i oprogramowania. Protokoły do tej sekcji powinny służyć jedynie jako przewodnik i należy spodziewać się modyfikacji. Jest również wymagane do przechwytywania obrazów w formacie pliku tiff.
2. Podczas rejestrowania obrazu należy używać następujących ustawień mikroskopu: czas ekspozycji, 500 ms; 40-krotne powiększenie z adapterem aparatu 0,63x (25,2x), intensywność GFP ustawiona na 100%.
   UWAGA: Różne konfiguracje i systemy mikroskopów mogą rejestrować obrazy różniące się od tych podanych w sekcji wyników. Aby uzyskać bardziej uniwersalny opis wymaganych obrazów, podano bardziej obiektywne szczegóły dotyczące obrazów. Agregacje muszą mieć średnicę od 1,0 do 10,0 pikseli i intensywność fluorescencji 0,10-1,0 (dowolne jednostki, skala 0-1), aby mogły być prawidłowo zidentyfikowane przez CellProfiler. Tło fluorescencyjne dla tych zagregowanych obrazów jest na ogół poniżej progu 0,10. W przypadku obrazów w jasnym polu intensywność robaka waha się od 0,7 do 1,0 przy intensywności tła 0,1-0,2. Średnia długość robaków na obrazach w jasnym polu waha się od 250 do 350 pikseli długości od głowy do ogona.
3. Dostosuj sterowanie światłem przechodzącym, aż robaki będą wyświetlane jasno oświetlone w porównaniu z ciemnym tłem. Unikaj nadmiernej ekspozycji; Zwiększy to rozmiar robaka.
4. Może być konieczna zmiana pozycji robaków w studni, aby zapobiec nadmiernemu zbrylaniu. Zbrylone robaki rozprowadź za pomocą końcówki do pipety.
5. Ustaw kanał na GFP, aby ustalić płaszczyznę ogniskową dla obu obrazów.
   UWAGA: Istotne jest, aby płaszczyzna ogniskowej została wyznaczona w kanale GFP. Każda zmiana ostrości dokonana podczas rejestrowania obrazów w jasnym polu spowoduje niewspółosiowość agregatów i robaków podczas analizy obrazu.
6. Uchwyć obraz w jasnym polu i natychmiast wykonaj odpowiadający mu obraz fluorescencyjny bez naruszania płyty.
7. Uruchom obrazy testowe przez potok, aby określić wartości intensywności i rozmiaru obiektów na obrazie zgodnie z "UWAGA" po kroku 8.2.
   UWAGA: CellProfiler może dostarczyć wszystkich niezbędnych informacji dotyczących intensywności i długości obiektów przed analizą.
8. Aby ocenić obrazy, najpierw pobierz CellProfiler¹⁷. Otwórz oprogramowanie i przeciągnij i upuść interesujące obrazy do pola Obrazy.
9. Kliknij obrazy na liście plików, aby je otworzyć.
10. W lewym górnym rogu ekranu znajduje się kilka ikon; użyj ich, aby zmierzyć rozmiar obiektów lub powiększyć określony obszar. Wybierz lupę, aby podświetlić obszar zainteresowania.
11. Wybierz ikonę strzałki, aby zmierzyć długość zarówno robaków, jak i agregatów.
12. Najedź kursorem na żądany obiekt, aby określić jego wartość intensywności, którą można zobaczyć w dolnej części ekranu.
    UWAGA: Ponieważ wszystkie zdjęcia są robione w skali szarości, wszystkie wartości pikseli czerwonego, niebieskiego i zielonego będą identyczne.

