Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63012

⸱

10 września 2021

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Synthetic Biology and Innovation, South Kensington Campus, 2Department of Medicine, South Kensington Campus, 3Section of Structural and Synthetic Biology, Department of Infectious Disease, Imperial College London, 4Sir Alexander Fleming Building, South Kensington Campus, 5School of Biosciences, Division of Natural Sciences, University of Kent, 6UK Dementia Research Institute Care Research and Technology Centre, Imperial College London; Hammersmith Campus, 7UK Innovation and Knowledge Centre for Synthetic Biology (SynbiCITE) and the London Biofoundry, Imperial College Translation & Innovation Hub

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Streszczenie

Streptomyces spp. są głównym źródłem klinicznych antybiotyków i chemikaliów przemysłowych. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 to szybko rosnąca odmiana i naturalny producent chloramfenikolu, jadomycyny i pikromycyny, co czyni ją atrakcyjnym kandydatem na podwozie do biologii syntetycznej nowej generacji. Dlatego narzędzia genetyczne, które przyspieszają rozwój S. venezuelae ATCC 10712, a także innych modeli Streptomyces spp., są wysoce pożądane w inżynierii produktów naturalnych i odkryciach. W tym celu w protokole tym przewidziano dedykowany bezkomórkowy system S. venezuelae ATCC 10712, który umożliwia wysokowydajną heterologiczną ekspresję genów o wysokiej zawartości G + C (%). Protokół ten jest odpowiedni dla reakcji wsadowych na małą skalę (10-100 μl) w formacie płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, podczas gdy reakcje są potencjalnie skalowalne. System bezkomórkowy jest solidny i może osiągnąć wysokie plony (~5-10 μM) dla szeregu rekombinowanych białek w minimalnym ustawieniu. Prace te obejmują również szeroki zestaw narzędzi plazmidowych do pomiaru w czasie rzeczywistym syntezy mRNA i białek, a także barwienia fluorescencyjnego w żelu znakowanych białek. Protokół ten można również zintegrować z wysokoprzepustowymi procesami charakterystyki ekspresji genów lub badaniem szlaków enzymatycznych z genów o wysokiej zawartości G + C (%) obecnych w genomach Actinomycetes.

Wprowadzenie

Systemy transkrypcyjno-translacyjne (TX-TL) bez komórek stanowią idealną platformę prototypowania dla biologii syntetycznej do realizacji szybkich cykli projektowania, budowy i testowania, koncepcji inżynieryjnej dla biologii syntetycznej1. Ponadto rośnie zainteresowanie systemami TX-TL do produkcji wysokowartościowych białek rekombinowanych w środowisku otwartej reakcji2, na przykład w celu włączenia niestandardowych aminokwasów do koniugatów przeciwciało-lek3. W szczególności TX-TL wymaga ekstraktu komórkowego, plazmidu lub liniowego DNA oraz roztworu energetycznego do katalizowania syntezy białek w reakcjach wsadowych lub półciągłych. Podczas gdy Escherichia coli TX-TL jest dominującym systemem bezkomórkowym, wiele pojawiających się niemodelowych systemów TX-TL przyciągnęło uwagę do różnych zastosowań4,5,6,7,8. Kluczowe zalety TX-TL to elastyczna skalowalność (skala od nanolitra do litra)9,10, wysoka powtarzalność i zautomatyzowane przepływy pracy8,11,12. W szczególności automatyzacja TX-TL pozwala na przyspieszoną charakterystykę części genetycznych i elementów regulatorowych8,12,13.

Jeśli chodzi o konfigurację reakcji, TX-TL wymaga zarówno pierwotnych, jak i wtórnych źródeł energii, a także aminokwasów, kofaktorów, dodatków i matrycowej sekwencji DNA. Trifosforany nukleotydów (NTP) stanowią podstawowe źródło energii do napędzania początkowej syntezy mRNA (ATP, GTP, CTP i UTP) i białek (tylko ATP i GTP). Aby zwiększyć wydajność TX-TL, NTP są regenerowane poprzez katabolizm wtórnego źródła energii, takiego jak maltose14, maltodextrin15, glucose14, 3-fosfoglicerynian (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17 i L-glutaminian18. Ta wrodzona aktywność metaboliczna jest zaskakująco wszechstronna, ale słabo zbadana, zwłaszcza w powstających systemach TX-TL. Każde źródło energii ma inne właściwości i zalety pod względem wydajności ATP, stabilności chemicznej i kosztów, co jest ważnym czynnikiem przy skalowaniu reakcji TX-TL. Do tej pory obecne protokoły dla E. coli TX-TL osiągnęły do 4,0 mg/ml (~157 μM) dla modelowego białka zielonej fluorescencji (GFP), wykorzystując mieszankę 3-PGA (30 mM), maltodekstryny (60 mM) i D-rybozy (30 mM) jako wtórne źródło energii19.

