Artykuł metodologiczny

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63048

⸱

4 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Tim Taylor Department of Chemical Engineering, Kansas State University, 2Department of Materials Science and Engineering, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Streszczenie

Biolodzy od dawna próbują zrozumieć związek między fenotypem a genotypem. Aby lepiej zrozumieć ten związek, kluczowe jest opracowanie praktycznych technologii, które łączą mikroskopijne badania przesiewowe komórek z izolacją komórek o wysokiej czystości na potrzeby dalszej analizy genetycznej. W tym artykule opisano zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli poli(glikolu etylenowego) do badań przesiewowych i izolacji bakterii o unikalnych fenotypach wzrostu z heterogenicznych populacji komórek. Metoda polega na otorbieniu lub uwięzieniu komórek hydrożelem, a następnie hodowli, badaniach przesiewowych pod mikroskopem, a następnie użyciu narzędzia do modelowania światła o wysokiej rozdzielczości do czasoprzestrzennej kontroli degradacji hydrożelu i uwalniania wybranych komórek do roztworu w celu pobrania. Zastosowanie różnych wzorów świetlnych pozwala na kontrolę nad morfologią wyekstrahowanej komórki, a wzory, takie jak pierścienie lub krzyżówki, mogą być używane do pobierania komórek przy minimalnej bezpośredniej ekspozycji na światło UV w celu złagodzenia uszkodzeń DNA izolatów. Co więcej, narzędzie do modelowania światła zapewnia regulowaną dawkę światła, aby osiągnąć różne szybkości degradacji i uwalniania komórek. Pozwala na degradację w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając pobieranie komórek z precyzją przestrzenną w skali mikronów. W tym miejscu zademonstrowano zastosowanie tego materiału do przesiewania i pobierania bakterii zarówno z hydrożeli luzem, jak i z mikrofabrykowanych urządzeń typu lab-on-a-chip. Metoda jest niedroga, prosta i może być stosowana do powszechnych i pojawiających się zastosowań w mikrobiologii, w tym do izolacji szczepów bakteryjnych o rzadkich profilach wzrostu z bibliotek mutantów oraz izolacji konsorcjów bakteryjnych z pojawiającymi się fenotypami w celu charakterystyki genomowej.

Wprowadzenie

Izolacja komórek o unikalnych zachowaniach ze złożonego i niejednorodnego środowiska jest fundamentalna dla uzyskania informacji genetycznej w biologii1. W mikrobiologii selekcja i izolacja rzadkich lub unikalnych drobnoustrojów po obserwacji staje się ważna w wielu zastosowaniach, które wymagają połączenia między informacjami genomicznymi a obserwowalnymi informacjami fenotypowymi. Zastosowania te obejmują wybór fenotypowo rzadkich szczepów z bibliotek mutantów2, wybór mikroorganizmów kluczowych ze złożonych społeczności mikroorganizmów3,4 oraz wybór fenotypowo rzadkich, ale ważnych bakterii z populacji izogenicznych. Izolacja żywotnych, ale niehodowlanych komórek (VBNC) z populacji bakterii jest ważnym przykładem tej drugiej, gdzie komórki o fenotypie VBNC są często ukryte w populacjach bakterii w proporcjach 1:102 do 1:1055,6. Ze względu na powszechne trudności w izolacji bakterii, wiele pozostaje niewiadomych na temat wielu fenotypowo rzadkich mikroorganizmów. Ograniczenia te podkreślają potrzebę stosowania technik izolacji komórek, aby najpierw zidentyfikować komórkę lub komórki docelowe z mieszaniny, a następnie pobrać i wyizolować je do dalszej analizy molekularnej7.

Niektóre z najczęściej stosowanych metod izolacji komórek to cytometria przepływowa i fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS)8, separacja immunomagnetyczna9,10, oraz mikrofluidyka11. Chociaż te metody izolacji mają wysoką wartość, mają również wady, które ograniczają ich stosowanie. Na przykład FACS może zapewnić rutynową izolację mikrobiologiczną na poziomie pojedynczej komórki w celu dalszej analizy genomicznej3, ale często jest ograniczony przez jego dostępność i koszty, a także problemy z dalszym zanieczyszczeniem11. Dużym zainteresowaniem cieszyły się podejścia oparte na mikroprzepływowości, takie jak mikroprzepływowa cytometria przepływowa, która w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową pozwala na znaczne zmniejszenie wymaganej objętości próbki12. Jednak separacja i pobranie pojedynczej lub małej grupy komórek z urządzeń mikroprzepływowych jest często trudnym problemem, który zazwyczaj wymaga bardziej złożonej konfiguracji i projektu urządzenia13. Wiele podejść opartych na mikroprzepływach genetycznie charakteryzuje komórki przed ich wprowadzeniem i obserwacją w urządzeniu14, ograniczając liczbę unikalnych gatunków obserwowanych podczas wykonywania funkcjonalnego badania przesiewowego. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, do powszechnego stosowania w wielu laboratoriach potrzebne są dalsze innowacje zarówno w zakresie metod, jak i materiałów, które są praktyczne w badaniach przesiewowych i izolacji komórek.

Ten artykuł przedstawia nowe, oparte na materiałach podejście do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Metoda wykorzystuje fotodegradowalne hydrożele do enkapsulacji komórek, hodowli, obserwacji mikroskopowej oraz uwalniania i odzyskiwania na żądanie docelowych bakterii o unikalnych fenotypach. Hydrożele są zaprojektowane tak, aby zawierały oczka o rozmiarze 10 nm, gdzie każdy link krzyżowy zawiera grupy o-nitrobenzylowe15. Materiał otacza lub wychwytuje komórki do obserwacji, umożliwiając jednocześnie dyfuzję składników odżywczych i produktów przemiany materii do i z komórek w celu hodowli. Wystawienie materiału na działanie wzorzystego źródła światła UV o długości fali 365 nm za pomocą mikroskopu pionowego umożliwia miejscową degradację hydrożelu poprzez fotorozszczepienie grup o-nitrobenzylowych16,17. Degradacja wyzwala selektywne uwalnianie komórek do odzyskania do dalszej analizy, w tym analizy genomicznej i, potencjalnie, proteomicznej i transkryptomicznej. Konfiguracja i protokół eksperymentu są stosunkowo proste, niedrogie i podatne na translację do laboratoriów mikrobiologicznych. Wymaga jedynie enkapsulacji komórek poprzez tworzenie hydrożelu, obserwacji przechwyconych komórek za pomocą pionowego jasnego pola i mikroskopu fluorescencyjnego oraz oświetlenia komórek będących przedmiotem zainteresowania wzorzystym źródłem światła UV w celu ich pobrania.

Kluczową zaletą tego opartego na materiałach podejścia do badań przesiewowych jest możliwość dostosowania do różnych formatów przesiewania. W najbardziej podstawowym formacie materiał może być używany do badań przesiewowych poprzez zamknięcie niejednorodnej kolekcji komórek w hydrożelach luzem. Komórki są następnie obserwowane pod kątem pożądanego fenotypu, a poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania są usuwane w celu charakterystyki genomowej. W bardziej wyszukanych formatach materiał można również zintegrować z urządzeniami typu lab-on-a-chip, aby zapewnić precyzyjne uwalnianie i pobieranie komórek z pożądanych obszarów urządzenia. Oba formaty są opisane tutaj i oba umożliwiły najnowsze nowatorskie aplikacje do badań przesiewowych i selekcji drobnoustrojów17,18,19. Metoda została zademonstrowana na modelowych organizmach Gram-ujemnych (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) i modelowym organizmie Gram-dodatnim (Bacillus subtilis) i została łatwo rozszerzona na wiele innych bakterii.

Protokół

1. Szczepy bakteryjne i protokoły hodowli

  1. Wykonać posiew bakterii metodą kreskową na płytkach agarowych z odpowiednimi pożywkami do wzrostu. W niniejszym opracowaniu B. subtilis (szczep 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) hodowano na płytkach z agarem ATGN (0,079 M KH2PO4, 0,015 M (NH4)2SO4, 0,6 mM MgSO4·7H2O, 0,06 mM CaCl2·2H2O, 0,0071 mM MnSO4·H2O, 0,125 M FeSO4·7H2O, 28 mM glukozy, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agaru) z dodatkiem 100 µg/mL spektynomycyny, a E. coli (szczep 25922, ATCC) na płytkach z agarem ATGN z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny.
    UWAGA: W poprzednich raportach dotyczących enkapsulacji w hydrożelu i uwalniania z tych materiałów autorstwa Fattahi et al.19 wykorzystano zamiast tego komórki A. tumefaciens C58
  2. Wybrać odpowiednie kolonie z płytek z agarem ATGN i rozpocząć hodowle nocne. W przypadku szczepów E. coli i B. subtilis użytych w tym badaniu, hodować w 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 215 rpm w płynnej pożywce ATGN przez 24 h. Przechowywać hodowle komórkowe w 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do czasu przyszłego użycia.
  3. Wybrać kolonie obu szczepów z banków glicerolowych za pomocą sterylnych pętli do szczepienia i inkubować w płynnej pożywce ATGN przez 24 h w 37 °C i 215 rpm.

