Artykuł metodologiczny

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

DOI:

10.3791/62999

⸱

22 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University, 2JST PRESTO, 3Graduate School of Chemical Sciences and Engineering, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój funkcjonalnych nanocząsteczek lipidowych (LNP) jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie systemów dostarczania leków (DDS). Ostatnio systemy dostarczania RNA oparte na LNP, a mianowicie LNP załadowane RNA, przyciągnęły uwagę terapii RNA. W szczególności szczepionki LNP zawierające mRNA zostały zatwierdzone do zapobiegania COVID-19, co doprowadziło do zmiany paradygmatu w kierunku opracowania nanoleków nowej generacji. W przypadku nanoleków opartych na LNP wielkość LNP jest istotnym czynnikiem w kontrolowaniu biodystrybucji LNP i wydajności LNP. Dlatego w procesie produkcji LNP niezbędna jest precyzyjna technika kontroli wielkości LNP. W tym miejscu przedstawiamy protokół produkcji LNP o kontrolowanej wielkości za pomocą urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP. LNP załadowane siRNA są również wytwarzane za pomocą urządzenia iLiNP i oceniane w doświadczeniu in vitro. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla wielkości LNP, w tym LNP obciążone siRNA, potencjał Z, wydajność enkapsulacji siRNA, cytotoksyczność i aktywność wyciszania genu docelowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząstka lipidowa (LNP) jest jednym z najczęściej używanych nanonośników w systemach dostarczania RNA. Niedawno LNP załadowane mRNA zostały zatwierdzone jako szczepionki do zapobiegania COVID-191,2,3. Ogólnie rzecz biorąc, rozmiar LNP odgrywa kluczową rolę w wydajności systemów biodystrybucji i dostarczania leków (DDS), w tym wyciszania genów lub ekspresji białek4,5,6. W związku z tym w procesie produkcji LNP wymagana jest precyzyjna metoda kontroli wielkości LNP.

Na przestrzeni lat uwagę przyciągnęły urządzenia mikroprzepływowe do produkcji LNP o kontrolowanej wielkości7. W 2018 r. opracowano pierwsze zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) LNP ładowane siRNA (np. Onpattro) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego8,9. W mikroprzepływowej metodzie produkcji LNP roztwór lipidowy i roztwór wodny są wprowadzane oddzielnie do urządzenia mikroprzepływowego, a następnie mieszane w mikrokanaliku. Aby zwiększyć wydajność mieszania, do produkcji LNP użyto mieszalnika chaotycznego10,11,12. Mieszalnik chaotyczny umożliwia produkcję LNP o określonych rozmiarach.

Proste urządzenie mikroprzepływowe, nazwane inwazyjną produkcją nanocząsteczek lipidowych (iLiNP), wyposażone w struktury przegrody, zostało opracowane do precyzyjnego kontrolowania wielkości LNP13,14. W porównaniu z mieszalnikiem chaotycznym, urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować wielkość LNP w zakresie od 20 do 100 nm w odstępach 10 nm. Ponadto urządzenie iLiNP wyprodukowało LNP załadowane siRNAs6, LNPs15, LNPs<sup załadowane rybonukleoproteinąsup class="xref">16 oraz LNPs17. Celem artykułu jest przedstawienie procesu wytwarzania i produkcji LNP obciążonego siRNA urządzenia iLiNP oraz opisanie procesu oceny LNP wytwarzanego przez urządzenie iLiNP.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzenia iLiNP

UWAGA: Urządzenie iLiNP jest produkowane przy użyciu standardowej metody miękkiej litografii18. Szczegółowy protokół produkcji został zgłoszony wcześniej10,13.

