Method Article

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

DOI:

10.3791/63015

⸱

November 20th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Center for Applied Structural Discovery, Biodesign Institute, Arizona State University, 3Eyring Materials Center, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, The Pennsylvania State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia elektronowa to potężne narzędzie do określania struktury w wysokiej rozdzielczości. Makrocząsteczki, takie jak białka rozpuszczalne lub błonowe, mogą być hodowane w wysoce uporządkowane dwuwymiarowe (2D) kryształy w sprzyjających warunkach. Jakość wyhodowanych kryształów 2D ma kluczowe znaczenie dla rozdzielczości końcowej rekonstrukcji poprzez przetwarzanie obrazu 2D. Z biegiem lat monowarstwy lipidowe były wykorzystywane jako warstwa nośna wspomagająca krystalizację 2D białek błony obwodowej, a także białek rozpuszczalnych. Metoda ta może być również stosowana do krystalizacji 2D integralnych białek błonowych, ale wymaga bardziej rozległych badań empirycznych w celu określenia warunków detergentu i dializy, aby ułatwić partycjonowanie do monowarstwy. Na granicy faz powietrze-woda tworzy się monowarstwa lipidowa, tak że polarne grupy głów lipidów pozostają uwodnione w fazie wodnej, a niepolarne, acylowe łańcuchy, ogony rozdzielają się w powietrzu, łamiąc napięcie powierzchniowe i spłaszczając powierzchnię wody. Naładowany charakter lub charakterystyczne ugrupowania chemiczne grup głównych zapewniają powinowactwo do białek w roztworze, sprzyjając wiązaniu w celu tworzenia macierzy 2D. Nowo utworzoną monowarstwę z matrycą 2D można łatwo przenieść do mikroskopu elektronowego (EM) na pokrytej węglem siatce miedzianej używanej do podnoszenia i podtrzymywania układu krystalicznego. W niniejszej pracy opisano metodologię monowarstwowej warstwy lipidowej do obrazowania kriogenicznego mikroskopem elektronowym (cryo-EM).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dyfrakcja elektronów przez kryształy 2D lub spiralne układy białek może osiągnąć rozdzielczość sub-nanometrową w korzystnych przypadkach1,2,3. Szczególnie interesujące są odtworzone matryce białek błonowych 2D lub kryształy w ich środowisku zbliżonym do ich natywnych środowisk1. Ponieważ kryształ działa jak wzmacniacz sygnału, zwiększając intensywność czynników strukturalnych przy określonych częstotliwościach przestrzennych, krystalografia elektronowa umożliwia sondowanie celu o mniejszym rozmiarze w wysokich rozdzielczościach, takich jak małe cząsteczki, niż w przypadku krio-EM-pojedynczej cząstki. Wiązka elektronów może być dyfrakcjonowana przez uporządkowany układ białek 2D, generując wzór dyfrakcyjny lub obraz siatkowy w zależności od tego, gdzie płaszczyzna obrazu jest zapisana na detektorze4. Intensywności dyfrakcji można następnie wyodrębnić i przetworzyć w celu zrekonstruowania struktury projekcyjnej 2D kryształu. Elektrony mają większy przekrój rozpraszania niż promienie rentgenowskie, a ich rozpraszanie jest w większości zgodne z modelem Rutherforda opartym na oddziaływaniu kulombowskim między elektronami a naładowanymi atomami w cząsteczce5. Grubości kryształów membranowych 2D są zwykle mniejsze niż 100 nm, odpowiednie do transmisji elektronów bez dynamicznego rozpraszania występującego w obrębie specimen6. Wykazano, że badania krystalografii elektronowej są potężnym narzędziem do badania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości białek błonowych i interakcji lipidowo-białkowych7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17.