2. Przygotowanie materiałów niezbędnych do formowania hydrożelu

  1. Synteza fotodegradowalnego PEG-o-NB-diakrylanu
    UWAGA: Synteza PEG-o-NB-diakrylanu w warunkach laboratoryjnych została szczegółowo opisana i wcześniej zgłoszona16,17. Alternatywnie, ze względu na rutynowy charakter syntezy, można ją zlecić zewnętrznej jednostce syntez chemicznych.
  2. Bufor sieciujący
    1. Należy zastosować recepturę wybranego medium dla danego szczepu bakterii i przygotować pożywkę z dwukrotną ilością składników odżywczych (2x). Do pożywki należy dodać fosforan, np. NaH2PO4, do stężenia końcowego 100 mM. Następnie należy dostosować wartość pH do 8 przy użyciu 5 M NaOH (aq).
    2. Roztwór buforu należy wysterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      UWAGA: Należy pominąć wszelkie metale przejściowe obecne w pożywkach, ponieważ metale te katalizują utlenianie tioli do disiarczków.
  3. Roztwór PEG-o-NB-diakrylanu
    1. Na każdy mg odważonego proszku PEG-o-NB-diakrylanu (masa cząsteczkowa 3,400 Da) należy dodać 3,08 µL wody ultrapure, aby uzyskać stężenie PEG-o-NB-diakrylanu 49 mM (stężenie akrylanu 98 mM).
    2. Roztwór należy wymieszać na wirówce typu vortex do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Roztwór 4-ramiennego PEG-tiolu
    1. W celu przygotowania 4-ramiennego PEG-tiolu (masa cząsteczkowa 10,000 Da), na każdy mg proszku należy dodać 4 µL wody ultrapure, aby uzyskać stężenie 20 mM (stężenie tiolu 80 mM).
    2. Roztwór należy wymieszać na wirówce typu vortex do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Przygotowanie perfluoroalkilowanych (niereaktywnych) szkiełek zakrywkowych

  1. Umieścić do 5 szkiełek przedmiotowych (25 mm x 75 mm x 1 mm) w polipropylenowym pojemniku do transportu szkiełek. Poddawać szkiełka działaniu kąpieli ultradźwiękowej w 2% (w/v) roztworze detergentu (Tabela materiałów) przez 20 min.
  2. Przepłukać szkiełka trzykrotnie wodą ultrapure, a następnie poddać je działaniu kąpieli ultradźwiękowej w wodzie przez 20 min. Osuszyć szkiełka strumieniem N2.
  3. Oczyścić plazmowo (patrz Tabela materiałów) obie strony szkiełek przedmiotowych zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 4.1 przez 2 min.
  4. Umieścić oczyszczone plazmowo szkiełka z powrotem w pojemniku i wypełnić go 0,5% (v/v) roztworem trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooctyl)silanu w toluenie. Pozostawić szkiełka w celu funkcjonalizacji na 3 h w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Po funkcjonalizacji szkiełkach, przepłukać je w pojemniku, najpierw toluenem, a następnie etanolem (trzykrotnie każdym z rozpuszczalników). Następnie osuszyć każde funkcjonalizowane szkiełko strumieniem N2.

4. Przygotowanie funkcjonalizowanych tiolami szkiełek podstawowych

  1. Czyszczenie szkiełek podstawkowych za pomocą urządzenia do czyszczenia plazmowego
    1. Umieścić szkiełka podstawkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm w szalce Petriego. Następnie umieścić szalkę Petriego w komorze urządzenia do czyszczenia plazmowego i włączyć zasilanie urządzenia.
    2. Włączyć pompę próżniową, aby usunąć powietrze z komory, aż manometr wskaże wartość 400 mTorr.
    3. Otworzyć zawór dozujący, aby wpuścić powietrze do komory, aż manometr osiągnie stabilne ciśnienie (800-1000 mTorr). Następnie wybrać RF w trybie „Hi” i poddać szkiełka działaniu plazmy przez 3 min.
    4. Po 3 min wyłączyć tryb RF oraz pompę próżniową.
    5. Wyjąć szalkę Petriego z komory, obrócić szkiełka podstawkowe i umieścić je ponownie w komorze, aby poddać działaniu plazmy drugą stronę szkiełka.
    6. Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.4, aby oczyścić plazmą nieobrobioną stronę szkiełka podstawkowego.
    7. Po zakończeniu procesu wyjąć szalkę Petriego z komory i wyłączyć urządzenie do czyszczenia plazmowego oraz pompę próżniową.
  2. Czyszczenie i hydroksylacja szkiełek podstawkowych roztworem piranha
    UWAGA: Do czyszczenia i hydroksylacji szkiełek szklanych można stosować standardowe protokoły czyszczenia roztworem piranha. Roztwór piranha to mieszanina H2O2 i H2SO4 w stosunku 30:70 (v/v). Można również stosować alternatywne metody czyszczenia szkiełek podstawkowych.
    OSTROŻNIE: Roztwór piranha jest silnie żrący i wybuchowy w kontakcie z rozpuszczalnikami organicznymi, dlatego należy z nim obchodzić się z najwyższą ostrożnością. Należy wdrożyć odpowiednie środki bezpieczeństwa i zabezpieczenia, takie jak stosowanie właściwych środków ochrony indywidualnej (fartuch laboratoryjny, fartuch chemoodporny, okulary ochronne, przyłbica, butylowe rękawice kwasoodporne). Wszelkie szkło i powierzchnie robocze mające kontakt z roztworem piranha przed użyciem powinny być czyste, suche i wolne od pozostałości organicznych. Roztworu piranha nigdy nie należy przechowywać w pojemniku zamkniętym lub częściowo zamkniętym.
    1. Umieścić czystą szalkę szklaną o wymiarach 100 mm x 50 mm na mieszadle magnetycznym z grzaniem z regulowaną prędkością mieszania pod dygestorium i dodać do szalki 14 mL H2SO4.
    2. Za pomocą pęsety z powłoką teflonową ostrożnie umieścić w szalce mały pasek magnetyczny z powłoką teflonową. Następnie powoli uruchomić mieszanie, aby uniknąć rozbryzgania kwasu.
    3. Następnie ostrożnie dodać do szalki 6 mL H2O2 i poczekać, aż roztwór zostanie dobrze wymieszany.
    4. Wyłączyć mieszadło, a następnie wyjąć pasek magnetyczny z szalki za pomocą pęsety. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie umieścić szkiełka podstawkowe w szalce i ustawić temperaturę na 60–80 °C.
    5. Po 30 min ostrożnie wyjąć szkiełka za pomocą pęsety i dwukrotnie zanurzyć je w wodzie dejonizowanej (DI), aby wypłukać pozostałości roztworu piranha.
    6. Po płukaniu wodą przechowywać szkiełka w wodzie DI w RT do czasu dalszego użycia.
    7. Wyłączyć płytkę grzewczą i pozwolić roztworowi piranha ostygnąć.
    8. Aby zutylizować roztwór piranha, ostrożnie umieścić szalkę szklaną o wymiarach 100 mm x 50 mm z wystudzonym roztworem w większym, pustym zlewce szklanym o objętości co najmniej 1,5 L. Następnie dodać 1 L wody w celu rozcieńczenia i dodać proszek wodorowęglanu sodu w celu neutralizacji. Należy pamiętać, że wodorowęglan sodu spowoduje pienienie i wydzielanie ciepła, dlatego należy go dodawać bardzo powoli, w przeciwnym razie pienienie może doprowadzić do rozpryskania kwasu. Gdy dalsze dodawanie wodorowęglanu sodu nie powoduje już pienienia, sprawdzić pH za pomocą papierka wskaźnikowego pH, aby zweryfikować neutralizację. Po zneutralizowaniu i schłodzeniu roztwór można wylać do zlewu.
  3. Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek podstawkowych
    1. Przygotować 5% (v/v) roztwór (3-merkaptopropyl)trimetoksysilanu (MPTS) o stężeniu 269 mM w suchym toluenie.
    2. Dodać 10 mL roztworu do oddzielnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 mL, umieścić jedno oczyszczone szkiełko w każdej probówce i zanurzyć je w roztworze.
      UWAGA: Stosowanie jednego szkiełka na probówkę 50 mL ma na celu zapewnienie tiolacji obu stron podłoża bez zakłóceń spowodowanych przez inne podłoża.
    3. Po 4 h każde szkiełko przemyć (cztery płukania na szkiełko) toluenem, mieszaniną etanolu i toluenu w stosunku 1:1 (v/v) oraz etanolem.
      UWAGA: Odbywa się to poprzez sekwencyjne zanurzanie każdego szkiełka w stożkowych probówkach wirówkowych zawierających wymienione roztwory.
    4. Po wypłukaniu podłoża zanurzyć je w etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: W zależności od liczby szkiełek ta metoda może być pracochłonna ze względu na obróbkę szkiełek pojedynczo. W przypadku większej liczby szkiełek można zastosować naczynia typu Columbia, które mieszczą kilka szkiełek jednocześnie.

