Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół dysocjacji neuronalnej (adaptacja protokołu towarzyszącego komercyjnemu zestawowi do dysocjacji mózgu dla dorosłych) optymalizuje przetwarzanie tkanek w ramach przygotowań do szczegółowych analiz końcowych, takich jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Dysocjacja neuronalna może być prowadzona poprzez dysocjację mechaniczną (taką jak przy użyciu filtrów, technik siekania lub rozcierania pipet), trawienie enzymatyczne lub ich kombinację. Delikatna natura komórek nerwowych może komplikować wysiłki zmierzające do uzyskania wysoce żywotnej, prawdziwej zawiesiny pojedynczej komórki z minimalną ilością zanieczyszczeń komórkowych, które są wymagane do analizy pojedynczej komórki. Dane pokazują, że to połączenie zautomatyzowanej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego konsekwentnie daje wysoce żywotną (>90%) zawiesinę jednokomórkową, pokonując wyżej wymienione trudności. Podczas gdy niektóre kroki wymagają zręczności manualnej, kroki te zmniejszają obsługę próbki i potencjalną utratę komórek. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje każdy etap procesu, aby wyposażyć inne laboratoria w skuteczne dysocjowanie niewielkich ilości tkanki nerwowej w ramach przygotowań do dalszej analizy.
Wprowadzenie
Hipokamp został po raz pierwszy opisany przez bolońskiego anatoma, Giulio Cesare Aranzio, w 1500 roku w klasie sup1. Nazywając tę nowo odkrytą strukturę, Aranzio prawdopodobnie zainspirował się jej niesamowitym podobieństwem do konika morskiego z rodzaju Hippocampus1. Hipokamp bierze udział w reakcjach na stres, ale jest powszechnie znany ze swojej roli w uczeniu się i pamięci. Mówiąc dokładniej, hipokamp jest odpowiedzialny za kodowanie i pobieranie pamięci deklaratywnej i przestrzennej1.
Hipokamp, czyli hipokamp właściwy, jest podzielony na podpola CA1 (cornu ammon....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UAMS. 6-miesięczne samice myszy typu dzikiego C57Bl6/J zostały zakupione i trzymane w grupie (4 myszy w klatce) w stałym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
1. Przygotowanie odczynników
- Przygotować możliwy do utrwalenia roztwór wyjściowy z żywych/martwych plam. Rozpuść barwienie fluorescencyjne w 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
- Zawinąć fiolkę w folię, oznaczyć jako "Odtworzona" i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy.
- Przygotuj 0....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Próbki opracowano przy użyciu cytometru przepływowego w jednostce centralnej, a uzyskane dane oceniono za pomocą pakietu oprogramowania do analizy przepływowej. Wcześniej przeanalizowano kontrole kompensacji – barwienie żywe/martwe oraz kontrolę negatywną. W przypadku użycia wielu fluorochromów dla każdego przeciwciała należy przygotować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) oraz kontrole jednobarwne. Kompensację nakładania się widm dla próbek doświadczalnych obliczono na podstawie przeanalizowanych kontroli. Do ident.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kilka kroków w tym protokole dysocjacji neuronalnej wymaga biegłej techniki i zręczności - perfuzja, aspiracja supernatantu i usunięcie mieliny. Przez cały proces perfuzji narządy wewnętrzne muszą pozostać nienaruszone (poza usunięciem przepony i przycięciem serca); Obejmuje to unikanie górnych komór serca za pomocą igły motylkowej. Podczas gdy potrzebna ilość soli fizjologicznej z heparyną jest różna, przezroczysty płyn wypływający z serca wskazuje, że proces został zakończony. Mózg musi być całkowicie i prawidłowo ukrw.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Aimee Rogers za zapewnienie praktycznego szkolenia i ciągłe wsparcie produktu. Dziękujemy dr Amandzie Burke za ciągłe rozwiązywanie problemów i wyjaśnianie dyskusji. Dziękujemy Meredith Joheim i Grupie Komunikacji Naukowej UAMS za redakcję gramatyczną i formatowanie tego manuskryptu. Badanie to było wspierane przez NIH R25GM083247 i NIH 1R01CA258673 (ARA).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do mikrowirówek 1,5 ml | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, różne kolory |
| 15 ml probówek Falcon | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polistyren |
| 25 ml Pipety serologiczne | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 ml Probówka z polistyrenu o okrągłym dnie | Falcon | 352052 | |
| 500 ml Filtr próżniowy/ Przechowywanie System butelek | Corning | 431097 | |
| 70 μ m Sitko do komórek | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Zawiera enzym P, bufor Z, bufor Y, enzym A, bufor A, roztwór do usuwania zanieczyszczeń |
| Folia aluminiowa | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mysz, klon REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Podstawowe białko antymielinowe | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, człowiek, mysz i szczur, klon 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mysz, klon REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Przeciwciało | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramiczne mieszadło z płytą grzejną | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimetylosulfotlenek | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Etanol | Pharmco firmy Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Perfusion FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| Rurki GentleMACS C | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo Dysocjator z grzałkami | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Szklana zlewka | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparyna sodowa | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetyczny pręt do mieszania | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Noyes Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15012-12 | Rozwarstwienie |
| Paraformaldehydu | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| końcówki do pipet GP LTS 20 i mikro; L 960A/10 | Końcówki | Rainin 30389270 | |
| GP LTS 250 µ L 960A/10 | Końcówki | Rainin 30389277 | |
| RT LTS 1000 µ L FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μ L) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Okrągłe wiadro na lód z pokrywką | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Probówki z okrągłym dnem z nasadką sitkową | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Napełniacze do pipet | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| i szpatułka Sonda | Precyzyjne narzędzia naukowe | 10090-13 | Rozwarstwienie i |
| Zestaw do infuzji perfuzyjnej Surflo Winged 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | igłą motylkową |
| Fisher Scientific | 14-809-37 | ||
| Wirówka Thermo Scientific Legend XTR | ThermoFisher | wycofana z produkcji | Lub inna standardowa wirówka stołowa |
| Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie | Fisher Scientific | 13-876-2 | Model o niskim przepływie |
| Zestaw startowy VetFlo dla myszy | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Maska anestezjologiczna, rurka, komora indukcyjna, kanistry z węglem drzewnym |
| Waporyzator VetFlo Jednokanałowy system anestezjologiczny | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0,2– 4 LPM |
| Vi-CELL XR Analizator żywotności komórek | Beckman Coulter Nauki przyrodnicze | 731196 | Liczenie komórek |
| Vi-CELL XR 4 worki fiolek na próbki | Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze | 383721 | Liczenie komórek |
Bibliografia
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
