Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda inokulacji Phytophthora capsici na roślinach czarnego pieprzu

DOI:

10.3791/63002

⸱

16 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science (CATAS), 2Hainan University, 3Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture, 4Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nakłuwanie podstawowej główki rośliny czarnego pieprzu to krótka i oszczędzająca czas metoda jej uszkodzenia. Tutaj przedstawiliśmy szczegółowe instrukcje wraz z filmem dotyczącym infekowania roślin czarnego pieprzu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Piper nigrum L. (pieprz) to typowa drzewiasta odmiana winorośli, która jest gospodarczo ważną uprawą przypraw na całym świecie. Na produkcję czarnego pieprzu znaczący wpływ ma choroba zgnilizny korzeni wywoływana przez Phytophthora capsici, która poważnie wpłynęła na rozwój branży jako problem "punktu przewężenia". Jednak molekularny genetyczny mechanizm oporności czarnego pieprzu jest niejasny, co prowadzi do powolnego postępu w opracowywaniu nowych odmian czarnego pieprzu. Skuteczny system inokulacji i precyzyjnego pobierania próbek Phytophthora capsici na roślinach pieprzu czarnego jest niezbędny do zbadania tej interakcji między roślinami a patogenami. Głównym celem tego badania jest zademonstrowanie szczegółowej metodologii, w której podstawowa główka czarnego pieprzu jest inokulowana Phytophthora capsici, przy jednoczesnym zapewnieniu odniesienia do inokulacji drzewiastych roślin winorośli. Podstawowa główka rośliny czarnego pieprzu została nakłuta, aby ją uszkodzić, a granulki grzybni pokryły trzy otwory, aby zatrzymać wilgoć, aby patogen mógł dobrze zainfekować roślinę. Ta metoda zapewnia lepszy sposób rozwiązania niestabilności, która jest spowodowana tradycyjnymi metodami inokulacji, w tym zraszaniem gleby lub zanurzaniem korzeni. Stanowi również obiecujący sposób badania sposobu działania między roślinami a innymi patogenami roślin przenoszonymi przez glebę w rolniczej hodowli precyzyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 i jest uprawiany w ponad 40 krajach i regionach w Azji, Afryce i Ameryce Łacińskiej. Zgnilizna korzeni Phytophthora jest najbardziej niszczycielską chorobą czarnego pieprzu i jest wywoływana przez lęgniowce Phytophthora capsici. Patogen ten infekuje również dyniowate, bakłażany, papryczki chili i pomidory2,3. W przypadku czarnego pieprzu cała uprawa może czasami zostać zdziesiątkowana przez tę chorobę. Ekspansja obszarów nasadzeń papryki jest ograniczona w wyniku niedostępności odmian odpornych, co znacznie utrudniło rozwój chińskiego przemysłu pieprzu czarnego. Skuteczna inokulacja i precyzyjny system pobierania próbek Phytophthora capsici na roślinach pieprzu czarnego są niezbędne do zbadania tej interakcji między rośliną a patogenem.

Identyfikacja i badanie przesiewowe odporności zasobów plazmy zarodkowej jest podstawowym wymogiem dla badań nad patogennością patogenu oraz hodowli i wykorzystania odpornych odmian. Szeroko stosowanym podejściem jest stosowanie różnych metod identyfikacji w oparciu o gatunki roślin i grupy patogenów. Obecne metody identyfikacji obejmują identyfikację populacji, identyfikację osobniczą, identyfikację narządów, identyfikację tkanek, identyfikację komórek, identyfikację biochemiczną i identyfikację molekularną, które zostały opracowane w ostatnich latach4,5. W tych dziedzinach odniesiono sukces, ale jest też wiele problemów. Bez względu na to, która metoda zostanie wybrana, podstawowe wymagania dotyczące identyfikacji odporności roślin są spójne, w tym jasne cele, wiarygodne wyniki oraz metody, które są proste, szybkie i łatwe do standaryzacji. Zasada ta musi być również przestrzegana przy określaniu odporności na pieprz.