5. Wykonanie krzemowych macierzy mikrootworów

  1. Powlekanie parylenem: Należy zastosować standardowy protokół opisany w poprzednich artykułach badawczych20,21 w celu powleczenia wafli krzemowych parylenem.
  2. Mikrofabrykacja: Należy postępować zgodnie z protokołem opisanym przez Barua i współpracowników18 w celu zaprojektowania i wykonania matrycy mikrootworów (Rycina uzupełniająca 1).
    ​UWAGA: W celu wykonania matryc mikrootworów na powlekonych parylenem waflach krzemowych zastosowano standardowe techniki fotolitograficzne opisane przez Timm i współpracowników17.

6. Tworzenie hydrożelu

  1. Formowanie hydrożelu objętościowego na szkiełkach podstawkowych
    1. Roztwór prekursorowy hydrożelu: Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL dodać 12,5 µL buforu sieciującego, a następnie 5,6 µL roztworu PEG-o-NB-diakrylanu. Na koniec do mieszaniny dodać 6,9 µL roztworu 4-ramiennego PEG-tiolu.
      UWAGA: Dodanie 4-ramiennego PEG-tiolu do mieszaniny inicjuje reakcję sieciowania. W związku z tym roztwór prekursorowy hydrożelu należy wykorzystać natychmiast po wymieszaniu.
    2. W celu enkapsulacji komórek w roztworze prekursorowym hydrożelu należy postępować zgodnie z krokami 6.1.3-6.1.9.
    3. W przypadku enkapsulacji komórek, przed krokiem 6.1.1, należy zaszczepić bufor sieciujący komórkami o pożądanej gęstości. Jak zgłoszono wcześniej19, zaobserwowano, że gęstość komórek 7,26 × 107 CFU/mL w buforze sieciującym odpowiada gęstości ~ 90 komórek/mm2 enkapsulowanych w całej objętości hydrożelu.
    4. Umieścić tiolowaną szkiełko podstawkowe na czystej szalce Petriego. Po przeciwległych stronach szkiełka umieścić dwa dystansory (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek jest niezbędna do kowalencyjnego przytwierdzenia hydrożelu do powierzchni szkiełka. Odbywa się to poprzez reakcję grup tiolowych na powierzchni z grupami akrylanowymi obecnymi w roztworze prekursorowym hydrożelu.
    5. Przymocować dystansory do szkiełka podstawkowego, przyklejając je taśmą do szalki Petriego.
    6. Nanieść pipetą pożądaną objętość roztworu prekursorowego na niereaktywne, perfluoroalkilowane szkiełko szklane.
    7. Położyć perfluoroalkilowane szkiełko szklane na szkiełku podstawkowym (Rysunek 1C). Odczekać 25 min w RT do pełnego sformowania hydrożelu.
    8. Po żelowaniu ostrożnie usunąć perfluoroalkilowane szkiełko szklane. Hydrożel pozostanie przytwierdzony do szkiełka podstawkowego.
      UWAGA: Aby uzyskać membranę o grubości 12,7 µm dla szkiełek o wymiarach 18 mm x 8 mm, należy użyć ~7 µL roztworu prekursorowego (Rysunek 1A,B). Zastosowanie większych objętości roztworu prekursorowego może doprowadzić do powstania hydrożelu pod szkiełkiem podstawkowym. Może to spowodować przyklejenie się szkiełka podstawkowego do szalki Petriego i jego pęknięcie podczas próby usunięcia. Ponadto pozostałości hydrożelu pod szkiełkiem są problematyczne podczas mikroskopii. Wymagane jest ostrożne usunięcie niereaktywnego perfluoroalkilowanego szkiełka szklanego, ponieważ gwałtowne usuwanie może uszkodzić hydrożel.
    9. Umieścić podłoże w szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w określonej pożywce hodowlanej. W tym przypadku do hodowli przez 24 h w temperaturze 37 °C zastosowano pożywkę ATGN uzupełnioną o 100 µg/mL spectinomycyny dla B. subtilis lub 100 µg/mL ampicyliny dla E.coli .

Schemat montażu hydrożelu z podstawowym szkiełkiem podstawowym, dystansami, żelowaniem kowalencyjnym i procesem inkubacji.
Rysunek 1: Formowanie hydrożelu na tiolowanych szkiełkach podstawowych. (A) Dystanse o grubości 12.7 µm umieszcza się po dwóch przeciwległych stronach szkiełka podstawowego zawierającego reaktywne grupy tiolowe. (B) Roztwór prekursora hydrożelu nanosi się pipetą na niereaktywne, fluorowane szkiełko. (C) Niereaktywne szkiełko umieszcza się na dystansach w celu utworzenia hydrożelu o grubości 12.7 µm. (D) Niereaktywne szkiełko ostrożnie usuwa się, pozostawiając hydrożel przytwierdzony do szkiełka podstawowego. (E) Przygotowany hydrożel można inkubować w pożywkach hodowlanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

7. Formowanie hydrożelu nad matrycami mikrootworów

  1. Wysiewanie bakterii w matrycach mikrootworów
    UWAGA: Na podłoża z matrycą mikrootworów wysiano 700 µL zawiesiny komórek o gęstości 0,1 OD600, a w celu usunięcia komórek z tła zastosowano metodę lift-off z użyciem parylenu zgodnie z protokołem opisanym przez Timm et al.22.
  2. Przygotować roztwór prekursora hydrożelu, dodając 5,6 µL PEG-o-NB-diakrylanu do 12,5 µL soli fosforanowej w buforze PBS o pH 8 ATGN, a następnie mieszając z 6,9 µL roztworu czteroramiennego tiolu PEG.
  3. Nanieść pipetą 12,5 µL roztworu prekursora na niereaktywne, perfluorowany szkiełko przedmiotowe i umieścić dwa stalowe dystanse 38 µm (patrz Tabela materiałów) po dwóch przeciwległych stronach podłoża z matrycą mikrootworów zaszczepionego komórkami.
  4. Odwrócić perfluorowane szkiełko przedmiotowe z kroplą roztworu prekursora i umieścić kroplę na środku podłoża z mikrootworami. Następnie inkubować przez 25 min w RT w celu formowania hydrożelu.
  5. Ostrożnie usunąć szkiełko przedmiotowe z podłoża z mikrootworami. Membrana hydrożelowa powinna pozostać przytwierdzona do podłoża z mikrootworami. Przejść do kroku 6.1.9.

8. Przygotowanie materiałów do ekstrakcji komórek

  1. Przygotowanie uchwytu z PDMS
    1. Zlep taśmą stos dziesięciu szkiełek podstawkowych o wymiarach 18 x 18 mm, a następnie przyklej ten stos do dna szalki Petriego.
    2. Aby wykonać uchwyty z PDMS, wymieszaj prekursor PDMS i czynnik sieciujący w stosunku objętościowym 10:1 w plastikowym kubku, odgazuj mieszaninę w desykatorze próżniowym, a następnie wlej mieszaninę do szalki Petriego.
    3. Utrwalaj PDMS przez 90 min w temperaturze 80 °C. Następnie wytnij obszar wokół oklejonego bloku, aby wyjąć uchwyt z PDMS i umieść go na szkiełku przedmiotowym, co ułatwi manipulację podczas mikroskopii.
  2. Przygotowanie mikrostrzykawki i rurek
    1. Odetnij 20 cm rurki PTFE (wewn. średnica 0,05 in) i przymocuj jeden koniec rurki do mikrostrzykawki o pojemności 100 µL.
      UWAGA: Podczas ekstrakcji należy unikać używania pipet, ponieważ pobieranie uwolnionych komórek za pomocą końcówki pipety może uszkodzić powierzchnię hydrożelu i doprowadzić do zanieczyszczenia.

