Artykuł metodologiczny

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62999

⸱

22 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University, 2JST PRESTO, 3Graduate School of Chemical Sciences and Engineering, Hokkaido University

W tym artykule

Podsumowanie

Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.

Streszczenie

Rozwój funkcjonalnych nanocząsteczek lipidowych (LNP) jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie systemów dostarczania leków (DDS). Ostatnio systemy dostarczania RNA oparte na LNP, a mianowicie LNP załadowane RNA, przyciągnęły uwagę terapii RNA. W szczególności szczepionki LNP zawierające mRNA zostały zatwierdzone do zapobiegania COVID-19, co doprowadziło do zmiany paradygmatu w kierunku opracowania nanoleków nowej generacji. W przypadku nanoleków opartych na LNP wielkość LNP jest istotnym czynnikiem w kontrolowaniu biodystrybucji LNP i wydajności LNP. Dlatego w procesie produkcji LNP niezbędna jest precyzyjna technika kontroli wielkości LNP. W tym miejscu przedstawiamy protokół produkcji LNP o kontrolowanej wielkości za pomocą urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP. LNP załadowane siRNA są również wytwarzane za pomocą urządzenia iLiNP i oceniane w doświadczeniu in vitro. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla wielkości LNP, w tym LNP obciążone siRNA, potencjał Z, wydajność enkapsulacji siRNA, cytotoksyczność i aktywność wyciszania genu docelowego.

Wprowadzenie

Nanocząstka lipidowa (LNP) jest jednym z najczęściej używanych nanonośników w systemach dostarczania RNA. Niedawno LNP załadowane mRNA zostały zatwierdzone jako szczepionki do zapobiegania COVID-191,2,3. Ogólnie rzecz biorąc, rozmiar LNP odgrywa kluczową rolę w wydajności systemów biodystrybucji i dostarczania leków (DDS), w tym wyciszania genów lub ekspresji białek4,5,6. W związku z tym w procesie produkcji LNP wymagana jest precyzyjna metoda kontroli wielkości LNP.

Na przestrzeni lat uwagę przyciągnęły urządzenia mikroprzepływowe do produkcji LNP o kontrolowanej wielkości7. W 2018 r. opracowano pierwsze zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) LNP ładowane siRNA (np. Onpattro) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego8,9. W mikroprzepływowej metodzie produkcji LNP roztwór lipidowy i roztwór wodny są wprowadzane oddzielnie do urządzenia mikroprzepływowego, a następnie mieszane w mikrokanaliku. Aby zwiększyć wydajność mieszania, do produkcji LNP użyto mieszalnika chaotycznego10,11,12. Mieszalnik chaotyczny umożliwia produkcję LNP o określonych rozmiarach.

Proste urządzenie mikroprzepływowe, nazwane inwazyjną produkcją nanocząsteczek lipidowych (iLiNP), wyposażone w struktury przegrody, zostało opracowane do precyzyjnego kontrolowania wielkości LNP13,14. W porównaniu z mieszalnikiem chaotycznym, urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować wielkość LNP w zakresie od 20 do 100 nm w odstępach 10 nm. Ponadto urządzenie iLiNP wyprodukowało LNP załadowane siRNAs6, LNPs15, LNPs<sup załadowane rybonukleoproteinąsup class="xref">16 oraz LNPs17. Celem artykułu jest przedstawienie procesu wytwarzania i produkcji LNP obciążonego siRNA urządzenia iLiNP oraz opisanie procesu oceny LNP wytwarzanego przez urządzenie iLiNP.

Protokół

1. Wykonanie urządzenia iLiNP

UWAGA: Urządzenie iLiNP jest wytwarzane przy użyciu standardowej metody miękkiej litografii18. Szczegółowy protokół wytwarzania został opisany wcześniej10,13.