Ostatnio obserwuje się rosnące zainteresowanie badaniem szlaków biosyntezy metabolitów wtórnych w systemach TX-TL20,21,22. W szczególności Actinobacteria są głównym źródłem metabolitów wtórnych, w tym antybiotyków i chemikaliów rolniczych23,24. Ich genomy są wzbogacone o tzw. biosyntetyczne klastry genów (BGC), które kodują szlaki enzymatyczne biosyntezy metabolitów wtórnych. Do badania części genetycznych Actinobacteria i szlaków biosyntezy opracowano ostatnio szereg systemów TX-TL opartych na Streptomyces5,6,25,26. Te wyspecjalizowane systemy Streptomyces TX-TL są potencjalnie korzystne z następujących powodów: [1] zapewnienie natywnego środowiska fałdowania białek dla enzymów ze Streptomyces spp.26; [2] dostęp do optymalnej puli tRNA dla wysokiej ekspresji genów G+C (%); [3] aktywny metabolizm pierwotny, który potencjalnie może zostać przejęty w celu dostarczenia prekursorów biosyntetycznych; oraz [4] dostarczanie enzymów, prekursorów lub kofaktorów z metabolizmu wtórnego obecnych w natywnym ekstrakcie komórkowym. W związku z tym niedawno stworzono wysokowydajny zestaw narzędzi S.venezuelae TX-TL, aby wykorzystać te unikalne możliwości5.

Streptomyces venezuelae to nowy gospodarz dla biologii syntetycznej z bogatą historią w biotechnologii przemysłowej5,27,28,29 i jako modelowy system do badania podziału komórek i regulacji genetycznej u Actinobacteria30,31,32. Główny szczep typu, S. venezuelae ATCC 10712, ma stosunkowo duży genom 8,22 Mb z 72,5% zawartością G+C (%) (numer dostępu: CP029197), który koduje 7377 sekwencji kodujących, 21 rRNA, 67 tRNA i 30 klastrów genów biosyntetycznych27. W biologii syntetycznej S. venezuelae ATCC 10712 jest atrakcyjnym podłożem dla heterologicznej ekspresji szlaków biosyntezy. W przeciwieństwie do większości innych barwników Streptomyces, zapewnia kilka kluczowych zalet, w tym szybki czas podwajania (~40 min), szeroki zakres narzędzi genetycznych i eksperymentalnych5,28, brak zlepiania się grzybni i zarodnikowanie w płynnych podłożach28,33. Kilka badań wykazało również wykorzystanie S. venezuelae do heterologicznej produkcji różnorodnego zestawu metabolitów wtórnych, w tym poliketydów, peptydów rybosomalnych i nierybosomalnych34,35,36,37,38. Te połączone cechy sprawiają, że szczep ten jest atrakcyjnym gospodarzem mikrobiologicznym do zastosowań w biologii syntetycznej i inżynierii metabolicznej. Chociaż S. venezuelae nie jest dominującym modelem Streptomyces dla heterologicznej ekspresji genów, wraz z dalszymi osiągnięciami jest on przygotowany do szerszego zastosowania w odkrywaniu produktów naturalnych.

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół (Rysunek 1) dla wysokowydajnego systemu TX-TL S. venezuelae, który został zaktualizowany z oryginalnego, poprzednio opublikowanego protokołu26. W tej pracy zoptymalizowano roztwór energetyczny i warunki reakcji w celu zwiększenia wydajności białka do 260 μg/ml dla białka reporterowego mScarlet-I w 4-godzinnej reakcji wsadowej 10 μl, przy użyciu standardowego plazmidu pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Plazmid ten został specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić różne metody wykrywania ekspresji białek. Protokół został również uproszczony, a system energetyczny został zoptymalizowany w celu zmniejszenia złożoności i kosztów tworzenia reakcji bezkomórkowych bez uszczerbku dla wydajności. Wraz ze zoptymalizowanym systemem TX-TL opracowano bibliotekę części genetycznych do precyzyjnego dostrajania ekspresji genów oraz jako narzędzia fluorescencyjne do monitorowania TX-TL w czasie rzeczywistym, tworząc w ten sposób wszechstronną platformę do prototypowania ekspresji genów i naturalnych szlaków biosyntezy produktów ze Streptomyces spp. i pokrewnych Actinobacteria.