9. Analiza obrazu

1. Aby skorzystać z potoku analizy obrazu CellProfiler, należy prawidłowo nazwać pary obrazów. Należy użyć następującego formatu: P1_A01_S1_C1, gdzie P1 odnosi się do konkretnej tabliczki i jej odpowiedniego oznaczenia numerycznego; "A" odnosi się do wiersza, a "01" do kolumny; "S" odnosi się do określonej pary obrazów dla pojedynczej studni; "C" odnosi się do kanału, gdzie "1" jest używane do oznaczania obrazów w jasnym polu, a "2" do obrazów fluorescencyjnych.
2. Pobierz CellProfiler (wersja 4.1.3 lub nowsza) z oficjalnej strony internetowej¹⁷.
3. Pobierz potok (plik uzupełniający 1). Przekaż potok (potok) do programu CellProfiler, wybierając pozycję Plik > Importuj > potok z pliku File.
   UWAGA: Moduły 2 i 3 zostały wyłączone, ponieważ zostały uznane za niepotrzebne. Ich funkcja może zostać przywrócona, jeśli analiza obrazu nie zapewni zadowalającej separacji i identyfikacji robaków; Wymagana jest jednak modyfikacja rurociągu.
4. Aby włączyć te moduły, zaznacz pola znajdujące się po lewej stronie każdego modułu. Zmień nazwę wejściowego obrazu binarnego modułu "UntangleWorms" na obraz wyjściowy z modułu "convertobjectstoimage".
5. Podczas pierwszego użycia może pojawić się komunikat o błędzie związany z modułem 2. W takim przypadku należy przystąpić do analizy.
6. Prześlij zestaw treningowy służący do identyfikacji robaków do modułu "UntangleWorms". Ten zestaw treningowy można znaleźć w pliku uzupełniającym 2.
   1. Wybierz moduł UntangleWorms, aby otworzyć jego ustawienia.
   2. Zidentyfikuj nazwę pliku zestawu treningowego i wybierz ikonę przekazywania pliku.
   3. Prześlij plik uzupełniający 2 (zestaw treningowy).
7. Prześlij obrazy, wybierając moduł Obrazy w lewym górnym rogu. Przeciągnij i upuść obrazy o odpowiednich nazwach, zgodnie z opisem w kroku 9.1.
8. Przed analizą obrazów wybierz żądany folder wyjściowy, który będzie używany do przechowywania wyników.
   1. Kliknij przycisk Ustawienia wyjściowe znajdujący się w lewym dolnym rogu programu.
   2. Wybierz ikonę folderu po prawej stronie opcji Domyślne wyjście, aby wybrać żądaną lokalizację wyjściową.
9. Wybierz ikonę Analizuj obrazy, aby rozpocząć analizę obrazu.
10. Jeśli analiza trwa zbyt długo i utknie w przetwarzaniu pojedynczego obrazu, prawdopodobnie jest to spowodowane problemami z pozyskiwaniem obrazu. W takim przypadku przerwij uruchamianie i przystąp do identyfikacji nieprzetworzonych obrazów, sortując folder wyjściowy i notując, które nazwy obrazów nie zostały znalezione.
    UWAGA: Obrazy mogą wymagać dodatkowego przetwarzania w celu usunięcia dużych lub intensywnie oświetlonych artefaktów, które nie mogą być przetworzone przez potok. W niektórych przypadkach może być konieczne wykluczenie takich obrazów z analizy.
11. Po pełnej analizie oprogramowanie zorganizuje wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel zawierającym poszczególne robaki (kolumna N) i odpowiadającą im liczbę agregatów (kolumna K).
    UWAGA: Pomyślny przebieg spowoduje utworzenie arkusza kalkulacyjnego programu Excel zawierającego liczbę agregatów na zidentyfikowanego robaka dla każdego odwiertu. Dane te mogą być manipulowane w sposób określony przez eksperymentatora.
12. Pobierz organizator metadanych (graficzny interfejs użytkownika) z pliku uzupełniającego 3 (Windows) lub pliku uzupełniającego 4 (Mac), aby wygodnie uporządkować dane z wyjściowego pliku CSV z CellProfiler.
    UWAGA: To oprogramowanie nie ma oficjalnej licencji i nie otworzy się automatycznie po pobraniu.
13. Wykonaj kroki 9.14-9.17, jeśli używasz 64-bitowego systemu operacyjnego Windows. Oprogramowanie nie będzie działać w 32-bitowym systemie Windows. Wykonaj kroki 9.18-9.20 w przypadku korzystania z systemu Mac OS. Kroki 9.21-9.22 są takie same dla obu systemów operacyjnych.
14. W systemie operacyjnym Windows zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj go do żądanej lokalizacji.
15. Zlokalizuj i otwórz wyodrębniony folder o nazwie gui_windowsOS_64x i uruchom aplikację, klikając ikonę aplikacji "gui".
16. Może zostać otwarty monit z prośbą o pozwolenie na uruchomienie. Wybierz pozycję Więcej informacji, a następnie kliknij przycisk Zaufaj mimo to.
17. Organizator metadanych jest gotowy do przeciągania i upuszczania wyjściowych plików CSV CellProfiler. Przejdź do kroku 9.21.
18. W systemie Mac OS znajdź pobrany plik i otwórz gui_macOS_64x.zip. Ten krok powinien automatycznie rozpakować wszystkie pliki.
19. Otwórz wyodrębniony folder znajdujący się w "Pobrane".
20. Kliknij prawym przyciskiem myszy aplikację "gui" i wybierz Otwórz. Pojawi się monit z prośbą o pozwolenie na otwarcie z powodu braku oficjalnej licencji. Wybierz pozycję Otwórz i przejdź do kroku 9.21.
21. Kliknij Prześlij swoje pliki tutaj lub przeciągnij i upuść żądane pliki CSV CellProfiler.
22. Kliknij przycisk Organizuj, który przeniesie użytkownika do nowego ekranu z przyciskiem Pobierz pliki. Kliknij przycisk i wybierz żądaną lokalizację, aby zapisać plik wyjściowy. Plik wyjściowy pojawi się jako oryginalna nazwa pliku z rozszerzeniem "_organized" dodanym do nazwy pliku.

Results

Opisany tutaj jest przepływ pracy C. elegans, który obejmuje protokoły hodowli, akwizycji obrazu i przetwarzania, które pozwalają na ocenę agregacji polyQ w obecności różnych bakterii przy użyciu formatu 24-dołkowej płytki jako platformy do hodowli i obrazowania (Rysunek 1). Protokół ten można dostosować do badania wpływu bakterii, określonych warunków, małych cząsteczek, leków lub manipulacji genomowych na proteostazę gospodarza. Opisana metoda została zoptymalizowana przy użyciu robaków, które konstytutywnie wyrażają jelitowy polyQ połączony z żółtym białkiem fluorescencyjnym (vha6p::p olyQ44::YFP); Jednak inne modele, które informują o proteostazie w mięśniach lub neuronach, mogą być również używane z dalszą optymalizacją. Na przykład wstępne eksperymenty pokazują zastosowanie tych metod w ilościowym oznaczaniu agregatów białkowych w innych tkankach, takich jak poliQ mięśniowy (rysunek uzupełniający 1). Jednak modyfikacja rurociągu będzie wymagana w celu prawidłowego dostosowania do rozmiaru i jasności agregatu, jak wspomniano w sekcji 8 UWAGA.

