Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Summary

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Abstract

Biolodzy od dawna próbują zrozumieć związek między fenotypem a genotypem. Aby lepiej zrozumieć ten związek, kluczowe jest opracowanie praktycznych technologii, które łączą mikroskopijne badania przesiewowe komórek z izolacją komórek o wysokiej czystości na potrzeby dalszej analizy genetycznej. W tym artykule opisano zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli poli(glikolu etylenowego) do badań przesiewowych i izolacji bakterii o unikalnych fenotypach wzrostu z heterogenicznych populacji komórek. Metoda polega na otorbieniu lub uwięzieniu komórek hydrożelem, a następnie hodowli, badaniach przesiewowych pod mikroskopem, a następnie użyciu narzędzia do modelowania światła o wysokiej rozdzielczości do czasoprzestrzennej kontroli degradacji hydrożelu i uwalniania wybranych komórek do roztworu w celu pobrania. Zastosowanie różnych wzorów świetlnych pozwala na kontrolę nad morfologią wyekstrahowanej komórki, a wzory, takie jak pierścienie lub krzyżówki, mogą być używane do pobierania komórek przy minimalnej bezpośredniej ekspozycji na światło UV w celu złagodzenia uszkodzeń DNA izolatów. Co więcej, narzędzie do modelowania światła zapewnia regulowaną dawkę światła, aby osiągnąć różne szybkości degradacji i uwalniania komórek. Pozwala na degradację w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając pobieranie komórek z precyzją przestrzenną w skali mikronów. W tym miejscu zademonstrowano zastosowanie tego materiału do przesiewania i pobierania bakterii zarówno z hydrożeli luzem, jak i z mikrofabrykowanych urządzeń typu lab-on-a-chip. Metoda jest niedroga, prosta i może być stosowana do powszechnych i pojawiających się zastosowań w mikrobiologii, w tym do izolacji szczepów bakteryjnych o rzadkich profilach wzrostu z bibliotek mutantów oraz izolacji konsorcjów bakteryjnych z pojawiającymi się fenotypami w celu charakterystyki genomowej.

Introduction

Izolacja komórek o unikalnych zachowaniach ze złożonego i niejednorodnego środowiska jest fundamentalna dla uzyskania informacji genetycznej w biologii¹. W mikrobiologii selekcja i izolacja rzadkich lub unikalnych drobnoustrojów po obserwacji staje się ważna w wielu zastosowaniach, które wymagają połączenia między informacjami genomicznymi a obserwowalnymi informacjami fenotypowymi. Zastosowania te obejmują wybór fenotypowo rzadkich szczepów z bibliotek mutantów², wybór mikroorganizmów kluczowych ze złożonych społeczności mikroorganizmów^3,4 oraz wybór fenotypowo rzadkich, ale ważnych bakterii z populacji izogenicznych. Izolacja żywotnych, ale niehodowlanych komórek (VBNC) z populacji bakterii jest ważnym przykładem tej drugiej, gdzie komórki o fenotypie VBNC są często ukryte w populacjach bakterii w proporcjach 1:10² do 1:10⁵5^,6. Ze względu na powszechne trudności w izolacji bakterii, wiele pozostaje niewiadomych na temat wielu fenotypowo rzadkich mikroorganizmów. Ograniczenia te podkreślają potrzebę stosowania technik izolacji komórek, aby najpierw zidentyfikować komórkę lub komórki docelowe z mieszaniny, a następnie pobrać i wyizolować je do dalszej analizy molekularnej⁷.

Niektóre z najczęściej stosowanych metod izolacji komórek to cytometria przepływowa i fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS)⁸, separacja immunomagnetyczna9^,10, oraz mikrofluidyka¹¹. Chociaż te metody izolacji mają wysoką wartość, mają również wady, które ograniczają ich stosowanie. Na przykład FACS może zapewnić rutynową izolację mikrobiologiczną na poziomie pojedynczej komórki w celu dalszej analizy genomicznej³, ale często jest ograniczony przez jego dostępność i koszty, a także problemy z dalszym zanieczyszczeniem¹¹. Dużym zainteresowaniem cieszyły się podejścia oparte na mikroprzepływowości, takie jak mikroprzepływowa cytometria przepływowa, która w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową pozwala na znaczne zmniejszenie wymaganej objętości próbki¹². Jednak separacja i pobranie pojedynczej lub małej grupy komórek z urządzeń mikroprzepływowych jest często trudnym problemem, który zazwyczaj wymaga bardziej złożonej konfiguracji i projektu urządzenia¹³. Wiele podejść opartych na mikroprzepływach genetycznie charakteryzuje komórki przed ich wprowadzeniem i obserwacją w urządzeniu¹⁴, ograniczając liczbę unikalnych gatunków obserwowanych podczas wykonywania funkcjonalnego badania przesiewowego. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, do powszechnego stosowania w wielu laboratoriach potrzebne są dalsze innowacje zarówno w zakresie metod, jak i materiałów, które są praktyczne w badaniach przesiewowych i izolacji komórek.

Ten artykuł przedstawia nowe, oparte na materiałach podejście do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Metoda wykorzystuje fotodegradowalne hydrożele do enkapsulacji komórek, hodowli, obserwacji mikroskopowej oraz uwalniania i odzyskiwania na żądanie docelowych bakterii o unikalnych fenotypach. Hydrożele są zaprojektowane tak, aby zawierały oczka o rozmiarze 10 nm, gdzie każdy link krzyżowy zawiera grupy o-nitrobenzylowe¹⁵. Materiał otacza lub wychwytuje komórki do obserwacji, umożliwiając jednocześnie dyfuzję składników odżywczych i produktów przemiany materii do i z komórek w celu hodowli. Wystawienie materiału na działanie wzorzystego źródła światła UV o długości fali 365 nm za pomocą mikroskopu pionowego umożliwia miejscową degradację hydrożelu poprzez fotorozszczepienie grup o-nitrobenzylowych^16,17. Degradacja wyzwala selektywne uwalnianie komórek do odzyskania do dalszej analizy, w tym analizy genomicznej i, potencjalnie, proteomicznej i transkryptomicznej. Konfiguracja i protokół eksperymentu są stosunkowo proste, niedrogie i podatne na translację do laboratoriów mikrobiologicznych. Wymaga jedynie enkapsulacji komórek poprzez tworzenie hydrożelu, obserwacji przechwyconych komórek za pomocą pionowego jasnego pola i mikroskopu fluorescencyjnego oraz oświetlenia komórek będących przedmiotem zainteresowania wzorzystym źródłem światła UV w celu ich pobrania.