W tej pracy, zalecany standardowy plazmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) może być użyty do ustalenia przepływu pracy S. venezuelae TX-TL w nowym laboratorium i jest dostępny na AddGene (patrz Tabela uzupełniająca S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I zapewnia użytkownikowi elastyczność w badaniu innych ramek otwartego czytania (ORF). mScarlet-I ORF jest zoptymalizowany pod kątem ekspresji genu S. venezuelae. Promotor SP44 jest silnym konstytutywnym promotorem, który jest wysoce aktywny zarówno u E. coli, jak i Streptomyces spp.39. Plazmid ma dwa unikalne miejsca enzymu restrykcyjnego (NdeI, BamHI), aby umożliwić subklonowanie nowych ORF w ramce ze wspólnym C-końcowym znacznikiem FLAG i systemem znaczników wiążących fluoresceinę arsenową (FlAsH). Alternatywnie, oba znaczniki mogą zostać usunięte z włączeniem kodonu stop po subklonowaniu nowego genu. Za pomocą tego wektora bazowego wykazano wysokowydajną ekspresję szeregu białek, a mianowicie białek ze szlaku biosyntezy oksytetracykliny i niescharakteryzowanej nierybosomalnej syntetazy peptydowej (NRPS) ze Streptomyces rimosus (Figura 2). Jeśli chodzi o wykrywanie mRNA, standardowy plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I zawiera aptamer dBrokułów (w regionie 3'-nieulegającym translacji) do wykrywania za pomocą sondy 3,5-difluoro-4-hydroksybenzylidenimidazolinon (DFHBI). W celu zwiększenia elastyczności na AddGene udostępniono również zestaw narzędzi EcoFlex40 kompatybilnych z MoClo, w tym wektor wahadłowy Streptomyces kompatybilny z EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) oraz szereg plazmidów wariantu pTU1-A-SP44 eksprymujących białko zielonej fluorescencji superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I i β-glukuronidazę (GUS). W szczególności plazmid pSF1C-A pochodzi z pAV-gapdh28 i jest utwardzany z miejsc BsaI/BsmBI do montażu MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP jest odpowiednikiem pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP z EcoFlex40, ale zawiera dodatkowe funkcje koniugacji i integracji chromosomów w Streptomyces spp. przy użyciu systemu integrazy phiC3128.

Pierwszy etap protokołu obejmuje wzrost szczepu S. venezuelae ATCC 10712 lub blisko spokrewnionego, pobieranie komórek w połowie fazy wykładniczej, etapy płukania komórek i równowagę w S30A i S30B. Ten etap trwa trzy dni, a czas na wzrost komórek można wykorzystać na przygotowanie pozostałych składników, jak opisano poniżej. Pobrane komórki są następnie poddawane lizie za pomocą sonikacji, klarowane i poddawane reakcji spływu. Na tym końcowym etapie przygotowania ekstrakty komórkowe można przygotować do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C, aby zminimalizować utratę aktywności. Do montażu reakcji TX-TL przy użyciu tego protokołu przedstawiono Streptomyces Master Mix (SMM), z opcją formatu Minimal Energy Solution (MES), który daje porównywalną wydajność. Ponadto zaleca się rozłożenie świeżej kultury S. venezuelae ATCC 10712 z glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową GYM i inkubację w temperaturze 28 °C przez co najmniej 48-72 godzin, aż pojawią się pojedyncze kolonie. Do kolejnych kroków należy używać tylko świeżych kultur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2, aby zapoznać się z przepisami na podłoże GYM i płytę agarową oraz do płukania S30A i S30B.