Rysunek 1: Wizualna reprezentacja przepływu pracy. Główne etapy protokołu obejmują pięć odrębnych etapów: przygotowanie robaka i synchronizacja wieku (kroki 1-5), kolonizacja jelita/leczenie robakami (krok 6), przygotowanie próbki do obrazowania (krok 7), akwizycja obrazu (krok 8) i przetwarzanie obrazu (krok 9). "Sekcje" protokołu są oznaczone na rysunku jako "Kroki". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Początkowe eksperymenty optymalizacyjne ujawniły różne trudności związane z przeludnieniem z powodu dużej liczby potomstwa, co skutkowało szybszym wyczerpywaniem się żywności. Suplementacja FUDR w płytkach NGM opisana w punkcie 2 rozwiązała ten problem (Rysunek 2). Dodatkowo, w obecności FUDR, robaki, które były karmione różnymi bakteriami, miały bardziej spójny rozmiar ciała, co pozwoliło na bardziej jednolite i dokładne wykrywanie robaków.

Rysunek 2: Użycie FUDR poprawia jakość obrazu poprzez zmniejszenie liczby potomstwa. Płytki z dodatkiem FUDR eliminują potomstwo C. elegans w porównaniu z robakami hodowanymi na płytkach NGM bez kontroli FUDR wysianych E. coli OP50. Obrazy zostały uzyskane w powiększeniu 25,2x (powiększenie 40x z adapterem aparatu 0,63x). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Fluorescencja tła przyczyniła się do fałszywie dodatniego wykrywania agregatów polyQ. Aby zredukować taki sygnał fluorescencyjny w przewodzie pokarmowym i poprawić automatyczne wykrywanie agregatów, konieczne było zamrożenie robaków przed obrazowaniem. Zamrażanie robaków w temperaturze -20 °C przez 18-48 godzin znacznie poprawiło wykrywanie agregatów polyQ poprzez eliminację fluorescencji tła (Rysunek 3A). Ludzkie oko jest w stanie rozróżnić agregaty i fluorescencję tła; stąd ręczne liczenie przed i po zamrożeniu jest takie samo (Rysunek 3B). Jednak automatyczne liczenie nie jest tak dokładne, ale zamrożenie znacznie poprawiło automatyczne liczenie z dokładnością porównywalną z liczeniem ręcznym (Rysunek 3B).

Rysunek 3: Zamrażanie poprawia wykrywanie agregatów. (A) Obrazy fluorescencyjne C. elegans wyrażające poliQ44 jelitowe przed i po zamrożeniu. Wstawki reprezentują zbliżenia zaznaczonego obszaru. Podziałka = 500 μm. (B) Średnia liczba agregatów w jelicie u robaków skolonizowanych P. aeruginosa MPAO1 przed i po zamrożeniu przy użyciu ręcznej lub automatycznej (rurociągowej) kwantyfikacji agregatów. Dane reprezentują dwie kontrpróby biologiczne (n = 60-109). Istotność statystyczną obliczono za pomocą testu t-Studenta (**** p < 0,0001). Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odwrócone oświetlenie jasnego pola zostało użyte do wykrycia całego C. elegans (Rysunek 4A) i kanału GFP do zobrazowania polyQ44::YFP agregaty (Rysunek 4B). Wykrywanie, rozplątywanie i kwantyfikacja zagregowanych robaków dla każdego robaka zostały wykonane poprzez zastosowanie zoptymalizowanego potoku przetwarzania obrazu CellProfiler (Plik uzupełniający 1), który pozwala na uzyskanie liczby agregatów na pojedynczego robaka (Rysunek 4C-D). Aby przetestować wykonalność tego podejścia i dokładność automatycznego wykrywania i kwantyfikacji agregatów, robaki wykazujące ekspresję specyficznego dla jelita polyQ44::YFP zostały wyhodowane i przygotowane do obrazowania zgodnie z ustalonymi protokołami (sekcje 1-7). Liczbę agregatów przypadających na robaka oceniano za pomocą automatycznego rurociągu (sekcje 8-9) lub ręcznego liczenia. Każdy eksperyment przeprowadzono w trzech niezależnych próbach z użyciem 90-571 robaków na stan. Podczas gdy średnia liczba agregatów na jelito uzyskana w dwóch badaniach nie miała znaczącej różnicy, robaki w trzecim badaniu miały znacznie mniej agregatów w przypadku ilościowego określenia przy użyciu podejścia automatycznego (Rysunek 5A). Średnia liczba agregatów z trzech badań skutkowała nieznacznie, ale znacznie mniejszą liczbą agregacji, gdy kwantyfikacja została przeprowadzona przy użyciu potoku CellProfiler (sekcje 8-9) (Rysunek 5B). Niemniej jednak różnica między tymi dwoma podejściami była minimalna, co wskazuje, że zautomatyzowana metoda może być stosowana do ekranów na dużą skalę.