9. Degradacja hydrożelu z użyciem narzędzia do naświetlania wzorzystego

UWAGA: Poniższe kroki opisane w tej sekcji są identyczne zarówno dla hydrożeli masowych, jak i macierzy mikrowykopów, z wyjątkiem wzorów naświetlania opisanych w krokach 9.6.4-9.6.6 oraz 9.6.7-9.6.10.

  1. Włącz mikroskop (patrz Tabela materiałów). Następnie włącz narzędzie do oświetlania wzorzystego (patrz Tabela materiałów).
  2. Włącz analogowy i cyfrowy moduł sterowania źródłem światła LED 365 nm. Następnie włącz moduł sterowania źródłem światła LED.
  3. Otwórz oprogramowanie mikroskopu oraz oprogramowanie narzędzia do oświetlania wzorzystego. Po otwarciu okna konfiguracji sprzętu wybierz przycisk Load.
    UWAGA: Zostaną tutaj załadowane trzy urządzenia (kamera zewnętrzna, moduł sterowania oraz narzędzie do oświetlania wzorzystego).
  4. Naciśnij przycisk Start. Otworzy się okno oprogramowania do wzorowania światła. Wybierz pierwszą opcję, przycisk Device Control, na lewym pasku bocznym okna.
  5. Skalibruj narzędzie do oświetlania wzorzystego.
    UWAGA: Kalibrację należy przeprowadzić przy użyciu tego samego obiektywu i filtra mikroskopu, które będą wykorzystywane podczas naświetlania.
    1. Ustaw powiększenie obiektywu mikroskopu na 10x.
      UWAGA: Powiększenie to zapewnia wystarczający odstęp roboczy między soczewką mikroskopu a powierzchnią próbki. Pozwala ono również na monitorowanie i rejestrowanie procesu odzyskiwania w czasie rzeczywistym poprzez okno obrazu.
    2. Ustaw soczewkę i filtr mikroskopu zgodnie z parametrami stosowanymi do naświetlania i umieść lustro kalibracyjne pod mikroskopem.
    3. W oknie Device Control przejdź do karty LED Control. Włącz LED #1 i ustaw natężenie światła na żądaną wartość. W standardowych eksperymentach ekstrakcji wartość ta wynosi 60%.
    4. W oknie Device Control kliknij kartę z nazwą produktu narzędzia do oświetlania wzorzystego. Następnie naciśnij przycisk Show Grid.
      UWAGA: Na lustrze kalibracyjnym zostanie wyświetlony wzór siatki.
    5. Dostosuj ostrość mikroskopu i czas ekspozycji kamery, aby uzyskać wysoką jakość obrazu siatki, a w razie potrzeby obróć kamerę, aby linie siatki były równoległe do ramy okna kamery.
    6. Wybierz przycisk Calibration Wizard w karcie z nazwą produktu narzędzia do oświetlania wzorzystego i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi przez oprogramowanie w tym oknie.
      UWAGA: Otworzy się okno konfiguracji kamery zewnętrznej.
    7. Otworzy się okno wyboru typu kalibracji (Calibration Type Selection). Wybierz Automatic Calibration i naciśnij Next.
    8. Po otwarciu okna regulacji wstępnej kalibracji (Pre-calibration Adjustment) postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i naciśnij przycisk Next.
    9. Po otwarciu okna informacji o mapowaniu (Mapping Information) zapisz kalibrację w odpowiednim folderze. W tym celu wprowadź datę, nazwę mikroskopu, użyty obiektyw oraz filtr.
    10. Po kalibracji naciśnij przycisk Working Area Definition znajdujący się w karcie z nazwą produktu narzędzia do oświetlania wzorzystego, aby w razie potrzeby zdefiniować obszar roboczy narzędzia do oświetlania wzorzystego.
  6. Sekcja projektowania sekwencji (Sequence Design) w celu przygotowania wzoru.
    1. Naciśnij przycisk Sequence Design na lewym pasku bocznym okna oprogramowania. Następnie naciśnij przycisk Profile Sequence Editor.
    2. Po otwarciu okna Profile Sequence Editor wybierz opcję New Profile w sekcji Profile List.
      UWAGA: Otworzy się okno edytora wzorów (Pattern Editor).
    3. Przygotuj żądany wzór do naświetlania, wybierając różne kształty i rozmiary wzorów lub rysując wzór ręcznie, jeśli jest to preferowane.
    4. W przypadku wzorów koła i przerywanego krzyża dla hydrożelu masowego postępuj zgodnie z krokami 9.6.5–9.6.6.
    5. W przypadku wzorów koła zdefiniuj koło o średnicy 30 µm nad docelową kolonią bakterii, aby pokryć całą kolonię. Wybierz biały kolor wypełnienia kształtu.
    6. W przypadku wzorów przerywanego krzyża wybierz kształt prostokąta z okna rysowania wzorów o wymiarach 3 µm x 8 µm. Umieść cztery prostokąty o tych wymiarach na krawędziach docelowej kolonii, tak aby połowa wzorów nakładała się na kolonię.
    7. W przypadku wzorów koła i pierścienia dla macierzy mikrodofłków postępuj zgodnie z krokami 9.6.8–9.6.10.
    8. W przypadku wzorów koła narysuj koło o średnicy 10 µm wokół obwodu dołka. Wybierz biały kolor wypełnienia kształtu.
    9. W przypadku wzoru pierścienia narysuj koło o średnicy 20 µm, umieść je nad dołkiem i wybierz biały kolor wypełnienia kształtu.
    10. Narysuj kolejny wzór koła o średnicy 10 µm z czarnym kolorem wypełnienia i umieść go wewnątrz obwodu dołka.
  7. Edytuj wzór i zmodyfikuj kształty w zależności od wybranej metody ekstrakcji. Upewnij się, że żądany wzór znajduje się w obszarze roboczym narzędzia do oświetlania wzorzystego.
  8. Umieść próbkę w uchwycie z PDMS i nanieś pipetą zdefiniowane medium na wierzch próbki, aby zapobiec jej odwodnieniu i zapewnić roztwór nośny dla uwalnianych komórek.
  9. Następnie zastąp to lustrem kalibracyjnym.
  10. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać wyraźny obraz kolonii w hydrożelu. Przejrzyj kolonie, aby zidentyfikować kolonię, która jest przedmiotem zainteresowania.
  11. W tym momencie zaprojektuj wzory świetlne, gdy podgląd z kamery pokazuje kolonie wewnątrz próbki, aby przetestować różne wzory ekstrakcji komórek.
  12. Zapisz zdefiniowany wzór. Po zapisaniu zdefiniowanego wzoru przejdź do sekcji Session Control.
  13. W tej sekcji, w karcie z nazwą produktu narzędzia do oświetlania wzorzystego, dodaj zapisaną sekwencję.
  14. Po dodaniu sekwencji wybierz opcję symulacji wzoru, aby wyświetlić go i dostosować do pożądanego miejsca naświetlania.
    UWAGA: Można tutaj skorygować położenie próbki, aby upewnić się, że wzór jest rzutowany precyzyjnie na docelowy obszar.
  15. Następnie w karcie sterowania LED ustaw natężenie światła na 60% i czas naświetlania na 40 s, a następnie rozpocznij proces naświetlania.
  16. Monitoruj degradację hydrożelu w czasie rzeczywistym w trybie jasnego pola (brightfield), aby upewnić się, że doszło do uwolnienia komórek.
    UWAGA: Należy unikać jakichkolwiek ruchów próbki podczas naświetlania, ponieważ może to spowodować degradację niepożądanych obszarów hydrożelu, co doprowadzi do zanieczyszczenia krzyżowego.

10. Odzyskiwanie komórek

UWAGA: Procedura odzyskiwania komórek jest identyczna zarówno dla hydrożeli masowych, jak i macierzy mikrowypustek.

  1. Po naświetlaniu światłem o długości fali 365 nm i uwolnieniu komórek, należy zebrać komórki za pomocą strzykawki mikrolitrowej i rurki mikrofluidycznej (Rysunek 2).
    UWAGA: Odzysk komórek musi zostać przeprowadzony natychmiast po naświetleniu wzoru. Pozwala to na zlokalizowane odzyskanie komórek przed ich oddaleniem się od obszaru napromieniowanego.
  2. Zmienić tryb mikroskopu z jasnego pola na filtr FITC lub TRITC, aby umożliwić wizualizację naświetlonego obszaru próbki gołym okiem.
  3. Po zlokalizowaniu naświetlonego obszaru, należy umieścić koniec rurki na napromieniowanym punkcie. Następnie należy przełączyć filtr mikroskopu z powrotem na jasne pole, aby monitorować odzyskiwanie komórek w czasie rzeczywistym.
  4. Używając strzykawki przymocowanej do drugiego końca rurki, należy ostrożnie pobrać uwolnione komórki. Pobrać 200 µL roztworu i przenieść go do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL w celu analizy DNA lub wysiania na podłoże.

