Artykuł metodologiczny

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

DOI:

10.3791/63045

⸱

24 września 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W stanie stacjonarnym, hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) pozostają w dużej mierze w stanie spoczynku i uważa się, że są głównie zależne od glikolizy, aby zaspokoić swoje potrzeby energetyczne. Jednak w warunkach stresowych, takich jak infekcja lub utrata krwi, HSC stają się proliferacyjne i szybko wytwarzają komórki progenitorowe, które z kolei dalej się różnicują, ostatecznie wytwarzając dojrzałe komórki krwi. Podczas tego procesu przejścia i różnicowania HSC wychodzą ze stanu spoczynku i szybko przechodzą metaboliczną zmianę z glikolizy na fosforylację oksydacyjną (OxPHOS). Różne warunki stresowe, takie jak starzenie się, rak, cukrzyca i otyłość, mogą negatywnie wpływać na funkcję mitochondriów, a tym samym mogą zmieniać przeprogramowanie metaboliczne i różnicowanie HSC i progenitorów podczas hematopoezy. Cenne informacje na temat funkcji glikolitycznych i mitochondrialnych HSC i progenitorów w warunkach normalnych i stresowych można uzyskać poprzez ocenę ich wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR), które są wskaźnikami odpowiednio glikolizy komórkowej i oddychania mitochondrialnego.

Tutaj dostarczony jest szczegółowy protokół pomiaru ECAR i OCR w populacjach komórek ujemnych w szpiku kostnym myszy, które obejmują zarówno hematopoetyczne komórki macierzyste, jak i prymitywne komórki progenitorowe (HSPC), przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Protokół ten opisuje podejścia do izolowania komórek ujemnych pod względem linii ze szpiku kostnego myszy, wyjaśnia optymalizację gęstości wysiewu komórek i stężeń 2-deoksy-D-glukozy (2-DG, analog glukozy, który hamuje glikolizę) i różnych leków ukierunkowanych na OxPHOS (oligomycyna, FCCP, rotenon i antymycyna A) stosowanych w tych testach oraz opisuje strategie leczenia farmakologicznego. W tych testach można zmierzyć kluczowe parametry strumienia glikolitycznego, takie jak glikoliza, pojemność glikoliczna i rezerwa glikolityczna oraz parametry OxPHOS, takie jak oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne, wyciek protonów, produkcja ATP, wolna wydolność oddechowa i skuteczność sprzężenia. Protokół ten umożliwia pomiary ECAR i OCR na nieprzylegających HSPC i może być uogólniony w celu optymalizacji warunków analizy dla dowolnego typu komórek zawiesinowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoeza to proces, w którym z HSCs1 powstają różne typy dojrzałych komórek krwi o wysoce wyspecjalizowanych funkcjach. HSC są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w różne multipotencjalne i specyficzne dla linii populacje progenitorów. Ci przodkowie ostatecznie wytwarzają komórki linii limfoidalnych, szpikowych, erytroidalnych i megakariocytów. Aby utrzymać swoją zdolność do samoodnawiania, HSC pozostają w dużej mierze w stanie spoczynku i, podobnie jak inne tkankowe komórki macierzyste, uważa się, że do produkcji ATP polegają na glikolizie, a nie na mitochondrialnym OxPHOS2,3. Wejście w cykl komórkowy prowadzi do zwiększonego oddychania i OxPHOS, co skutkuje podwyższonym poziomem reaktywnych form tlenu (ROS), które są szkodliwe dla utrzymania i funkcji HSC3. Powtarzający się podział komórek może zatem prowadzić do zmniejszenia zdolności HSC do samoodnawiania się, a ostatecznie do ich wyczerpania.

W dorosłej hematopoezie, HSC przede wszystkim przechodzą asymetryczny podział komórek, podczas którego jedna z komórek potomnych zachowuje potencjał HSC i nadal polega na metabolizmie glikolitycznego. Druga komórka potomna staje się prymitywną komórką progenitorową, która traci zdolność do samoodnawiania, ale namnaża się i ostatecznie daje początek zróżnicowanym funkcjonalnym komórkom krwiotwórczym4. Kiedy HSC różnicują się, aby wytworzyć dalszych progenitorów, uważa się, że następuje przejście z glikolizy na metabolizm mitochondrialny, aby dostarczyć energię i elementy budulcowe potrzebne do wsparcia tego szybkiego przejścia5, jak sugerują obserwacje, że HSC posiadają nieaktywną masę mitochondrialną6,7,8,9. W przeciwieństwie do tego, aktywność mitochondrialna (wskazywana przez powiązane poziomy ROS) jest znacznie wyższa u przodków zaangażowanych w linię niż u HSCs9,10,11. Zmiany metaboliczne, które zachodzą w najwcześniejszym etapie hematopoezy, sugerują zatem bezpośrednią i kluczową rolę mitochondriów w regulacji losu HSC.

