Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63007

⸱

21 października 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Streszczenie

Ten protokół dysocjacji neuronalnej (adaptacja protokołu towarzyszącego komercyjnemu zestawowi do dysocjacji mózgu dla dorosłych) optymalizuje przetwarzanie tkanek w ramach przygotowań do szczegółowych analiz końcowych, takich jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Dysocjacja neuronalna może być prowadzona poprzez dysocjację mechaniczną (taką jak przy użyciu filtrów, technik siekania lub rozcierania pipet), trawienie enzymatyczne lub ich kombinację. Delikatna natura komórek nerwowych może komplikować wysiłki zmierzające do uzyskania wysoce żywotnej, prawdziwej zawiesiny pojedynczej komórki z minimalną ilością zanieczyszczeń komórkowych, które są wymagane do analizy pojedynczej komórki. Dane pokazują, że to połączenie zautomatyzowanej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego konsekwentnie daje wysoce żywotną (>90%) zawiesinę jednokomórkową, pokonując wyżej wymienione trudności. Podczas gdy niektóre kroki wymagają zręczności manualnej, kroki te zmniejszają obsługę próbki i potencjalną utratę komórek. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje każdy etap procesu, aby wyposażyć inne laboratoria w skuteczne dysocjowanie niewielkich ilości tkanki nerwowej w ramach przygotowań do dalszej analizy.

Wprowadzenie

Hipokamp został po raz pierwszy opisany przez bolońskiego anatoma, Giulio Cesare Aranzio, w 1500 roku w klasie sup1. Nazywając tę nowo odkrytą strukturę, Aranzio prawdopodobnie zainspirował się jej niesamowitym podobieństwem do konika morskiego z rodzaju Hippocampus1. Hipokamp bierze udział w reakcjach na stres, ale jest powszechnie znany ze swojej roli w uczeniu się i pamięci. Mówiąc dokładniej, hipokamp jest odpowiedzialny za kodowanie i pobieranie pamięci deklaratywnej i przestrzennej1.

Hipokamp, czyli hipokamp właściwy, jest podzielony na podpola CA1 (cornu ammonis), CA2 i CA31. W porównaniu z resztą układu nerwowego, hipokamp ma kilka unikalnych cech definiujących, w tym plastyczność i potencjał dla trwającej neurogenezy2. Neurogeneza to proces proliferacji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych, po którym następuje ich integracja z istniejącą wcześniej siecią neuronalną. Neurogeneza jest ograniczona do strefy podziarnistej zakrętu zębatego i strefy podkomorowej komór bocznych (i opuszki węchowej)3. Chociaż neurogeneza jest obfita w embriogenezie, jest to proces trwający całe życie3,4. W związku z tym dyskusja ta skupi się na neurogenezie dorosłych w hipokampie.

Strefy podkomorowe i subziarniste to nisze neurogenne zawierające komórki wyściółki i naczyń krwionośnych, a także niedojrzałe i dojrzałe linie nerwowych komórek macierzystych5. Mikroglej przyczynia się do powstania tych nisz jako komórki odpornościowe regulujące neurogenezę6. Neuronalne komórki progenitorowe są niemacierzystymi progeniami nerwowych komórek macierzystych7. W strefie podkomorowej obecne są trzy typy neuronalnych komórek progenitorowych: promieniste komórki glejowe typu B, komórki progenitorowe typu C wzmacniające tranzyt i neuroblasty typu A3,8. Wolno dzielące się nerwowe komórki progenitorowe typu B w strefie podkomorowej mogą różnicować się w szybko dzielące się komórki typu C8. Następnie komórki typu C różnicują się w komórki typu A8. Te neuroblasty migrują przez rostralny strumień migracyjny do opuszki węchowej, zanim zróżnicują się w interneurony lub oligodendrocyty9. Te interneurony opuszki węchowej są kluczem do krótkotrwałej pamięci węchowej i uczenia się asocjacyjnego, podczas gdy oligodendrocyty mielinizują aksony ciała modzelowatego9. Większość neurogenezy u dorosłych zachodzi w strefie podziarnistej zakrętu zębatego, gdzie znajdują się promieniowe progenitory neuronalne typu 1 i niepromieniowe typu 23. Większość nerwowych komórek progenitorowych jest przeznaczona do przekształcenia się w zębate ziarniste neurony i astrocyty10. Połączone połączeniami szczelinowymi, astrocyty tworzą sieci modulujące plastyczność, aktywność synaptyczną i pobudliwość neuronów5. Jako główny neuron pobudzający zakrętu zębatego, komórki ziarniste dostarczają dane wejściowe z kory śródwęchowej do regionu CA311.