W naturalnych warunkach polowych, na identyfikację odporności na choroby może mieć wpływ wiele czynników środowiskowych. W związku z tym zaproponowano, aby oderwane liście i nawadniane korzenie były używane w laboratorium w celu identyfikacji odporności na choroby. Młode liście zdrowych roślin zaszczepiono in vitro w laboratorium, a obszar chorych liści zmierzono poprzez zaszczepienie patogenu w celu zidentyfikowania odporności roślin na choroby6. Jednak inokulacja liści in vitro może być stosowana tylko do ogólnej identyfikacji oporności, a nie do badań interakcji molekularnych. Mimo to status odporności na chorobę często występuje w nawadnianej inokulacji korzeni, co powoduje niepewność w dalszym badaniu hodowli molekularnej pod kątem odporności na choroby. Dlatego niezbędne są szybkie i proste metody wykrywania w pomieszczeniach. Niniejsze badanie ma na celu opracowanie metody identyfikacji oporności w laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sadzonek czarnego pieprzu do infekcji

  1. Weź pięciowęzłowe cięcie o długości około 40 cm i średnicy 0,5 cm ze zdrowej i silnie rosnącej ortotropowej gałęzi czarnego pieprzu za pomocą zdezynfekowanego noża do przycinania lub sekatora. Przycinaj dolne trzy węzły gałęzi plagiotropowych, pozostawiając dwa górne węzły z nienaruszonymi około 10 liśćmi.
  2. Przygotuj podłoże ukorzeniające zawierające glebę i obornik zwierzęcy (krowie lub owcze) w stosunku 1:1. Podłoże ukorzeniające należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
  3. Umieść sadzonki w podłożu ukorzeniającym pod kątem około 50°, przy czym trzeci węzeł dotyka powierzchni podłoża, a pączek pachowy w tym węźle powyżej podłoża.
    UWAGA: Użyta tutaj torba ma następujące wymiary: wysokość 40-60 cm, średnica 25-30 cm.
  4. Zalej korzenie rośliny 10-20 l wody. Umieść sadzonki w szklarni z 90% cieniem w temperaturze 25-30 °C w celu ukorzenienia i wzrostu.

2. Rozmnażanie Phytophthora capsici (P. capsici)

UWAGA: Zapas kultur Phytophthora capsici jest przechowywany w laboratorium ochrony roślin Instytutu Badań nad Przyprawami i Napojami, Chińskiej Akademii Tropikalnych Nauk Rolniczych7.

  1. Bulwy ziemniaka rozsmarować i oczyścić pod bieżącą wodą z kranu, a następnie pokroić 200 g ziemniaków w kostkę o długości 1 cm3. Umieść część kostek w zlewce zawierającej 800 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i gotuj przez 20 minut.
  2. Przefiltruj bulion przez podwójną gazę za pomocą filtracji grawitacyjnej. Przygotować agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA), dodając 20 g dekstrozy i 15 g agaru do filtratu i uzupełniając objętość do 1 lddH2O. Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min8.
  3. Wlej 20 ml wysterylizowanego PDA w postaci płynnej do okrągłej szalki Petriego o średnicy 9 cm wewnątrz okapu z laminarnym przepływem powietrza. Pozostaw na noc płyty PDA z otwartymi pokrywkami wewnątrz okapu z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec kondensacji.
  4. Użyj pętli inokulacyjnej, aby pobrać grzybnię z bulionu Phytophthora capsici z wnętrza probówki. Umieścić inokulum stroną grzybni stykającą się z PDA na szalce Petriego.