Dysfunkcyjne mitochondria obecne w różnych warunkach stresu, takich jak starzenie się, rak, cukrzyca i otyłość12, mogą zakłócać zdolność HSC do samoodnawiania się, powodując brak równowagi w różnicowaniu HSC/progenitorów poprzez wytwarzanie nadmiernych ilości ROS, upośledzanie produkcji ATP i/lub zmienianie innych procesów metabolicznych9,12,13. Zaburzenia homeostazy metabolicznej w różnicowaniu HSC/progenitorów mogą znacząco wpływać na hematopoezę, potencjalnie przyczyniając się do rozwoju nieprawidłowości hematologicznych13. Biorąc pod uwagę krytyczny wpływ glikolizy i mitochondrialnego OxPHOS na łodygę i różnicowanie HSC, interesujące jest zbadanie zarówno parametrów metabolicznych w warunkach normalnych, jak i stresowych. Cenne informacje na temat funkcji glikolitycznej i mitochondrialnej HSC i komórek progenitorowych można uzyskać, oceniając ich ECAR i OCR, które są wskaźnikami odpowiednio glikolizy komórkowej i oddychania mitochondrialnego.

Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse to potężne urządzenie wyposażone w dwie sondy na studnię do jednoczesnego pomiaru ECAR i OCR w żywych komórkach, dzięki czemu może być używane do oceny bioenergetyki komórkowej w czasie rzeczywistym, w odpowiedzi na różne substraty lub inhibitory. Kartridż testowy używany z analizatorem zawiera porty iniekcyjne, w których można przechowywać do czterech leków do automatycznego wstrzykiwania podczas testu. Schemat typowego testu obciążeniowego glikolizy jest pokazany w Rysunek 1A. Test rozpoczyna się od pomiaru ECAR komórek inkubowanych w pożywce do testów wysiłkowych glikolizy zawierającej glutaminę, ale nie glukozę ani pirogronian. Reprezentuje to zakwaszenie zachodzące z powodu nieglikolitycznej aktywności komórek i jest zgłaszane jako zakwaszenie nieglikolityczne. Następnie wstrzykuje się glukozę w stężeniu nasycającym. W wyniku glikolizy glukoza w komórce jest przekształcana w pirogronian, który jest dalej metabolizowany w cytoplazmie w celu wytworzenia mleczanu lub w mitochondriach w celu wytworzenia CO2 i wody.

Konwersja glukozy do mleczanu powoduje produkcję netto, a następnie uwolnienie protonów do podłoża zewnątrzkomórkowego, co skutkuje szybkim wzrostem ECAR14,15,16. Ta stymulowana glukozą zmiana ECAR jest zgłaszana jako glikoliza w warunkach podstawowych. Drugie wstrzyknięcie składa się z oligomycyny (inhibitora syntazy ATP, znanego również jako kompleks V17), która hamuje mitochondrialną produkcję ATP. Podczas inhibicji OxPHOS za pośrednictwem oligomycyny, komórki maksymalnie zwiększają glikolizę, aby zaspokoić swoje zapotrzebowanie energetyczne. Powoduje to dalszy wzrost ECAR, ujawniając maksymalną zdolność glikolityczną komórek. Różnica między maksymalną pojemnością glikolityczną a glikolizą bazową nazywana jest rezerwą glikolityczną. Na koniec wstrzykuje się 2-DG, który powoduje znaczny spadek ECAR, zwykle zbliżony do poziomów zakwaszenia nieglikolitycznego. 2-DG jest analogiem glukozy, który konkurencyjnie wiąże się z heksokinazą, powodując hamowanie glikolizy18. Tak więc wywołany przez 2-DG spadek ECAR dodatkowo potwierdza, że glikoliza jest rzeczywiście źródłem ECAR obserwowanym po wstrzyknięciach glukozy i oligomycyny.