Kluczową zaletą tego opartego na materiałach podejścia do badań przesiewowych jest możliwość dostosowania do różnych formatów przesiewania. W najbardziej podstawowym formacie materiał może być używany do badań przesiewowych poprzez zamknięcie niejednorodnej kolekcji komórek w hydrożelach luzem. Komórki są następnie obserwowane pod kątem pożądanego fenotypu, a poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania są usuwane w celu charakterystyki genomowej. W bardziej wyszukanych formatach materiał można również zintegrować z urządzeniami typu lab-on-a-chip, aby zapewnić precyzyjne uwalnianie i pobieranie komórek z pożądanych obszarów urządzenia. Oba formaty są opisane tutaj i oba umożliwiły najnowsze nowatorskie aplikacje do badań przesiewowych i selekcji drobnoustrojów^17,18,19. Metoda została zademonstrowana na modelowych organizmach Gram-ujemnych (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) i modelowym organizmie Gram-dodatnim (Bacillus subtilis) i została łatwo rozszerzona na wiele innych bakterii.

Protocol

1. Szczepy bakteryjne i protokoły hodowli

1. Smugi kolonii bakterii na płytkach agarowych uzupełnione odpowiednimi pożywkami wzrostowymi. W tym raporcie B. subtilis (szczep 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) jest hodowany na ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄·H₂O, 0,125 M FeSO_4·7H₂O, 28 mM glukozy, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) płytki agarowe uzupełnione 100 μg/ml spektynomycyny i E. coli (szczep 25922, ATCC) na płytkach agarowych ATGN uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny.
   UWAGA: Wcześniejsze doniesienia o kapsułkowaniu i uwalnianiu hydrożelu za pomocą tych materiałów z Fattahi et al.¹⁹ zamiast tego używały komórek A. tumefaciens C58
2. Wybierz żądane kolonie z płytek agarowych ATGN i rozpocznij hodowle przez noc. W przypadku stosowanych tu szczepów E. coli i B. subtilis należy przeprowadzić hodowlę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 215 obr./min w płynnym podłożu ATGN przez 24 godziny. Przechowuj kultury komórkowe w 50% glicerolu w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.
3. Pobrać kolonie obu szczepów z zapasów glicerolu za pomocą sterylnych pętli inokulacyjnych i inkubować w płynnych pożywkach ATGN przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 215 obr./min.

2. Przygotowanie materiału potrzebnego do tworzenia hydrożelu

1. Fotodegradowalna synteza diakrylanu PEG-o-NB
   UWAGA: Wewnętrzna synteza diakrylanu PEG-o-NB została dobrze opisana i wcześniej opisana^16,17. Alternatywnie, ponieważ synteza jest rutynowa, można ją zlecić na zewnątrz z zakładu syntezy chemicznej.
2. Bufor sieciujący
   1. Weź przepis na wybraną pożywkę dla szczepu bakteryjnego i przygotuj pożywkę z 2x składnikami odżywczymi. Dodać fosforan, np. NaH₂PO_4, do pożywki do końcowego stężenia 100 mM. Następnie dostosuj wartość pH do 8 za pomocą 5 M NaOH (aq).
   2. Wysterylizować roztwór buforowy i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Pomiń wszelkie metale przejściowe obecne w pożywkach, ponieważ metale te katalizują utlenianie tioli do dwusiarczków.
3. Roztwór diakrylanu PEG-o-NB
   1. Na każdy mg podwielokrotnego diakrylanu PEG-o-NB (masa cząsteczkowa 3 400 Da) dodać 3,08 μl ultraczystej wody, aby osiągnąć stężenie 49 mM diakrylanu PEG-o-NB (stężenie akrylanu 98 mM).
   2. Zmieszać roztwór, aż będzie dobrze wymieszany i przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
4. 4-ramienny roztwór PEG-tiol
   1. W przypadku 4-ramiennego preparatu PEG-tiol (10 000 Da o masie cząsteczkowej) dodać 4 μl ultraczystej wody na mg proszku, aby osiągnąć stężenie 20 mM (80 mM stężenia tiolu).
   2. Mieszać ten roztwór aż do jego dobrego wymieszania i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

3. Przygotowanie perfluoroalkilowanych (niereaktywnych) szkiełek nakrywkowych

1. Umieść do 5 szkiełek podstawowych (25 mm x 75 mm x 1 mm) w koperty na slajdy z polipropylenu. Sonikować szkiełka 2% (w/v) roztworem detergentu (tabela materiałów) przez 20 minut.
2. Opłucz szkiełka trzykrotnie ultraczystą wodą, a następnie poddaj je sonikacji w wodzie przez 20 minut. Wysuszyć szkiełka za pomocą strumienia N₂.
3. Czyścić plazmowo (patrz Tabela Materiałów) po obu stronach szkiełek podstawowych zgodnie z protokołem w punkcie 4.1 przez 2 min.
4. Umieść oczyszczone plazmowo szkiełka z powrotem w maszynce do przenoszenia i napełnij pojemnik 0,5% (v/v) roztworem trichloro(1H, 1H, 2H, 2H,-perfluorooktylo)silanu w toluenie. Pozwól tym szklanym szkiełkom funkcjonować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
5. Po funkcjonalizacji szkiełek należy je przepłukać w komorze do szkiełek, najpierw toluenem, a następnie etanolem (trzy razy każdym rozpuszczalnikiem). Następnie wysusz każde funkcjonalizowane szkiełko strumieniem N₂.

