Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Ovo Karmienie komercyjnych jaj brojlerów: dokładna i powtarzalna metoda wpływania na rozwój i wzrost mięśni

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63006

⸱

20 września 2021

 ,  ,  , 
1Department of Animal and Dairy Sciences, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowano solidną metodologię do przeprowadzania badań nad żywieniem in ovo z wykorzystaniem nieinkubowanych komercyjnych jaj brojlerów w celu sprawdzenia zdolności naturalnych i syntetycznych związków, w tym przypadku rybozydu nikotynamidu, do wpływania na rozwój i wzrost mięśni.

Streszczenie

W ciągu ostatnich trzech dekad naukowcy zajmujący się czerwonym mięsem i drobiem skupili się na opracowywaniu strategii i technologii manipulowania rozwojem mięśni podczas rozwoju embrionalnego i płodowego. Ten obszar nadal jest obszarem zainteresowania, ponieważ w tym czasie ustalana jest liczba włókien mięśniowych, która stanowi podstawę dla całego przyszłego wzrostu. U drobiu liczne badania wykazały, że karmienie ovo czynnikami wzrostu, witaminami lub innymi składnikami odżywczymi poprawiło rozwój mięśni zarodkowych i jelit piskląt. Poprawa rozwoju mięśni in ovo może przynieść korzyści przemysłowi drobiarskiemu, prawdopodobnie wpływając na wydajność mięsa, tempo wzrostu lub stany miopatii. W ciągu ostatnich pięciu lat Laboratorium Gonzaleza na Uniwersytecie w Georgii opracowało metodologię żywienia zarodków brojlerów i kurcząt nikotynamidem in ovo, która zmieniła rozwój mięśni. Po wstrzyknięciu do woreczka żółtkowego rozwijającego się zarodka, rybozyd nikotynamidu zwiększał masę mięśni piersiowych głównych i gęstość włókien mięśniowych w momencie wylęgu. Protokół ten zademonstruje metodologię dokładnego i powtarzalnego przeprowadzania badań żywienia in ovo z wykorzystaniem komercyjnych standardowych i wysokowydajnych zarodków brojlerów. Te dane i metody pozwolą innym grupom badawczym na prowadzenie badań nad żywieniem in ovo z dużym sukcesem i powtarzalnością.

Wprowadzenie

Od 1960 roku, konsumpcja mięsa drobiowego per capita w Stanach Zjednoczonych wzrosła w zdumiewającym tempie, podczas gdy inne podstawowe źródła białka pozostały w stagnacji, spadły lub minimalnie wzrosły. Przemysł drobiarski zainwestował dużo czasu i wysiłku badawczego w optymalizację żywienia i genetyki, aby wyprodukować wydajnego ptaka, który nadąży za popytem. Ponieważ głównym celem przemysłu drobiarskiego jest produkcja mięśni do przekształcenia w mięso, ich wysiłki drastycznie zmieniły ostateczną masę mięśniową ptaków podczas zbiorów.

Podobnie jak większość gatunków, drób rozwija mięśnie w sposób dwufazowy. Pierwotna miogeneza wykorzystuje mezenchymalne komórki macierzyste do produkcji pierwotnych włókien mięśniowych, które służą jako rusztowanie dla drugiej fali rozwoju włókien mięśniowych1. U drobiu miogeneza pierwotna zachodzi w dniach embrionalnych od 3 do 8, a miogeneza wtórna zachodzi od 8 do 21 dnia2. Po rozwinięciu, pierwotne i wtórne włókna mięśniowe służą jako podstawa dla całego przyszłego wzrostu mięśni poprzez hipertrofię komórkową. Dlatego naukowcy i przemysł włożyli wiele wysiłku w manipulowanie pierwotną i wtórną miogenezą u wszystkich gatunków produkujących mięso, aby zmaksymalizować wydajność mięsa.