Układ mikroskopowy z mikroszystrzykawką, hydrożel na uchwycie PDMS do oświetlania miejsca pobierania komórek.
Rycina 2: Schematyczna reprezentacja metody ekstrakcji w celu pobrania komórek uwolnionych z hydrożelu. Tutaj, bezpośrednio po ekspozycji na UV o długości fali 365 nm, degradacji hydrożelu i uwolnieniu komórek, mikroskop jest wykorzystywany do oświetlenia próbki hydrożelu światłem z filtra TRITC, co skutkuje pojawieniem się jasnej zielonej plamy pokrywającej obszar, w którym nastąpiło uwolnienie komórek. Pomaga to użytkownikowi w zidentyfikowaniu lokalizacji przestrzennej do pobrania próbki. Po zwizualizowaniu tego obszaru, rurka do pobierania przymocowana do strzykawki mikrolitrowej zostaje umieszczona w tym miejscu i próbka jest pobierana. Mikroskopia w jasnym polu przy powiększeniu 10x jest stosowana do monitorowania w czasie rzeczywistym końca rurki i powierzchni hydrożelu w celu precyzyjnego pobrania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

11. Oczyszczanie genomowego DNA i pomiar jakości DNA

  1. Użyć zestawu do oczyszczania DNA (patrz Tabela materiałów), aby wyekstrahować DNA z izolatów bakterii.
    1. Postępować zgodnie ze specyfikacją producenta opisaną w instrukcji zestawu do oczyszczania DNA23 do ostatniego kroku (krok 7), wymagającego elucji buforem AE.
    2. W kroku elucji postępować zgodnie ze specyfikacją producenta, z tą różnicą, że należy użyć 100 µL buforu AE zamiast 200 µL.
    3. Powtórzyć elucję raz, zgodnie z opisem w kroku 11.1.2. Krok ten prowadzi do zwiększenia całkowitej wydajności DNA.
  2. Zmierzyć jakość DNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis (patrz Tabela materiałów).
    1. Włączyć spektrofotometr. Po inicjalizacji urządzenia, na stronie głównej, wybrać na ekranie opcję dsDNA.
    2. Następnie podnieść ramię podstawki i oczyścić miejsce pomiarowe wodą DI oraz chusteczkami bezpyłowymi.
    3. Nanieść pipetą 2 µL roztworu ślepej próby, w tym przypadku buforu AE, na miejsce pomiarowe, delikatnie opuścić ramię podstawki i wybrać na ekranie opcję Blank.
    4. Następnie podnieść podstawkę i oczyścić miejsce pomiarowe wodą DI, aby usunąć wszelkie pozostałości z poprzedniego pomiaru.
    5. Nanieść próbkę (2 µL) na miejsce pomiarowe, opuścić ramię podstawki i wybrać na ekranie przycisk Measure.
    6. Powtórzyć kroki 11.2.4 i 11.2.5 dla wszystkich próbek.
    7. Po zakończeniu pomiarów wybrać na ekranie opcję „End Experiments”. Włożyć pamięć flash do urządzenia i nacisnąć na ekranie „Export data”.

12. Określanie żywotności komórek z ekstraktów hydrożelu i mikrodołków

  1. Rozcieńcz zawiesiny bakteryjne z czynnikiem rozcieńczenia 105, korzystając z płytki 96-dołkowej.
  2. Pipetuj 10 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej i nanieś w trzech punktach na płytki ATGN dla każdej zawiesiny bakteryjnej.
  3. Przechyl płytki, aby rozprowadzić komórki na powierzchni agaru. Pozostaw płytki ATGN z zawiesinami bakteryjnymi do wyschnięcia na powietrzu.
  4. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 48 h. Policz i zapisz liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU). Policz wszystkie trzy naniesienia zawiesin bakteryjnych na każdej płytce.
    UWAGA: Kroki 12.1-12.4 wykonaj w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć kontaminacji płytek.

Wyniki

Aby zbadać zdolność światła UV do wywoływania kontrolowanej degradacji hydrożelu w celu uwalniania komórek, hydrożele najpierw enkapsulowano na tiolowanych szkiełkach podstawowych w obecności samych materiałów, bez bakterii. Każdy hydrożel poddano działaniu trzech powtórzonych okrągłych wzorów światła o różnych intensywnościach i czasach naświetlania. Procent degradacji żelu obliczono po ekspozycji na światło UV przy każdej intensywności światła, a następnie określono czas ekspozycji poprzez sprzęgnięcie wiszących grup tiolowych z barwnikiem fluoresceina-5-maleimid w celu obrazowania fluorescencyjnego19,24. Reprezentatywny przykład wpływu tych dwóch parametrów na degradację hydrożelu przedstawiono na Rysunku 3. Jak widać, światło strukturyzowane generowane przez narzędzie do iluminacji wzorowanej zapewnia czasowo-przestrzenną kontrolę degradacji hydrożelu z rozdzielczością umożliwiającą uwolnienie jedynie niewielkiej liczby komórek.

Wykres fotodegradacji, % degradacji w funkcji czasu ekspozycji, efekty natężenia, wstawki z obrazami mikrostruktury.
Rysunek 3: Kontrola degradacji hydrożelu. Dawka światła UV i wynikająca z niej szybkość degradacji hydrożelu są regulowane za pomocą narzędzia do naświetlania wzorzystego. (Wstawka) Wybrano dwa różne natężenia światła do wzorzystej degradacji hydrożelu. Po ekspozycji na światło UV o długości fali 365 nm hydrożele oznakowano fluoresceiną-5-maleimidem w celu obrazowania fluorescencyjnego. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society.​ Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W celu ekstrakcji komórek zastosowano różne wzory światła, aby zbadać uwalnianie komórek (Rysunek 4). W tym przypadku komórki bakterii Agrobacterium zostały zamknięte w hydrożelach objętościowych na tiolowanych szkiełkach podstawkowych, a następnie hodowano w formie mikroskalowych kolonii. Hydrożele poddano następnie inspekcji za pomocą mikroskopii w jasnym polu, a wybrane mikrokolonie naświetlano zróżnicowanymi wzorami światła UV. Zaobserwowano, że różne wzory naświetlania wpływały na morfologię uwalnianych komórek. Może to być korzystne w różnych zastosowaniach. Na przykład naświetlanie w formie pierścienia wokół docelowej kolonii prowadzi do uwolnienia całej kolonii wciąż zamkniętej w ochronnym hydrożelu PEG i bez bezpośredniej ekspozycji na światło UV (Rysunek 4A), co może chronić komórki i ułatwiać późniejszą puryfikację. Z kolei poprzez naświetlanie części lub całości kolonii światłem UV, komórki mogą zostać wyekstrahowane albo w postaci zagregowanych klastrów komórkowych (Rysunek 4B), albo jako wolne, pojedyncze komórki (Rysunek 4C).

Obraz mikroskopowy ekspozycji wzoru UV na odzyskiwanie komórek: pierścień, przerwany krzyż, wzór krzyża.
Rycina 4: Kontrola morfologii wyekstrahowanych komórek. (A) Zastosowanie wzoru pierścienia w celu uwolnienia całej kolonii komórek, chronionej w matrycy PEG. (B) Zastosowanie wzoru przerwanego krzyża w celu uwolnienia komórek w postaci agregatów. (C) Zastosowanie wzoru krzyża w celu uwolnienia pojedynczych komórek. Przedruk (adaptacja) za zgodą Fattahi i wsp.19 ​ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Kluczowe w protokole enkapsulacji są zarówno gęstość wysiewu komórek, jak i grubość hydrożelu, ponieważ oba te parametry mogą wpływać na liczbę komórek włączonych do hydrożelu w celu obserwacji. Aby to zademonstrować, próbki komórek A. tumefaciens zostały zamknięte w hydrożelach o dwóch różnych grubościach przy użyciu cienkich dystansów (12,7 µm) lub grubych dystansów (40 µm), a następnie hodowane i obrazowane zgodnie z ustalonymi protokołami. Cieńsze hydrożele doprowadziły do uzyskania gęstości mikrokolon na poziomie 90 kolonii/mm2 w całym hydrożelu, przy czym zaobserwowano minimalne nakładanie się kolonii (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do tego, grubość hydrożelu większa niż 12,7 µm skutkowała tworzeniem się kolonii nakładających się w kierunku pionowym (Rysunek 5B), co może prowadzić do ekstrakcji wielu kolonii jednocześnie. Nakładające się kolonie mogą powodować kontaminację krzyżową podczas ekstrakcji ze względu na dwuwymiarowy charakter wzoru świetlnego. Na przykład, można wycelować w kolonię znajdującą się na górze, podczas gdy kolonia znajdująca się pod nią zostanie wyekstrahowana razem z nią (Rysunek 5C). Dlatego do przygotowania hydrożelu zaleca się stosowanie dystansów 12,7 µm.