4. Przygotowanie tiolowych (bazowych) szkiełek nakrywkowych

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych za pomocą myjki plazmowej
   1. Umieścić szkiełka nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm na szalce Petriego. Następnie umieść szalkę Petriego w komorze myjki plazmowej i włącz zasilanie myjki plazmowej.
   2. Włącz pompę próżniową, aby oczyścić powietrze w komorze, aż manometr wskaże 400 mTorr.
   3. Otwórz zawór dozujący, aby wpuścić powietrze do komory, aż manometr osiągnie stałe ciśnienie (800-1000 mTorr). Następnie wybierz RF z trybem "Hi" i naświetl szkiełka nakrywkowe na 3 minuty.
   4. Po 3 minutach wyłącz tryb RF i pompę próżniową.
   5. Wyjmij szalkę Petriego z komory, odwróć szkiełka nakrywkowe i umieść je z powrotem w komorze, aby plazmowo odsłonić drugą stronę szklanego szkiełka nakrywkowego.
   6. Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.4 w celu oczyszczenia plazmowego nieobrobionej strony szkiełka nakrywkowego.
   7. Po zakończeniu procesu należy wyjąć szalkę Petriego z komory i wyłączyć myjkę plazmową oraz pompę próżniową.
2. Czyszczenie i hydroksylacja szkiełek nakrywkowych roztworem piranii
   UWAGA: Do czyszczenia i hydroksylowania szkiełek szklanych można stosować standardowe protokoły czyszczenia piranii. Roztwór piranii jest mieszaniną H₂O₂ i H₂SO₄ w stosunku 30:70 (v/v). Można również stosować alternatywne metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych.
   UWAGA: Roztwór piranii jest silnie i wybuchowy z rozpuszczalnikami organicznymi i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. Należy wdrożyć odpowiednie środki bezpieczeństwa i ograniczające rozprzestrzenianie się wirusa, takie jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, fartuch chemiczny, okulary ochronne, osłona twarzy, rękawice butylowe kwasoodporne). Wszystkie naczynia szklane i powierzchnie robocze mające kontakt z roztworem piranii powinny być czyste, suche i wolne od pozostałości organicznych przed użyciem. Roztwór piranii nigdy nie powinien być przechowywany w częściowo zamkniętym lub zamkniętym pojemniku.
   1. Umieść czyste szklane naczynie o wymiarach 100 mm x 50 mm na mieszadle magnetycznym z płytą grzejną z regulowaną prędkością mieszania pod wyciągiem i dodaj do naczynia 14 ml_H2SO4
   .
   2. Delikatnie umieść małe, pokryte teflonem mieszadło magnetyczne za pomocą kleszczyków pokrytych teflonem wewnątrz naczynia. Następnie powoli obracaj mieszadłem, aby uniknąć rozpryskiwania kwasu.
   3. Następnie delikatnie dodaj 6 ml H₂O₂ do naczynia i pozwól roztworowi dobrze się wymieszać.
   4. Wyłącz mieszadło, a następnie wyjmij mieszadło z naczynia za pomocą kleszczy. Następnie delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe w naczyniu za pomocą kleszczyków i ustaw temperaturę na 60–80 °C.
   5. Po 30 minutach delikatnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków i zanurz je dwukrotnie w wodzie dejonizowanej (DI), aby zmyć resztki roztworu piranii.
   6. Po spłukaniu wodą szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w wodzie DI o temperaturze suchej do dalszego użycia.
   7. Wyłącz płytę grzejną i pozwól roztworowi piranii ostygnąć.
   8. Aby usunąć roztwór piranii, delikatnie umieścić szklane naczynie o wymiarach 100 mm x 50 mm zawierające schłodzony roztwór piranii w większej, pustej szklanej zlewce o objętości co najmniej 1,5 l. Następnie dodaj 1 l wody do rozcieńczenia i dodaj wodorowęglan sodu w proszku w celu zneutralizowania. Należy pamiętać, że wodorowęglan sodu spowoduje bulgotanie i wytwarzanie ciepła i powinien być dodawany bardzo powoli, w przeciwnym razie bulgotanie może prowadzić do rozpryskiwania się kwasu. Gdy dalsze dodawanie wodorowęglanu sodu nie powoduje bulgotania, należy sprawdzić pH za pomocą papieru pH, aby upewnić się, że zostało zneutralizowane. Po zneutralizowaniu i schłodzeniu roztworu można go wylać do zlewu.
3. Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek nakrywkowych
   1. Przygotować 5% (v/v) roztwór 269 mM roztworu (3-merkaptopropylo)trimetoksysilanu (MPTS) w suchym toluenie.
   2. Dodać 10 ml roztworu do pojedynczych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i umieścić po jednym oczyszczonym szkiełku nakrywkowym w każdej probówce i zanurzyć je w roztworze.
      UWAGA: Jedno szkiełko nakrywkowe na probówkę o pojemności 50 ml służy do zapewnienia tiolowania obu stron podłoża bez zakłócania przez inne podłoża.
   3. Po 4 godzinach umyć każde szkiełko nakrywkowe (cztery prania na szkiełko nakrywkowe) toluenem, mieszaniną etanolu i toluenu w stosunku 1:1 (v/v) i etanolem.
      UWAGA: Odbywa się to poprzez sekwencyjne zanurzanie każdego szkiełka nakrywkowego w stożkowych probówkach wirówkowych zawierających wymienione roztwory.
   4. Po wypłukaniu podłoża zanurzyć je w etanolu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: W zależności od liczby szkiełek nakrywkowych, metoda ta może stać się pracochłonna ze względu na obróbkę szkiełek nakrywkowych pojedynczo. W przypadku wielu szkiełek nakrywkowych można użyć słoików Columbia, które mieszczą się w kilku szkiełkach nakrywkowych w tym samym czasie.

5. Produkcja matryc mikrodołkowych z krzemu

1. Powłoka parylenowa: Użyj standardowego protokołu opisanego w poprzednich artykułach badawczych^20,21, aby pokryć płytki krzemowe parylenem.
2. Mikrofabrykacja: Postępuj zgodnie z protokołem opisanym przez Barua et al.¹⁸, aby zaprojektować i wyprodukować układ mikrostudzienek (rysunek uzupełniający 1).
   UWAGA: Standardowe techniki fotolitograficzne opisane przez Timma i in.¹⁷ zostały zastosowane do wytworzenia matryc mikrodołkowych na płytkach krzemowych pokrytych parylenem.