Jedna z technologii badanych u drobiu, zwana żywieniem w ovo, polega na podawaniu związków poprzez wstrzykiwanie. Żywienie in ovo, technologia stosowana w przemyśle drobiarskim od prawie 40 lat, została początkowo opracowana do podawania szczepionek3. Literatura dokumentuje, że żywienie in ovo różnymi związkami i składnikami odżywczymi w różnych okresach rozwojowych i lokalizacjach w jaju pozytywnie wpłynęło na rozwój i wzrost mięśni ovo4,5,6. Do tej pory Laboratorium Gonzaleza na Uniwersytecie w Georgii jest pionierem w wykorzystaniu rybozydu nikotynamidu w żywieniu ovo do manipulowania rozwojem mięśni drobiu.

Rybozyd nikotynamidu, analog pirydyno-nukleozydowy witaminy B3, wytwarza NAD+ poprzez szlak ratunkowy7. Ponieważ ten szlak wykorzystuje mniej etapów enzymatycznych do produkcji NAD+, produkcja jest najbardziej wydajna8. Gonzalez i Jackson9 wykazali, że suplementacja woreczka żółtkowego z zarodka brojlerów rybozydem nikotynamidu zwiększyła główną masę mięśniową i gęstość włókien mięśniowych wyklutych piskląt. Zostało to później potwierdzone przez Xu i wsp.10, którzy odkryli, że zwiększenie dawki rybozydu nikotynamidu zwiększa masę mięśni i zwiększa gęstość włókien mięśniowych. Te pierwsze dwa badania przeprowadzono na brojlerach o plorowanym ploju komercyjnym. Ponieważ brojlery o wysokiej wydajności mają większy potencjał genetyczny dla ostatecznego rozmiaru masy mięśniowej, celem badania było określenie wpływu dawki rybozydu nikotynamidu na główny rozwój i wzrost mięśni piersiowych wyklutych piskląt brojlerów o wysokiej wydajności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metodologie zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgia.