  1. Produkcja form SU-8
    1. Wlej SU-8 3050 na 3-calową płytkę krzemową. Odwiruj płytkę krzemową, aby uzyskać warstwę SU-8 o grubości 100 μm.
    2. Upiecz wafel silikonowy, umieszczając go na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C na 5 minut i 95 °C na 45 minut.
    3. Po upieczeniu umieść wafel krzemowy na stoliku systemu litografii bez maski.
    4. Wystaw wafel krzemowy na działanie światła UV o długości fali 365 nm przez 1,5 s na jedną pozycję.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto stacjonarnego systemu litografii bez maski. System automatycznie naświetla światło UV w podzielonym obszarze naświetlania (jedna pozycja) mikrokanału.
    5. Po naświetlaniu promieniami UV wafel krzemowy piec na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 1 min i w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    6. Ostudzić płytkę krzemową, a następnie zanurzyć ją w wywoływaczu SU-8 na 15 minut, aby usunąć nienaświetlony SU-8.
    7. Potraktuj formę SU-8 parą trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanu za pomocą eksykatora i pompy próżniowej.
  2. Wykonanie urządzenia iLiNP
    1. Wymieszaj bazę silikonową i utwardzacz polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w).
    2. Odgazowanie mieszaniny za pomocą pompy próżniowej i eksykatora.
      UWAGA: PDMS odgazowywano za pomocą pompy próżniowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odgazowany PDMS wylać na formę SU-8 na szalce Petriego o średnicy 100 mm i grubości od 0,5 do 1 cm, a następnie piec w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.
    4. Ostudzić formę, a następnie oderwać podłoże PDMS od formy SU-8 za pomocą pęsety.
    5. Przebić trzy otwory (0,5 mm) w podłożu PDMS. Połącz podłoże PDMS i szklane szkiełko za pomocą tlenowego środka do czyszczenia plazmowego, aby zbudować urządzenie iLiNP (patrz Rysunek 1)13.
    6. Podłączyć trzy kapilary PEEK (średnica zewnętrzna 0,3 mm, średnica zewnętrzna 0,5 mm) do wlotów i wylotów urządzenia iLiNP i utwardzić za pomocą superglue.
      UWAGA: Długość naczyń włosowatych PEEK jest regulowana i zależy od eksperymentu.

2. Przygotowanie roztworów lipidowych

  1. Przygotować roztwory lipidów/etanolu: 13,4 mM 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC), 10 mM 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamoniowy propan (DOTAP), 5 mM glikolu 1,2-dimyrystoylo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowego-2000 (DMG-PEG2k) i 20 mM cholesterolu. Przed rozpoczęciem doświadczenia przechowywać roztwory podstawowe w temperaturze -20 °C.
  2. Aby wytworzyć LNP obciążone siRNA, wymieszaj roztwory DOTAP, DSPC, cholesterolu i DMG-PEG2k w stosunku molowym 50/10/38,5/1,5. Całkowite stężenie lipidów dostosowuje się do 8 mM.

3. Przygotowanie roztworów wodnych

  1. Przygotować roztwory wodne: 154 mM NaCl (sól fizjologiczna), 25 mM bufor octanowy o pH 4,0 przy użyciu wody destylowanej wolnej od DNaz/RNaz.
  2. Przefiltruj roztwory przez filtry membranowe o wielkości 0,2 μm lub filtry strzykawkowe.

4. Przygotowanie roztworu siRNA/buforu

  1. Rozpuścić 70 μg siGL4 w 1 ml 25 mM buforu octanowego (pH 4,0).
    UWAGA: siGL4 jest używany do knockdown genu lucyferazy.

5. Konfiguracja urządzenia iLiNP i produkcja LNP

UWAGA: Zobacz schematy Rysunek 1.

  1. Napełnić szklane strzykawki o pojemności 1 ml roztworami lipidowymi i wodnymi (z kroków 3.1 i 4.1 w oddzielnych strzykawkach), odpowiednio.
    UWAGA: Dostosuj objętość lipidów i roztworu wodnego w zależności od ilości wymaganej do eksperymentu oceniającego LNP.
  2. Podłączyć szklane strzykawki do kapilar PEEK za pomocą łączników strzykawkowych.
  3. Ustawić natężenie przepływu roztworów lipidowych i wodnych.
    UWAGA: Stosunek natężenia przepływu (FRR) fazy wodnej do fazy lipidowej wynosi od 3:1 do 9:1.
  4. Roztwory lipidowe i wodne należy wprowadzić oddzielnie do urządzenia iLiNP za pomocą pomp strzykawkowych.
  5. Zbierz zawiesiny LNP w mikroprobówce z wylotu urządzenia iLiNP (Rysunek 1).