  1. Wytwarzanie formy z SU-8
    1. Nalać SU-8 3050 na 3-calowy wafelek krzemowy. Rozprowadzić warstwę metodą spin-coatingu, aby uzyskać warstwę SU-8 o grubości 100 µm.
    2. Wygrzać wafelek krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 5 min i 95 °C przez 45 min.
    3. Po wygrzaniu umieścić wafelek krzemowy na stole systemu litografii bezmaskowej.
    4. Naświetlić wafelek krzemowy światłem UV o długości fali 365 nm przez 1,5 s na jedną pozycję.
      UWAGA: W tym doświadczeniu wykorzystano system litografii bezmaskowej. System automatycznie naświetla UV podzielony obszar naświetlania (jedną pozycję) mikrokanału.
    5. Po naświetlaniu UV wygrzać wafelek krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 1 min i 95 °C przez 5 min.
    6. Ostudzić wafelek krzemowy, a następnie namoczyć w wywoływaczu SU-8 przez 15 min w celu usunięcia nienaświetlonego SU-8.
    7. Poddać formę z SU-8 działaniu oparów trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanu, używając eksykatora i pompy próżniowej.
  2. Wytwarzanie urządzenia iLiNP
    1. Zmieszać bazę silikonową i czynnik sieciujący polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w).
    2. Odgazować mieszaninę za pomocą pompy próżniowej i eksykatora.
      ​UWAGA: PDMS był odgazowywany za pomocą pompy próżniowej przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    3. Nalać odgazowany PDMS na formę z SU-8 w 100 mm szalce Petriego do grubości od 0,5 do 1 cm, a następnie wygrzać w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 1 h.
    4. Ostudzić formę, a następnie oddzielić podłoże z PDMS od formy z SU-8 za pomocą pęsety.
    5. Wyciąć trzy otwory (0,5 mm) w podłożu z PDMS. Połączyć podłoże z PDMS ze szkiełkiem podstawowym za pomocą cleanera plazmowego tlenowego, aby zbudować urządzenie iLiNP (patrz Rysunek 1)13.
    6. Podłączyć trzy kapilary PEEK (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) do wlotów i wylotu urządzenia iLiNP i utrwalić superklejem.
      ​UWAGA: Długość kapilar PEEK jest regulowana i zależy od przeprowadzanego eksperymentu.

2. Przygotowanie roztworów lipidów

  1. Przygotować roztwory lipidów w etanolu: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2k) oraz 20 mM cholesterolu. Roztwory stokowe przechowywać w temperaturze -20 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. W celu wytworzenia LNP obciążonych siRNA, zmieszać roztwory DOTAP, DSPC, cholesterolu i DMG-PEG2k w stosunku molowym 50/10/38,5/1,5. Całkowite stężenie lipidów należy dostosować do poziomu 8 mM.

3. Przygotowanie roztworów wodnych

  1. Przygotować roztwory wodne: 154 mM NaCl (sól fizjologiczna) oraz 25 mM bufor octanowy o pH 4.0, używając wody destylowanej wolnej od DNazy/RNazy.
  2. Przefiltrować roztwory przez filtry membranowe lub filtry strzykawkowe o rozmiarze porów 0.2 µm.

4. Przygotowanie roztworu siRNA/buforu

  1. Rozpuścić 70 µg siGL4 w 1 mL 25 mM buforu octanowego (pH 4.0).
    UWAGA: siGL4 jest stosowany do wyciszenia genu lucyferazy.

5. Konfiguracja urządzenia iLiNP i produkcja LNP

UWAGA: Schematy znajdują się na Ryc. 1.

  1. Napełnij szklane strzykawki o pojemności 1 mL odpowiednio roztworem lipidowym i wodnym (z kroków 3.1 i 4.1, w osobnych strzykawkach).
    UWAGA: Dostosuj objętość roztworu lipidowego i wodnego w zależności od ilości wymaganej do eksperymentu oceny LNP.
  2. Połącz szklane strzykawki z kapilarami PEEK za pomocą złączy do strzykawek.
  3. Ustaw szybkość przepływu roztworów lipidowego i wodnego.
    UWAGA: Stosunek szybkości przepływu (FRR) fazy wodnej do fazy lipidowej mieści się w zakresie od 3:1 do 9:1.
  4. Wprowadź roztwory lipidowy i wodny osobno do urządzenia iLiNP, korzystając z pomp strzykawkowych.
  5. Zbierz zawiesiny LNP do mikroprobówki z wylotu urządzenia iLiNP (Rysunek 1).