Analiza żywotności komórek podczas ekspozycji pierścieniowej; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej i w świetle przechodzącym.
Rysunek 5: Grubość hydrożelu wpływa na czystość ekstrakcji. (A) Przy zastosowaniu dystansów o grubości 12,7 µm do formowania hydrożelu, kolonie powstają w obrębie jednej płaszczyzny ogniskowej przy powiększeniu 10x. (B) Przy powiększeniu 10x można zaobserwować nakładanie się kolonii, jeśli zastosowano dystansy o grubości większej niż 12,7 µm. (C) Nakładanie się kolonii może prowadzić do kontaminacji krzyżowej podczas uwalniania komórek: (i) zastosowano wzór pierścieniowy w celu uwolnienia docelowej kolonii komórek, (ii) docelowa kolonia komórek odrywa się od hydrożelu, a (iii) podczas ekspozycji na światło pod kolonią docelową obserwuje się drugą, znajdującą się poniżej kolonię. Kolonia ta również zostaje usunięta, co prowadzi do kontaminacji krzyżowej. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society.​ Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Biorąc pod uwagę potencjalne uszkodzenia bakterii pod wpływem światła UV, efekt zróżnicowanych mikrowzorów światła UV na żywotność komórek przebadano dalej z wykorzystaniem modelowych bakterii Gram-dodatnich (B. subtilis) oraz modelowych bakterii Gram-ujemnych (E. coli). Każdy z gatunków został zamknięty w hydrożelach objętościowych i hodowany w formie mikroskopijnych kolonii zgodnie ze standardowymi protokołami, co pozwoliło zweryfikować ich kompatybilność z hydrożelem. Wybrane mikrokolonie o jednakowych rozmiarach (średnica 26 ± 1 μm) poddano działaniu stałej dawki światła (168 mJ/mm2), albo w formie wzorów okrągłych, w których całe mikrokolonie były wystawione na działanie światła UV, albo we wzorach krzyżowych, które degradują jedynie krawędzie hydrożelu, aby zminimalizować ekspozycję komórek na światło. Następnie komórki odzyskano i wysiano na płytki w celu określenia liczby CFU/mL odzyskanych z każdej kolonii. Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie odzysku komórek (Ryc. 6A). Aby dokładniej zbadać czystość wyizolowanych komórek, z próbek E. coli wyizolowano DNA i poddano analizie za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Dla obu wzorów poziomy jakości DNA mieściły się w zakresie A260/A280 od 1,8 do 2,0 (Ryc. 6B), co mieści się w optymalnym zakresie dla sekwencjonowania genomowego25. Wykazuje to, że wzory UV stosowane do uwalniania w opisanych warunkach mają minimalny wpływ na liczbę żywotnych komórek odzyskanych z hydrożeli objętościowych oraz na jakość genomowego DNA po ekstrakcji.

Wykresy słupkowe i mikrofotografie porównujące wzrost E. coli i B. subtilis, jakość DNA oraz wyniki ekspozycji na wzory.
Rysunek 6: Wpływ różnych wzorów ekspozycji na światło na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwalnianych z hydrożeli masowych. (A) Poziomy odzysku komórek dla E. coli oraz B. subtilis po ekstrakcji z wykorzystaniem wzorów krzyżowych i kolistych. W tym eksperymencie ekstrakcję przeprowadzono z kolonii sferycznych o tej samej średnicy (26 µm ± 1 µm), aby zapewnić równą liczbę komórek uwalnianych z każdej kolonii. Następnie roztwory z ekstrakcji wysiano na płytki, aby obliczyć CFU/mL uzyskane dla każdego wzoru. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w CFU/mL uzyskanych dla wzorów krzyżowych i kolistych zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (P-value > 0.05, n= 6 dla obu szczepów). (B) Spektrofotometryczna ocena ilościowa jakości DNA dla wyizolowanych komórek E. coli z wykorzystaniem wzorów krzyżowych i kolistych. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jakości DNA dla zastosowanych wzorów (P-value > 0.05, n = 6) (C) Obrazy w polu jasnym kolonii o równych średnicach eksponowanych na wzory krzyżowe i koliste. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Matryce mikrowycieków stanowią alternatywny interfejs przesiewowy typu lab-on-a-chip, który oferuje bardziej kontrolowane funkcje screeningu w porównaniu do hydrożeli masowych. Na przykład matryce mikrowycieków umożliwiają wysiew bakterii do oddzielnych miejsc hodowlanych, w których można kontrolować liczbę komórek w inokulum. Cechy geometryczne mikrowycieków, takie jak głębokość i średnica otworu, są również kontrolowane za pomocą standardowych metod mikrofabrykacji. Dzięki tym zaletom mikrowycieki okazały się przydatne w badaniu wzrostu bakterii w ograniczeniu przestrzennym26, a ostatnio w odkrywaniu interakcji symbiotycznych i antagonistycznych między różnymi gatunkami bakterii w sytuacji ich wspólnego zamknięcia w skali mikro18. Ekstrakcja komórek z wycieków do analiz genomicznych, takich jak sekwencjonowanie amplikonów 16S, jest kluczowa dla tych zastosowań. Przy użyciu tego samego materiału hydrożelowego, światło UV może być naświetlane nad wyciekiem zawierającym interesujące komórki, albo w formie wzorów kołowych, albo pierścieniowych. Ta druga metoda zapewnia degradację hydrożelu tylko na obwodzie mikrowycieku, aby zapobiec bezpośredniemu napromieniowaniu komórek. Aby to zademonstrować, komórki A. tumefaciens wykazujące ekspresję mCherry zostały wysiane do wycieków, a następnie hydrożel przymocowano do matrycy mikrowycieków. Komórki hodowano, a następnie naświetlano wzorami kołowymi lub pierścieniowymi. Membranę zabarwiono następnie barwnikiem fluoresceiną-5-maleimidem. Dwukolorowe obrazy fluorescencyjne wykazały, że zarówno membrana, jak i komórki wewnątrz wycieków są usuwane przy obu wzorach napromieniowania17. W przeciwieństwie do formatu hydrożelu masowego, ekstrakcja komórek w tym przypadku była obserwowana wyłącznie w formie skupisk komórkowych18.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; komórki w fluorescencji czerwonej i niebieskiej. Przekroje poziome i pionowe.
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazujące wpływ wzoru światła na izolację komórek z matryc mikrootworów. (A) Mikrootwory o średnicach 40 µm zawierające bakterie (czerwone) po zasianiu i inkubacji. (B) Naświetlanie z użyciem wzorów w kształcie koła i pierścienia (niebieskie). (C) Zmniejszona fluorescencja czerwona świadczy o ekstrakcji komórek z naświetlonych otworów. (D) Dwukolorowy obraz fluorescencyjny błon i bakterii po naświetlaniu, wskazujący na usunięcie zarówno hydrożelu (zielony), jak i bakterii (czerwone) z docelowych otworów. (E) Z-stack, dwukolorowy obraz fluorescencyjny docelowych otworów. Czerwona linia w (D) oznacza płaszczyznę xz obrazowaną w (E), a zielona linia w (E) oznacza płaszczyznę xy obrazowaną w (D). Próbki na obrazach (C-E) zostały przemyte w celu usunięcia uwolnionych komórek, a następnie utrwalone i obrazowane. Pasek skali = 40 µm. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

W celu ilościowego określenia żywotności komórek bakteryjnych i jakości DNA po ekstrakcji w tym formacie, komórki B. subtilis oraz E. coli zostały zasiane, wyhodowane, a następnie uwolnione z matryc mikrootworów przy użyciu wzorów w kształcie koła i pierścienia (Rysunek 8A, B). Uwolnione komórki wysiano następnie na płytki z agarem ATGN, a następnie określono ilościowo jakość DNA wyekstrahowanych komórek. Aby zapewnić obecność stałej liczby komórek podczas każdej ekstrakcji, do uwolnienia wybrano mikrootwory o podobnej intensywności fluorescencji (~6000 A.U.), a tym samym o podobnej liczbie komórek. Liczba żywych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru koła nie różniła się znacząco od liczby żywych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru pierścienia dla obu gatunków bakterii (Rysunek 8C). Ponadto poziomy jakości DNA nie różniły się znacząco między wzorami koła i pierścienia dla obu gatunków bakterii (Rysunek 8D). Zatem, podobnie jak w przypadku wyników dla hydrożeli masowych, zastosowanie światła UV o natężeniu i czasie trwania określonych w niniejszej pracy miało pomijalny wpływ na żywotność i jakość DNA komórek wyekstrahowanych z matryc mikrootworów. Wyniki te dowodzą, że żywe komórki bakteryjne mogą być selektywnie odzyskiwane z mikrootworów z minimalnymi uszkodzeniami w celu przeprowadzenia dalszych analiz.