Monowarstwa lipidowa to pojedyncza warstwa lipidowa złożona z fosfolipidów gęsto upakowanych na granicy powietrzno-wodnej6, która może pomóc w tworzeniu tablicy 2D dla rozpuszczalnych białek lub białek błony obwodowej18. W zależności od gęstości lipidów i ich ciśnienia bocznego, cząsteczki lipidów mogą tworzyć uporządkowaną matrycę 2D na granicy faz powietrze-woda z łańcuchami acylowymi rozciągniętymi na powietrze i hydrofilowymi grupami głowy wystawionymi w roztworze wodnym1,6,19. Grupa lipidowa może wchodzić w interakcje z białkami poprzez oddziaływanie elektrostatyczne lub może być modyfikowana w celu zapewnienia znacznika powinowactwa do wiązania określonej domeny białkowej. Na przykład DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacetowy kwas)sukcynylo]2-Ni 2+) jest często używany do tworzenia monowarstwy lipidowej do wiązania białek z polihistydyną tag20,21,22. Ponadto toksyna B może wiązać określony pentasacharyd gangliozydu GM1 w monowarstwie lipidowej do badań strukturalnych23,24. Poprzez zakotwiczenie białek w grupach lipidowych, monowarstwa lipidowa może pomóc w tworzeniu cienkich matryc 2D do badań krystalograficznych elektronów o wysokiej rozdzielczości. Technika monowarstwowej warstwy lipidowej została wykorzystana w krystalografii elektronowej do badań strukturalnych białek, takich jak streptawidyna2,25, annexin V26, toksyna27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase25,29,30, karboksysom shell proteins31 oraz białka kapsydu klasy HIV-132 i wirusa mysiej białaczki Moloneya33. Ze względu na stabilność i właściwości chemiczne monowarstwy lipidowej, zbadano różne zastosowania do przygotowania próbek dla obrazowania krio-EM34. Konieczna będzie jednak optymalizacja w celu tworzenia macierzy białkowych.

Tutaj podajemy obszerne szczegóły ogólnego przygotowania monowarstw lipidowych do obrazowania kriogenicznego oraz kilka kwestii, które mogą wpłynąć na jakość tworzonych monowarstw.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie bloku teflonowego

  1. Przygotuj blok teflonowy z odpornej na chemikalia żywicy PTFE (politetrafluoroetylen). Wykonaj otwory w bloku za pomocą ogólnego wiertła, a następnie wymiary oznaczone w Rysunek 1.

2. Jednowarstwowy preparat lipidowy

UWAGA: Szacowany czas pracy: 30- 45 minut

  1. Przygotowanie zapasu lipidów
    1. Przygotować mieszaninę lipidów o stężeniu 0,01 mg/ml w chloroformie/metanolu w proporcji 9:1 (v/v), używając 8,91 ml chloroformu, 0,99 ml metanolu i 0,01 ml lipidów 10 mg/mL.
  2. Przygotowanie płytki teflonowej
    1. Sonikować płytkę teflonową w kąpieli metanolowej przez 5 minut.
    2. Myć gorącą wodą przez 15 minut.
    3. Spłucz wodą destylowaną.
    4. Wysuszyć płytkę teflonową w eksykatorze przez 30 minut i przechowywać ją w próżni, gdy nie jest używana (Rysunek 1).

3. Tworzenie monowarstwy lipidowej na zbiorniku buforowym

UWAGA: Szacowany czas pracy: 1,5 godziny

  1. Świeżo przygotować mieszaninę lipidów 0,01 mg/ml w mieszaninie chloroformu/metanolu w stosunku 9:1 w dniu eksperymentu.
  2. Umieść bibułę filtracyjną typu 1 na szalce Petriego i ułóż blok teflonu na bibule filtracyjnej.
  3. Napełnij studzienki płytki teflonowej 60 μl buforu.
  4. Ostrożnie dodawać mieszaninę lipidów na wierzch powierzchni buforu kropla po kropli (najlepiej 1 μl na kroplę) za pomocą strzykawki Hamiltona.
  5. Zwilż bibułę filtracyjną wodą destylowaną, aby utrzymać wilgotność na szalce Petriego.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Chloroform powinien odparować i powinna powstać monowarstwa lipidu na powierzchni buforu.