Rysunek 1B przedstawia schemat typowego testu stresu mitochondrialnego. Test rozpoczyna się od wyjściowego pomiaru OCR komórek, inkubowanych w mitochondrialnym pożywce do testów wysiłkowych zawierającej glukozę, glutaminę i pirogronian. Po podstawowych pomiarach OCR oligomycyna jest wstrzykiwana do tego testu, który hamuje kompleks V, zmniejszając w ten sposób przepływ elektronów przez łańcuch transportu elektronów (ETC)17. W związku z tym OCR jest zmniejszony w odpowiedzi na wstrzyknięcie oligomycyny, a ten spadek OCR jest związany z produkcją mitochondrialnego ATP. Drugie wstrzyknięcie składa się z cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP), protonoforu i rozprzęgacza mitochondrialnego OxPHOS17. FCCP załamuje gradient protonów mitochondrialnych, umożliwiając przepływ protonów przez wewnętrzną błonę mitochondriów. Z powodu wstrzyknięcia FCCP przepływ elektronów przez ETC jest depreparowany, a kompleks IV zużywa tlen na maksymalnym poziomie. Różnica między maksymalnym OCR a podstawowym OCR jest określana jako wolna wydolność oddechowa, która jest miarą zdolności komórki do reagowania na zwiększone zapotrzebowanie na energię w warunkach stresu. Na koniec wstrzykuje się mieszaninę dwóch inhibitorów ETC (rotenonu, inhibitora kompleksu I i antymycyny A, inhibitora kompleksu III17), co całkowicie zamyka przepływ elektronów, a OCR spada do niskiego poziomu. OCR mierzony po wstrzyknięciu rotenonu i antymycyny A odpowiada niemitochondrialnemu OCR napędzanemu przez inne procesy zachodzące w komórkach. Niemitochondrialny OCR umożliwia obliczenie oddychania podstawowego, wycieku protonów i maksymalnego oddychania.

Oddychanie podstawowe stanowi różnicę między OCR podstawowym a OCR niemitochondrialnym. Wyciek protonów odnosi się do różnicy między OCR po wstrzyknięciu oligomycyny a OCR niemitochondrialnym. Maksymalne oddychanie stanowi różnicę między OCR po wstrzyknięciu FCCP a OCR niemitochondrialnym. Skuteczność sprzężenia oblicza się jako procent szybkości produkcji ATP w stosunku do podstawowej częstości oddychania. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół pomiaru ECAR i OCR w HSPC z ujemnym wynikiem linii przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XFe96. Protokół ten opisuje podejścia do izolowania HSPC z ujemną linią myszy, wyjaśnia optymalizację gęstości wysiewu komórek i stężeń różnych leków stosowanych w testach strumienia zewnątrzkomórkowego oraz opisuje strategie leczenia farmakologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na kręgowcach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z przepisami Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan.

1. Dzień przed testem (Całkowity czas: ~10 min)

  1. Nawodnienie wkładu czujnika (Czas kroku: ~10 min)
    1. Otwórz zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego i wyjmij wkład czujnika oraz zespół płytki użytkowej. Zachowaj mieszkania przewodnika załadunku do wykorzystania następnego dnia.
    2. Ręcznie oddziel wkład czujnika (górna zielona część z pokrywką) od płytki użytkowej (dolna 96-dołkowa mikropłytka) i umieść go do góry nogami obok płytki użytkowej.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej kalibrem 200 μl, dołączonym do zestawu do oznaczania topnika.
    4. Umieść wkład czujnika z powrotem na płycie narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie zanurzone w kalibrze.
    5. Umieść na noc zmontowany wkład czujnika i płytkę narzędziową z kalibrem w inkubatorze bez emisji CO2 37 °C. Aby zapobiec parowaniu kalibru, upewnij się, że inkubator jest odpowiednio nawilżony. W przypadku korzystania ze zwykłego inkubatora w piekarniku do inkubacji w temperaturze 37 °C bez emisji CO2 °C, należy umieścić w inkubatorze otwartą zlewkę zawierającą wodę, aby ją nawilżyć. Jeśli to możliwe, użyj stacji przygotowawczej XF do wszystkich inkubacji w temperaturze 37 °C innych niż CO2.
      UWAGA: Alternatywnie wkład czujnika można nawodnić przez noc 200 μl sterylnej ultraczystej wody na studzienkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2. Zastąp wodę 200 μl na studzienkę o temperaturze 37 °C wstępnie podgrzanego kalibru, co najmniej 45-60 minut przed załadowaniem portów iniekcyjnych w dniu testu.

2. Dzień testu (Całkowity czas: ~9 h 30 min)

UWAGA: Całkowity czas wskazany powyżej obejmuje skumulowany czas trwania kroków 2.1-2.4 oprócz kroku 2.5 lub kroku 2.6.