6. Dializa zawiesiny LNP i pomiar wielkości LNP

  1. Dializować zawiesinę LNP przy użyciu membrany dializacyjnej (próg odcięcia MW 12−14 kDa) w temperaturze 4 °C przez noc przeciwko soli fizjologicznej (dla LNP POPC) lub D-PBS (dla LNP obciążonych siRNA).
    UWAGA: POPC nie rozpuszcza się w soli fizjologicznej (patrz punkt 2.1). Roztwór POPC/etanol jest rozcieńczany solą fizjologiczną w urządzeniu iLiNP.
  2. Zebrać zdializowane zawiesiny LNP do mikroprobówek.
  3. Pipetować 20-30 µL zawiesiny LNP do mikrokuwety kwarcowej.
  4. Zmierzyć wielkość LNP, rozkład wielkości LNP oraz indeks polidyspersyjności za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

7. Pomiar potencjału zeta LNP

UWAGA: Do pomiaru potencjału zeta wykorzystano analizator cząstek (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.

  1. Rozcieńczyć zawiesinę LNP otrzymaną w kroku 6.1, 35-krotnie w buforze HEPES 10 mM (pH 7.4).
  2. Nabrać pipetą od 700 do 1000 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP do kuwety kapilarnej.
  3. Zmierzyć potencjał zeta zgodnie z instrukcją producenta.

8. Wydajność enkapsulacji siRNA za pomocą testu RiboGreen

UWAGA: Analizę Ribogreen przeprowadza się w celu oceny enkapsulacji siRNA w LNP19. Analiza Ribogreen pozwala zmierzyć ilość RNA wewnątrz i na zewnątrz LNP z dodatkiem lub bez dodatku surfaktantu (np. TritonX-100).

  1. Rozcieńć siGL4 o stężeniu 2 mg/mL w buforze HEPES 10 mM (pH 7,4) do uzyskania roztworu siGL4 o stężeniu 500 ng/mL.
  2. Przygotuj szereg rozcieńczeń (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/mL) roztworu siGL4 w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej dla próbek z dodatkiem Triton (+) oraz bez dodatku Triton (-).
  3. Rozcieńcz zawiesinę LNP 100-krotnie w buforze HEPES 10 mM (pH 7,4).
  4. W celu przygotowania roztworu Triton (+) wymieszaj następujące składniki: 980 µL HEPES 10 mM (pH 7,4), 20 µL 10% w/v TritonX-100 oraz 1,25 µL RiboGreen na 10 studzienek mikropłytki 96-dołkowej.
  5. W celu przygotowania roztworu Triton (-) wymieszaj następujące składniki: 1000 µL HEPES 10 mM (pH 7,4) oraz 1,25 µL RiboGreen na 10 studzienek mikropłytki 96-dołkowej.
  6. Pipetuj 100 µL szeregu rozcieńczeń roztworu siGL4 oraz rozcieńczonych zawiesin LNP do studzienek czarnej mikropłytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Szereg rozcieńczeń roztworu siGL4 oraz rozcieńczone zawiesiny LNP naniesiono do czterech mikrostudzienek dla każdego wariantu.
  7. Pipetuj 100 µL roztworu detekcyjnego (TritonX-100 (+) lub Triton (-)) do studzienek.
    UWAGA: Roztwór detekcyjny (TritonX-100 (+)) naniesiono do dwóch studzienek na próbkę dla każdego wariantu, a roztwór TritonX-100 (-) do pozostałych dwóch studzienek dla każdego wariantu próbki.
  8. Inkubuj mikropłytkę przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  9. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali 475 nm.
  10. Oblicz wydajność enkapsulacji siRNA korzystając z następującego równania19.
    Równanie wydajności enkapsulacji siRNA; analiza stężenia siRNA z użyciem Triton do celów badawczych.

9. Hodowla komórek

  1. Przygotować pożywkę wzrostową zawierającą DMEM, 10% FBS inaktywowanego termicznie, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny oraz 400 µg/mL G418.
  2. Hodować komórki HeLa stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy świetlika i Renilla (HeLa-dluc) w 100 mm szalce hodowlanej traktowanej TC, zawierającej pożywkę wzrostową, w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .

10. Test żywotności komórek

  1. Wysiać 100 µL zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (6 x 103 komórek/dołek) do mikropłytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Komórki policzono przy użyciu płytki do liczenia komórek i mikroskopu.
  2. Inkubować mikropłytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  3. Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA w DMEM (FBS (-)) do stężeń 10 i 100 nM siRNA.
  4. Nanieść 100 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonych siRNA do każdego dołka.
  5. Inkubować mikropłytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  6. Usunąć zawiesinę LNP i dodać 100 µL DMEM (FBS (+)).
  7. Inkubować mikropłytkę przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  8. Zmierzyć żywotność komórek przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Jako kontrolę negatywną zastosowano D-PBS (-).

11. Analiza wyciszania genu lucyferazy

  1. Wysiać 75 µL zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (4.5 x 103 komórek/dołek) na mikropłytce 96-dołkowej.
  2. Inkubować mikropłytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  3. Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA w DMEM (FBS (-)) do stężeń 10 i 100 nM siRNA.
  4. Nanieść 75 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonych siRNA do każdego dołka.
  5. Inkubować mikropłytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  6. Usunąć zawiesinę LNP i dodać 75 µL DMEM (FBS (+)).
  7. Inkubować mikropłytkę przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .
  8. Zmierzyć ekspresję lucyferazy przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Jako kontrolę negatywną zastosowano D-PBS (-).

Wyniki

Rycina 2A,B przedstawia rozkład wielkości nanocząstek lipidowych (LNP) POPC wytworzonych przy różnych warunkach przepływu. Metoda przygotowania LNP oparta na mikroprzepływach pozwala kontrolować rozmiar LNP poprzez warunki przepływu, takie jak całkowity przepływ (TFR) oraz stosunek przepływów (FRR). W porównaniu z typowymi urządzeniami mikroprzepływowymi, w tym urządzeniem z mieszalnikiem chaotycznym oraz urządzeniem mikroprzepływowym z ogniskowaniem przepływu, urządzenie iLiNP umożliwiło precyzyjną kontrolę wielkości LNP w zakresie od 20 do 100 nm (Rycina 2). LNP o mniejszych rozmiarach powstawały przy wysokich całkowitych przepływach. Ponadto LNP wytworzone przy FRR wynoszącym 5 były mniejsze niż te przy FRR wynoszącym 3, niezależnie od całkowitego przepływu13.

Nanocząsteczki lipidowe (LNPs) obciążone siRNA przygotowano również przy użyciu urządzenia iLiNP (Rycyna 3A). Do przygotowania LNP obciążonych siRNA wykorzystano kationowy lipid DOTAP, aby skutecznie enkapsulować siRNA wewnątrz LNP. Urządzenie iLiNP wytworzyło kationowe LNP obciążone siRNA o rozmiarze 90 nm i wąskim rozkładzie (Rycyna 3A,B). Wydajność enkapsulacji siRNA wyniosła 95% ze względu na oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy kationowym lipidem a ujemnie naładowanymi cząsteczkami siRNA (Rycyna 3C).

Cytotoksyczność oraz aktywność wyciszania genów LNP obciążonych siRNA o rozmiarze 90 nm oceniono, jak pokazano na Rysunku 4 oraz Rysunku 5. LNP obciążone siRNA nie wykazały cytotoksyczności przy dawkach 10 i 100 nM siRNA. Potwierdzono również, że poziom ekspresji lucyferazy ulegał obniżeniu w zależności od stężenia siRNA. LNP obciążone siRNA zahamowały ekspresję lucyferazy w 80% przy dawce 100 nM siRNA. Wpływ rozmiaru LNP na aktywność wyciszania genów został opisany we wcześniejszych doniesieniach6,13,17.