Rysunek 4: Zagregowane wykrywanie za pomocą CellProfiler. (A) Obraz Brightfield używany do identyfikacji ciał robaków. (B) Oryginalny obraz fluorescencyjny uzyskany przy użyciu kanału GFP i wykorzystany do identyfikacji i ilościowego określenia całkowitej liczby agregatów poliQ44 w jelitach. (C) Dane zagregowane zidentyfikowane za pomocą narzędzia CellProfiler. (D) Całkowita liczba zidentyfikowanych agregatów nałożonych na oryginalny obraz fluorescencyjny z konturami robaków i agregatów. Przechwytywanie i przetwarzanie obrazu zostało wykonane przy użyciu ustawień opisanych w rozdziałach 8-9. Panele E-H reprezentują zbliżenia odpowiadających im obszarów konturowych na obrazach A-D. Obrazy zostały uzyskane w powiększeniu 25,2x (powiększenie 40x z adapterem aparatu 0,63x). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Skuteczność automatycznej kwantyfikacji agregatów. (A) Średnia łączna liczba na jelito u robaków skolonizowanych kontrolną E. coli OP50 przy użyciu ręcznego liczenia (ręcznego) i automatycznej kwantyfikacji opartej na CellProfiler (Pipeline). Wyniki reprezentują dane analizowane w trzech oddzielnych badaniach (T1-T3) (n = 90-571). (B) Średnią liczbę agregatów na jelito uzyskano przy użyciu ręcznej lub automatycznej (Pipeline) kwantyfikacji zagregowanej. Istotność statystyczną obliczono za pomocą testu t-Studenta (* p < 0,05, ** p < 0,01). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ocenić powtarzalność wyników wśród różnych eksperymentatorów, obrazy z płytki zawierającej sześć dołków robaków, które były karmione Pseudomonas aeruginosa MPAO1 lub Escherichia coli OP50, zostały pozyskane przez trzy osoby, z których dwie nie miały wcześniejszego doświadczenia z obrazowaniem robaków przy użyciu tych protokołów. Obrazy zebrane z każdej studni zawierały od 30 do 115 wykrytych robaków. Nieistotną różnicę w agregacji wykryto u robaków z tych samych studni, które zostały zobrazowane przez trzech eksperymentatorów. Podczas gdy średnia liczba agregatów na jelito pozostała bardzo spójna między trzema eksperymentatorami dla robaków karmionych MPAO1 i OP50, istniały pewne statystycznie istotne różnice w średniej liczbie agregatów, ale tylko u robaków skolonizowanych przez MPAO1 (Rysunek uzupełniający 2). Wyniki te podkreślają powtarzalność wyników nawet wśród niedoświadczonych eksperymentatorów.

Aby upewnić się, że na odtwarzalność zbiorczej kwantyfikacji nie wpływa znacząco pozycja robaka, wybrano zestaw 15 robaków i zobrazowano go 15 oddzielnych razy po mieszaniu pomiędzy każdym przechwytywaniem obrazu za pomocą końcówki do pipety. Obrazy agregatów u robaków karmionych E. coli OP50 i P. aeruginosa MPAO1 zebrano i przeanalizowano za pomocą CellProfiler. Średnia liczba agregatów z każdego z tych różnych zestawów obrazów różniła się nieznacznie, ale nieistotnie, co dodatkowo potwierdza odtwarzalność tego podejścia (rysunek uzupełniający 3).

Wykazano, że kolonizacja jelita C. elegans patogenami Gram-ujemnymi zaburza proteostazę w tkankach, a P. aeruginosa jest jednym z najsilniejszych induktorów agregacji polyQ⁹. Aby ustalić, czy te zoptymalizowane protokoły z powodzeniem wykryją i określą ilościowo wzmocnienie agregacji za pośrednictwem P. aeruginosa, robaki wyrażające poliQ jelitowe skolonizowano E. coli OP50 (bakterie kontrolne), a P. aeruginosa MPAO1, przeprowadzono sekcje 1-8. Pozyskane obrazy analizowano za pomocą programu CellProfiler (sekcja 9, plik uzupełniający 1). Wyniki automatycznej kwantyfikacji wskazują na znaczny wzrost liczby agregatów indukowanych przez P. aeruginosa MPAO1, co konsekwentnie skutkuje dwukrotnym wzrostem w porównaniu z robakami karmionymi kontrolną E. coli OP50 (Rysunek 6).