  1. Przygotowanie mikropłytek pokrytych klejem komórkowym (Czas kroku: ~1 h 30 min)
    UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Przygotować 2,5 ml roztworu kleju komórkowego (22,4 μg/ml, patrz tabela materiałów) na 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórkowych, rozpuszczając 56 μg kleju komórkowego w odpowiedniej objętości wysterylizowanego filtrem 0,1 M wodorowęglanu sodu (pH 8,0) i natychmiast dodając 1 N wodorotlenek sodu w połowie objętości użytego kleju komórkowego. Wiruj lub pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
    2. Otwórz 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórkowej (dołączoną do zestawu do oznaczania topnika) i dozuj 25 μl przygotowanego roztworu kleju komórkowego na dno każdej studzienki. Przykryj mikropłytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz okapu.
    3. Po inkubacji usunąć i wyrzucić nadmiar roztworu kleju komórkowego za pomocą wielokanałowej pipety lub aspiratora i umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 μl sterylnej ultraczystej wody. Wysuszyć płytkę na powietrzu, ze zdjętą pokrywką, wewnątrz kaptura przez 30-45 min.
      UWAGA: Pokryte klejem komórkowym mikropłytki do hodowli komórkowych mogą być przechowywane przez okres do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C. Wstępnie powlekane mikropłytki przechowywane w temperaturze 4 °C muszą być pozostawione do ogrzania do temperatury pokojowej wewnątrz okapu przed wysiewem komórek.
  2. Przygotowanie podłoża testowego (Czas kroku: ~30 min)
    1. Przygotowanie podłoża do testów warunków skrajnych glikolizy
      1. Uzupełnij 100 ml pożywki bazowej (patrz tabela materiałów) 1 ml 200 mM L-glutaminy.
        UWAGA: Końcowe stężenie L-glutaminy w pożywce testowej wynosi 2 mM.
      2. Podgrzać pożywkę z dodatkiem L-glutaminy do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
      3. Dostosować pH ciepłej pożywki do 7,4 za pomocą 1 N NaOH.
      4. Wysterylizuj pożywkę filtrem 0,2 μm i utrzymuj ją w temperaturze 37 °C, aż będzie gotowa do użycia.
    2. Przygotowanie pożywki do badania wysiłkowego mitochondriów
      1. Uzupełnij 100 ml podłoża bazowego 0,45 g glukozy, 1 ml 200 mM L-glutaminy i 1 ml 100 mM pirogronianu sodu.
        UWAGA: Końcowe podłoże testowe zawiera 25 mM glukozy, 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
      2. Podgrzej glukozę, L-glutaminę i pożywkę uzupełnioną pirogronianem sodu do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
      3. Dostosować pH ciepłej pożywki do 7,4 za pomocą 1 N NaOH.
      4. Przefiltruj i wysterylizuj podłoże filtrem 0,2 μm i utrzymuj w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
  3. Zbierz HSPC HSPC o ujemnej linii myszy (czas kroku: ~ 3 h)
    1. Przygotuj bufor do testu, uzupełniając zbilansowany roztwór soli Hanka o 4% płodową surowicę bydlęcą. Przygotuj 1x bufor wzbogacający, rozcieńczając 5x bulion sterylną wodą destylowaną. Trzymaj oba na lodzie do czasu użycia.
    2. Humanitarna eutanazja myszy za pomocą CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy i usunięcie tylnych kończyn nożyczkami. Ostrożnie usuń wszystkie tkanki z kości i odetnij końce po obu stronach kości udowej i piszczelowej za pomocą nożyczek. Wypłukać komórki szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej za pomocą buforu testowego. Przepłukane komórki przepuścić przez sterylny filtr 70 μm, odwirować filtrat o stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    3. Lizować czerwone krwinki poprzez ponowne zawieszenie osadu komórkowego w 500 μl buforu ACK (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Po lizie przez 1 minutę na lodzie, przemyć próbki, dodając 1 ml buforu do oznaczania i odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Po umyciu próbki inkubować z koktajlem biotynylowanych przeciwciał skierowanych przeciwko CD2 (rozcieńczenie 1:200), CD3 (rozcieńczenie 1:200), CD5 (rozcieńczenie 1:200), CD8 (rozcieńczenie 1:200), Ter-119 (rozcieńczenie 1:200), B220 (rozcieńczenie 1:200) i Gr-1 (rozcieńczenie 1:800) przez 45 minut na lodzie w całkowitej objętości 500 μl buforu do oznaczania.
    5. Przemyć próbki 1 ml buforu do oznaczania z odwirowaniem, jak powyżej.