1. Inkubacja jaj i leczenie

  1. Zlecenie pobierania jaj i leczenia
    1. Zdobądź nieinkubowane, zapłodnione jaja brojlerów o wysokiej wydajności i przetransportuj je do laboratorium.
    2. Sprawdź i wyrzuć jaja uznane za złej jakości.
      UWAGA: Wyeliminuj zniekształcone jaja (okrągłe, wydłużone, o płaskiej stronie), popękane, brudne/poplamione, o cienkiej skorupce i pomarszczone. Jest to ważne, aby zminimalizować ryzyko zgniłych jaj.
    3. Przypisuj indywidualne numery jaj, waż i rejestruj numery i wagi jaj w arkuszu kalkulacyjnym
      4. .
    4. Skorzystaj z arkusza kalkulacyjnego, aby posortować jajka według wagi.
      1. Podświetl kolumny liczby jaj i wagi jaja.
      2. Wybierz kartę Dane, a następnie Sortuj - sortuj dane według masy jaja od najmniejszej do największej.
        UWAGA: Aby uzyskać najlepszą szybkość wylęgu, należy używać jaj o wadze od 40 do 70 g.
      3. Opierając się na projekcie eksperymentu, przypisz jajom (numerycznie lub alfabetycznie) zabieg iniekcji i dzień eutanazji. Wprowadź numer zabiegu i dzień eutanazji w osobnych kolumnach i losowo przypisz te czynniki do każdej warstwy.
        UWAGA: W tej publikacji leczenie zostało losowo przydzielone w każdej warstwie 8 jaj.
    5. Wygeneruj tabelę przestawną w programie arkusza kalkulacyjnego, aby upewnić się, że każdy zabieg ma podobną początkową masę jaj.
      1. Zaznacz wszystkie dane w arkuszu kalkulacyjnym, które mają zostać przeanalizowane.
      2. Wybierz opcję Tabela przestawna na karcie Wstaw.
      3. Wybierz zmienną niezależną (kolumna Dzień Eutanazji) w oknie podrzędnym Pola tabeli przestawnej i przeciągnij do pola Wiersze.
      4. Wybierz zmienną niezależną (kolumna Leczenie) w oknie podrzędnym B i przeciągnij do pola Wiersze, w obszarze Dzień Eutanazji.
      5. Wybierz interesującą Cię zmienną zależną (Waga jajka) i przeciągnij ją do pola Wartości.
      6. Zmień ustawienia pola wartości, klikając zmienną zależną i wybierając Ustawienia pola wartości.
        1. Zmień ustawienie na Średnia.
  2. Przypisanie tac
    1. W arkuszu kalkulacyjnym przypisz jajka do tacy (numerycznie lub alfabetycznie), aby zabiegi były równomiernie reprezentowane na tacy.
      1. Przypisz pierwsze cztery jaja z przypisanymi zabiegami do tacy 1. Przypisz następne cztery jajka do zasobnika 2 i kontynuuj, aż wszystkie jajka zostaną przypisane do tacy.
        UWAGA: Ten krok będzie się różnił w zależności od liczby inkubatorów i tac użytych w eksperymencie.
  3. Upewnij się, że wszystkie zabiegi są równomiernie reprezentowane na tacy za pomocą funkcji tabeli przestawnej.
    1. Zaznacz wszystkie dane w arkuszu kalkulacyjnym, które mają zostać przeanalizowane.
    2. Wybierz opcję Tabela przestawna na karcie Wstawianie.
    3. Zaznacz zmienną niezależną (kolumnę zasobnika) w oknie podrzędnym Pola tabeli przestawnej i przeciągnij do pola Wiersze.
    4. Wybierz interesującą Cię zmienną zależną (Waga jajka) i przeciągnij ją do pola Wartości.
    5. Zmień ustawienia pola wartości, klikając zmienną zależną i wybierając Ustawienia pola wartości.
      1. Zmień ustawienie na Liczba.
  4. Inkubacja
    1. Umieścić jaja na odpowiedniej tacy inkubacyjnej i wstępnie je inkubować w temperaturze 26,6 °C przy wilgotności względnej 40% ± 4% przez 6 godzin
      UWAGA: Niektóre inkubatory są wyposażone w systemy samokontroli, które mogą nie być w pełni dokładne. Użyj innych urządzeń monitorujących temperaturę i wilgotność, aby kontrolować warunki.
    2. Zwiększyć temperaturę inkubatora do 37 °C przy wilgotności względnej 40% ± 4% i utrzymać te warunki do 18 dnia inkubacji.
      1. Aby zapewnić odpowiednią temperaturę inkubatora, należy dwa razy dziennie mierzyć temperaturę powierzchni kilku jaj w całym inkubatorze za pomocą termicznego termometru powierzchniowego, aby upewnić się, że temperatura powierzchni wynosi 37 °C.
    3. Obracaj jajka co godzinę, aby zmienić ich położenie.
    4. Rejestruj masę jaj codziennie, aby zapewnić utratę masy jaj o 10%-12,5% w ciągu pierwszych 18,5 dni inkubacji.
      UWAGA: Jeśli utrata masy ciała nie mieści się w pożądanym zakresie, dostosuj (zwiększ lub zmniejsz) wilgotność.
  5. Dzień inkubacji-10 w iniekcjach ovo
    1. Obliczyć ilość rybozydu nikotynamidu potrzebną do każdego zabiegu, korzystając ze wzoru o masie 290,07 g/mol, wstrzykując 100 μl roztworu do woreczka żółtkowego każdego jaja.
      UWAGA: Jako rozcieńczalnik do wszystkich roztworów stosuje się sterylny roztwór soli fizjologicznej (0,9%).
      Obliczenie: 50 jaj × 100 μl = 5 000 μl (5 ml) potrzebnego roztworu. Zaokrąglić do 6 ml, aby upewnić się, że dostępna jest wystarczająca ilość roztworu do wstrzykiwań (Rycina 1).
      1. Po przygotowaniu roztworów umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby utrzymać je w temperaturze jaj.
    2. Wyjmuj jajka z inkubatora po jednej tacy na raz i przykryj ciepłym ręcznikiem.
    3. Świecę jajkową, aby zlokalizować woreczek żółtkowy i oczyścić obszar wstrzyknięcia 70% etanolem.
    4. Wprowadzić sterylną igłę podskórną o gramaturze 20 G, 2,54 cm ~1 cm do skorupki jajka i wstrzyknąć przypisaną dawkę do woreczka żółtkowego. Wstrzyknąć jaja po podaniu rybozydu nikotynamidu 0 mM w 100 μl jałowego roztworu soli fizjologicznej (0,9%).
    5. Natychmiast należy przykryć miejsce wstrzyknięcia małym kawałkiem całkowicie wodoodpornej taśmy, aby uniknąć nadmiernej utraty wilgoci.
    6. Gdy wszystkie jaja zostaną poddane leczeniu, umieść tackę z powrotem w inkubatorze.
    7. W 18 dniu inkubacji wyjmij jaja z tac i umieść je w skrzynkach wylęgowych zgodnie z ich zabiegami.
    8. Umieść pudełka wylęgowe w inkubatorze i zwiększaj wilgotność do 60 ± 2%, aż wszystkie jaja się wyklują lub do 23 dnia inkubacji.
      UWAGA: Jeśli jaja nie zawierają zarodka w momencie prześwietlania, wyrzuć jajo. Zapobiegnie to występowaniu zgniłych jaj.