Analiza wzrostu bakterii i jakości DNA; formowanie wzorów; wykresy CFU/mL i czystości DNA; eksperyment.
Rysunek 8: Wpływ różnych wzorów naświetlania na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwalnianych z macierzy mikrowykwropów. (A,B) W przypadku zarówno E. coli, jak i B. subtilis, do ekstrakcji komórek z mikrowykwropów o średnicy 10 µm zastosowano wzory okręgu oraz wzory pierścienia. W tym eksperymencie do ekstrakcji komórek wykorzystano wzór okręgu o średnicy 10 µm oraz wzór pierścienia o średnicy wewnętrznej 10 µm i średnicy zewnętrznej 20 µm. Wykorzystano mikrowykwropy o tych samych średnicach, aby zapewnić taką samą liczbę komórek uwalnianych z każdego mikrowykwropu. (C) Następnie wyekstrahowane roztwory wysiano na płytki w celu obliczenia CFU/mL uzyskanych dla każdego wzoru naświetlania. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w CFU/mL otrzymanych dla wzoru okręgu i pierścienia zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (P-value > 0.05, n = 6 dla obu szczepów). (D) Do pomiaru jakości DNA komórek E. coli i B. subtilis przy użyciu wzorów okręgu i pierścienia wykorzystano spektrofotometrię. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w jakości DNA dla zastosowanych wzorów (P-value > 0.05, n = 6 dla obu szczepów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Projektowanie i wytwarzanie matryc mikrootworów. (A) Do wytworzenia matryc mikrootworów na płytkach krzemowych zastosowano standardowe techniki mikrowytwarzania. (B) Każdy podłoże składało się z macierzy 7 x 7 otworów o średnicy 10µm, głębokości 20 µm i skoku 30 µm. (C) Każda matryca składała się z 225 mikrootworów. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Barua i wsp.18. Copyright 2021 Frontiers Media. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Materiał i podejście umożliwiają hodowlę wysokoprzepustową, kontrolę nad pożywką wzrostową i warunkami wzrostu oraz czystą i precyzyjną ekstrakcję komórek w prosty i ekonomiczny sposób. Ekstrakcja wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z narzędziem do oświetlenia wzorzystego i może być wykonana w sposób sekwencyjny w celu wyizolowania wielu celów komórkowych. Każda ekstrakcja trwa 5-10 minut, a z jednego hydrożelu usuwa się do 30 docelowych kolonii. Kluczową zaletą tego podejścia jest jego zdolność adaptacji do wielu różnych formatów testów, co wykazano w przypadku badań przesiewowych zarówno z hydrożeli luzem, jak i matryc mikrodołkowych. Proces separacji w obu formatach został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania bakterii, które wykazują unikalne zachowanie wzrostu, w celu dalszego genotypowania po hodowli i obserwacji mikroskopowej, co ma kluczowe znaczenie dla łączenia genotypu komórki z fenotypem. Do tej pory charakterystyka genomiczna bakterii wyekstrahowanych z tych interfejsów obejmowała sekwencjonowanie amplikonów 16S w celu identyfikacji wielogatunkowych kolekcji bakterii z mikrobiomów środowiskowych, które generują emergentne zachowania wzrostowe18, oraz sekwencjonowanie całego genomu w celu pomyślnej identyfikacji mutacji genetycznych, które powodują rzadkie profile wzrostu w komórkach obecnych w bibliotekach mutantów19.

Stosowanie hydrożeli luzem do badań przesiewowych i izolacji komórek jest najprostszym i najprostszym formatem. Hydrożele fotodegradowalne w dużej ilości tworzą się szybko (25 min) po zmieszaniu prekursorów z przezroczystymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w celu zamknięcia komórek w matrycy 3-D hodowli komórkowej, która jest obrazowana za pomocą standardowego pionowego lub odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W związku z tym metoda ta ma potencjał, aby zostać przeniesiona do powszechnych laboratoriów mikrobiologicznych, które nie dysponują zasobami ani wiedzą specjalistyczną w zakresie mikrowytwarzania. Wadą tego formatu jest to, że komórki są losowo zorientowane w trójwymiarowym hydrożelu. W związku z tym komórki mogą pojawiać się poza płaszczyzną ogniskową podczas obrazowania z obiektywami o większym powiększeniu, a ekstrakcja może być trudna, jeśli kolonie komórek są zorientowane zbyt blisko siebie lub jeśli występuje pionowe nakładanie się kolonii. Osadzanie cienkiego hydrożelu (<13 μm) zgodnie z opisem ma kluczowe znaczenie dla złagodzenia tej wady. Ekspozycja w przerwanych krzyżowych wzorach światła (ryc. 4B) jest tutaj lepsza, ponieważ ten wzór powoduje, że komórki są wolne od hydrożelu, które mają minimalną ekspozycję na światło UV i można je łatwo odzyskać poprzez powlekanie.

W przeciwieństwie do tego, format matrycy mikrostudzienkowej zapewnia lepiej kontrolowany interfejs, ponieważ komórki bakteryjne są podzielone na dyskretne mikrodołki, które służą jako małe kultury lub miejsca kokultur 17,18,26. Wymiary, skok i gęstość mikrostudzienki są precyzyjnie wytwarzane przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych. W porównaniu z hydrożelami luzem, bakterie można ekstrahować z układów mikrodołków o wyższym stopniu swoistości i mniejszym prawdopodobieństwie zanieczyszczenia krzyżowego, ponieważ komórki są obecne tylko w określonych miejscach, a nie losowo rozproszone w hydrożelu. Stężenie i proporcje komórek bakteryjnych w roztworze do wysiewu mogą być również zmieniane w celu kontrolowania ilości i składu inokulum mikrostudzienki poprzez proces wysiewu, który został scharakteryzowany w poprzednich raportach26, co daje użytkownikowi elastyczność w eksperymentalnym projektowaniu sita. Podstawową wadą przesiewania za pomocą formatu matrycy mikrodołkowej jest dodatkowy czas i wiedza specjalistyczna wymagana do mikrowytwarzania. Szacuje się, że produkcja mikrostudni kosztowała ~10 USD za matrycę, co obejmuje koszty materiałów i wydatki na pomieszczenia czyste. Ponadto matryce mikrostudzienek są tradycyjnie wykonane z krzemu, co może powodować trudności z obrazowaniem, ponieważ podłoża są nieprzezroczyste. Co więcej, duże rozproszenie światła z powierzchni krzemu może ograniczać obrazowanie w mikrostudzienkach i może zmniejszać rozdzielczość wzoru podczas ekspozycji na hydrożel światłem UV z narzędzia do oświetlania wzorzystego (patrz rysunek 8A,B). Podobne mikrostudzienki zostały wyprodukowane na przezroczystych podłożach kwarcowych, aby rozwiązać tego typu ograniczenia27; Jednak ta produkcja jest znacznie trudniejsza. Ekspozycja na wzory pierścieni, które oświetlają obwód studni, jest tutaj preferowana, aby uwolnić wolne komórki ze studzienek, jednocześnie minimalizując ekspozycję na promieniowanie UV.

Najczęstszym problemem, który występuje w obu formatach, jest oderwanie hydrożelu od podłoża znajdującego się pod spodem podczas hodowli z powodu pęcznienia hydrożelu. Jeżeli stanowi to problem w przypadku hydrożeli luzem, obecność, gęstość i jednorodność grup tiolowych w warstwie przyłączającej substancji chemicznej (MTPS) na powierzchni szkiełka nakrywkowego ze szkła bazowego należy zweryfikować przy użyciu odpowiedniej techniki charakteryzacji powierzchni (XPS, ATR-FTIR, AFM itp.). Niskie gęstości powierzchniowych grup tiolowych spowodowane nieefektywną funkcjonalizacją powierzchni mogą prowadzić do słabej interakcji między substratem a hydrożelem. W przypadku wystąpienia niskiego poziomu tiolizacji powierzchniowej należy sprawdzić stabilność roztworu MTPS. Należy zachować ostrożność podczas wstępnego czyszczenia szkiełka podstawowego, aby zapewnić czystą powierzchnię przed obróbką MTPS, a także należy zachować ostrożność, aby zapewnić użycie bezwodnego toluenu podczas reakcji powierzchniowej MTPS (sekcja 4 protokołu). W przypadku układów mikrostudzienkowych powierzchnie nie są tiolowane, a zamiast tego hydrożele przyłączają się poprzez częściowe wypełnienie studzienek hydrożelem, który zakotwicza hydrożel w podłożu krzemowym17. Jeśli w tym systemie problemem jest odklejanie hydrożelu, w matrycy można wytrawić więcej mikrostudzienek lub innych elementów w mikroskali, aby jeszcze bardziej zakotwiczyć hydrożel w podłożu i promować silniejsze przyczepienie.