    6. Przemyć próbki 1 ml 1x buforu wzbogacającego z odwirowaniem, jak powyżej.
    7. Próbki inkubować z 20 μl nanokulek streptawidyny i 100 μl 1x buforu wzbogacającego na lodzie przez 15 minut.
    8. Przemyć próbki 1 ml 1x buforu wzbogacającego z odwirowaniem, jak powyżej.
    9. Zawiesić próbki w 2,5 ml 1x buforu wzbogacającego. Umieść je na magnesie separacyjnym na 5 minut. Zebrać supernatanty oddzielnie w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.
    10. Ponownie zawiesić próbki oddzielone magnesem w dodatkowych 2,5 ml buforu wzbogacającego 1x i umieścić je ponownie na magnesie rozdzielającym na 5 minut. Zebrać i połączyć supernatanty z poprzednimi zbiorami w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z kroku 2.3.9.
      UWAGA: Supernatanty zawierają frakcje komórek ujemne pod względem linii.
    11. Odwirować stożkowe probówki o pojemności 15 ml zawierające ujemnie wybrane komórki przez 5 minut w temperaturze 200 × g w temperaturze 4 °C.
    12. Zawiesić osady komórek w 1 ml buforu do oznaczania i policzyć liczbę komórek za pomocą błękitu trypanowego ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika komórek, takiego jak Countess 3,
      UWAGA: Zgodnie z wyżej opisanym podejściem, ~6 × 106 HSPC ujemnych pod względem linii powinno być łatwo oczyszczone z tylnych kończyn pojedynczej myszy. Jeśli odczynniki, takie jak bufor testowy, 1x bufor wzbogacający i koktajl przeciwciał specyficzny dla linii, są przygotowywane w dniu poprzedzającym eksperyment, wzbogacenie HSPC od 4 myszy zajmuje około 2,5-3 godzin. Zajęłoby to dodatkowe 10 minut dla każdej myszy powyżej tej liczby.
  4. Wysiewanie komórek w mikropłytkach pokrytych klejem komórkowym (Czas kroku: ~1 h)
    1. Odwirować komórki z etapu 2.3.12 w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiednim pożywce do oznaczania (pożywka do badania wysiłkowego glikolizy lub pożywka do badania wysiłkowego mitochondriów). Wirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Powtórz krok 2.4.2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim podgrzanym podłożu do oznaczania do stężenia 2,5 ×10,5 komórek na 50 μl lub 5 × 10,6 na ml.
    4. Odpipetować 50 μl zawiesiny komórkowej wzdłuż boku każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórek pokrytej klejem w temperaturze pokojowej. Odpipetować 50 μl pożywki testowej do narożnych dołków pomiarowych tła. Użyj pipety wielokanałowej do powlekania komórek, aby zapewnić spójność.
    5. Utworzyć szalkę równoważącą wirówkę, dodając 50 μl wody na studzienkę z niepowlekanej 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej.
    6. Odwirować komórki na płytce o masie 200 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Nie używaj hamulca. Przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2 na 25-30 minut, aby upewnić się, że komórki są całkowicie połączone. Potwierdź wzrokowo pod mikroskopem, że komórki są stabilnie przylegające do powierzchni mikropłytki.
      UWAGA: Ponieważ ~6 × 106 HSPC ujemnych pod względem linii można pobrać z tylnych kończyn pojedynczej myszy, HSPC wyizolowane od 4 myszy (~2,4 × 107 komórek) są potrzebne do wypełnienia całej 96-dołkowej płytki, jeśli celem jest równoległe badanie przesiewowe wielu interwencji ex vivo. Jeśli jednak celem jest zbadanie wpływu zmiany genetycznej lub interwencji na parametry metaboliczne HSPC in vivo, wówczas HSPC wyizolowane z wielu par myszy kontrolnych i testowych można analizować w wielu powtórzeniach technicznych równolegle przy użyciu jednej płytki.
  5. Wykonanie testu wysiłkowego glikolizy przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (Czas kroku: ~3 h 30 min)
    1. Ładowanie wkładu czujnika związkami iniekcyjnymi
      1. Przygotować 100 mM glukozy, 20 μM oligomycyny i 500 mM roztworów 2-DG we wstępnie podgrzanym pożywce do testu wysiłkowego glikolizy (pH 7,4).
        UWAGA: Wszystkie roztwory związków do wstrzykiwania są przygotowywane przy stężeniu 10x. Końcowe stężenia studzienki wynoszą 10 mM dla glukozy, 2 μM dla oligomycyny i 50 mM dla 2-DG (patrz tabela 1).
      2. Wyjmij uwodniony wkład czujnika z inkubatora o temperaturze 37 °C innej niż CO2 z kroku 1.1.5. Usuń pęcherzyki powietrza z kalibru w tabliczce narzędziowej, wyjmując wkładkę czujnika z kalibru i umieszczając ją na tej samej tabliczce narzędziowej co kaliber.