2. Eutanazja i pobieranie próbek mięśni piersiowych większych

  1. Eutanazja piskląt
    1. W 18. dniu inkubacji należy wyjąć zarodki jajowe z inkubatora i umieścić je w temperaturze pokojowej na 1 godzinę, aby zatrzymać metabolizm. Usuń zarodki z jaj, zważ bez woreczka żółtkowego, a następnie odetnij głowę. 12 godzin po wykluciu, poddać pisklęta eutanazji przez wystawienie na działanie CO2 przez 10 minut, zważyć, szybko pobrać pomiar długości od korony do zadu, a następnie ściąć głowę.
      UWAGA: Fakt, że ptak nie ma już głowy, zapewnia eutanazję.
    2. Rozważmy następujące pomiary (kroki 2.1.2.1-2.1.2.4) przy użyciu suwmiarki cyfrowej dla zarodków i piskląt.
      1. Aby określić długość od korony do zadu, połóż pisklę na boku z głową schowaną i nogami pod ciałem. Zmierz od czubka głowy do ogona.
      2. Aby zmierzyć szerokość głowy, zmierz od jednego otworu na ucho do drugiego otworu na ucho.
      3. Aby określić długość głowy, zmierz od tyłu dzioba do tyłu czaszki.
      4. Weź nieelastyczny sznurek i owiń go wokół czaszki od jednego otworu do ucha, aby zmierzyć obwód głowy. Umieść ciąg na linijce metrycznej, aby uzyskać pomiar.
    3. Zbierz obwód klatki piersiowej, owijając sznurek wokół klatki piersiowej, pod miejscem, w którym skrzydła stykają się z ciałem i umieszczając sznurek na linijce metrycznej, aby uzyskać pomiar.
    4. Spryskaj piersi 70% etanolem i palcami pociągnij pióra i skórę, aby odsłonić mięśnie piersiowe większe i wykonaj pomiary (kroki 2.1.4.1-2.1.4.2) suwmiarką cyfrową.
      1. Aby określić szerokość klatki piersiowej, zmierz w poprzek klatki piersiowej, w której skrzydła stykają się z ciałem.
      2. Aby określić długość klatki piersiowej, zmierz od dołu obojczyka do górnej części poduszeczki tłuszczowej.
  2. Ekstrakcja mięśnia piersiowego większego, pomiar i pobieranie
    1. Za pomocą nożyczek chirurgicznych lub skalpela i kleszczy usuń prawy mięsień piersiowy większy, przecinając wzdłuż kości stępki i uwalniając mięsień ze ściany ciała.
      UWAGA: Pamiętaj, aby nie zbierać mięśnia piersiowego mniejszego, wizualnie identyfikując, że mięsień pozostaje na klatce piersiowej
      2. .
    2. Po usunięciu mięśnia piersiowego większego połóż mięsień płasko na patyczku do lodów i zbierz następujące pomiary (kroki 2.2.2.1-2.2.2.3) za pomocą suwmiarki cyfrowej.
      1. Aby określić długość mięśnia, zmierz od czaszki do ogonowej części mięśnia.
      2. Aby określić szerokość mięśnia, zmierz w najszerszej części czaszki mięśnia.
      3. Aby określić grubość mięśni, podnieś pierś kleszczami i zmierz w najgrubszej części czaszkowej części mięśnia.
    3. W razie potrzeby należy przechowywać ten mięsień piersiowy oraz lewy mięsień piersiowy większy do dalszych analiz (takich jak histologia, ekspresja białek i genów itp.) w temperaturze -80 °C przez okres do roku.