Populacje neuronalnych komórek macierzystych mogą być izolowane za pomocą strategii izolacji immunomagnetycznej lub immunofluorescencyjnej12,13. Tkanka nerwowa jest szczególnie trudna do dysocjacji; Wysiłki w tym kierunku często skutkują próbkami o słabej żywotności komórek i/lub niewytworzeniem niezbędnej zawiesiny jednokomórkowej do dalszej analizy. Dysocjacja neuronalna może być przeprowadzona poprzez dysocjację mechaniczną (np. przy użyciu filtrów, technik siekania lub trituracji pipet), trawienie enzymatyczne lub kombinację technik14,15. W badaniu oceniającym metody dysocjacji neuronalnej porównano żywotność i jakość ręcznej dysocjacji mechanicznej za pomocą rozcierania pipet w porównaniu z kombinacjami rozcierania pipet i trawienia za pomocą różnych enzymów15. Jakość została oceniona na podstawie ilości grudek komórkowych i DNA lub szczątków subkomórkowych w przygotowanej zawiesinie15. Zawiesiny guzów glejowych poddanych samej ręcznej dysocjacji mechanicznej miały znacznie niższą żywotność komórek niż leczenie dyspazą lub kombinacją DNazy, kolagenazy i hialuronidazy15. Volovitz i in. uznali różnice w żywotności i jakości między różnymi metodami i podkreślili, że nieodpowiednia dysocjacja może zmniejszyć dokładność dalszej analizy15.

W osobnym badaniu, autorzy porównali ponad 60 różnych metod i kombinacji dysocjacji hodowanych komórek neuronalnych14. Metody te obejmowały osiem różnych wariantów ręcznej dysocjacji mechanicznej za pomocą trituracji pipet, porównanie inkubacji z pięcioma pojedynczymi enzymami w trzech różnych odstępach czasu oraz różne kombinacje dysocjacji mechanicznej z trawieniem enzymatycznym lub kombinacją dwóch enzymów14. Żadna z metod mechanicznych nie pozwoliła na uzyskanie zawiesiny jednokomórkowej14. Cztery z pojedynczych zabiegów enzymatycznych, dziesięć z kombinowanych zabiegów enzymatycznych i cztery kombinacje dysocjacji mechanicznej z trawieniem enzymatycznym dały zawiesinę pojedynczej komórki14. Trawienie enzymatyczne z TrypLE, a następnie Trypsyna-EDTA najskuteczniej dysocjowane próbki14. Nawiasem mówiąc, próbki potraktowane TrypLE i/lub Trypsin-EDTA miały tendencję do tworzenia galaretowatych grudek14. Chociaż badanie to zostało przeprowadzone na hodowanych komórkach, mówi o niedociągnięciach samego rozcierania pipetami lub trawienia enzymatycznego.