1. Przygotowanie rozwiązań i ogólne wytyczne

  1. Po przygotowaniu wszystkie roztwory, komórki (po wzroście) i ekstrakty komórkowe należy przechowywać na lodzie, chyba że określono wyjątek.
  2. Zapasy na 1 M Mg-glutaminianu, 4 M K-glutaminianu, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml kwasu poliwinylosulfonowego należy przechowywać w temperaturze pokojowej, a wszystkie inne zapasy w temperaturze -80 °C. Zminimalizuj liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, aby uniknąć degradacji chemicznej.
  3. W celu przygotowania roztworu energetycznego (patrz Tabela 3), takiego jak 3-PGA (wymaga dostosowania pH), postępuj zgodnie ze wskazówkami zawartymi w protokole E. coli TX-TL41.
    UWAGA: Wszystkie składniki są w pełni rozpuszczalne w ddH2O i przechowywane w postaci podwielokrotności w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  4. Rozmrażaj poszczególne zapasy lub roztwory energetyczne (opisane później) na lodzie. Podgrzej zapas aminokwasów w temperaturze 42 °C z wirowaniem przez ~15-30 minut, aby rozpuścić wszystkie aminokwasy.
  5. Ponieważ niektóre aminokwasy (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) wytrącają się na lodzie, minimalizując czas odpoczynku, pozostaw ten roztwór w temperaturze pokojowej i użyj wiru do rozpuszczenia.
  6. Dodać obliczone objętości (tabela 3) roztworów podstawowych i wody i dobrze wymieszać za pomocą wiru.
  7. Roztwór energetyczny należy podzielić na 20-100 μl porcji na probówkę lub według uznania na lód i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

2. Przygotowanie komórek S. venezuelae ATCC 10712

  1. Dzień 1 - Przygotowanie pożywki/buforu i nocna hodowla wstępna
    1. Przygotować 1 l sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie z przegrodami o pojemności 2 l, zgodnie z opisem w Tabeli 1. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się ze źródłami sprzętu/chemikaliów/odczynników.
    2. Przygotować 1 x 50 ml sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml, zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    3. Przygotować 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 i 500 ml 4 M roztworów NH4Cl, aby uzyskać 1 l płuczących S30A i 1 l płuczących S30B. Przepisy znajdują się w tabeli 2.
    4. Przygotuj nocną hodowlę wstępną. Podgrzej wstępnie sterylne 50 ml płynnej pożywki GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml do temperatury 28 °C przez 30 minut.
    5. Zaszczepić pojedynczą kolonię S. venezuelae ATCC 10712 (lub szczepu pokrewnego) z płytki agarowej GYM do wstępnie ogrzanych 50 ml płynnej pożywki GYM i inkubować w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 16 godzin (nocna hodowla wstępna).
  2. Dzień 2 - Przygotuj prekulturę na dzień i główną kulturę wzrostu.
    1. Podgrzać 50 ml sterylnego płynnego podłoża GYM w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml w temperaturze 28 °C przez 30 minut.
    2. Przenieść 1 ml nocnej kultury wstępnej do wstępnie ogrzanych 50 ml płynnej pożywki GYM i inkubować w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 8 godzin (hodowla wstępna w ciągu dnia).
    3. Po tym okresie wzrostu sprawdzić OD600 w spektrofotometrze, używając rozcieńczenia 1:10 sterylnym podłożem GYM w plastikowej kuwecie o pojemności 1 ml (1 cm długości ścieżki).
      UWAGA: OD600 powinien osiągnąć co najmniej 3-4. Jeśli wzrost jest słaby, zaleca się powtórzenie kroków 2.2.1-2.2.2.