Schemat chipa mikroprzepływowego do otrzymywania zawiesiny LNP poprzez szybkie rozcieńczanie lipidów w etanolu i siRNA w buforze.
Rysunek 1: (A) Schematyczna ilustracja i (B) zdjęcie urządzenia iLiNP. Urządzenie iLiNP składa się z podłoży z PDMS i szkła. Urządzenie iLiNP jest połączone z kapilarami PEEK za pomocą superkleju. Roztwory lipidów oraz siRNA/buforu są wprowadzane oddzielnie do urządzenia iLiNP przy użyciu pomp strzykawkowych. Zawiesina LNP jest zbierana do mikroprobówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rozkład wielkości LNP, FRR 3 i 5; wykres pokazuje wpływ zmienności TFR na intensywność i wielkość.
Rysunek 2: Rozkłady wielkości LNP z POPC otrzymanych za pomocą urządzenia iLiNP przy różnych stosunkach przepływów (FRR). Wielkość LNP z POPC zmierzono metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). LNP z POPC przygotowano poprzez zmianę całkowitego przepływu i FRR: (A) FRR 3 oraz (B) FRR 5. Małe LNP powstawały w warunkach wysokiego całkowitego przepływu. Ponadto wielkość LNP utworzonych przy FRR 5 była mniejsza niż przy FRR 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy charakterystyki LNP: rozkład wielkości, potencjał zeta i wyniki wydajności enkapsulacji siRNA.
Rysunek 3: Charakterystyka LNP obciążonych siRNA. (A) Rozkład wielkości LNP obciążonych siRNA. siRNA (siGL4) są enkapsulowane w LNP poprzez oddziaływanie elektrostatyczne między lipidem kationowym (DOTAP) a ujemnie naładowanymi siRNA. (B) Potencjał zeta LNP obciążonych siRNA. Przed pomiarem zawiesinę LNP rozcieńczono buforem HEPES 10 mM (pH 7.4). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (odchylenie standardowe). n = 3. (C) Wydajność enkapsulacji siRNA w LNP opartych na DOTAP. Wydajność enkapsulacji określono za pomocą testu RiboGreen. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza żywotności komórek; wykres słupkowy; stężenia siGL4 w stosunku do kontroli; pomiary odpowiedzi komórkowej.
Rycina 4: Cytotoksyczność LNP obciążonych siRNA. LNP obciążone siRNA rozcieńczono w DMEM (FBS (-)), aby uzyskać stężenia siGL4 wynoszące 10 i 100 nM. Zawiesiny LNP dodano do komórek HeLa-dLuc i inkubowano przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . N.T.: Nieleczone (D-PBS(-)). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy ekspresji lucyferazy; odpowiedź siGL4 na dawkę 10, 100 nM w porównaniu z kontrolą N.T.
Rycina 5: Aktywność wyciszania genu lucyferazy po zastosowaniu LNP obciążonych siRNA. LNP obciążone siRNA przygotowano w ten sam sposób, co w teście żywotności komórek. Poziom ekspresji lucyferazy zmierzono przy użyciu systemu Dual-Glo Luciferase Assay System. N.T.: niepoddane traktowaniu (D-PBS(-)). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Rozmiar LNP wpływa na biodystrybucję LNP, działanie przeciwnowotworowe i wyciszanie genów. W związku z tym metoda kontroli wielkości LNP jest istotną techniką wytwarzania nanoleków DDS, w tym systemów dostarczania RNA. Celem pracy jest wprowadzenie urządzenia iLiNP do precyzyjnego dostrajania wielkości LNP i jego zastosowanie do produkcji LNP obciążonych siRNA. Urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować rozmiar LNP w zakresie od 20 do 100 nm (rysunek 2)13. Gdy warunki przepływu, takie jak całkowite natężenie przepływu i FRR, zostaną zmienione w celu kontrolowania wielkości LNP, zawiesinę LNP należy zebrać po około 5 do 10 sekundach, aby ustabilizować przepływ roztworu. Zawiesinę LNP pobraną z wylotu urządzenia iLiNP poddano natychmiastowej dializie w stosunku do roztworu buforowego w celu usunięcia etanolu i zapobieżenia agregacji LNP.

Kontrola wielkości LNP jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie DDS. Ogólnie rzecz biorąc, konwencjonalny proces produkcji LNP, taki jak metoda hydratacji filmu lipidowego, wymaga procesu dostrajania rozmiaru po produkcji LNP20. Z drugiej strony, metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach może wytwarzać LNP o kontrolowanej wielkości poprzez wprowadzenie roztworów lipidowych i wodnych do urządzenia mikroprzepływowego 6,11,13. Chociaż proces dializy jest wymagany do usunięcia etanolu z zawiesiny LNP, ciągły proces za pomocą urządzenia mikroprzepływowego w połączeniu z systemem przepływu stycznego obiecuje automatyzację procesu produkcji LNP14. Zgodnie z literaturą rozmiary POPC LNP wynosiły 50-60 nm i 30-60 nm, dla urządzenia mikroprzepływowegoskupiającego przepływ 21 i urządzenia mieszającego chaotycznie odpowiednio10. W porównaniu z innymi urządzeniami mikroprzepływowymi, urządzenie iLiNP umożliwia kontrolę wielkości POPC LNP w szerokim zakresie od 20 do 100 nm.