6. Tworzenie hydrożelu

1. Masowe tworzenie się hydrożelu na szklanych szkiełkach nakrywkowych
   1. Roztwór prekursora hydrożelu: Dodać 12,5 μl buforu sieciującego do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, a następnie 5,6 μl roztworu dikrylanu PEG-o-NB. Na koniec dodać do mieszaniny 6,9 μl 4-ramiennego roztworu PEG-tiol.
      UWAGA: Dodanie 4-ramiennego tiolu PEG do mieszaniny inicjuje reakcję sieciowania. Dlatego roztwór prekursora hydrożelu należy zużyć natychmiast po wymieszaniu.
   2. W celu enkapsulacji komórek w roztworze prekursora hydrożelu należy postępować zgodnie z krokami 6.1.3-6.1.9.
   3. W celu enkapsulacji komórek, przed krokiem 6.1.1, zaszczepij bufor sieciujący o żądanej gęstości komórek. Jak zgłoszono wcześniej¹⁹, zaobserwowano, że gęstość komórek 7,26 × 10⁷ CFU/ml w buforze sieciującym koreluje z gęstością ~ 90 komórek/^mm2 zamkniętych w hydrożelu.
   4. Umieść tiolowane szkiełko nakrywkowe na czystej szalce Petriego. Umieść dwie przekładki (patrz Tabela materiałów) po dwóch przeciwległych stronach szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Funkcjonalizacja tiolowa szkiełek nakrywkowych jest niezbędna do kowalencyjnego przylegania hydrożelu do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Odbywa się to poprzez reakcję grup tiolowych na powierzchni i grup akrylowych obecnych w roztworze prekursora hydrożelu.
   5. Zamocuj przekładki na podstawowym szkiełku nakrywkowym, przyklejając je do szalki Petriego.
   6. Odpipetować żądaną objętość roztworu prekursora na niereaktywnym, perfluoroalkilowanym szkiełku podstawowym.
   7. Umieść szkiełko ze szkła perfluoroalkilowego na podstawowym szkiełku nakrywkowym (Rysunek 1C). Odczekaj 25 minut w temperaturze pokojowej na zakończenie tworzenia hydrożelu.
   8. Po żelowaniu delikatnie usuń szkiełko perfluoroalkilowane. Hydrożel pozostanie przymocowany do podstawowego szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: W przypadku szkiełek nakrywkowych o wymiarach 18 mm x 8 mm, aby uzyskać membranę o grubości 12,7 μm, należy użyć ~7 μl roztworu prekursora (Rysunek 1A,B). Użycie większych objętości roztworu prekursora może spowodować, że pod bazowym szkiełkiem nakrywkowym pojawi się hydrożel. Może to spowodować, że szkiełko nakrywkowe przyklei się do szalki Petriego i pęknie przy próbie usunięcia. Również pozostałości hydrożelu pod szkiełkiem nakrywkowym są problematyczne dla mikroskopii. Konieczne jest delikatne usunięcie niereaktywnego szkiełka ze szkła perfluoroalkilowego, ponieważ szybkie usunięcie może uszkodzić hydrożel.
   9. Umieścić podłoże na szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm w określonych pożywkach hodowlanych. W tym przypadku zastosowano pożywkę ATGN uzupełnioną spektynomycyną o spektynomycynie 100 μg/ml dla B. subtilis lub 100 μg/ml ampicyliny dla E. coli w temperaturze 37 °C przez 24 godziny hodowli.

Rysunek 1: Tworzenie hydrożelu na szkiełkach nakrywkowych ze szkła tiolowego. (A) Przekładki o grubości 12,7 μm są umieszczone po dwóch przeciwnych stronach podstawowego szkiełka nakrywkowego zawierającego reaktywne grupy tiolowe. (B) Roztwór prekursora hydrożelu pipetuje się na niereaktywnym szkiełku ze szkła fluorowanego. (C) Niereaktywne szkiełko podstawowe umieszcza się na przekładkach w celu wytworzenia hydrożelu o grubości 12,7 μm. (D) Niereaktywne szkiełko podstawowe delikatnie usuwa się, pozostawiając hydrożel przymocowany do podstawowego szkiełka nakrywkowego. (E) Przygotowany hydrożel może być inkubowany w pożywkach do hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Tworzenie hydrożelu na układach mikrodołków

1. Wysiewanie bakterii w układach mikrodołkowych
   UWAGA: 700 μL zawiesin komórek 0,1 OD₆₀₀ wysiano na substratach układu mikrostudzienek, a metodę lift-off parylenu zastosowano w celu usunięcia komórek z tła przy użyciu protokołu opisanego przez Timma i wsp.²².
2. Przygotować roztwór prekursora hydrożelu, dodając 5,6 μl dikrylanu PEG-o-NB z 12,5 μl soli fizjologicznej ATGN buforowanej fosforanem o pH 8 i mieszając z 6,9 μl czteroramiennego roztworu tiolu PEG.
3. Pobrać pipetę 12,5 μl roztworu prekursora na niereaktywnym, perfluoroalkilowym szkiełku podstawowym i umieścić dwie stalowe przekładki o grubości 38 μm (patrz Tabela Materiałów) po dwóch przeciwnych stronach podłoża z matrycy mikrostudzienkowej zaszczepionej komórkami.
4. Odwrócić szkiełko ze szkła perfluoroalkilowego kropelką roztworu prekursora i umieścić kropelkę na środku podłoża mikrostudzienki. Następnie inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej w celu wytworzenia hydrożelu.
5. Delikatnie wyjmij szkiełko z podłoża mikrostudzienki. Membrana hydrożelowa powinna pozostać przymocowana do podłoża mikrostudzienki. Przejdź do kroku 6.1.9.

8. Przygotowanie materiału do ekstrakcji komórek

1. Przygotowanie uchwytu PDMS
   1. Sklej ze sobą stos dziesięciu szkiełek nakrywkowych o wymiarach 18 x 18 mm i przyklej ten stos szkiełek nakrywkowych do dna szalki Petriego.
   2. Aby wytworzyć uchwyty PDMS, należy wymieszać prekursor PDMS i utwardzacz w stosunku objętościowym 10:1 w plastikowym kubku, odgazować mieszaninę w eksykatorze próżniowym, a następnie wlać mieszaninę na szalkę Petriego.
   3. Utwardzać PDMS przez 90 minut w temperaturze 80 °C. Następnie przetnij wokół zaklejonego taśmą bloku, aby wyjąć uchwyt PDMS i umieść uchwyt PDMS na szklanym szkiełku, aby ułatwić obsługę mikroskopii.
2. Przygotowanie mikrostrzykawki i rurki
   1. Wytnij 20 cm rurki PTFE (0,05 cala średnicy wewnętrznej) i przymocuj jeden koniec rurki do strzykawki o pojemności 100 μl mikrolitrów.
      UWAGA: Do ekstrakcji należy unikać używania pipet, ponieważ pobieranie uwolnionych komórek za pomocą końcówki pipety może uszkodzić powierzchnię hydrożelu i doprowadzić do zanieczyszczenia.

9. Degradacja hydrożelu za pomocą narzędzia do wzorzystego oświetlenia

UWAGA: Następujące kroki opisane w tej sekcji są identyczne zarówno dla hydrożeli masowych, jak i układów mikrodołkowych, z wyjątkiem wzorców ekspozycji na światło opisanych w krokach 9.6.4-9.6.6 i 9.6.7-9.6.10.