    4. Subkultura: 0,25 ml dziennej kultury wstępnej w 1 l płynnej pożywki GYM w 2-litrowych kolbach z przegrodami.
    5. Wstrząsać przez noc w temperaturze 28 °C, 200 obr./min przez 14 godzin.
  3. Dzień 3 – Zbierz komórki
    1. Po poprzednim okresie inkubacji (14 godzin) zapisz OD600 głównej kultury. Rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:10 świeżą pożywką GYM do pomiaru OD600.
      UWAGA: Na tym etapie OD600 powinien osiągnąć 3,0-4,0.
    2. Jeśli OD600<3.0, zwiększ prędkość wytrząsania do 250-300 obr./min i zwiększaj, aż zostanie osiągnięta OD600 3.0. Rosną nie dłużej niż dodatkowe 2 godziny (łącznie 16 godzin).
    3. Jeśli OD600>3,0, przenieść kultury do pojemników wirujących i szybko schłodzić na mokrym lodzie przez 30 minut.
    4. Czekając, aż hodowla komórkowa ostygnie na lodzie, należy przygotować 4 ml świeżych 1 M ditiotreitolu (DTT), S30A i S30B, jak opisano w tabeli 1, i przechowywać je na lodzie. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać informacje o źródle substancji chemicznej/odczynników.
    5. Wstępnie zważyć pustą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml i schłodzić w temperaturze -20 °C.
    6. Dodaj 2 ml 1 M DTT do 1 l buforu S30A na lodzie i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Dodaj DTT do myjących S30A i S30B tylko przed ich użyciem.
    7. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 10 min i ostrożnie wyrzucić supernatant szybkim i pojedynczym ruchem.
      UWAGA: Jeśli osad zostanie zakłócony, zmaksymalizuj retencję komórek za pomocą resztkowego podłoża GYM i kontynuuj protokół.
    8. Dodać 500 ml buforu S30A i ponownie zawiesić komórki, energicznie potrząsając butelkami wirującymi, aż grudki komórek zostaną jednorodnie rozproszone.
    9. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 6 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Chociaż w tym momencie osad komórkowy będzie twardszy, niektóre ogniwa pozostaną w zawiesinie (patrz Rysunek 1). Traktować zgodnie z opisem w ppkt 2.3.7 i zachować jak najwięcej komórek.
    10. Powtórz kroki 2.3.8-2.3.9.
    11. Dodaj 2 ml 1 M DTT do 1 l buforu S30B na lodzie i dobrze wymieszaj. Dodaj 500 ml buforu S30B do komórek. Powtórz krok 2.3.9.
    12. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu S30B i przenieść do wstępnie zważonej, schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby przenieś pozostałe komórki z dodatkowymi 5-10 ml buforu S30B. Napełnij do 50 ml S30B.
    13. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 × g, w temperaturze 4 °C, 10 minut i ostrożnie odrzucić supernatant.
    14. Powtórz krok 2.3.13.
    15. Ostrożnie odessać pozostały supernatant S30B za pomocą pipety o pojemności 100-200 μl.
    16. Zważyć mokre ogniwa w peletek.
      UWAGA: Typowa masa granulatu z mokrymi komórkami na 1 l nocnej hodowli GYM (OD600 = 3,0) wynosi ~4,5 g.
    17. Na każdy 1 g mokrych komórek dodać 0,9 ml buforu S30B. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety Pasteura lub wiru.
    18. Odwirować krótko (~10 s) do 500 × g w celu osadzenia komórek.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a komórki można zamrozić na ciekłym azocie lub suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C. Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z ciekłym azotem, w tym osłony twarzy i rękawice.