3. Statystyki

  1. Analizuj dane jako całkowicie randomizowany projekt z jajem/pisklęciem jako jednostką eksperymentalną.
    UWAGA: Dawka rybozydu nikotynamidu (DOS) służyła jako efekt stały. Wszystkie dane przeanalizowano za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej (patrz tabela materiałów) i obliczono porównania parami między średnimi najmniejszymi kwadratami zabiegów. Różnice uznano za istotne przy P < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nie odnotowano wpływu DOS na masę ciała zarodków w 18. dniu oraz wyklutych piskląt (P > 0,52; Rysunek 2). Nie stwierdzono wpływu DOS na żadne pomiary mięśnia pectoralis major zarodków w 18. dniu (P > 0,24; Rysunek 3). Nie odnotowano wpływu DOS na pomiary długości i szerokości mięśnia pectoralis major u wyklutych piskląt (P > 0,26); jednak DOS wpłynął na masę i grubość mięśnia (P < 0,03;

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do tej pory Laboratorium Gonzaleza na University of Georgia jest jedyną grupą, która wykazała pozytywny wpływ rybozydu nikotynamidu in ovo żywiącego się na rozwój i wzrost mięśni piersiowych . Pierwsze badanie wykazało, że podawanie in ovo 250 mM rybozydu nikotynamidu zwiększa masę i wymiary mięśni po wstrzyknięciu do woreczka żółtkowego9. W badaniu kontrolnym wstrzyknięcie do żółtka zwiększającej dawki rybozydu nikotynamidu, podobnie jak dawki testowane w obecnym badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Cobb Vantress, Inc. za przekazanie jaj i zapewnienie pomocy technicznej przy inkubacji jaj. Autorzy chcieliby podziękować firmie ChromaDex, Inc. za pomoc techniczną w postaci rybozydu nikotynamidu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Air-Tite&handel; sterylne igły podskórne - 20 g; 1 calFisher Scientific14-817-208https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-hypodermic-needles-32/p-7182916#?keyword
Waga analitycznaVWRVWR-214B2https://us.vwr.com/store/product/20970740/vwr-b2-series-analytical-and-precision-balances
Kompletny zestaw preparacyjnyDOCAZONDK1001https://www.amazon.com/DOCAZON-Complete-Dissection-Set-Dissecting/dp/B07VBHKSW3
Fisherbrand™ Isotemp&handel; Wanny wodne ogólnego przeznaczenia DeluxeFisher ScientificFSGPD02 https://www.fishersci.com/shop/products/isotemp-general-purpose-water-baths/p-6448020
Marka rybaków&handel; Sterylne strzykawki do jednorazowego użytkuFisher Scientific14-955-464https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/p-7114739#?keyword
HIGH INTENSITY EGG CANDLERInkubatory TitanNiehttps://www.titanincubators.com/collections/egg-candlers/products/egg-candler-high-intensity
Termometr na podczerwień na czołoHALIDODOXZ-001
Microsoft ExcelMicrosoftN/A
Neiko Tools Suwmiarka cyfrowaNeiko Tools01408Ahttps://www.amazon.com/Neiko-01407A-Electronic-Digital-Stainless/dp/B000NEA0P8?th=1
Wodoodporna taśma Nexcare AbsoluteNexcareMarka 732https://www.nexcare.com/3M/en_US/nexcare/products/catalog/~/Nexcare-Absolute-Waterproof-Tape/?N=4326+3294529207+3294631805
& rt=rud
Rozmiar pióra Temperatura i wilgotność Rejestrator danych USB z wyświetlaczemOmegaOM-HL-SP-TH
SAS 9.4 dla systemu WindowsSAS InstituteN/Ahttps://www.sas.com/en_us/home.html
Sportsman 1502 InkubatorGQF Produkcja1502https://www.gqfmfg.com/item/1502-digital-sportsman/
Tru Niagen (rybozyd nikotynamidu)ChromaDex, Inc.Nie dotyczyhttps://www.truniagen.com/truniagen-300mg/ - uwaga, skontaktuj się z firmą, aby uzyskać czysty produkt
Wood Craft SticksCreatologyM20001547https://www.michaels.com/wood-craft-sticks-by-creatology/M20001547.html
== dotyczy https://www.omega.com/en-us/temperature-measurement/temperature-and-humidity-data-loggers/p/OM-HL-SP-Series