Rysunek 6: Średnia liczba agregatów na jelito u robaków skolonizowanych kontrolnymi E. coli OP50 i P. aeruginosa MPAO1. Liczbę agregatów w jelicie oceniano za pomocą CellProfiler (punkty 8-9). Dane są reprezentowane jako średnia liczba agregatów na jelito u robaków skolonizowanych OP50 (n = 1068) i MPAO1 (n = 1557). Istotność statystyczną obliczono za pomocą testu t-Studenta (**** p < 0,0001). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zoptymalizowany potok został zaprojektowany do obsługi dużych badań przesiewowych dla warunków wpływających na proteostazę. Aby przetestować wykonalność tego podejścia w badaniach przesiewowych dużych bibliotek bakterii pod kątem ich wpływu na proteostazę gospodarza, zastosowano opisany tutaj potok (sekcje 1-9) w celu przetestowania wpływu 90 nieistotnych zmutowanych szczepów genów z nokautem genu 90 P. aeruginosa na agregację polyQ¹⁸. To pilotażowe badanie przesiewowe jest częścią większego projektu mającego na celu badanie przesiewowe wszystkich nieistotnych zmutowanych szczepów P. aeruginosa pod kątem ich zdolności do wpływania na proteostazę gospodarza. Spośród 90 badanych szczepów bakteryjnych, kolonizacja jelita C. elegans jednym kandydatem wykazała znaczny spadek liczby agregatów (Ryc. 7). Dalsze eksperymenty mające na celu ocenę czułości tego testu przeprowadzono poprzez ręczne zliczanie zagregowane z losowo wybranych sześciu mutantów P. aeruginosa, które różniły się nieistotnie od kontroli MPAO1. Eksperymenty te zostały przeprowadzone przy użyciu bardziej tradycyjnych 6-centymetrowych płytek NGM, przenosząc robaki na szczepy testowe jako L1, aby podsumować wcześniej ustalone metody⁹. Eksperymenty potwierdzające poprzez ręczne liczenie wykazały, że żaden z mutantów, w tym ten, który znacząco zmniejszył liczbę agregatów (Rysunek 7), nie wpłynął na agregację polyQ (Rysunek uzupełniający 4). Ponadto subtelne zmiany w agregacji zaobserwowane w badaniu przesiewowym 90 zmutowanych szczepów nie zostały wykryte wśród ręcznego liczenia wybranych kandydatów, co wskazuje, że takie zmiany mogą wynikać ze zmienności biologicznej i eksperymentalnej, takiej jak niska wartość n. Podsumowując, wyniki wskazują, że chociaż nasza metoda może niezawodnie wychwycić znaczące zmiany, subtelne prawdopodobnie zostaną pominięte, a wszyscy potencjalni kandydaci będą musieli zostać indywidualnie potwierdzeni.

Rysunek 7: Liczba agregatów na jelito w reprezentatywnym zestawie próbek robaków skolonizowanych przez 92 szczepy bakterii. Dane są reprezentowane jako średnia liczba agregatów na jelito znormalizowana do liczby robaków skolonizowanych MPAO1. Linie przerywane reprezentują średnią liczbę agregatów u robaków skolonizowanych za pomocą kontroli MPAO1 (góra, otwarte kółko) i OP50 (dół, otwarty kwadrat). Solidne symbole reprezentują 90 różnych zmutowanych szczepów P. aeruginosa MPAO1 z nokautem. Średnia liczba agregatów na robaka między robakami skolonizowanymi MPAO1 a pojedynczym mutantem była statystycznie istotna. Szare kółka reprezentują próbki, które zostały potwierdzone ręcznie (rysunek uzupełniający 4). Istotność statystyczną obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie wielokrotnego porównania w teście post-hoc Dunnetta (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zarządzać dużą ilością danych generowanych przez CellProfiler, stworzono graficzny interfejs użytkownika (GUI) automatyzujący przetwarzanie i organizację danych (Rysunek 8). Graficzny interfejs użytkownika został opracowany przy użyciu Tkinter, wieloplatformowego zestawu narzędzi widżetów Pythona o otwartym kodzie źródłowym. Z podanych metadanych aplikacja wyodrębnia liczbę agregatów (kolumna K) z każdego dołka (kolumna J) znajdującego się na płycie. Do przeprowadzenia wspomnianego procesu wykorzystano bibliotekę obsługi danych w Pythonie o nazwie "Pandas". Aplikacja GUI zapewnia użytkownikom obsługę przeciągania i upuszczania plików danych. Dane w każdym pliku są przechowywane w postaci dwuwymiarowej struktury tabelarycznej zwanej ramką danych. Pusta para słowników jest inicjowana dla każdej unikatowej studni znalezionej w ramce danych. Następnie odrębne agregaty znajdujące się w każdym dołku są liczone i dołączane do odpowiednich par słownikowych. Kolumna z mniejszą ilością danych jest dopełniana pustymi ciągami wartości, aby upewnić się, że każda kolumna ma równy rozmiar. Na koniec struktura jest konwertowana na ramkę danych, która jest eksportowana w postaci arkusza kalkulacyjnego do katalogu określonego przez użytkownika.