1. Włącz mikroskop (patrz tabela materiałów). Następnie włącz narzędzie do wzorzystego oświetlenia (patrz Tabela materiałów).
2. Włącz analogowy i cyfrowy moduł sterujący źródła światła LED 365 nm. Następnie włącz moduł sterujący źródłem światła LED.
3. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i oprogramowanie narzędzia do oświetlenia wzorzystego. Po otwarciu okna konfiguracji sprzętowej wybierz przycisk Załaduj.
   UWAGA: W tym miejscu zostaną załadowane trzy urządzenia. (Kamera innej firmy, moduł sterujący i narzędzie do wzorzystego oświetlenia)
4. Naciśnij przycisk Start. Otworzy się teraz okno oprogramowania do modelowania światła. Wybierz pierwszą opcję, przycisk Kontrola urządzeń, na lewym pasku bocznym okna.
5. Skalibruj narzędzie do wzorzystego oświetlenia.
   UWAGA: Kalibrację należy przeprowadzić przy użyciu tego samego obiektywu mikroskopu i filtra, które będą używane do ekspozycji na światło.
   1. Ustaw obiektyw mikroskopu na 10-krotne powiększenie.
      UWAGA: To powiększenie zapewnia wystarczającą odległość roboczą między soczewką mikroskopu a powierzchnią próbki. Pozwala również na monitorowanie i rejestrowanie procesu pobierania w czasie rzeczywistym przez okno obrazu.
   2. Ustaw soczewkę mikroskopu i filtr na ustawienia używane do ekspozycji na światło i umieść lustro kalibracyjne pod mikroskopem.
   3. W oknie Device Control naciśnij zakładkę Sterowanie diodami LED. Włącz diodę LED #1 i ustaw natężenie światła na żądaną liczbę. W standardowych eksperymentach ekstrakcji wartość ta jest ustawiona na 60%.
   4. Naciśnij zakładkę zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia w oknie Kontrola urządzeń. Następnie naciśnij przycisk Pokaż siatkę.
      UWAGA: Wzór siatki zostanie wyświetlony na lustrze kalibracyjnym.
   5. Dostosuj ostrość mikroskopu i ekspozycję kamery, aby uzyskać wysoką jakość obrazu siatki, a w razie potrzeby obróć kamerę, aby wyrównać linie siatki równolegle do ramki okna kamery.
   6. Wybierz przycisk Kreatora kalibracji pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez oprogramowanie w tym oknie.
      UWAGA: Otworzy się okno konfiguracji kamery innej firmy.
   7. Otworzy się okno wyboru typu kalibracji. Wybierz opcję Automatyczna kalibracja i naciśnij przycisk Dalej.
   8. Gdy otworzy się okno Regulacja wstępnej kalibracji, postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania i naciśnij przycisk Dalej.
   9. Gdy otworzy się okno Informacje o mapowaniu, zapisz tę kalibrację odpowiednio w żądanym folderze. Odbywa się to poprzez wpisanie daty, nazwy mikroskopu, soczewki obiektywu i filtra.
   10. Po kalibracji naciśnij przycisk Definicja obszaru roboczego znajdujący się pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia, aby w razie potrzeby zdefiniować obszar roboczy narzędzia do wzorzystego oświetlenia.
6. Sekcja projektowania sekwencji do przygotowania wzoru.
   1. Naciśnij przycisk Projektowanie sekwencji na lewym pasku bocznym okna oprogramowania. Następnie naciśnij przycisk Edytor sekwencji profili.
   2. Gdy otworzy się okno Edytor sekwencji profili, wybierz opcję Nowy profil w obszarze Lista profili.
      UWAGA: Teraz otworzy się okno Edytora wzorców.
   3. Przygotuj żądany wzór do ekspozycji na światło, wybierając różne kształty i rozmiary wzoru, lub w razie potrzeby narysuj wzór ręcznie.
   4. W przypadku wzorów kół i łamanych krzyżyków dla hydrożelu luzem, wykonaj kroki 9.6.5-9.6.6
   5. W przypadku wzorów okręgów zdefiniuj okrąg o średnicy 30 μm nad docelową kolonią bakterii, aby pokryć całą kolonię. Wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   6. W przypadku łamanych wzorów krzyżowych wybierz kształt prostokąta z okna rysunku wzoru o wymiarach 3 μm x 8 μm. Umieść cztery prostokąty o tym wymiarze na krawędziach docelowej kolonii, podczas gdy połowa wzorów ma nakładkę z kolonią.
   7. W przypadku wzorów okręgów i pierścieni dla układów mikrostudzienek wykonaj kroki 9.6.8-9.6.10.
   8. W przypadku wzorów kołowych narysuj okrąg o średnicy 10 μm wokół obwodu studni. Wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   9. Aby uzyskać wzór pierścienia, narysuj okrąg o średnicy 20 μm, umieść go nad studzienką i wybierz kolor wypełnienia kształtu: biały.
   10. Narysuj kolejny wzór koła o średnicy 10 μm z czarnym kolorem wypełnienia i umieść go na obwodzie studni.
7. Edytuj deseń i modyfikuj kształty w oparciu o żądaną metodę wyodrębniania. Upewnij się, że żądany wzór znajduje się w obszarze roboczym narzędzia do oświetlenia z wzorem.
8. Umieść próbkę w uchwycie PDMS i odpipetuj określone media na wierzchu próbki, aby zapobiec odwodnieniu próbki i zapewnić roztwór nośnikowy dla uwolnionych komórek.
9. Następnie zastąp go lustrem kalibracyjnym.
10. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać ostry obraz kolonii w hydrożelu. Sprawdź kolonie, aby zidentyfikować interesującą Cię kolonię.
11. Tutaj zaprojektuj wzory świetlne, podczas gdy widok kamery pokazuje kolonie wewnątrz próbki, aby przetestować różne wzorce ekstrakcji komórek.
12. Zapisz zdefiniowany wzorzec. Po zapisaniu zdefiniowanego wzorca należy wybrać sekcję Kontrola sesji.
13. W tej sekcji, pod zakładką zatytułowaną nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia, dodaj zapisaną sekwencję.
14. Po dodaniu sekwencji wybierz opcję symulacji wzoru, aby wyświetlić i dostosować do żądanego miejsca ekspozycji.
    UWAGA: Lokalizację próbki można tutaj dostosować, aby zapewnić precyzyjne rzutowanie wzoru na obszar docelowy.
15. Następnie ustaw natężenie światła na 60%, a czas naświetlania na 40 s pod zakładką sterowania LED i rozpocznij proces naświetlania.
16. Monitoruj degradację hydrożelu w czasie rzeczywistym i w trybie jasnego pola, aby zapewnić uwalnianie komórek.
    UWAGA: Zapobiegaj wszelkim ruchom próbki podczas ekspozycji na światło, ponieważ może to spowodować degradację niepożądanych obszarów hydrożelu, powodując zanieczyszczenie krzyżowe.

10. Pobieranie komórek

UWAGA: Procedura pobierania komórek jest identyczna zarówno dla hydrożeli masowych, jak i dla układów mikrodołkowych.