Bibliografia

  1. Biressi, S., Molinaro, M., Cossu, G. Cellular heterogeneity during vertebrate skeletal muscle development. Developmental Biology. 308 (2), 281-293 (2007).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: Skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Sharma, J., Burmester, B. Resistance of Marek's disease at hatching in chickens vaccinated as embryos with the Turkey herpesvirus. Avian Diseases. 26 (1), 134-149 (1982).
  4. Al-Murrani, W. K. Effect of injecting amino acids into the egg on embryonic and subsequent growth in the domestic fowl. British Poultry Science. 23 (2), 171-174 (1982).
  5. Ohta, Y., Kidd, M. T., Ishibashi, T. Embryo growth and amino acid concentration profiles of broiler breeder eggs, embryos, and chicks after in ovo administration of amino acids. Poultry Science. 80 (10), 1430-1436 (2001).
  6. Zhao, M. M., et al. In ovo feeding of creatie pyruvate increases hatching weight, growth performance, and muscle growth but has no effect on meat quality in broiler chickens. Livestock Science. 206, 59-64 (2017).
  7. Bieganowski, P., Brenner, C. Discoveries of nicotinamide riboside as a nutrient and conserved NRK genes establish a Preiss Handler independent route to NAD1 in fungi and humans. Cell. 117 (4), 495-502 (2004).
  8. Chi, Y., Sauve, A. Nicotinamide riboside, a trace nutrient in foods, is a Vitamin B3 with effects on energy metabolism and neuroprotection. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 16 (6), 657-661 (2013).
  9. Gonzalez, J. M., Jackson, A. R. In ovo feeding of nicotinamide riboside affects pectoralis major muscle development. Translational Animal Science. 4 (3), 1-7 (2020).
  10. Xu, X., Jackson, A. R., Gonzalez, J. M. The effects of in ovo nicotinamide riboside dose on broiler myogenesis. Poultry Science. 100 (3), 100926(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zarodki brojlerównikotynamid rybozydahiperplazja włókien mięśniowychmięsień piersiowy większyembrionalna miogenezainkubacja drobiugęstość włókien mięśniowychmorfometria mięśni
In Ovo Karmienie komercyjnych jaj brojlerów: dokładna i powtarzalna metoda wpływania na rozwój i wzrost mięśni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.