Brakuje bezpośrednich porównań ręcznej i automatycznej dysocjacji mechanicznej. Jednak jedna grupa przeprowadziła cytometrię przepływową, aby porównać ręczną i półautomatyczną mechaniczną dysocjację całych mózgów myszy w połączeniu z komercyjnymi zestawami do dysocjacji enzymatycznej papainy lub trypsyny16. Przetwarzanie za pomocą dysocjatora w bardziej spójny sposób dawało żywe komórki16. Po dysocjacji autorzy wyizolowali również komórki Prominin-1, neuronalne komórki prekursorowe i mikroglej16. W przypadku dwóch z trzech izolowanych populacji komórek czystość izolowanych komórek była nieco wyższa, gdy próbki były przetwarzane za pomocą dysocjatora, w porównaniu z manually16. Reiß i wsp. zauważyli, że zmienność między osobami w technice pipetowania utrudnia odtwarzalność plonów populacji żywotnych komórek w dysocjacji tkanek16. Autorzy doszli do wniosku, że zautomatyzowana dysocjacja mechaniczna standaryzuje przetwarzanie próbek16.

Metoda dysocjacji opisana w tym manuskrypcie to połączenie w pełni zautomatyzowanej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego, przy użyciu roztworów towarzyszących komercyjnemu zestawowi do dysocjacji mózgu dla dorosłych17. W przeciwieństwie do standardowych protokołów, ten zoptymalizowany protokół ogranicza manipulację próbką, daje wysoce żywotną zawiesinę jednokomórkową i jest przeznaczony do przetwarzania minimalnych ilości tkanki wyjściowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UAMS. 6-miesięczne samice myszy typu dzikiego C57Bl6/J zostały zakupione i trzymane w grupie (4 myszy w klatce) w stałym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować możliwy do utrwalenia roztwór wyjściowy z żywych/martwych plam. Rozpuść barwienie fluorescencyjne w 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
  2. Zawinąć fiolkę w folię, oznaczyć jako "Odtworzona" i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy.
  3. Przygotuj 0,9% roztwór soli fizjologicznej z heparyną. Rozcieńczyć zawartość jednej fiolki heparyny sodowej (10 000 jednostek USP na 10 ml) w 1 litrze podwójnie destylowanej wody (ddH2O).
  4. Przygotować wystarczającą ilość na około 45 ml na zwierzę i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  5. Zrób 1% paraformaldehydu (PFA).
    1. W dygestorium podgrzej płytę grzejną do 50 °C. W kuchence mikrofalowej podgrzej 100 ml ddH2O w szklanej zlewce do temperatury około 60 °C. Dodaj mieszadło magnetyczne i przenieś na płytę grzejną.
    2. W dygestorium odważyć 1 g PFA i dodać do zlewki ddH2O. Dodać 0,1125 g kryształów NaOH i mieszać aż do rozpuszczenia (5-10 min).
    3. Dodać 0,4 g NaPO4- monobasic i mieszać do rozpuszczenia (2-5 min). Przefiltrować próżniowo roztwór i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl i NaOH.
    4. Schłodzić na lodzie lub w temperaturze 4°C przez 30 minut przed przechowywaniem.
      UWAGA: Podwielokrotności 1,5 ml można przechowywać w temperaturze -20 °C przez jeden rok. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli po rozmrożeniu roztwór stanie się mętny lub wytrąci się osad, nie należy go stosować.
      UWAGA: Toksyczny, łatwopalny. Zawsze pracuj z PFA pod wentylowanym kapturem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
  6. Zawiesić liofilizowany enzym A w 1 ml buforu A. Nie mieszaj roztworu.
    UWAGA: Enzym A i bufor A oraz A, Y i Z są odczynnikami w komercyjnym zestawie do dysocjacji mózgu dla dorosłych17.
  7. Podzielić enzym P na podwielokrotności po 50 μl i ponownie zawiesić enzym A na 10 μl podwielokrotności. Zgodnie z instrukcją zestawu przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.

2. Dzień eksperymentu

  1. Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C.
  2. Umieść porcję (porcje) PFA w lodówce do stopniowego rozmrażania.
  3. Umieść odtworzoną żywą/martwą plamę w ciemności (np. w szufladzie) do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować bufor do albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodać 0,5 g BSA do 100 ml 1x buforowany fosforanem roztwór Dulbecco bez wapnia i magnezu (D-PBS), pH 7,2.
  5. Dodaj mieszadło i mieszaj na talerzu mieszającym przez 30 minut. Przenieść do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego bufora BSA.
  6. Przygotować rozcieńczenie robocze żywej/martwej plamy. Dodać 1 μl odtworzonego roztworu podstawowego żywej/martwej plamy do 360 μL D-PBS i przechowywać w ciemności (np. w szufladzie lub pudełku) w temperaturze pokojowej. Przygotować 50 μl roztworu roboczego na próbkę.

