Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Streptomyces spp. są głównym źródłem klinicznych antybiotyków i chemikaliów przemysłowych. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 to szybko rosnąca odmiana i naturalny producent chloramfenikolu, jadomycyny i pikromycyny, co czyni ją atrakcyjnym kandydatem na podwozie do biologii syntetycznej nowej generacji. Dlatego narzędzia genetyczne, które przyspieszają rozwój S. venezuelae ATCC 10712, a także innych modeli Streptomyces spp., są wysoce pożądane w inżynierii produktów naturalnych i odkryciach. W tym celu w protokole tym przewidziano dedykowany bezkomórkowy system S. venezuelae ATCC 10712, który umożliwia wysokowydajną heterologiczną ekspresję genów o wysokiej zawartości G + C (%). Protokół ten jest odpowiedni dla reakcji wsadowych na małą skalę (10-100 μl) w formacie płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, podczas gdy reakcje są potencjalnie skalowalne. System bezkomórkowy jest solidny i może osiągnąć wysokie plony (~5-10 μM) dla szeregu rekombinowanych białek w minimalnym ustawieniu. Prace te obejmują również szeroki zestaw narzędzi plazmidowych do pomiaru w czasie rzeczywistym syntezy mRNA i białek, a także barwienia fluorescencyjnego w żelu znakowanych białek. Protokół ten można również zintegrować z wysokoprzepustowymi procesami charakterystyki ekspresji genów lub badaniem szlaków enzymatycznych z genów o wysokiej zawartości G + C (%) obecnych w genomach Actinomycetes.
Wprowadzenie
Systemy transkrypcyjno-translacyjne (TX-TL) bez komórek stanowią idealną platformę prototypowania dla biologii syntetycznej do realizacji szybkich cykli projektowania, budowy i testowania, koncepcji inżynieryjnej dla biologii syntetycznej1. Ponadto rośnie zainteresowanie systemami TX-TL do produkcji wysokowartościowych białek rekombinowanych w środowisku otwartej reakcji2, na przykład w celu włączenia niestandardowych aminokwasów do koniugatów przeciwciało-lek3. W szczególności TX-TL wymaga ekstraktu komórkowego, plazmidu lub liniowego DNA oraz roztworu energetycznego do katalizowania syntezy biał....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2, aby zapoznać się z przepisami na podłoże GYM i płytę agarową oraz do płukania S30A i S30B.
1. Przygotowanie rozwiązań i ogólne wytyczne
- Po przygotowaniu wszystkie roztwory, komórki (po wzroście) i ekstrakty komórkowe należy przechowywać na lodzie, chyba że określono wyjątek.
- Zapasy na 1 M Mg-glutaminianu, 4 M K-glutaminianu, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml kwasu poliwinylosulfonowego należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a wszystkie inne zapasy w temperaturze -80 °C. Zminimalizuj liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, aby uniknąć degradacji chemicz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy szczegółowy protokół został przedstawiony jako przykład, aby pomóc użytkownikowi w stworzeniu systemu TX-TL dla Streptomyces w oparciu o szczep modelowy S. venezuelae ATCC 10712 (Rycina 1). Użytkownik może chcieć badać inne szczepy Streptomyces; jednakże etapy wzrostu/zbioru innych szczepów o dłuższym czasie podwajania lub odmiennych preferencjach wzrostu będą wymagały indywidualnej optymalizacji w celu uzyskania najlepszych wyników. Dla uzyskania repreze.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym manuskrypcie opisano wysokowydajny protokół TX-TL S. venezuelae ze szczegółowymi krokami, które są proste do wykonania zarówno dla doświadczonych, jak i nowych użytkowników systemów TX-TL. Kilka cech z istniejących protokołów TX-TL41 Streptomyces45 i E. coli zostało usuniętych w celu ustanowienia minimalnego, ale wysokowydajnego protokołu dla S. venezuelae TX-TL 5,26. Zaleca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za następujące wsparcie badawcze: EPSRC [EP/K038648/1] dla SJM jako PDRA z PSF; Wellcome Trust sponsorował stypendium ISSF dla SJM z PSF w Imperial College London; Grant badawczy Towarzystwa Królewskiego [RGS\R1\191186]; Nagroda Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] dla SJM na Uniwersytecie w Kent; oraz stypendium doktoranckie Global Challenges Research Fund (GCRF) dla KC na Uniwersytecie w Kent.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolba 2,5 l UltraYield | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well/przezroczysta płyta dolna | ThermoFisher | 10692202 | |
| Chlorek amonu (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (roztwór 100 mM, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Karbenicylina (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glukoza (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥ 98% - HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glukozo-6-fosforan (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości) | Melford | B2001 | |
| Czterowodna sól hemimagnezowa kwasu L-glutaminowego (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Chlorek magnezu (98%) | Ekstrakt z słodu fluorochem | 494356 | |
| Sigma | 70167-500G | ||
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-dołkowa płytka do mikrodializy, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly (winyl siarczan) sól potasowa | Sigma | 271969 | |
| Glutaminian potasu (>99%) | Sigma | G1149 | |
| Próbnik aminokwasów RTS | 5 Prime | 2401530 | |
| Chlorek sodu (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Kolumna Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Melford | Y1333 | ||
| Sprzęt | |||
| Czytnik płyt | BMG | Omega |
Bibliografia
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