      3. Umieść prowadnicę ładowania A/D płasko (dołączoną do zestawu do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego) na górze wkładu czujnika, ustawiając go tak, aby litera "A" znajdowała się w lewym górnym rogu, aby upewnić się, że do załadowania dostępne są tylko porty A. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 20 μl 100 mM roztworu glukozy do portów A.
      4. Zamień prowadnicę załadunkową A/C na płaską prowadnicę załadunkową B/C, orientując ją tak, aby litera "B" znajdowała się w lewym górnym rogu, aby upewnić się, że do załadunku dostępne są tylko porty B. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 22 μl 20 μM roztworu oligomycyny do portów B.
      5. Ponownie ustaw prowadnicę ładowania B/C płasko, aby zlokalizować literę "C" w lewym górnym rogu do ładowania portów C. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 25 μl 500 mM roztworu 2-DG do portów C.
      6. Wyjmij i wyrzuć prowadnicę ładowania flats.
        UWAGA: Ważne jest, aby każda seria portów ze wszystkich 96 studzienek, w tym studzienki tła, była całkowicie załadowana tą samą objętością wstrzykiwanego związku.
    2. Tworzenie, kalibracja i pomiary szablonów
      1. Utwórz lub załaduj szablon testu obciążenia glikolizą do sterownika. Wprowadź szczegółowe informacje dotyczące strategii wstrzykiwania, warunków leczenia i typów komórek, a następnie naciśnij przycisk generuj grupy. Przejdź do mapy płyt i przypisz odwierty do każdej grupy, która ma być analizowana. Przypisz 4 dołki narożne do pomiarów tła.
      2. W protokole upewnij się, że kalibracja i równoważenie są zaznaczone na etapie inicjalizacji.
      3. W przypadku pomiaru podstawowego i pomiarów po każdym wstrzyknięciu (glukoza, oligomycyna i 2-DG) należy ustawić liczbę cykli pomiarowych na 3 i czasy mieszania - oczekiwania - pomiaru na 3 min - 0 min - 3 min (patrz tabela 2).
      4. Zdejmij pokrywę z załadowanego związkami i uwodnionego wkładu czujnika, zanurzonego w kalibrze w tabliczce narzędziowej. Umieść go na tacy roboczej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i rozpocznij bieg.
        UWAGA: Pierwszym krokiem jest kalibracja, która zwykle trwa ~20 min.
      5. Po upływie 25-30 minut inkubacji wyjąć mikropłytkę zawierającą komórki z inkubatora o temperaturze 37 °C innej niż CO2 °C z etapu 2.4.6. Nie naruszając komórek, powoli dodawać 130 μl wstępnie podgrzanego podłoża do testów wysiłkowych glikolizy (pH 7,4) na studzienkę, aby uzupełnić objętość pożywki w każdym dołku do 180 μl i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisji CO2 na dodatkowe 15-20 min.
        UWAGA: Preferowany jest całkowity czas inkubacji 45-60 minut po odwirowaniu.
      6. Po zakończeniu kalibracji zastąp płytkę użytkową mikropłytką testową (bez pokrywy) zawierającą komórki. Naciśnij płytkę ogniwa obciążnikowego, aby rozpocząć pomiary, które potrwają ~1.5 godziny do zakończenia testu.
      7. Po zakończeniu pomiarów należy pobrać mikropłytkę testową zawierającą komórki i usunąć pożywkę testową, nie naruszając komórek. Przemyć raz delikatnie 250 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, nie usuwając komórek.
      8. Dodać 10 μl buforu do lizy RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% deoksycholanu Na, 0,1% dodecylosiarczanu sodu, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy, do każdej studzienki i mieszać płytkę na wytrząsarce przez 10 min. Zamrozić całą płytkę w temperaturze -80 °C.
      9. Rozmrozić płytkę i wykonać test pomiaru białka w celu normalizacji danych zgodnie z instrukcjami producenta.
      10. Pobieranie i analizowanie danych. Otwórz plik danych za pomocą oprogramowania Wave Desktop. Kliknij Normalizuj i wklej wartości normalizacji dla każdej studzienki. Kliknij Zastosuj, aby znormalizować dane. Kliknij Eksportuj i wybierz generator raportów z testu warunków skrajnych glikolizy, aby wyeksportować analizowane dane do generatora raportów. Alternatywnie wyeksportuj dane do aplikacji zewnętrznej.