6. Dializa zawiesiny LNP i pomiar wielkości LNP

  1. Zawiesinę LNP należy dializować za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcia 12−14 kDa MW) w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do soli fizjologicznej lub D-PBS odpowiednio dla LNP POPC i LNP obciążonych siRNA.
    UWAGA: POPC nie rozpuszcza się w roztworze soli fizjologicznej (patrz 2.1). Roztwór POPC/etanolu rozcieńcza się solą fizjologiczną w urządzeniu iLiNP.
  2. Zebrać dializowane zawiesiny LNP do mikroprobówek.
  3. Odpipetować 20-30 μl zawiesiny LNP do mikroogniwa kwarcowego.
  4. Zmierz rozmiar LNP, rozkład wielkości LNP i wskaźnik polidyspersyjności za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

7. Pomiar potencjału Z LNP

UWAGA: Do pomiaru potencjału Z, zgodnie z instrukcją producenta, użyto analizatora cząstek (patrz Tabela materiałów).

  1. Rozcieńczyć zawiesinę LNP otrzymaną z kroku 6.1 35 razy 10 mM buforem HEPES (pH 7.4).
  2. Odpipetować 700-1000 μl rozcieńczonej zawiesiny LNP do komórki kapilarnej.
  3. Zmierz potencjał Z zgodnie z instrukcją producenta.

8. Skuteczność enkapsulacji siRNA za pomocą testu RiboGreen

UWAGA: Test Ribogreen jest wykonywany w celu oceny enkapsulacji siRNA w LNPs19. Test rybozielony może mierzyć ilość RNA wewnątrz i na zewnątrz LNP z / bez środka powierzchniowo czynnego (np. TritonX-100).

  1. Rozcieńczyć 2 mg/ml siGL4 10 mM buforem HEPES (pH 7,4) do 500 ng/ml roztworu siGL4.
  2. Przygotować serię rozcieńczeń (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/ml) roztworu siGL4 w celu wytworzenia krzywej kalibracyjnej dla próbek Trytona (+) i Trytona (-).
  3. Rozcieńczyć zawiesinę LNP 100 razy 10 mM buforem HEPES (pH 7,4).
  4. Zmieszaj następujące składniki roztworu Triton (+): 980 μl 10 mM HEPES (pH 7,4), 20 μl 10% w/v TritonX-100 i 1,25 μl RiboGreen na 10 dołków 96-dołkowej mikropłytki.
  5. Zmieszaj następujące składniki roztworu Triton (-): 1000 μl 10 mM HEPES (pH 7,4) i 1,25 μl RiboGreen na 10 dołków 96-dołkowej mikropłytki.
  6. Odpipetować 100 μl roztworu siGL4 i rozcieńczonych zawiesin LNP do studzienek czarnej 96-dołkowej mikropłytki.
    UWAGA: Serię rozcieńczeń roztworu siGL4 i rozcieńczonych zawiesin LNP dozowano do czterech mikrostudzienek na warunek.
  7. Pobrać pipetą 100 μl roztworu detekcyjnego (TritonX-100 (+) lub Triton (-)) do studzienek.
    UWAGA: Roztwór detekcyjne (TritonX-100 (+)) dozowano do dwóch dołków na próbkę w każdym warunku, a roztwór TritonX-100 (-) dozowano do pozostałych dwóch dołków na próbkę.
  8. Inkubować mikropłytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 475 nm.
  10. Oblicz skuteczność enkapsulacji siRNA z następującego równania19.
    figure-protocol-1

9. Hodowla komórkowa

  1. Przygotuj pożywkę wzrostową zawierającą DMEM, inaktywowany termicznie 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 400 μg/ml G418.
  2. Hodowla komórek HeLa wykazujących stabilną ekspresję świetlika i lucyferazy Renilla (HeLa-dluc) w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej poddanej działaniu TC zawierającym pożywkę wzrostową w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