Rysunek 8: Graficzny interfejs użytkownika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wykrywanie specyficznych dla mięśni agregatów polyQ. Robaki wykazujące ekspresję specyficznego dla mięśni polyQ35::YFP posiano jako L1 i hodowano na OP50 przez 48 godzin. Gdy robaki rozwiną się w młode osobniki dorosłe, przeniesiono je na 24-dołkowe płytki NGM, uzupełniono 100 μg/ml FUDR i wysiewano MPAO1 przez dodatkowe 72 godziny przed obrazowaniem. (A) Obraz w jasnym polu używany do identyfikacji ciał robaków. (B) Oryginalny obraz fluorescencyjny uzyskany przy użyciu kanału GFP. (C) Dane zagregowane zidentyfikowane za pomocą narzędzia CellProfiler. (D) Całkowita liczba zidentyfikowanych agregatów nałożonych na oryginalny obraz fluorescencyjny z konturami robaków i agregatów. Przechwytywanie i przetwarzanie obrazu zostało wykonane przy użyciu ustawień opisanych w rozdziałach 8-9. Panele E-H reprezentują zbliżenia odpowiadających im obszarów konturowych na obrazach A-D. Podziałka liniowa = 500 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Odtwarzalność zagregowanej kwantyfikacji między różnymi eksperymentatorami. Średnia liczba agregatów oznaczonych ilościowo za pomocą CellProfiler dla sześciu studzienek robaków skolonizowanych P. aeruginosa MPAO1 (czarne paski) i sześciu studzienek robaków skolonizowanych kontrolnym E. coli OP50 (szare paski). Każdy odwiert został zobrazowany przez trzech eksperymentatorów (AVS, DMC, RDH). Dane są reprezentowane jako średnia liczba agregatów na jelito (n = 30-115). Istotność statystyczną obliczono za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya (* p < 0,05, ** p < 0,01). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Wpływ pozycji robaka na odtwarzalność zagregowanej kwantyfikacji. Średnia łączna liczba na jelito u robaków skolonizowanych kontrolnymi E. coli OP50 (szare paski) i P. aeruginosa MPAO1 (czarne paski). Wyniki reprezentują średnią liczbę agregatów na jelito (15≥n≥12) oznaczoną ilościowo za pomocą CellProfiler. Położenie robaków w studniach było zmieniane przez agitację pomiędzy każdym przejęciem. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w żadnej z grup. Istotność statystyczna została obliczona za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Potwierdzenie ekranu pilota z ręcznym liczeniem. Średnią liczbę agregatów w jelicie określono ilościowo ręcznie. Dane reprezentują profile agregacji robaków skolonizowanych sześcioma mutantami nokautującymi MPAO1 (szare kółka Rysunek 7) w porównaniu z kontrolami MPAO1 i OP50 typu dzikiego (n = 30). Istotność statystyczna została obliczona za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie wielokrotnego porównania w teście post-hoc Dunnetta (**** p < 0,0001). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Wpływ FUDR na agregację poliQ w jelitach. Dane są reprezentowane jako średnia liczba agregatów polyQ44::YFP na jelito (n = 20). Robaki przeniesiono na płytki kontrolne (bez FUDR) lub zawierające FUDR (100 μg/ml) po 48 godzinach wzrostu w temperaturze 25 °C na E. coli OP50. Ręczne liczenie zostało pobrane po dodatkowych 48 godzinach. Istotność statystyczną obliczono za pomocą testu t-Studenta (ns = nieistotne). Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Potok proteostazy. Dostępny do pobrania potok analizy obrazu do użytku w CellProfiler. Instrukcję składania wniosków można znaleźć w punkcie 9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Zestaw treningowy do rozplątywania robaka. Plik do wgrania do modułu "UntangleWorms". Ten konkretny zestaw treningowy jest specyficzny dla robaków używanych w początkowym podejściu. Zmiany w rozmiarze i kształcie robaka zmienią dokładność i jakość identyfikacji. Może być konieczne utworzenie bardziej spersonalizowanego pliku treningowego. Instrukcje dotyczące tworzenia nowego zestawu treningowego można znaleźć na oficjalnej stronie CellProfiler¹⁷. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Graficzny interfejs użytkownika dla systemu operacyjnego Windows. gui_windowsOS_64x.zip. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Graficzny interfejs użytkownika dla systemu operacyjnego Mac. gui_MacOS_64x.zip. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Opisany protokół określa procedury hodowli, obrazowania i przetwarzania obrazów C. elegans , które obejmują CellProfiler, oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Reprezentatywne wyniki wskazują na odtwarzalność, redukcję błędu systematycznego i skalowalność. Ta ustandaryzowana procedura poprawi strategie badań przesiewowych stosowane w dużych bibliotekach bakteryjnych, genomicznych lub leków. Chociaż istnieją inne zautomatyzowane metody wykrywania obiektów C. elegans , opisana technika oferuje ustandaryzowany potok o wyższej przepustowości, który integruje hodowlę, akwizycję obrazu i analizę.

Konieczne było przetestowanie kilku wariantów hodowli robaków, aby zoptymalizować opisany w niniejszym dokumencie protokół. Początkowo robaki przenoszono do próbki bakterii natychmiast po synchronizacji wieku (etap L1). Jednak takie podejście doprowadziło do powstania populacji robaków o różnych rozmiarach, nawet wśród robaków w tej samej studni. C. elegans są znane z unikania patogenów¹⁹, co mogło przyczynić się do obserwowanej zmienności wielkości i ostatecznie wpłynąć w szczególności na dalsze obrazowanie, w szczególności wykrywanie robaków. Aby wyeliminować taką zmienność, cały obszar NGM w każdym dołku został pokryty bakteriami testowymi. Ponadto robaki karmiono E. coli OP50 i pozwalano im w pełni rozwinąć się w młode osobniki dorosłe przez 48 godzin w temperaturze 25 °C. Umożliwienie robakom osiągnięcia dorosłości na E. coli OP50 przed przeniesieniem ich na bakterie testowe skutkowało bardziej spójną wielkością ciała. Dodatkowo przeludnienie i szybkie wyczerpywanie się pokarmu przez potomstwo zostały wyeliminowane poprzez uzupełnienie agaru NGM FUDR. Wdrożenie FUDR usunęło potomstwo i poprawiło automatyczną identyfikację robaków, która była zasłonięta przez mieszanie się potomstwa z populacją rodzicielską. Jednak ważne jest, aby zachować ostrożność i stosować odpowiednie kontrole podczas korzystania z FUDR, ponieważ wiadomo, że związek ten wpływa na proteostazę i długość życia C. elegans ^20,21. W warunkach opisanych w tym protokole FUDR nie wpływał na agregację poliQ w jelitach (rysunek uzupełniający 5); Dlatego jego wykorzystanie było odpowiednie i korzystne dla opisanej metody.