3. Liza komórek za pomocą sonikacji w celu uzyskania surowego ekstraktu komórkowego

UWAGA: Na tym etapie użytkownik może zdecydować się na zakłócenie komórek przez sonikację albo we frakcjach 1 ml (opcja 1), albo jako większą zawiesinę komórek (5 ml) w probówce o pojemności 50 ml (opcja 2). Obie opcje zostały szczegółowo opisane poniżej, aby zapewnić odtwarzalność, ponieważ końcowa objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie z powodu utraty komórek podczas poprzednich etapów zbioru i mycia. Nowy użytkownik powinien najpierw spróbować użyć opcji 2.1, aby ustanowić protokół.

  1. Liza komórek przez sonikację we frakcjach 1 ml
    1. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml (odciąć koniec końcówki, aby zwiększyć rozmiar otworu), przenieś 1 ml zawiesiny komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Jeśli komórki są zamrożone, szybko rozmrozić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą osad w letniej wodzie przed lizą komórek. Przenieś probówkę do mokrego lodu, gdy tylko granulki zaczną się rozmrażać i schładzaj przez 10 minut.
    2. Umieść każdą probówkę do mikrowirówki w zlewce z lodowatą wodą, używając plastikowego stojaka na probówki do przytrzymania probówki do sonikacji.
      UWAGA: Ze względu na wrażliwość ekstraktu komórkowego na przegrzanie, ważne jest, aby rurki nie nagrzewały się, aby zapobiec wytrącaniu się białek i zmniejszonej aktywności enzymatycznej.
    3. Użyj sondy sonikatora z końcówką o średnicy 3 mm i wyczyść ją 70% (v/v) etanolem i wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniwa, aż znajdzie się ~1 cm poniżej powierzchni cieczy.
    4. Wprowadź następujące ustawienia do sonikatora: częstotliwość 20 kHz, amplituda 65%, czas włączenia impulsu 10 s, czas wyłączenia impulsów 10 s, całkowity czas sonikacji 1 min.
    5. Uruchom protokół sonikacji. Przesuwaj rurkę w górę/w dół i na boki podczas pierwszych dwóch cykli spoczynku, aby zapewnić równomierne sonikowanie komórek. Zapisz pobór energii.
      UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednią ochronę słuchu podczas sonikacji. Lepkość zmniejszy się, gdy komórki zostaną zakłócone, a jasnokremowe granulki mokrych komórek powinny zamienić się w jednorodny brązowy płyn. Zalecany dopływ energii wynosi 240 J na ml mokrych komórek. Jeśli komórki są tylko częściowo zbagatelizowane, zawiesina nadal będzie miała kremowy kolor z lepkimi grudkami komórek, szczególnie po bokach probówki.
    6. Odwróć probówkę 2-3 razy i powtórz sonikację przez dodatkowy jeden lub dwa cykle po 10 sekund, często mieszając, aż komórki zostaną całkowicie rozerwane.
  2. Liza komórek poprzez sonikację zawiesiny komórek o pojemności 5 ml
    1. Jeśli komórki są zamrożone, szybko rozmrozić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą osad w letniej wodzie, wstrząsając przed lizą komórek. Przenieś probówkę do mokrego lodu, gdy tylko granulki zaczną się rozmrażać i schładzaj przez 10 minut.
    2. Krótko obrócić probówkę o wymiarach 500 x g, aby osadzić komórki.
    3. Umieść probówkę o pojemności 50 ml w zlewce z lodowatą wodą w celu sonikacji.
      UWAGA: Ze względu na wrażliwość ekstraktu komórkowego na przegrzanie, ważne jest, aby rurki nie nagrzewały się, aby zapobiec wytrącaniu się białek i zmniejszonej aktywności enzymatycznej.
    4. Użyj sondy sonikatora z końcówką o średnicy 6 mm i wyczyść ją 70% (v/v) etanolem i ddH2O (patrz schemat wizualny sondy 6 mm w Rysunek 1). Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny ogniw (~5 ml), aż znajdzie się ~1 cm poniżej powierzchni cieczy.
    5. Wprowadź następujące ustawienia do sonikatora: częstotliwość 20 kHz, amplituda 65%, czas włączenia impulsu 10 s, czas wyłączenia impulsów 10 s, całkowity czas sonikacji 1 min na ml mokrych komórek (łącznie 5 minut).
    6. Uruchom protokół sonikacji. Przesuwaj rurkę w górę/w dół i na boki podczas pierwszych dwóch cykli spoczynku, aby upewnić się, że komórki są równomiernie sonikowane.
      UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa należy nosić odpowiednią ochronę słuchu podczas sonikacji. Lepkość zmniejszy się, gdy komórki zostaną rozerwane, a jasnokremowe mokre komórki powinny zamienić się w jednorodny brązowy płyn. Zapisz pobór energii. Zalecany jest optymalny dopływ energii wynoszący 240 J na ml mokrych komórek (łącznie ~1200 J po 5 minutach sonikacji).
    7. Jeśli niektóre komórki pozostaną nienaruszone, postępuj zgodnie ze wskazówkami z kroku 3.1.5.
    8. Przenieść ekstrakty komórkowe do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml.

4. Klarowanie ekstraktu komórkowego i reakcja spływu

  1. Odwirować zlizane komórki w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Przenieść supernatant do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w postaci podwielokrotności o pojemności 1 ml.
  2. Przeprowadź reakcję spływu ekstraktów komórkowych. Inkubować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakty komórkowe w temperaturze 30 °C przez 60 minut w bloku grzewczym lub inkubatorze bez wstrząsania.
  3. Odwirować ekstrakty komórkowe o stężeniu 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wymieszać sklarowany osad, obracając probówkę pięć razy do uzyskania jednorodnej konsystencji, a następnie trzymać ją na lodzie. Delikatnie odwróć, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  4. Rozcieńczyć 10 μl ekstraktu komórkowego 100-krotnie buforem S30B i zmierzyć całkowite stężenie białka za pomocą testu Bradforda z trzema powtórzeniami technicznymi (patrz Materiał uzupełniający S2 dla wytycznych dotyczących testu Bradforda).
  5. Jeśli stężenie białka wynosi 20-25 mg/ml, przenieś ekstrakty komórkowe w postaci 100 μl podwielokrotności do nowych probówek o pojemności 1,5 ml, błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym osłony twarzy i rękawice.
  6. Jeśli stężenie białka wynosi <20 mg/ml, powtórz kroki przygotowania surowego ekstraktu, aby upewnić się, że wysokiej jakości ekstrakt komórkowy i wydajność TX-TL są porównywalne z poprzednio opublikowaną pracą5.