1. Po ekspozycji na światło 365 nm i uwolnieniu komórek, zbierz komórki za pomocą mikrolitrowej strzykawki i rurki mikroprzepływowej (Rysunek 2).
   UWAGA: Pobieranie komórek należy wykonać natychmiast po ekspozycji wzoru. Pozwala to na miejscową regenerację komórek, zanim uwolnione komórki odejdą od napromieniowanego obszaru.
2. Zmień mikroskop z jasnego pola na filtr FITC lub TRITC, aby umożliwić wizualizację odsłoniętego obszaru próbki gołym okiem.
3. Po zlokalizowaniu odsłoniętego obszaru umieść koniec rurki na napromieniowanym miejscu. Następnie zmień filtr mikroskopu z powrotem na jasne pole, aby monitorować pobieranie komórek w czasie rzeczywistym.
4. Użyj strzykawki dołączonej do drugiego końca rurki, aby ostrożnie pobrać uwolnione komórki. Pobrać 200 μl roztworu i umieścić roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu analizy DNA lub posiewu.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie metody ekstrakcji do zbierania komórek uwolnionych z hydrożelu. Tutaj, bezpośrednio po ekspozycji na promieniowanie UV 365 nm, degradacji hydrożelu i uwolnieniu komórek, mikroskop jest używany do oświetlenia próbki hydrożelu światłem z filtra TRITC, w wyniku czego powstaje jasnozielona plamka pokrywająca obszar, w którym nastąpiło uwolnienie komórek. Pomaga to użytkownikowi w określeniu lokalizacji przestrzennej do pobrania próbki. Po uwidocznieniu tego obszaru w tym miejscu umieszcza się rurkę pobierającą przymocowaną do mikrolitrowej strzykawki i pobiera się próbkę. Mikroskopia jasnego pola przy 10-krotnym powiększeniu służy do monitorowania końca rurki i powierzchni hydrożelu w czasie rzeczywistym w celu precyzyjnego zbierania komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

11. Oczyszczanie genomowego DNA i pomiar jakości DNA

1. Użyj zestawu do oczyszczania DNA (patrz tabela materiałów), aby wyekstrahować DNA z izolatów bakterii.
   1. Postępuj zgodnie ze specyfikacją producenta opisaną w podręczniku zestawu do oczyszczania DNA²³ aż do ostatniego kroku (krok 7), wymagającego elucji za pomocą buforu AE.
   2. Na etapie elucji należy postępować zgodnie ze specyfikacją producenta, z tą różnicą, że należy użyć 100 μl buforu AE zamiast 200 μl.
   3. Powtórzyć elucję jeden raz, jak opisano w kroku 11.1.2. Ten krok prowadzi do zwiększenia ogólnej wydajności DNA.
2. Zmierzyć jakość DNA za pomocą spektrofotometru UV-VIS (patrz Tabela materiałów).
   1. Włącz spektrofotometr. Po inicjalizacji urządzenia, na stronie głównej, wybierz opcję dsDNA na ekranie.
   2. Następnie podnieś ramię cokołu i wyczyść pozycję cokołu wodą DI i niestrzępiącymi się chusteczkami.
   3. Odpipetować 2 μl roztworu próby ślepej, w tym przypadku bufora AE, na pozycji cokołu, a następnie delikatnie opuścić ramię cokołu i wybrać na ekranie opcję Blank.
   4. Następnie podnieś cokół i wyczyść pozycję cokołu wodą DI, aby usunąć wszelkie pozostałości materiału z poprzedniego pomiaru.
   5. Załaduj próbkę (2 μl) na pozycję cokołu, opuść ramię cokołu i wybierz przycisk Zmierz na ekranie.
   6. Powtórz kroki 11.2.4 i 11.2.5 dla wszystkich próbek.
   7. Po zakończeniu pomiaru wybierz "Zakończ eksperymenty" na ekranie. Włóż pendrive do urządzenia i naciśnij "Eksportuj dane" na ekranie.

12. Określanie żywotności komórek na podstawie hydrożelu i ekstraktów z mikrostudzienek

1. Rozcieńczyć zawiesiny bakteryjne współczynnikiem rozcieńczenia 10:⁵ przy użyciu płytki 96-dołkowej.
2. Odpipetować 10 μl rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej i umieścić trzy razy na płytkach ATGN dla każdej zawiesiny bakteryjnej.
3. Przechyl płytki, aby rozprowadzić komórki na powierzchni agaru. Wysuszyć na powietrzu płytki ATGN zawierające zawiesiny bakteryjne.
4. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Policzyć i zapisać liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU). Policz wszystkie trzy rozprowadzone zawiesiny bakteryjne na każdej płytce.
   UWAGA: Wykonaj kroki 12.1-12.4 w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uniknąć zanieczyszczenia płytki.

Results

Aby zbadać zdolność światła UV do wywoływania kontrolowanej degradacji hydrożelu w celu uwolnienia komórek, najpierw kapsułkowano hydrożele na tiolowanych szkiełkach nakrywkowych bez obecności bakterii. Każdy hydrożel poddano działaniu trzech powtórzonych wzorów okręgów światła o różnym natężeniu i czasie ekspozycji. Procentową degradację żelu obliczono po ekspozycji na światło UV przy każdym natężeniu światła, a następnie czas ekspozycji określono ilościowo, łącząc wiszące grupy tiolowe z barwnikiem fluoresceino-5-maelimidowym do obrazowania fluorescencyjnego^19,24. Reprezentatywny przykład wpływu tych dwóch parametrów na degradację hydrożelu pokazano na rysunku Rysunek 3. Jak widać, wzorzyste światło dostarczane przez narzędzie do wzorzystego oświetlenia zapewnia przestrzenno-czasową kontrolę degradacji hydrożelu w rozdzielczości, która może umożliwić uwolnienie tylko niewielkiej liczby komórek.

Rysunek 3: Kontrola degradacji hydrożelu. Dawka światła UV i wynikająca z niej szybkość degradacji hydrożelu są regulowane za pomocą narzędzia do wzorzystego oświetlenia. (Wstawka) Do wzorzystej degradacji hydrożelu wybrano dwie różne intensywności światła. Po ekspozycji na światło UV o długości fali 365 nm hydrożele znakowano fluoresceiną-5-maleimidem do obrazowania fluorescencyjnego. Przedruk (adaptacja) za zgodą Fattahi et ^al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Do ekstrakcji komórek, do badania uwalniania komórek użyto różnych wzorów świetlnych (Rysunek 4). W tym przypadku komórki bakterii Agrobacterium zostały zamknięte w hydrożelach w masie na tiolowanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie wyhodowane w koloniach w mikroskali. Hydrożele zostały następnie zbadane w mikroskopii jasnego pola, a docelowe mikrokolonie wystawiono na działanie różnych wzorów światła UV. Zaobserwowano, że różne wzorce ekspozycji wpływają na morfologię uwolnionych komórek. Jest to potencjalnie korzystne dla różnych zastosowań. Na przykład, odsłonięcie wzoru pierścienia wokół docelowej kolonii powoduje uwolnienie całej kolonii nadal zamkniętej w ochronnym hydrożelu PEG i bez bezpośredniej ekspozycji na światło UV (Rysunek 4A), co może zachować komórki i zapewnić łatwe oczyszczanie w dalszej części procesu. W przeciwieństwie do tego, wystawiając część lub całą kolonię na działanie światła UV, komórki można wyodrębnić jako zagregowane klastry komórek ( Rysunek 4B) lub jako wolne, pojedyncze komórki ( Rysunek 4C).