Zamrożenie próbek przed obrazowaniem okazało się kluczowym krokiem w pomyślnym wykorzystaniu rurociągu. Łączne zliczenia przed zamrożeniem były znacznie wyższe niż zliczenia ręczne (rysunek 3B). Utrzymywanie robaków w temperaturze -20 °C przez 18-48 godzin przed obrazowaniem zmniejszyło fluorescencję tła i ostatecznie poprawiło wykrywanie agregatów (ryc. 3A). Wpływ zamrażania na wykrywanie agregatów został zbadany tylko dla polyQ i nie powinien być uogólniany na inne modele bez dalszych badań takich efektów.

Pomimo tego, że wszystkie warunki są takie same, zaobserwowano, że średnia liczba agregatów na robaka może się różnić w różnych seriach, podczas gdy stosunek między liczbą agregatów u zwierząt skolonizowanych OP50 w porównaniu z MPAO1 pozostał stały (Rysunek 6, Rysunek uzupełniający 2, Rysunek uzupełniający 5). Dlatego ważne jest, aby zawsze włączać kontrolę E. coli OP50 lub wszelkie dodatkowe odpowiednie kontrole referencyjne w każdym przebiegu. Na taką zmienność zagregowanych liczb między doświadczeniami mogą mieć wpływ warunki środowiskowe (temperatura, wilgotność)^22,23 lub tło genetyczne⁸. W rzeczywistości zaobserwowano, że po długotrwałej hodowli fluorescencja jelit drastycznie spadła lub została całkowicie utracona, co wymagało rozmrożenia nowego szczepu z zamrożonego bulionu. Obserwowany spadek fluorescencji może być wynikiem zmian genetycznych, które hamują toksyczne transgeny, takie jak te eksprymujące polyQ. Niemniej jednak wyjątkowa powtarzalność wyników obserwowanych między różnymi eksperymentatorami (rysunek uzupełniający 2), między powtórzeniami biologicznymi (rysunek 5) i w obrębie tej samej próbki (rysunek uzupełniający 3) podkreśla siłę tego podejścia.

W licznych doniesieniach wykorzystano poliQ jelitowe do badania proteostazy 9,11,12,13,24,25. Nie można jednak dokonać bezpośredniego porównania wyników ze względu na zmienność między podejściami eksperymentalnymi a metodami odczytu. Niemniej jednak kilka wyników z wcześniej opublikowanych danych jest rekapitulowanych przez opisaną w niniejszym dokumencie automatyczną kwantyfikację, w tym bakteryjną indukcję agregacji ^9,13 i porównywalną liczbę agregatów¹¹. Reasumując, opisany potok stanowi cenne narzędzie do badania proteostazy.

Opisana tutaj metoda wiąże się z pewnymi nieodłącznymi wyzwaniami. Na przykład wymaga to wystarczającej ilości czasu, aby opanować wszystkie składniki tego protokołu, co jest szczególnie prawdziwe w przypadku sekcji 8 protokołu, która wymaga znajomości testu w celu określenia, czy uzyskane obrazy są odpowiednie do analizy rurociągu. Możliwe są odchylenia od ustawień akwizycji obrazu stosowanych w tym protokole; Jednak prawdopodobnie będzie wymagana modyfikacja ustawień i zestawu do trenowania robaków. Rurociąg ten może rozróżniać agregaty o różnych rozmiarach i te, które się stykają, co ogranicza "mieszanie" kruszyw i ostatecznie zwiększa czułość wykrywania. Jednak podczas próby zidentyfikowania dużych agregatów, które przekraczają akceptowany zakres rozmiarów, mogą pojawić się problemy, ponieważ rozszerzenie górnego progu rozmiaru może prowadzić do błędów spowodowanych słabą identyfikacją, takich jak niemożność rozróżnienia zagregowań, które się stykają. Przed analizą obrazu należy znaleźć równowagę między dokładnością, rozmiarem i intensywnością. Skuteczność identyfikacji agregatów można jeszcze bardziej zwiększyć poprzez włączenie uczenia maszynowego w celu stworzenia sieci neuronowej zdolnej do usprawnienia wykrywania agregatów. Takie ulepszenia są obecnie badane i znacznie pomogą w rozwiązaniu bieżących problemów, takich jak wykrywanie agregatów, które leżą na różnych płaszczyznach ogniskowych lub mają nietypowe kształty.

Jedną z istotnych słabości opisanej metody jest zmienność w automatycznym zliczaniu zagregowanym, ponieważ nie zawsze są one rekapitulowane przez ręczne liczenie u robaków karmionych różnymi szczepami bakterii. Na przykład, w oparciu o zautomatyzowane liczenie, robaki karmione mutantem P. aeruginosa 53 (M53) miały znacznie mniej agregatów w porównaniu ze szczepem typu dzikiego (MPAO1) (Figura 7); jednak potwierdzenie trafienia nie wykazało istotnej różnicy (rysunek uzupełniający 4). Ogólnie rzecz biorąc, wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków mają wysoki wskaźnik wykrywania wyników fałszywie dodatnich, a opisana metoda nie jest wyjątkiem²⁶. W związku z tym jest to krytyczna część protokołu, aby potwierdzić wszystkie potencjalne trafienia.

Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem strategii badań przesiewowych w celu identyfikacji bakterii, które wpływają na proteostazę gospodarza, każdy krok może być dalej modyfikowany w celu przetestowania wpływu bibliotek genomowych RNAi, małych cząsteczek lub innych warunków. Na każdym etapie można wprowadzać dodatkowe modyfikacje w celu dostosowania do wymagań konkretnej strategii kontroli przesiewowej. Co więcej, technika ta zapewnia poziom elastyczności, który pozwala na optymalizację każdego kroku w celu dopasowania do określonego modelu. Na przykład, podejście to można rozszerzyć na agregację polyQ w innych tkankach lub ekstrakcję innych cech wykrytych na obrazach, takich jak monitorowanie ekspresji genów za pomocą indukowalnych reporterów fluorescencyjnych (np. genów szoku cieplnego), ocena subkomórkowej lokalizacji białek (np. lokalizacja jądrowa DAF-16), badanie agregacji w innych modelach chorobowych (Aβ_1-42, α-synukleina, TDP-43 itp.) lub ocena fenotypów fizjologicznych. takich jak rozmiar robaka.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,7 ml mikroprobówki	Olympus Plastics	Cat#24-282	Probówki do mikrowirówek
10 ml Pipety serologiczne	GenClone	Cat#12-104	Pipety plastikowe
15 mL Probówki wirówkowe, stojakowe	Olympus Plastics	Cat#28-101	Probówki stożkowe
5-fluoro-2′-deoksyurydyna	Fisher Scientific	D2235100MG	FUDR
Kontroler pipet Accu-jet Pro Genesee	Scientific	91-600RB	Pistolet do pipet
Agar	Fisher Scientific	Cat#BP1423-2	Agar granulowany
	BioRender BioRender		Generator figur graficznych
Wybielacz (regularny)	Clorox	Bar# 044600324111, wybielacz bez rozprysków	4,5% podchlorynu
soduC. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM140, Q35::YFP	Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM738, Q44::YFP	PoliQ
jelitowy CaCl2· 2H2O	Fisher Scientific	Cat#C79-500	Dwuwodny chlorek wapnia
CellProfiler	Broad Institute		Oprogramowanie do analizy obrazu
Cholesterol	Fisher Scientific	Cat#ICN10138201	Głowica
do kąpieli z obiegiem	Lauda	26LE	Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO	CoolLED	8114931	Kontrola i emiter światła fluorescencyjnego
16 ml Probówki hodowlane	Olympus Plastics	21-129	Probówki hodowlane, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50	Centrum Genetyki Caenorhabditis	OP50	E. coli control szczep
Etanol, 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Okular 10x/23B, regulowany, 3d gen	Leica Microsystems	10450910	Zestaw okularów
Zestaw filtrów ET GFP - MZ10F	Leica Microsystems	10450588	Kostka filtra
GraphPad Prism v9.2.0	GraphPad Software, Inc.		Narzędzie do analizy statystycznej
Inkubator Heratherm IMP180	Thermo	51031562	Inkubator z chłodzeniem
Innova 4000	New Brunswick Scientific	M1192-0000	Inkubator wstrząsowy
K5 Kamera	Leica Microsystems	11547112	Stereomikroskopowa
kamera KH2P04	Fisher Scientific	Cat#P285-3	Jednozasadowy fosforan potasu
LAS X Oprogramowanie	obrazowania mikroskopem	Leica Microsystems
Nośnik optyki Leica MZ10 F Leica	Microsystems	10450103	Mikroskop stereoskopowy
Fisher	Scientific	Cat#0215522805	Chlorowodorek lewamizolu
Bulion Luria (Lennox)	Apex Bioresearch Products	Cat#11-125	LB
Magnetyczna płytka mieszająca	Fisher Scientific	11-100-49S Płytka	mieszająca
MgSO4· 7H2O	Alfa	Aesar A14491	siedmiowodne siarczanu magnezu
	Premiere	8205	Pojedyncze matowe szkiełka
mikroskopowe Na2HPO4· 7H2O	Fisher Scientific	Cat#S373-500	Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny
NaCl	Fisher Scientific	Cat#S671-500	Chlorek sodu
NaOH	Fisher Scientific	Cat#S318-3	Granulki wodorotlenku sodu
Obiektywny achromat, f = 100 mm	Leica Microsystems	10411597	Obiektyw mikroskopu
Szalki Petriego	Genesee Scientific	Cat#32-107G	100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Biblioteka mutantów	Manoil Lab (Uniwersytet Waszyngtoński)		P. aeruginosa Biblioteka mutantów
Płytka do hodowli zawiesiny 24-dołkowa, z płaskim dnem	Olympus Plastics	25-102	Służy do hodowli robaków i obrazowania
Tubus trójokularowy 100% Leica z serii M	Microsystems	10450043
Trypticase Peptone	ThermoFisher, Difco	Cat#211921
TX-400 Rotor	Thermo Scientific	Cat#75003181	Wirnik kubełkowy wahadłowy
System filtrów napędzany podciśnieniem	GenClone	Cat#25-227	500 mL, membrana PES, .22 i mikro;
m Obiektyw wideo z mocowaniem C-Mount	Leica Microsystems	10447367	tubus adaptera aparatu 0,63x