5. Przygotowanie szablonu DNA plazmidu

  1. Oczyść plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I (pochodzenia pUC19) ze świeżo przekształconego szczepu plazmidu E. coli (DH10β, JM109) wyhodowanego w 50 ml kultury LB (ze 100 mg/ml karbenicyliny) za pomocą odpowiedniego zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Eluować plazmid w 2 x 300 μl wody wolnej od nukleaz i połączyć frakcje.
  3. Dodać 0,1 objętości (66 μl) 3 M octanu sodu (pH 5,2).
  4. Dodać 0,7 objętości (462 μl) izopropanolu.
  5. Inkubować DNA w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
  6. Odwirować w temperaturze 16 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  7. Dodaj 2 ml 70% (v/v) etanolu do osadu DNA.
  8. Odwróć probówkę 3-4 razy, aby ponownie zawiesić osad plazmidowego DNA.
  9. Odwirować przy 16 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  10. Powtórz kroki 5.7-5.9 i usuń cały widoczny płyn.
  11. Suszyć osad DNA na powietrzu przez 10-30 minut lub suszyć przez 5 minut za pomocą wirówki próżniowej.
  12. Zawiesić wysuszony osad w 600 μl ddH2O bez nukleaz.
  13. Zmierzyć stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.
  14. Przygotować 50-100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zalecane jest wysokie stężenie DNA w zakresie 500-1000 ng/μL ze względu na ścisłe ograniczenia objętościowe reakcji bezkomórkowych. Rozcieńczyć plazmidowy rdzeń DNA do 80 nM; 168 ng/μL plazmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I odpowiada 80 nM.

6. Przygotowanie roztworu Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Roztwór aminokwasów
    1. Użyj zestawu do próbowania aminokwasów, aby uniknąć błędów ręcznych i skrócić czas przygotowania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dostępnymi online.
    2. Rozcieńczyć 20x roztwór podstawowy aminokwasu za pomocą ddH2O do końcowego stężenia 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Dalej rozcieńczyć do 2,4 mM (2 mM L-Leu) w roztworze 2,4x SMM (patrz Tabela 3).
      UWAGA: Końcowe stężenie w reakcji TX-TL wynosi 1 mM 19x aminokwasy i 0,83 mM L-Leu.
  2. Roztwór energetyczny i dodatki
    1. Przygotować pozostałe składniki roztworu 2,4x SMM, postępując zgodnie z przepisem opisanym w Tabeli 3.
    2. Alternatywnie, przygotuj 2,4x Rozwiązanie Minimalnego Zużycia Energii (MES), postępując zgodnie z przepisem opisanym w Tabeli 3.