        UWAGA: Alternatywnie, całkowita zawartość jądrowego DNA w każdym dołku może być wykorzystana do normalizacji danych. Barwnik fluorescencyjny, taki jak CyQuant, który wiąże się z kwasem nukleinowym, może być użyty do oceny całkowitej zawartości jądrowego DNA na studzienkę.
  6. Wykonanie testu wysiłkowego mitochondriów przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (Czas kroku: ~3 h 30 min)
    1. Ładowanie wkładu czujnika związkami iniekcyjnymi
      1. Przygotować 20 μM oligomycyny, 20 μM FCCP i 5 μM roztworów rotenonu + 5 μM antymycyny A we wstępnie podgrzanym mitochondrialnym roztworze testowym wysiłkowym (pH 7,4).
        UWAGA: Wszystkie roztwory związków do wstrzykiwania są przygotowywane przy stężeniu 10x. Końcowe stężenia studzienki wynoszą 2 μM dla oligomycyny, 2 μM dla FCCP i po 0,5 μM dla rotenonu i antymycyny A (patrz tabela 3).
      2. Wyjąć uwodniony wkład z czujnikiem z inkubatora w temperaturze 37 °C z kroku 1.1.5 i usunąć pęcherzyki powietrza, jak opisano wcześniej w kroku 2.5.1.2.
      3. Wykonując kroki od 2.5.1.3 do 2.5.1.6, dozować 20 μl 20 μM oligomycyny w portach A, 22 μl 20 μM FCCP w portach B i 25 μl mieszaniny 5 μM rotenonu i 5 μM antymycyny A w portach C.
        UWAGA: Ważne jest, aby każda seria portów we wszystkich 96 studzienkach, w tym w studzienkach tła, była całkowicie załadowana tą samą objętością związku iniekcyjnego.
    2. Tworzenie, kalibracja i pomiary szablonów
      1. Utwórz lub załaduj szablon testu wysiłkowego mitochondriów do kontrolera. Wprowadź szczegółowe informacje dotyczące strategii wstrzykiwania, warunków leczenia i typów komórek, a następnie naciśnij przycisk generuj grupy. Przejdź do mapy płyt i przypisz odwierty do każdej grupy, która ma być analizowana. Przypisz 4 dołki narożne do pomiarów tła.
      2. W protokole upewnij się, że kalibracja i równoważenie są zaznaczone na etapie inicjalizacji.
      3. W przypadku pomiaru podstawowego i pomiarów po każdym wstrzyknięciu (oligomycyna, FCCP i rotenon + antymycyna A) należy ustawić liczbę cykli pomiarowych na 3 i Mix - Wait - Measure times na 3 min - 0 min - 3 min (patrz Tabela 4).
      4. Rozpocznij bieg, aby przeprowadzić kalibrację jak w kroku 2.5.2.4.
      5. Dodać 130 μl wstępnie podgrzanej pożywki do badania wysiłkowego mitochondriów (pH 7.4) na studzienkę, jak w kroku 2.5.2.5.
      6. Rozpocznij pomiary; pobierz i przeanalizuj dane jak w krokach od 2.5.2.6 do 2.5.2.10. Eksportuj przeanalizowane dane do generatora raportów z mitochondrialnych testów wysiłkowych lub aplikacji zewnętrznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, liczba komórek i stężenia różnych leków ukierunkowanych na OxPHOS (używanych w testach strumienia zewnątrzkomórkowego) zostały zoptymalizowane do pomiaru ECAR i OCR HSPC wyizolowanych od 24-tygodniowych samic myszy C57BL/6. Najpierw przeprowadzono test stresu glikolizy w celu optymalizacji liczby komórek i stężenia oligomycyny. W teście tym użyto różnej liczby HSPC na studzienkę, w zakresie od 5 × 104 do 2,5 × 105. Jak pokazano w Rysunek 2A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano zoptymalizowany protokół oceny bioenergetyki komórkowej (glikolizy i OxPHOS) w mysich HSPC przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse. To urządzenie jest potężnym narzędziem, które jednocześnie mierzy ECAR i OCR żywych komórek, które są wskaźnikami odpowiednio glikolizy i oddychania mitochondrialnego. Dzięki temu może być używany do oceny bioenergetyki komórkowej w czasie rzeczywistym. Co więcej, 96-dołkowa platforma oparta na mikropłytkach oferuje wysokoprzepustową kwantyfikację z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratorium Lombard jest wspierana przez NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 i ME200030) oraz Glenn Foundation for Medical Research. Prace w laboratorium Li są wspierane przez NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m filtrCorning430626Służy do filtrowania-sterylizacji pożywki testowej
100 mM pirogronian soduLife Technologies11360-070Składnik pożywki do testów wysiłkowych mitochondriów
15 ml stożkowe probówki FalconCorning352096Używany podczas zbiorów HSPC i do przygotowywania roztworów leków testowych
200 mM L-glutaminaLife Technologies25030-081Składnik testu wysiłkowego glikolizy i pożywki do testu stresu mitochondrialnego