3. Perfuzja

  1. Umieść roztwór soli fizjologicznej z heparyną na lodzie.
  2. Włącz tlen, ustaw kulkę wskaźnika przepływomierza na parowniku do znieczulenia dla małych zwierząt na 1 l/min. Upewnij się, że ciśnienie tlenu i izofluran są odpowiednie.
  3. Ustaw pokrętło parownika na 3.5% (w celu indukcji i konserwacji).
  4. Zalać przewody pompy perfuzyjnej roztworem soli fizjologicznej/heparyny. Ustaw prędkość na 6 ml/min.
  5. Umieść mysz w komorze indukcyjnej, włącz odpowietrznik i odczekaj kilka minut, aż mysz przestanie reagować. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca dzięki braku wycofania pedału do szkodliwego szczypania.
  6. Połóż mysz na plecach na tacy sekcyjnej z nosem w stożku nosowym. Wykonaj wtórne potwierdzenie pełnego znieczulenia poprzez brak wycofania pedału do szkodliwego uszczypnięcia. Przypnij wszystkie cztery łapy do tacy.
  7. Spryskaj brzuch zwierzęcia 20% etanolem.
  8. Za pomocą kleszczy uszczypnij dolną część brzucha i unieś skórę. Użyj nożyczek, aby przeciąć futro i skórę do dna klatki piersiowej.
  9. Wykonaj dwa ukośne nacięcia od spodu klatki piersiowej w kierunku każdego ramienia.
  10. Ostrożnie wyciąć przeponę (omijając płuca i serce). Wytnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
  11. Ostrożnie odetnij tkankę łączną wokół serca.
    UWAGA: Kroki 3.10-3.11 są krytyczne; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
  12. Użyj nożyczek, aby przyciąć prawy przedsionek (ciemny płat w lewym górnym rogu serca). Wyłączyć dopływ izofluranu do odpowietrznika.
  13. Trzymaj serce stabilnie za pomocą kleszczy. Ze skosem igły motylkowej skierowanym do góry, przebij lewą komorę, trzymając igłę poziomo i równolegle do zwierzęcia.
  14. Przytrzymaj igłę na miejscu, włącz pompę i przelej co najmniej 30 ml roztworu soli fizjologicznej/heparyny, aż płyn opuszczający serce stanie się nieprzezroczysty, a wątroba i płuca będą blade.
    UWAGA: Kroki 3.13-3.14 są krytyczne; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
  15. Wyłącz pompę, wyjmij igłę i przenieś mysz do obszaru sekcji.

4. Sekcja

  1. Za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych odetnij głowę.
  2. Wytnij futro od tyłu głowy do oczu. Oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić czaszkę.
  3. Przytnij czaszkę między oczami. Wykonaj dwa nacięcia z tyłu czaszki, na godzinie 10 i 2, a następnie wykonaj jedno długie cięcie (trzymaj końcówki w górze, aby uniknąć uszkodzenia mózgu) wzdłuż linii środkowej czaszki do pierwotnego nacięcia między oczami.
  4. Użyj kleszczy, aby oderwać dwie połówki czaszki na boki. Użyj szpatułki, aby usunąć mózg i umieść go na szklanej szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie wypełnionym zimnym D-PBS (Ryc. 1).
  5. Użyj skalpela lub brzytwy, aby oddzielić każdą półkulę. Następnie usuń opuszki węchowe i móżdżek.
  6. Użyj kleszczy, aby usunąć śródmózgowie, aż hipokamp zostanie odsłonięty.
  7. Zabezpiecz mózg kleszczami. Używając drugiego zestawu kleszczy, delikatnie wysuń hipokamp z każdej półkuli i przenieś oba hipokampy do oznaczonej 1,5 ml probówki zawierającej zimny D-PBS.
  8. Umieścić probówkę z próbką zawierającą dwa hipokampy myszy na lodzie.