7. Ustawianie standardowej reakcji S. venezuelae TX-TL

  1. Rozmrozić ekstrakt komórkowy, roztwór SMM (lub MES) i plazmidowe DNA na lodzie. Wstępnie schłodzić 384-dołkową płytkę w temperaturze -20 °C.
  2. Ustaw reakcje TX-TL, w których 25% objętości to plazmidowe DNA, 33,33% to ekstrakt komórkowy, a 41,67% to roztwór SMM; utrzymuj je na lodzie, aby uniknąć odchylenia czasu rozpoczęcia.
    UWAGA: Dostarczono standardowy szablon TX-TL (Tabela 4) do obliczania objętości potrzebnych odczynników na podstawie liczby reakcji. Standardowa objętość dla reakcji 33 μl jest następująca: 11 μl ekstraktu komórkowego, 13,75 μl SMM i 8,25 μl plazmidowego DNA.
  3. Delikatnie wiruj mieszaninę przez ~5 s przy niskiej prędkości, aby upewnić się, że roztwór jest jednorodny. Unikaj pienienia/tworzenia się pęcherzyków.
  4. Przenieść 10 μl podwielokrotności do trzech dołków na płytce 384-dołkowej jako trzykrotek techniczny bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Uszczelnij płytkę przezroczystą pokrywą i wiruj z prędkością 400 × g przez 5 s.
  5. Inkubować reakcję w temperaturze 28 °C w inkubatorze (do odczytów punktu końcowego) lub na czytniku płytek bez wstrząsania.
    UWAGA: Reakcje zwykle wymagają 3-4 godzin, aby osiągnąć zakończenie. Patrz Materiał uzupełniający S2, aby uzyskać wskazówki dotyczące czytnika płytek i standardowych pomiarów mScarlet-I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy szczegółowy protokół został przedstawiony jako przykład, aby pomóc użytkownikowi w stworzeniu systemu TX-TL dla Streptomyces w oparciu o szczep modelowy S. venezuelae ATCC 10712 (Rycina 1). Użytkownik może chcieć badać inne szczepy Streptomyces; jednakże etapy wzrostu/zbioru innych szczepów o dłuższym czasie podwajania lub odmiennych preferencjach wzrostu będą wymagały indywidualnej optymalizacji w celu uzyskania najlepszych wyników. Dla uzyskania repreze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym manuskrypcie opisano wysokowydajny protokół TX-TL S. venezuelae ze szczegółowymi krokami, które są proste do wykonania zarówno dla doświadczonych, jak i nowych użytkowników systemów TX-TL. Kilka cech z istniejących protokołów TX-TL41 Streptomyces45 i E. coli zostało usuniętych w celu ustanowienia minimalnego, ale wysokowydajnego protokołu dla S. venezuelae TX-TL 5,26. Zaleca...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za następujące wsparcie badawcze: EPSRC [EP/K038648/1] dla SJM jako PDRA z PSF; Wellcome Trust sponsorował stypendium ISSF dla SJM z PSF w Imperial College London; Grant badawczy Towarzystwa Królewskiego [RGS\R1\191186]; Nagroda Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] dla SJM na Uniwersytecie w Kent; oraz stypendium doktoranckie Global Challenges Research Fund (GCRF) dla KC na Uniwersytecie w Kent.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba 2,5 l UltraYieldThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well/przezroczysta płyta dolnaThermoFisher10692202
Chlorek amonu (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (roztwór 100 mM, >99%)ThermoFisherR0481
Karbenicylina (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glukoza (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)MelfordG32040
DFHBI (≥ 98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glukozo-6-fosforan (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (skontaktuj się z dostawcą w sprawie czystości)MelfordB2001
Czterowodna sól hemimagnezowa kwasu L-glutaminowego (>98%)Sigma49605
Chlorek magnezu (98%)Ekstrakt z słodu fluorochem494356
Sigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-dołkowa płytka do mikrodializy, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly (winyl siarczan) sól potasowaSigma271969
Glutaminian potasu (>99%)SigmaG1149
Próbnik aminokwasów RTS5 Prime2401530
Chlorek sodu (99%)Fluorochem94554
Kolumna Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE (1 g)Sigma505471
MelfordY1333
Sprzęt
Czytnik płytBMGOmega
Ekstrakt z drożdży

Bibliografia

  1. Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66(2018).
  2. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24(2019).
  3. Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  4. Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495(2019).
  5. Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
  6. Xu, H., Liu, W. -Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
  7. Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875(2019).
  8. Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
  9. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  10. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
  11. McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045(2019).
  12. McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
  13. Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
  14. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  15. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  16. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).
  17. Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
  18. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  19. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
  20. Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
  21. Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
  22. Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
  23. Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642(2020).
  24. Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
  25. Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
  26. Moore, S. J., Lai, H. -E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL - a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
  27. Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864(2020).
  28. Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
  29. Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
  30. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684(2013).
  31. Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
  32. Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387(2021).
  33. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
  34. Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
  35. Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
  36. Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
  37. Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
  38. Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
  39. Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
  40. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  41. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  42. Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
  43. Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
  44. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
  45. Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
  46. Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
  47. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  48. Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272(2018).
  49. Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
  50. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
  51. Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
  52. Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
  53. Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
  54. Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezkom rkowy system Streptomyceszestaw narz dzi biologii syntetycznejgeny o wysokiej zawarto ci GCekspresja heterologicznasynteza bia ekzestaw narz dzi plazmidowychbarwienie fluorescencyjnecie ki enzymatycznewysokoprzepustowa ekspresja
Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.