10. Test żywotności komórek

  1. Nasiona 100 μl zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (6 x 103 komórki/dołek) w 96-dołkowej mikropłytce.
    UWAGA: Komórki policzono za pomocą płytki licznika komórek i mikroskopu.
  2. Inkubować mikropłytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  3. Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA DMEM (FBS (-)) w stężeniach 10 i 100 nM siRNA.
  4. Dozować 100 μl rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonej siRNA do dołka.
  5. Inkubować mikropłytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  6. Usunąć zawiesinę LNP i dodać 100 μl DMEM (FBS (+)).
  7. Inkubować mikropłytkę przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    8. .
  8. Zmierz żywotność ogniwa za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    Uwaga: Jako kontrolę ujemną zastosowano D-PBS (-).

11. Test knockdown genu lucyferazy

  1. Wysiew: 75 μl zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (4,5 x 103 komórki/dołek) w 96-dołkowej mikropłytce.
  2. Inkubować mikropłytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  3. Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA DMEM (FBS (-)) w stężeniach 10 i 100 nM siRNA.
  4. Dozować 75 μl rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonej siRNA na jeden dołek.
  5. Inkubować mikropłytkę przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  6. Usunąć zawiesinę LNP i dodać 75 μl DMEM (FBS (+)).
  7. Inkubować mikropłytkę przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    8. .
  8. Zmierz ekspresję lucyferazy za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Użyliśmy D-PBS (-) jako kontroli negatywnej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2A,B pokazuje rozkład wielkości LNP POPC wytwarzany w różnych warunkach przepływu. Metoda przygotowania LNP oparta na mikroprzepływach może kontrolować wielkość LNP na podstawie warunków przepływu, takich jak całkowite natężenie przepływu (TFR) i FRR. W porównaniu z typowymi urządzeniami mikroprzepływowymi, w tym mieszalnikiem chaotycznym i urządzeniem mikroprzepływowym skupiającym przepływ, urządzenie iLiNP umożliwiło precyzyjną kontrolę wielkości LNP w zakresie od 20 do 100 nm (Rysunek 2). Małe LNP powstające w warunkach wysokiego całkowitego natężenia przepływu. Ponadto rozmiary LNP utworzone przy FRR wynoszącym 5 były mniejsze niż te z FRR wynoszącym 3, niezależnie od całkowitego natężenia przepływu13.

LNP załadowane siRNA zostały również przygotowane za pomocą urządzenia iLiNP (Rysunek 3A). Do przygotowania LNP obciążonego siRNA użyto DOTAP, lipidu kationowego, aby skutecznie zakapsułkować siRNA w LNP. Urządzenie iLiNP wytworzyło kationowe LNP o wielkości 90 nm obciążone siRNA o wąskim rozkładzie (Rysunek 3A,B). Skuteczność enkapsulacji siRNA wyniosła 95% ze względu na oddziaływanie elektrostatyczne między kationowym lipidem a ujemnie naładowanymi siRNA (Rysunek 3C).

Cytotoksyczność i aktywność wyciszająca genów LNP o rozmiarach 90 nm siRNA zostały ocenione, jak pokazano w Rysunek 4 i Rysunek 5. LNP naładowane siRNA wykazały cytotoksyczność przy dawce 10 i 100 nM siRNA. Potwierdziliśmy również, że poziom ekspresji lucyferazy był zmniejszony w zależności od stężenia siRNA. LNP załadowane siRNA hamowały 80% ekspresję lucyferazy w dawce 100 nM siRNA. Wpływ wielkości LNP na aktywność wyciszania genów został zgłoszony wcześniej6,13,17.