4. Zastosowanie siatki EM na monowarstwie lipidowej

UWAGA: Szacowany czas pracy: 1,5 godziny

  1. Delikatnie umieść dziurawą siatkę EM pokrytą węglem bez rozładowania żarzenia, stroną węglową do dołu, na górze każdego zbiornika buforowego.
  2. Ostrożnie wstrzyknąć białka do dołka do wstrzykiwania bocznego. Jako punkt wyjścia należy przyjąć końcowe stężenia białka w studzience około 1 μM białka. Wstępnie zoptymalizuj stężenie białka przed eksperymentem.
  3. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Delikatnie wstrzyknąć około 20-30 μl buforu do bocznego portu iniekcyjnego. Spowoduje to podniesienie siatki ponad powierzchnię bloku teflonowego.
  5. Natychmiast podnieś siatkę pęsetą i podnieś ją pionowo z kropli.
  6. Przygotuj próbki jednowarstwowe do barwienia ujemnego lub obrazowania krio-TEM (Rysunek 2). Jeśli białka utworzą matrycę 2D, widmo mocy obrazu lub periodogram Fouriera pokażą intensywność dyfrakcji przy częstotliwościach przestrzennych opartych na symetrii kryształów. Jeśli w widmie mocy nie są pokazane żadne plamy dyfrakcyjne, jest mało prawdopodobne, aby białka utworzyły kryształ 2D.
  7. Sprawdź pokrycie monowarstwy lipidowej na siatce EM za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Obraz elektronowy o mniejszym powiększeniu jest pomocny w identyfikacji morfologii pokrytej monowarstwy. Zazwyczaj kontrast obrazu obszaru pokrytego monowarstwą będzie nieco niższy niż obszaru odkrytego. Ponadto obliczone widmo mocy obrazu 2D pomoże zidentyfikować lokalizację krystalicznej 2D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monowarstwa lipidowa osadzona na siatce EM może być wizualizowana pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM) bez barwienia. Obecność monowarstwy można rozpoznać po różnicy kontrastu w stosunku do obszaru, w którym nie ma żadnej próbki na ścieżce wiązki. Obszary, które mają pokrycie monowarstwą lipidową, mają niższy kontrast miejscowy niż te bez pokrycia, ponieważ wiązka elektronów przez puste otwory nie ulega rozproszeniu i wykazuje jaśniejsze oświetlenie (Rysunek 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monowarstwa lipidowa jest potężnym narzędziem, które ułatwia wzrost dużych kryształów 2D do badań strukturalnych makrocząsteczek biologicznych. Aby z powodzeniem przygotować nienaruszoną monowarstwę lipidową na granicy faz powietrze-woda, zdecydowanie zaleca się, aby lipidy były przygotowywane na świeżo w dniu eksperymentu, ponieważ utlenianie lipidowego łańcucha acylowego może prowadzić do przerwania upakowania w monowarstwie i niekorzystnie wpłynąć na powstające kryształy. Zakupione lipidy w postaci proszku należy rozp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie tego manuskryptu było częściowo wspierane przez Biuro Badawcze Armii Stanów Zjednoczonych (W911NF2010321) oraz fundusze startowe Uniwersytetu Stanowego Arizony dla P.-L.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14:0 PC (DMPC)Avanti Lipids8503451,2-dimyristoilo-sn-glicero-3-fosfocholina,
1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Żarówka do małych pipetFisher Scientific03-448-21
ChloroformSigma-AldrichC2432
Odkurzacz eksykatorSouthern Labware55207
Siatki EMMikroskopia elektronowaCF413-50CF-1.2/1.3-4C 1.2 &mikro; m otwór, 1,3 i mikro; m przestrzeń
Bibuła filtracyjnaGE Healthcare Life Sciences1001-090Średnica 90 mm
Szkło Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20A
Strzykawka Hamilton (25 &mikro; L)Hamilton Company80465
(250 &mikro; L)Hamilton Company81165
Strzykawka Hamilton (5 &mikro; L)Hamilton Company87930
Strzykawka Hamilton (500 µ L)Hamilton Company203080
MetanolSigma-AldrichM1775-1GA szalka
PetriegoVWR25384-342100 mm i razy 15 mm
Blok teflonowyGrainger55UK0560 µ Studzienki L z bocznymi portami iniekcyjnymi, ręcznie robione
PęsetaMikroskopia elektronowa Nauki78325Różne style
Woda
Myjka ultradźwiękowaVWR97043-996
Strzykawka ultraczysta

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
  2. Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
  3. Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
  4. Wang, H. -W., Wang, J. -W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
  5. Williams, D. B., Carter, C. B. Transmission electron microscopy. , Springer. New York, NY. (2016).
  6. Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
  7. Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
  8. Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).
  9. Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371(2015).
  10. Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
  11. Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
  12. Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
  13. Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
  14. Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
  15. Chiu, P. -L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
  16. Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106(2014).
  17. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
  18. Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
  19. Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
  20. Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
  21. Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
  22. Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
  23. Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
  24. Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
  25. Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
  26. Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
  27. Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
  28. Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
  29. Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
  30. Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
  31. Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
  32. Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
  33. Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
  34. Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
  35. Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
  36. Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
  37. Dietrich, J., nien-Bryan, C. Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , Imperial College Press. (2005).
  38. Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869(2015).
  39. De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
  40. Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
  41. Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
  42. Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
  43. Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
  44. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  45. Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipid MonolayerElectron Crystallography2D CrystallizationMembrane ProteinsSoluble ProteinsCryogenic Electron MicroscopyEM Grid PreparationTransmission Electron MicroscopeProtein Structure DeterminationSurface Tension

Related Articles