2-Deoksy-D-glukoza (2-DG)Sigma-AldrichD8375Trzecie wstrzyknięcie leku podczas testu warunków skrajnych glikolizy
5x Bufor wzbogacający (MojoSort)Biolegend480017Używany do płukania podczas zbiorów HSPC
Chlorek amonu (NH4Cl)Fisher ScientificA661-3Składnik lizy ACK bufor
Antymycyna ASigma-AldrichA86743. wstrzyknięcie leku podczas testu wysiłkowego mitochondriów
Zestaw do oznaczania białek Bio-Rad DCBio-Rad500-0112Używany zgodnie z instrukcjami producenta
Cyjanek karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC29202. wstrzyknięcie leku podczas testu wysiłkowego mitochondriów
Cell-TakCorning354240Klej komórkowy. Służy do powlekania mikropłytek komórkowych
Countes 3 Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificDo liczenia komórek
EDTAFisher ScientificO2793-500Składnik buforu do lizy ACK i buforu do lizy RIPA
Falcon 70 μ mfiltr Fisher Scientific08-771-2Używany jako sitko do komórek podczas zbiorów HSPC
Gibco Płodowa surowica bydlęca (FBS)Fisher Scientific26400044Służy do przygotowania buforu testowego podczas zbiorów HSPC
Gibco HBSSFisher Scientific14175095Służy do przygotowania buforu testowego podczas zbiorów HSPC
GlukozaSigma-AldrichG7528Składnik testu wysiłkowego mitochondriów pożywka i pierwsze wstrzyknięcie testu wysiłkowego glikolizy
OligomycynaSigma-AldrichO4876Drugie wstrzyknięcie leku podczas testu wysiłkowego glikolizy i 1. wstrzyknięcie leku podczas testu stresu mitochondrialnego
PBSLife Technologies10010-049Służy do mycia komórek po teście do oznaczania ilościowego białka
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Fisher ScientificP235-500Składnik buforu do lizy ACK
Koktajl inhibitorów proteazy ()Roche11836170001Dostarczany w postaci tabletek. Jedną tabletkę rozpuszczono w 10 ml buforu RIPA w celu uzyskania 1x.
Antymysz biotyna szczura-B220, identyfikator klonu: RA3-6B2Biolegend103203Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Antymysz biotynowa szczura-CD2, identyfikator klonu: RM2-5Biolegend100103Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Antymysz biotynowa szczura-CD3, identyfikator klonu: 17A2Biolegend100243Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Antymysz biotynowa szczura-CD5, klon ID: 53-7.3Biolegend100603Używany do uszczuplenia linii podczas zbiorów HSPC
Antymysz biotyny szczura-CD8, Identyfikator klonu: 53-6.7Biolegend100703Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Szczurzy antymysz biotynowa-Gr-1, identyfikator klonu: RB6-8C5Biolegend108403Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Antymysz biotyny szczura-Ter-119, Identyfikator klonu: TER-119Biolegend116203Używany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
RotenoneSigma-AldrichR88753. wstrzyknięcie leku podczas testu stresu mitochondrialnego
Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XFe96Seahorse Biosciences teraz Agilentdo pomiarów ECAR i OCR w czasie rzeczywistym.
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761Służy do wytwarzania Roztwór kleju komórkowego do powlekania mikropłytek
Chlorek sodu (NaCl)FisherBP358Składnik buforu do lizy RIPA
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750Składnik buforu do lizy RIPA
Fluorek sodu (NaF)Sigma-AldrichS7920Składnik buforu do lizy RIPA
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS8045Przygotowany 1 N roztwór. Służy do normalizacji pH
Nanokulki streptawidyny (MojoSort)Biolegend480015Stosowany do zubożenia linii podczas zbiorów HSPC
Tris-HClFisherBP153Składnik buforu do lizy RIPA Pożywka
bazowa XF PożywkaAgilent102353-100stosowana do przygotowania testu wysiłkowego glikolizy i testu wysiłkowego mitochondriów pożywka do badania
XF Konikmorski Nauki biologiczneStosowane dla substancji innych niż CO2 37 ° C inkubacje
XFe96 zewnątrzkomórkowy FluxPakAgilent102416-100 lub 102601-100Zawiera wkłady testowe z tabliczkami użytkowymi, płaskie prowadnice ładowania do ładowania
leków na wkład testowy, roztwór kalibru XF i mikropłytkę do hodowli komórkowych XF
bazowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hematopoetyczne kom rki macierzysteocena glikolizyfosforylacja oksydacyjnaszybko zu ycia tlenuszybko zakwaszania zewn trzkom rkowegotest stresu mitochondrialnegotest stresu glikolitycznego

Powiązane artykuły