3. Zakażenie czarnym pieprzem

  1. Inkubacja
    1. Zidentyfikuj obszar 5 cm nad powierzchnią podłoża i w pobliżu korzeni na łodydze do zaszczepienia.
    2. Wydrążyć krążek grzybni o średnicy 0,5 cm na rosnącym brzegu kultury Phytophthora capsici na PDA na szalce Petriego za pomocą świdra korkowego.
    3. Uszkodzić łodygę za pomocą igły strzykawkowej i zrobić trzy otwory w trójkątny wzór w wybranym obszarze inokulacji. Przykryj każdy otwór krążkiem grzybni. Umieść otwory blisko siebie, aby upewnić się, że zraniony obszar jest całkowicie pokryty krążkami grzybni.
    4. Przykryj krążki grzybni wysterylizowanymi, zwilżonymi wacikami, aby zapobiec wysuszeniu. Przywiąż podkładkę do trzpienia za pomocą paska polietylenu, aby utrzymać pozycję krążków zaszczepiających.
      UWAGA: Po 8 godzinach od inokulacji zaszczepione otwory zmieniły kolor na, a zmiana powiększyła się w miarę upływu czasu. Liście żółkły i opadały, a zaszczepiona roślina obumarła 7-10 dni po zaszczepieniu. W roślinach kontrolnych nie rozwinęły się zmiany chorobowe. Większość genów uległa ekspresji inaczej po inokulacji Phytophthora capsici w porównaniu z grupą kontrolną. Analiza histopatologiczna zakażonych tkanek wykazała, że Phytophthora capsici skolonizowała ksylem.
  2. Pobrać próbki interesujących materiałów roślinnych i przechowywać je w temperaturze -80 °C w ciekłym azocie do wykorzystania w kolejnych badaniach.
    UWAGA: Ciekły azot, plastikowe torby, markery, nożyce do gałęzi i inne materiały zostały przygotowane przed eksperymentami.
  3. Po pobraniu próbek z określonych materiałów roślinnych do ich wykorzystania, należy przelać w autoklawie wszystkie pozostałe materiały roślinne, resztki kultury i pożywki hodowlanej Phytophthora capsici oraz wszystkie narzędzia i sprzęt laboratoryjny używane w tej pracy związanej z zaszczepianiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje objawy liści czarnego pieprzu po zaszczepieniu P. capsici. Rysunek 2 pokazuje objawy łodyg czarnego pieprzu po zaszczepieniu P. capsici. Patogen zainfekował pieprz na łodydze podstawy; Objawy, w tym żółknięcie liści, więdnięcie, brązowienie ksylemu i stopniowe czernienie naczyń. Rysunek 3 pokazuje większość genów wyrażanych inaczej po inokulacji Phytophthora capsici w porównaniu z grupą kontrolną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu główka podstawy została nakłuta w celu uszkodzenia i zapewnienia skutecznego systemu inokulacji w roślinie czarnego pieprzu. Granulki grzybni następnie przykryły trzy otwory, aby zatrzymać wilgoć i umożliwić patogenowi dobre zainfekowanie rośliny. Po zaszczepieniu liście żółknęły i opadały, a zaszczepione rośliny obumarły. W roślinach kontrolnych nie rozwinęły się zmiany chorobowe. Większość genów uległa ekspresji inaczej po inokulacji Phytophthora capsici w porównaniu z grupą kontrolną. Choroby gr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2020YFD1001200), Chiński System Badań Rolniczych (CARS-11), specjalny fundusz badawczy Platformy Innowacji dla Akademików Prowincji Hainan (YSPTZX202154), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Hainan w Chinach (321RC652) oraz Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 31601626).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Proszek agarowySolarbioA8190
Czysta ławkaHaier
DekstrozaXilong Scientific 15700501
Piec do sterylizacji w wysokiej temperaturzePetriego Zaelway
BS-90-D
Talerze na płytki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
  2. Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
  3. Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830(2015).
  4. Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
  5. Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
  6. Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
  7. Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
  8. Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099(2018).
  9. English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
  10. Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
  11. Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
  12. Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
  13. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  14. Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

choroba zgnilizny korzeniinterakcja patogen ro linainokulacja nak uciemgranulki grzybniagar ziemniaczano dekstrozypatogeny glebowehodowla precyzyjna

Powiązane artykuły