Ograniczeniem techniki w obu formatach jest ograniczona stabilność hydrożeli w obecności bakterii. Zauważono, że niektóre bakterie, takie jak A. tumefaciens, mogą rozkładać hydrożel w ciągu 5-7 dni17,19, co ogranicza czas eksperymentu. Obecnie prowadzone są badania nad mechanizmami degradacji bakterii; Przypuszcza się, że grupy estrowe obecne w monomerach diakrylanowych podlegają hydrolizie i/lub degradacji enzymatycznej za pośrednictwem bakterii, jak zauważono w innych układach17. Opracowanie bardziej stabilnych chemii hydrożelowej wydłuży czas, w którym bakterie mogą pozostać w hydrożelu i rozszerzy ekran na mikroorganizmy o wolniejszym tempie wzrostu. Drugim ograniczeniem jest to, że w obu formatach odzyskiwanie i ekstrakcja komórek odbywa się w otwartym środowisku, co skutkuje stosunkowo dużymi objętościami ekstrakcji (30-100 μl), które mogą być podatne na zanieczyszczenie zewnętrzne. Dlatego należy zadbać o to, aby zapewnić wystarczającą ilość komórek z docelowych kolonii, jednocześnie minimalizując objętość roztworu ekstrakcyjnego. Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do posiewu i odzysku lub do ekstrakcji materiału DNA, zaobserwowano, że w hydrożelach luzem komórki muszą być hodowane wystarczająco długo, aby osiągnąć średnicę kolonii co najmniej 10 μm. Aby obniżyć wymaganą objętość do ekstrakcji komórek, zaobserwowano, że użycie mikrolitrowej strzykawki i rurki (ryc. 2) było bardziej efektywne niż pipetowanie. Rurki pozwoliły na dokładniejsze pobieranie izolatów z punktu uwalniania, wymagając mniejszej objętości roztworu i zmniejszając ryzyko zanieczyszczenia.

Przyszłe prace obejmują zrozumienie wpływu właściwości mechanicznych hydrożelu na wzrost komórek, ponieważ cechy mechaniczne tych hydrożeli są dobrze kontrolowane przez dobór odpowiednich prekursorów monomerów na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych28, a interakcje mechaniczne prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w zachowaniu bakterii29. Ponieważ materiały hydrożelowe mogą być łatwo włączane do wielu różnych systemów i urządzeń, dalszy rozwój koncentruje się również na integracji tego materiału z układami mikroprzepływowymi. Pozwoliłoby to zredukować roztwór ekstrakcyjny do objętości femtolitrów do pikolitrów, w porównaniu z tradycyjnymi objętościami 30-100 μl, które są obecnie wymagane w formacie otwartego zbioru. Mniejsze objętości roztworu znacznie zmniejszyłyby potencjalne zanieczyszczenie i przesunęłyby podejście w kierunku izolacji i charakterystyki pojedynczych komórek.

Oświadczenia

RRH i AJV złożyły patent na tę technologię. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte przez NSF CAREER Award #1944791.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-merkaptopropylo)trietoksysilanSigma-Aldrich175617-25G> 95%
proszek do prania Alconox Alconox1104
Siarczan amonuFisher ChemicalA702-500Certyfikowany
autoklaw granulowany ACS SK300CYamato Scientific18016
Bacillus subtilis 1A1135Centrum Zapasów Genetycznych Bacillus1A1135
Mikroskop pionowyBrightfield Olympus CorporationBX51
Chlorek wapnia, bezwodnyFisher ChemicalC614-500do dezykatorów Granulki, Wirówka siatkowa 4-20
5702Eppendorf5702
Monohydrat kwasu cytrynowegoSigma-AldrichC1909-500Godczynnik ACS, > 99,0%
D-glukozy ( Dekstroza)VWR Amresco Life Science0188-1KG
Dneasy Blood & Zestaw tkanekQiagen69504Zestaw do oczyszczania DNA
DOWSIL 184 silikonowa baza elastomerowaDow Silicones CorporationTemperatura przechowywania: -30-60 ° C
DOWSIL 184 utwardzacz z elastomeru silikonowegoDow Silicones CorporationTemperatura przechowywania: < 32 C
Spektrofotometr mikropłytkowy EPOCH2BioTek InstrumentsEPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922Thermo Fisher ScientificR19020
Etanol, bezwodnyFisher Chemical459844
Fisherbrand Szkło osłonowe mikroskopuFisher Scientific12540A
Szkiełka mikroskopowe premium Fisherfinest gładkieFisher Scientific12-544-4
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich216763-500MLZawiera inhibitor, 30% wag. w H2O
Incu-Shaker MiniBenchmarkE5-0014-01
IsopropanolSigma-Aldrich190764
Siarczan magnezu, 7-hydratMacron Fine Chemicals6066-04Avantor Performance Materials, Inc.
MetanolSigma-Aldrich179337-4LOdczynnik ACS, > 99,8%
NanoDrop Jeden spektrofotometrThermo ScientificND-ONEC-W
Azot, sprężonyMathesonUN1066
Tlenowy środek do czyszczenia plazmyHarrick PlasmaPDC-001-HP
Pentaerytrytol tetra(merkaptoetylo) polioksyetylen (4 ramiona-PEG)NOF Ameryka CorporationPTE-100SHSunbright-PTE-100SH
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10XVWR Amresco Life ScienceK813-500MLPrzechowywać między 15 stopniami; C– 30 &stopni; C
Polidimetylosiloksan (PDMS) Slygard 184Dow Corning4019862
Polygon400MightexDSI-D-000
Szkiełka mikroskopowe premiumFisher Scientific12-544-425 x 75 x 1 mm
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761-500G
Chlorek soduSigma Life ScienceS5886-500GBioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045-500GBioXtra, > 98%, granulki (bezwodne)
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodnySigma-Aldrich71505-250GBioUltra, do biologii molekularnej, > 99.0% (T)
Grubościomierz ze stali nierdzewnejPrecision Brand Products77739
Kwas siarkowySigma-Aldrich320501-2.5L
Toluen, bezwodny, 99,8%Sigma-Aldrich244511-1LBezwodny, > 99,8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooktylo)silan (TPS), 97%Sigma-Aldrich448931-10G
Tryptyczny bulion sojowySigma-Aldrich22092-500GDo mikrobiologii
Super Nuova Cyfrowe mieszadło z płytą grzejnąThermo Scientific S131825
Ultradźwiękowy sonografFischer ScientificFS-110H

Bibliografia

  1. Welch, J. D., et al. Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).
  2. Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries. Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).
  3. Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).
  4. Nichols, D., et al. Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
  5. Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
  6. Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 8, 580(2017).
  7. Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition. Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006(2013).
  8. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  9. Poonlapdecha, W., et al. Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples. International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).
  10. Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).
  11. Blainey, P. C. The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).
  12. Shrirao, A. B., et al. Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification. Technology. 06 (01), 1-23 (2018).
  13. Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -M. Microfluidics and microbial engineering. Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).
  14. Kehe, J., et al. Massively parallel screening of synthetic microbial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).
  15. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels. Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).
  16. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  17. Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes. ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).
  18. Barua, N., et al. Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays. Frontiers in Microbiology. 11, 3361(2021).
  19. Fattahi, N., et al. Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes. Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).
  20. Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).
  21. Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562(2018).
  22. Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701(2017).
  23. DNeasy Blood & Tissue Handbook - QIAGEN. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en (2021).
  24. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  25. Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28(2018).
  26. Hansen, R. H., et al. Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development. PLoS One. 11 (5), 0155080(2016).
  27. Halsted, M., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).
  28. Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160(2013).
  29. Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. Mechanical interactions between bacteria and hydrogels. Scientific Reports. 8 (1), 10893(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fotodegradowalne hydro eleizolacja kom rekdegradacja hydro eluurz dzenia mikroprzep ywoweenkapsulacja kom rekwzorowanie wiat em UVmacierze mikrootwor wcharakterystyka genomicznamikroskopia konfokalna
Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.