5. Przygotuj mieszankę enzymów 1 i 2 dla każdej próbki

UWAGA: Dla objętości większych niż 2 ml użyj pipety serologicznej 10 ml; dla objętości 200 μL-2 ml użyj pipety 1000 μL; dla objętości 21-199 μL użyj pipety 200 μL; dla objętości 2-20 μL, użyj pipety 20 μL; dla objętości poniżej 2 μL, użyj pipety 0-2 μL.

  1. Dla każdej próbki rozmrozić po jednej porcji enzymu P i enzymu A w temperaturze pokojowej.
  2. W przypadku mieszanki enzymatycznej 1 połącz 50 μl enzymu P i 1900 μl buforu Z w oznakowanej probówce C (tabela materiałów).
  3. W przypadku mieszaniny enzymów 2 dodać 20 μl buforu Y do rozmrożonych 10 μl podwielokrotności enzymu A.

6. Protokół dysocjacji mózgu osoby dorosłej17

UWAGA: Podczas pracy z próbkami, probówki powinny być umieszczone w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej, podczas gdy BSA i D-PBS pozostają na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Włącz dysocjator.
  2. Użyj kleszczy, aby przenieść fragmenty tkanki hipokampa do rurki C.
  3. Przenieś 30 μl mieszanki enzymów 2 do probówki C. Przekręć nakrętkę, aż poczujesz napięcie, a następnie dokręć, aż usłyszysz kliknięcie.
  4. Umieść rurkę C do góry nogami w pozycji dysocjatora; próbce zostanie przypisany status Wybrany (Rysunek 2). Przymocuj grzejnik do rurki C.
  5. Naciśnij ikonę folderu, wybierz folder Ulubione, przewiń i wybierz 37C_ABDK_02 program. Kliknij OK, aby zastosować program do wszystkich wybranych lamp C, a następnie dotknij Start (Rysunek 2).
  6. Oznaczyć jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml na próbkę.
  7. Umieścić sitko o pojemności 70 μm na każdej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilżyć 2 ml buforu BSA.
  8. Po zakończeniu programu wyjmij grzałkę i rurkę C z dysocjatora.
  9. Dodać 4 ml buforu BSA do próbki i nanieść mieszaninę na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  10. Dodaj 10 ml D-PBS do probówki C, zamknij ją i delikatnie zamieszaj roztwór. Nałóż go na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  11. Wyrzuć sitko do komórek i rurkę C. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odessać i wyrzucić supernatant.

7. Usuwanie gruzu

  1. Zawiesić osad w 1550 μl zimnego D-PBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Dodać 450 μl zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetować w górę iw dół (nie wirować).
    UWAGA: Roztwór do usuwania zanieczyszczeń jest odczynnikiem w komercyjnym zestawie dysocjacyjnym Adult Brian Dissociation Kit17.
  3. Delikatnie nałóż 1 ml zimnego D-PBS na zawiesinę komórkową, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj, aż całkowita ilość nakładki wyniesie 2 ml.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
  4. Wirować przy 3000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C z pełnym przyspieszeniem i pełnym hamowaniem.
    UWAGA: Jeśli fazy nie są wyraźnie oddzielone, powtórz kroki 7.2-7.3. Odwirować po raz ostatni przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawieszenie powinno teraz składać się z trzech odrębnych warstw (Rysunek 3). Zassać najwyższą warstwę. Przesuwaj końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.
  6. Dodaj 2 ml zimnego D-PBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
  7. Wirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu BSA.
    UWAGA: W tym momencie komórki można ponownie zawiesić w odpowiednim buforze, a następnie znakować magnetycznie i izolować w ramach przygotowań do sekwencjonowania pojedynczych komórek.