Rysunek 4: Kontrola nad morfologią pobranych komórek. (A) Użycie wzoru pierścieniowego do uwolnienia całej kolonii komórek, chronionej w matrycy PEG. (B) Użycie łamanego wzoru krzyżowego do uwalniania komórek w agregatach. (C) Użycie wzoru krzyżowego do uwolnienia pojedynczych komórek. Przedruk (adaptacja) za zgodą Fattahi et ^al.19 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kluczowe w protokole enkapsulacji jest zarówno gęstość rozsiewu komórek, jak i grubość hydrożelu, ponieważ oba te parametry mogą wpływać na liczbę komórek włączonych do hydrożelu do obserwacji. Aby to zademonstrować, próbki komórek A. tumefaciens zamknięto w hydrożelach o dwóch różnych grubościach za pomocą cienkich przekładek (12,7 μm) lub grubych przekładek (40 μm) i zobrazowano zgodnie z ustalonymi protokołami. Cieńsze hydrożele spowodowały gęstość mikrokolonii wynoszącą 90 kolonii/mm² w całym hydrożelu, gdzie zaobserwowano minimalne nakładanie się kolonii (Rysunek 5A). Natomiast grubość hydrożelu większa niż 12,7 μm powodowała tworzenie się nakładających się kolonii w kierunku pionowym (Rysunek 5B), co może skutkować ekstrakcją wielu kolonii. Nakładające się na siebie kolonie mogą powodować zanieczyszczenie krzyżowe podczas ekstrakcji ze względu na dwuwymiarowy charakter wzoru świetlnego. Na przykład, górna kolonia może być celem ataku, podczas gdy leżąca pod nią kolonia również jest wydobywana (Rysunek 5C). Dlatego do przygotowania hydrożelu zaleca się stosowanie przekładek o wielkości 12,7 μm.

Rysunek 5: Grubość hydrożelu wpływa na czystość ekstrakcji. (A) Wykorzystując przekładki o grubości 12,7 μm do tworzenia hydrożelu, kolonie są tworzone w jednej 10-krotnej płaszczyźnie ogniskowej. (B) Nakładanie się kolonii można zaobserwować przy 10-krotnym powiększeniu, jeśli zastosuje się przekładki o grubości większej niż 12,7 μm. (C) Zanieczyszczenie krzyżowe może wystąpić w przypadku nałożenia kolonii podczas uwalniania komórek: (i) wzór pierścieniowy jest używany do uwolnienia docelowej kolonii komórek, (ii) docelowa kolonia komórkowa odłącza się od hydrożelu i (iii) druga, leżąca pod spodem kolonia jest obserwowana podczas ekspozycji na światło pod docelową kolonią. Ta kolonia jest również usuwana, co powoduje zanieczyszczenie krzyżowe. Przedruk (adaptacja) za zgodą Fattahi et ^al.19 Copyright 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Biorąc pod uwagę potencjalne uszkodzenia bakterii za pomocą światła UV, wpływ różnych mikrowzorów światła UV na żywotność komórek był dalej badany przy użyciu modelu, bakterii Gram-dodatnich (B. subtilis) i modelu, bakterii Gram-ujemnych (E. coli). Każdy z nich został zamknięty w hydrożelach luzem i wyhodowany w koloniach w mikroskali zgodnie ze standardowymi protokołami, weryfikując ich kompatybilność z hydrożelem. Docelowe mikrokolonie o równoważnych rozmiarach (26 ± średnicy 1 μm) zostały następnie wystawione na działanie stałej dawki światła (168 mJ/^mm2), albo w postaci wzorów kołowych wystawiających całe mikrokolonie na działanie światła UV, albo wzorów krzyżowych, które degradują tylko krawędzie hydrożelu, aby zminimalizować ekspozycję komórek na światło. Komórki zostały następnie odzyskane i posiane w celu ilościowego określenia CFU/ml odzyskanego z każdej kolonii. Nie stwierdzono istotnej różnicy w poziomie regeneracji komórek (Rysunek 6A). Aby dokładniej zbadać czystość wyekstrahowanych komórek, DNA wyekstrahowano z próbek E. coli i przeanalizowano za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Dla obu wzorców poziomy jakości DNA mieszczą się w zakresie A₂₆₀/A₂₈₀ od 1,8 do 2,0 (Rysunek 6B), co jest w idealnym zakresie dla sekwencjonowania genomu²⁵. Pokazuje to, że wzorce UV używane do uwalniania w opisanych warunkach mają minimalny wpływ na ilość żywotnych komórek odzyskanych z hydrożeli luzem lub na jakość genomowego DNA po ekstrakcji.