figure-results-1
Rysunek 1: (A) Schematyczna ilustracja i (B) zdjęcie urządzenia iLiNP. Urządzenie iLiNP składa się z PDMS oraz podłoży szklanych. Urządzenie iLiNP jest połączone z kapilarnami PEEK za pomocą superglue. Roztwory lipidów i siRNA/buforu są oddzielnie wprowadzane do urządzenia iLiNP za pomocą pomp strzykawkowych. Zawiesina LNP jest zbierana w mikroprobówce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Rozkłady wielkości LNP POPC wytwarzane przez urządzenie iLiNP przy różnych proporcjach natężenia przepływu (FRR). Rozmiar POPC LNP jest mierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Płyny LNP POPC przygotowuje się poprzez zmianę całkowitego natężenia przepływu i FRR: (A) 3 FRR i (B) 5 FRR. Małe LNP powstają w warunkach wysokiego całkowitego natężenia przepływu. Ponadto rozmiary LNP utworzone przy FRR wynoszącym 5 były mniejsze niż te przy FRR wynoszącym 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka LNP załadowanych siRNA. (A) Rozkład wielkości LNP załadowanych siRNA. siRNA (siGL4) są zamknięte w LNP przez oddziaływanie elektrostatyczne między lipidem kationowym (DOTAP) a ujemnie naładowanymi siRNA. (B) Potencjał Z LNP obciążonych siRNA. Zawiesinę LNP rozcieńczono 10 mM buforem HEPES (pH 7,4) przed pomiarem. Dane są przedstawiane jako średnia ± SD (odchylenie standardowe). n = 3. (C) skuteczność enkapsulacji siRNA LNP na bazie DOTAP. Skuteczność enkapsulacji określono za pomocą testu RiboGreen. Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Cytotoksyczność LNP obciążonych siRNA. LNP obciążone siRNA rozcieńczono DMEM (FBS (-)) w celu uzyskania stężeń siGL4 10 i 100 nM. Zawiesiny LNP dodaje się do komórek HeLa-dLuc i inkubuje przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . N.T.: Niepoddane obróbce (D-PBS(-)). Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Aktywność knockdownu genu lucyferazy potraktowana LNP załadowanymi siRNA. LNP ładowane siRNA są przygotowywane w taki sam sposób, jak test żywotności komórek. Poziom ekspresji lucyferazy mierzy się za pomocą systemu testowego Dual-Glo Luciferazy. N.T.: Niepoddane obróbce (D-PBS(-)). Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozmiar LNP wpływa na biodystrybucję LNP, działanie przeciwnowotworowe i wyciszanie genów. W związku z tym metoda kontroli wielkości LNP jest istotną techniką wytwarzania nanoleków DDS, w tym systemów dostarczania RNA. Celem pracy jest wprowadzenie urządzenia iLiNP do precyzyjnego dostrajania wielkości LNP i jego zastosowanie do produkcji LNP obciążonych siRNA. Urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować rozmiar LNP w zakresie od 20 do 100 nm (rysunek 2)13. Gdy warunki przepływu, takie jak całkowite natężenie przepływu i FRR, zostaną zmienione w celu kontrolowania wielkości LNP, zawiesinę LNP należy zebrać po około 5 do 10 sekundach, aby ustabilizować przepływ roztworu. Zawiesinę LNP pobraną z wylotu urządzenia iLiNP poddano natychmiastowej dializie w stosunku do roztworu buforowego w celu usunięcia etanolu i zapobieżenia agregacji LNP.

Kontrola wielkości LNP jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie DDS. Ogólnie rzecz biorąc, konwencjonalny proces produkcji LNP, taki jak metoda hydratacji filmu lipidowego, wymaga procesu dostrajania rozmiaru po produkcji LNP20. Z drugiej strony, metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach może wytwarzać LNP o kontrolowanej wielkości poprzez wprowadzenie roztworów lipidowych i wodnych do urządzenia mikroprzepływowego 6,11,13. Chociaż proces dializy jest wymagany do usunięcia etanolu z zawiesiny LNP, ciągły proces za pomocą urządzenia mikroprzepływowego w połączeniu z systemem przepływu stycznego obiecuje automatyzację procesu produkcji LNP14. Zgodnie z literaturą rozmiary POPC LNP wynosiły 50-60 nm i 30-60 nm, dla urządzenia mikroprzepływowegoskupiającego przepływ 21 i urządzenia mieszającego chaotycznie odpowiednio10. W porównaniu z innymi urządzeniami mikroprzepływowymi, urządzenie iLiNP umożliwia kontrolę wielkości POPC LNP w szerokim zakresie od 20 do 100 nm.