8. Liczba komórek

  1. Zliczanie komórek należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta dostępnego licznika ogniw (jedna opcja jest zaznaczona w tabeli materiałów)

9. Żywa/martwa plama

  1. Pozostałe 900 μl (od 7.7) odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu.
  2. Podczas wirowania próbki oznacz jedną rurkę przepływową na próbkę i zawiń ją w folię, aby ograniczyć ekspozycję na światło.
  3. Odessać i wyrzucić supernatant.
  4. Zawiesić osad w 50 μl rozcieńczonej żywej/martwej plamy (wcześniej przygotowanej).
    UWAGA: Ten krok należy wykonać przy słabym oświetleniu. Aby to osiągnąć, wyłącz górne światła w pomieszczeniu.
  5. Przenieść każdą próbkę do odpowiedniej oznakowanej rurki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8-10 minut w ciemności (np. w szufladzie lub pudełku).
  6. Dodać 500 μl buforu BSA i odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu.
  7. Odessać i wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Pellet może nie być widoczny; Pozostawić niewielką ilość bufora, aby przypadkowo nie zassać osadu. W tym momencie komórki można ponownie zawiesić w odpowiednim buforze, zablokować i wybarwić przeciwciałami specyficznymi dla komórki. Zobacz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładowym protocol18.

10. Fiksacja (opcjonalnie)

  1. Zawiesić granulat w 200 μL 1% PFA (wcześniej przygotowany). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Przemyć przez dodanie 500 μl D-PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odessać supernatant.
    UWAGA: Pellet może nie być widoczny; Pozostawić niewielką ilość bufora, aby przypadkowo nie zassać osadu.
  4. Zawiesić osad w 200 μl D-PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.