Proces wytwarzania zastosowanego urządzenia iLiNP polegał na standardowej miękkiej litografii. Dzięki temu urządzenie iLiNP może być produkowane masowo techniką szybkiego prototypowania i zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów za pomocą urządzenia jednorazowego użytku. Urządzenie iLiNP może wytwarzać LNP obciążone siRNA w taki sam sposób, jak metoda produkcji POPC LNP. W przypadku metody produkcji LNP z wykorzystaniem urządzenia iLiNP użytkownik nie wymaga żadnych skomplikowanych procedur. Z tych powodów oczekuje się, że metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach, w tym urządzenie iLiNP, będzie stosowana jako standardowa metoda produkcji LNP. Protokół zawarty w tym artykule może być dostosowany do innych urządzeń mikroprzepływowych do produkcji LNP. Ponadto produkcja LNP obciążonych mRNA jest również możliwa dzięki zmianie roztworu siRNA/buforu na roztwór buforowy zawierający mRNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140, oraz Iketani Science and Technology Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)NOF Corp.MC-6081
Glikol 1,2-dimyrystoilo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowy-2000 (DMG-PEG2K)NOF Corp.GM-020
1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamonowy propan (DOTAP)NOF Corp.CL-8181TA
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholinew (DSPC)NOF Corp.MC-8080
10 x D-PBS (-)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.048-29805
Kwas octowyFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.017-00251
Test żywotności komórek CellTiter-BluePromegaG8081
cholesterolSigma-AldrichC8667-5G
Biurkowy system litografii bez maskiNEOARK CORPORATIONDDB-701-DL4
Membrana dializacyjnaRepligen132697
System oznaczania lucyferazy Dual-GloPromegaE2940
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher ScientificLot: 42G6587K
G418Nacalai Tesque08973-14
Podłoże szklaneMatsunami Glass Ind., Ltd.S1111
Szklana strzykawkaHamiltonGASSTIGHT 1002
OgniwoHeLa: Komórki HeLa-dluc zostały dostarczone przez dr Yusuke Sato z Uniwersytetu Hokkaido,
HEPES,FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.342-01375
Dulbecco o niskiej zawartości glukozy" s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Sigma-AldrichD6046-500ML
Tlenowy środek do czyszczenia plazmyFemto ScienceCUTE-1MP/R
Penicylina– streptomycyna, trypsyna (2,5%)Thermo Fisher Scientific15140122
Quant-iT Odczynnik RNA RiboGreenThermo Fisher ScientificR11491
siGL4Hokkaido System Science Co., LtdSekwencje nici sensownej i antysensownej siGL4 to odpowiednio 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT
-3' i 5'-UUGCUCACGAACGAACGACGGTsT
-3'.
Wafel krzemowyGTC
SILPOT 184 W/C (PDMS)dow Corning Toray Co., Ltd.w zestawie znajduje się baza silikonowa i utwardzacz
Octan soduFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.192-01075
Chlorek soduFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.191-01665
SU-8 3050Nippon Kyaku Co., Ltd.
Łącznik strzykawkowyInstytut Technologii Mikrochemicznej Co., Ltd.ISC-011
Pompa strzykawkowaChemyxCX07200
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma-Aldrich448931-10G
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
UltraPure  Woda destylowana bez DNaz/RNazThermo Fisher Scientific10977015
Zetasizer Nano ZS  Malvern InstrumentsZEN3600

Bibliografia

  1. Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586(2021).
  2. Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
  3. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  4. Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
  5. Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
  6. Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
  7. Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
  8. Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
  9. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
  10. Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962(2017).
  11. Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37(2012).
  13. Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
  14. Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
  15. Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
  16. Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
  17. Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
  18. Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
  19. Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
  20. Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
  21. Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dostarczanie siRNAkontrola rozmiaru LNPsystemy dostarczania RNAwyciszanie genówdynamiczne rozpraszanie światłaenkapsulacja siRNAtest cytotoksycznościlipid kationowy
Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.