Proces wytwarzania zastosowanego urządzenia iLiNP polegał na standardowej miękkiej litografii. Dzięki temu urządzenie iLiNP może być produkowane masowo techniką szybkiego prototypowania i zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów za pomocą urządzenia jednorazowego użytku. Urządzenie iLiNP może wytwarzać LNP obciążone siRNA w taki sam sposób, jak metoda produkcji POPC LNP. W przypadku metody produkcji LNP z wykorzystaniem urządzenia iLiNP użytkownik nie wymaga żadnych skomplikowanych procedur. Z tych powodów oczekuje się, że metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach, w tym urządzenie iLiNP, będzie stosowana jako standardowa metoda produkcji LNP. Protokół zawarty w tym artykule może być dostosowany do innych urządzeń mikroprzepływowych do produkcji LNP. Ponadto produkcja LNP obciążonych mRNA jest również możliwa dzięki zmianie roztworu siRNA/buforu na roztwór buforowy zawierający mRNA.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140, oraz Iketani Science and Technology Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)NOF Corp.MC-6081
Glikol 1,2-dimyrystoilo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowy-2000 (DMG-PEG2K)NOF Corp.GM-020
1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamonowy propan (DOTAP)NOF Corp.CL-8181TA
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholinew (DSPC)NOF Corp.MC-8080
10 x D-PBS (-)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.048-29805
Kwas octowyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.017-00251
Test żywotności komórek CellTiter-BluePromegaG8081
cholesterolSigma-AldrichC8667-5G
Biurkowy system litografii bez maskiNEOARK CORPORATIONDDB-701-DL4
Membrana dializacyjnaRepligen132697
System oznaczania lucyferazy Dual-GloPromegaE2940
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher ScientificLot: 42G6587K
G418Nacalai Tesque08973-14
Podłoże szklaneMatsunami Glass Ind., Ltd.S1111
Szklana strzykawkaHamiltonGASSTIGHT 1002
OgniwoHeLa: Komórki HeLa-dluc zostały dostarczone przez dr Yusuke Sato z Uniwersytetu Hokkaido,
HEPES,FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.342-01375
Dulbecco o niskiej zawartości glukozy" s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Sigma-AldrichD6046-500ML
Tlenowy środek do czyszczenia plazmyFemto ScienceCUTE-1MP/R
Penicylina– streptomycyna, trypsyna (2,5%)Thermo Fisher Scientific15140122
Quant-iT Odczynnik RNA RiboGreenThermo Fisher ScientificR11491
siGL4Hokkaido System Science Co., LtdSekwencje nici sensownej i antysensownej siGL4 to odpowiednio 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT
-3' i 5'-UUGCUCACGAACGAACGACGGTsT
-3'.
Wafel krzemowyGTC
SILPOT 184 W/C (PDMS)dow Corning Toray Co., Ltd.w zestawie znajduje się baza silikonowa i utwardzacz
Octan soduFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.192-01075
Chlorek soduFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.191-01665
SU-8 3050Nippon Kyaku Co., Ltd.
Łącznik strzykawkowyInstytut Technologii Mikrochemicznej Co., Ltd.ISC-011
Pompa strzykawkowaChemyxCX07200
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma-Aldrich448931-10G
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
UltraPure  Woda destylowana bez DNaz/RNazThermo Fisher Scientific10977015
Zetasizer Nano ZS  Malvern InstrumentsZEN3600

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586(2021).
  2. Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
  3. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  4. Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
  5. Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
  6. Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
  7. Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
  8. Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
  9. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
  10. Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962(2017).
  11. Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37(2012).
  13. Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
  14. Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
  15. Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
  16. Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
  17. Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
  18. Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
  19. Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
  20. Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
  21. Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dostarczanie siRNAkontrola rozmiaru LNPsystemy dostarczania RNAwyciszanie gen wdynamiczne rozpraszanie wiat aenkapsulacja siRNAtest cytotoksyczno cilipid kationowy

Powiązane artykuły