11. Cytometria przepływowa

  1. Oznacz nasadki filtrów na nowych probówkach.
  2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml odpipetuj każdą próbkę na nasadkę filtra.
  3. Odwirować krótko przy 200 x g w temperaturze 4 °C, pozwalając wirówce osiągnąć tylko 200 x g przed zatrzymaniem pracy.
  4. Przejdź do rdzenia cytometrii przepływowej w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Próbki opracowano przy użyciu cytometru przepływowego w jednostce centralnej, a uzyskane dane oceniono za pomocą pakietu oprogramowania do analizy przepływowej. Wcześniej przeanalizowano kontrole kompensacji – barwienie żywe/martwe oraz kontrolę negatywną. W przypadku użycia wielu fluorochromów dla każdego przeciwciała należy przygotować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) oraz kontrole jednobarwne. Kompensację nakładania się widm dla próbek doświadczalnych obliczono na podstawie przeanalizowanych kontroli. Do ident...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kilka kroków w tym protokole dysocjacji neuronalnej wymaga biegłej techniki i zręczności - perfuzja, aspiracja supernatantu i usunięcie mieliny. Przez cały proces perfuzji narządy wewnętrzne muszą pozostać nienaruszone (poza usunięciem przepony i przycięciem serca); Obejmuje to unikanie górnych komór serca za pomocą igły motylkowej. Podczas gdy potrzebna ilość soli fizjologicznej z heparyną jest różna, przezroczysty płyn wypływający z serca wskazuje, że proces został zakończony. Mózg musi być całkowicie i prawidłowo ukrw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Aimee Rogers za zapewnienie praktycznego szkolenia i ciągłe wsparcie produktu. Dziękujemy dr Amandzie Burke za ciągłe rozwiązywanie problemów i wyjaśnianie dyskusji. Dziękujemy Meredith Joheim i Grupie Komunikacji Naukowej UAMS za redakcję gramatyczną i formatowanie tego manuskryptu. Badanie to było wspierane przez NIH R25GM083247 i NIH 1R01CA258673 (ARA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlFisher Scientific02-682-003Basix, różne kolory
15 ml probówek FalconBecton Dickinson Labware Europe352009Polistyren
25 ml Pipety serologiczneFisher Scientific14-955-235
5 ml Probówka z polistyrenu o okrągłym dnieFalcon352052
500 ml Filtr próżniowy/ Przechowywanie System butelekCorning431097
70 μ m Sitko do komórekFisher Scientific08-771-2
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłychMiltenyi Biotec  130-107-677Zawiera enzym P, bufor Z, bufor Y, enzym A, bufor A, roztwór do usuwania zanieczyszczeń
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mysz, klon REA969Miltenyi Biotec130-116-246
Podstawowe białko antymielinoweSigma-AldrichM3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, człowiek, mysz i szczur, klon 2-2BMiltenyi Biotec130-117-394
BD LSRFortessaBD
BSASigma-AldrichA7906-50G
CD11b-VioBlue, mysz, klon REA592Miltenyi Biotec130-113-810
CD31 PrzeciwciałoMiltenyi Biotec130-111-541
Ceramiczne mieszadło z płytą grzejnąFisher Scientific11-100-100SH
DimetylosulfotlenekFisher ScientificBP231-100
EtanolPharmco firmy Greenfield Global111000200
Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific14-432-22
- SharpFine Science Tools14060-09
Perfusion FlowJoBD(v10.7.0)
Rurki GentleMACS CMiltenyi Biotec130-093-237
GentleMACS Octo Dysocjator z grzałkamiMiltenyi Biotec130-096-427
Gibco DPBS (1X)ThermoFisher Scientific14190144
Szklana zlewkaFisher Scientific02-555-25A
Heparyna sodowaFresenius Kabi504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisherL34965
Magnetyczny pręt do mieszaniaFisher Scientific14-513-51
Noyes Noyes Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15012-12Rozwarstwienie
ParaformaldehyduSigma-Aldrich441244-3KGPrilled, 95%
końcówki do pipet GP LTS 20 i mikro; L 960A/10KońcówkiRainin 30389270
GP LTS 250 µ L 960A/10KońcówkiRainin 30389277
RT LTS 1000 µ L FL 768A/8Rainin30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L)Rainin30386597
RBXMO FITC XADSFisher ScientificA16167
Okrągłe wiadro na lód z pokrywkąFisher Scientific07-210-129
Probówki z okrągłym dnem z nasadką sitkowąFalcon100-0087
S1 Napełniacze do pipetThermoFisher Scientific9541
i szpatułka SondaPrecyzyjne narzędzia naukowe10090-13Rozwarstwienie i
Zestaw do infuzji perfuzyjnej Surflo Winged 23 G x 3/4"TermunoSV-23BLKigłą motylkową
Fisher Scientific14-809-37
Wirówka Thermo Scientific Legend XTRThermoFisherwycofana z produkcjiLub inna standardowa wirówka stołowa
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływieFisher Scientific13-876-2Model o niskim przepływie
Zestaw startowy VetFlo dla myszyKent ScientificVetFlo-MSEKITMaska anestezjologiczna, rurka, komora indukcyjna, kanistry z węglem drzewnym
Waporyzator VetFlo Jednokanałowy system anestezjologicznyKent ScientificVetFlo-1210S0,2– 4 LPM
Vi-CELL XR Analizator żywotności komórekBeckman Coulter Nauki przyrodnicze731196Liczenie komórek
Vi-CELL XR 4 worki fiolek na próbkiBeckman Coulter Nauki Przyrodnicze383721Liczenie komórek
do pipet do pipet Stojak na probówki z

Bibliografia

  1. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
  2. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
  3. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).
  5. Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
  6. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
  7. Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
  8. Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
  9. Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
  10. Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
  11. Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
  12. Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
  13. Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
  14. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
  15. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
  16. Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
  17. Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
  18. Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
  19. Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
  20. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).
  22. Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
  23. Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
  24. Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
  25. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  26. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
  27. Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
  28. Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).
  29. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
  30. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
  31. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).
  32. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
  33. O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
  34. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dysocjacja neuronówdysocjacja mechanicznatrawienie enzymatycznezawiesina pojedynczych komórekcytometria przepływowausuwanie zanieczyszczeńsitko do komórekperfuzja mózgupopulacja komórek neuronalnych
Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.