Rysunek 6: Wpływ różnych wzorców ekspozycji na światło na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwalnianych z hydrożeli luzem. (A) Poziomy odzysku komórek zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis po ekstrakcji przy użyciu wzorów krzyżowych i okręgowych. W tym eksperymencie ekstrakcję przeprowadzono z kulistych kolonii o tej samej średnicy (26 μm ± 1 μm), aby upewnić się, że liczba uwolnionych komórek z każdej kolonii jest równoważna. Wyekstrahowane roztwory zostały następnie posiane w celu obliczenia CFU/ml uzyskanego z każdego wzoru. Analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jtk/ml uzyskanej z wzorców krzyżowych i kołowych zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (wartość P > 0,05, n = 6 dla obu szczepów). (B) Spektrofotometryczna kwantyfikacja jakości DNA dla wyizolowanych komórek E. coli przy użyciu wzorów krzyżowych i kołowych. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jakości DNA dla zastosowanych wzorów (wartość P > 0,05, n = 6) (C) Obrazy w jasnym polu kolonii o równych średnicach wystawionych na wzory krzyżowe i kołowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Matryce Microwell zapewniają alternatywny, lab-on-a-chip interfejs przesiewowy, który oferuje bardziej kontrolowane funkcje przesiewowe w porównaniu do hydrożeli masowych. Na przykład układy mikrodołkowe umożliwiają wysiewanie bakterii do dyskretnych miejsc hodowli, w których można kontrolować liczbę komórek w inokulum. Cechy geometryczne mikrostudzienek, takie jak głębokość i średnica studni, są również kontrolowane za pomocą standardowych metod mikrowytwarzania. Dzięki tym korzyściom, mikrostudnie okazały się przydatne do badania wzrostu bakterii w warunkach zamknięcia przestrzennego²⁶, a ostatnio do odkrycia symbiotycznych i antagonistycznych interakcji między różnymi gatunkami bakterii, gdy są zamknięte razem w mikroskali¹⁸. Ekstrakcja komórkowa ze studni do analizy genomicznej, takiej jak sekwencjonowanie amplikonów 16S, ma kluczowe znaczenie dla tych zastosowań. Używając tego samego materiału hydrożelowego, światło UV można naświetlić nad studnią zawierającą interesujące nas komórki, w postaci okręgów lub pierścieni. Ten ostatni zapewnia degradację hydrożelu tylko na obwodzie mikrostudzienki, aby zapobiec bezpośredniemu napromieniowaniu komórek. Aby to zademonstrować, komórki A. tumefaciens wykazujące ekspresję mCherry zostały wysiane do studzienek, a hydrożel został następnie przyłączony do układu mikrostudzienek. Komórki hodowano, a następnie naświetlano wzorami kołowymi lub pierścieniowymi. Membrana została następnie wybarwiona barwnikiem fluoresceino-5-maleimidowym. Dwukolorowe obrazy fluorescencyjne ujawniły, że zarówno błona, jak i komórki w studzienkach są usuwane dla obu wzorców napromieniowania¹⁷. W przeciwieństwie do masowego formatu hydrożelu, ekstrakcja komórek została tutaj zaobserwowana tylko w postaci klastrów komórek¹⁸.

Rysunek 7: Reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazujące wpływ wzoru świetlnego na izolację komórek z matryc mikrodołkowych. (A) Mikrostudzienki o średnicy 40 μm zawierające bakterie (czerwone) po wysiewie i hodowli. (B) Ekspozycja na światło za pomocą wzorów okręgów i pierścieni (niebieski). (C) Zmniejszona czerwona fluorescencja pokazuje, że komórki są ekstrahowane z napromieniowanych studzienek. (D) Dwukolorowy obraz fluorescencyjny membran i bakterii po napromieniowaniu, wskazujący na usunięcie zarówno hydrożelu (kolor zielony), jak i bakterii (kolor czerwony) ze studzienek docelowych. (E) Z-stack, dwukolorowy obraz fluorescencyjny studni docelowych. Czerwona linia w (D) oznacza płaszczyznę xz zobrazowaną w (E), a zielona linia w (E) oznacza płaszczyznę xy zobrazowaną w (D). Próbki na obrazach (C-E) przemyto w celu usunięcia uwolnionych komórek, a następnie utrwalono i zobrazowano. Podziałka = 40 μm. Przedruk (adaptacja) za zgodą van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby określić ilościowo żywotność komórek bakteryjnych i jakość DNA po ekstrakcji w tym formacie, komórki B. subtilis i E. coli zostały wysiane, hodowane, a następnie uwalniane z układów mikrodołkowych przy użyciu wzorów okręgów i pierścieni (Rysunek 8A, B). Uwolnione komórki zostały następnie posiane na płytkach agarowych ATGN, a jakość DNA wyekstrahowanych komórek została określona ilościowo. Aby upewnić się, że podczas każdej ekstrakcji obecna jest stała liczba komórek, do uwolnienia skierowano mikrostudzienki o podobnej intensywności fluorescencji (~6000 A.U.), a zatem podobną liczbę komórek. Liczba żywotnych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru okręgu nie różniła się znacząco od liczby żywotnych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru pierścieniowego dla obu bakterii (Rysunek 8C). Ponadto poziomy jakości DNA nie różniły się znacząco między wzorcami koła i pierścienia dla żadnej z bakterii (Ryc. 8D). W związku z tym, podobnie jak w przypadku hydrożeli luzem, zastosowanie światła UV o określonej tutaj intensywności i czasie trwania miało znikomy wpływ na żywotność i jakość DNA komórek wyekstrahowanych z matryc mikrostudzienek. Odkrycia te pokazują, że żywe komórki bakteryjne mogą być selektywnie pobierane z mikrostudzienek przy minimalnych uszkodzeniach do dalszej analizy.

Rysunek 8: Wpływ różnych wzorców ekspozycji na światło na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwolnionych z układów mikrodołków. Panie przewodniczący, panie i panowie! Zarówno w przypadku E. coli, jak i B. subtilis, do ekstrakcji komórek z mikrodołków 10 μm zastosowano wzory okręgów i pierścieni. W tym eksperymencie do ekstrakcji komórek wykorzystano wzór kołowy o średnicy 10 μm oraz wzór pierścieniowy o średnicy wewnętrznej 10 μm i średnicy zewnętrznej 20 μm. Zastosowano mikrostudzienki o tych samych średnicach, aby zapewnić, że liczba uwolnionych komórek z każdej mikrostudzienki była taka sama. (C) Wyekstrahowane roztwory zostały następnie posiane w celu obliczenia jtk/ml uzyskanej z każdego wzorca ekspozycji. Analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jtk/ml uzyskanej z wzoru koła i pierścienia zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (wartość P > 0,05, n = 6 dla obu szczepów). (D) Spektrofotometrię wykorzystano do pomiaru jakości DNA zarówno komórek E. coli, jak i B. subtilis przy użyciu wzorów okręgów i pierścieni. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jakości DNA dla zastosowanych wzorców (wartość P > 0,05, n = 6 dla obu szczepów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Projektowanie i produkcja układów mikrodołków. (A) Standardowe techniki mikrofabrykacji zostały zastosowane do produkcji matryc mikrodołkowych na płytkach krzemowych. (B) Każdy substrat składał się z 7 x 7 układów studni o średnicy 10 μm i głębokości 20 μm i skoku 30 μm. (C) Każda tablica składała się z 225 mikrostudzienek. Ten rysunek został zmodyfikowany z Barua et al.¹⁸. Prawa autorskie 2021 Frontiers Media. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Materiał i podejście umożliwiają hodowlę wysokoprzepustową, kontrolę nad pożywką wzrostową i warunkami wzrostu oraz czystą i precyzyjną ekstrakcję komórek w prosty i ekonomiczny sposób. Ekstrakcja wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z narzędziem do oświetlenia wzorzystego i może być wykonana w sposób sekwencyjny w celu wyizolowania wielu celów komórkowych. Każda ekstrakcja trwa 5-10 minut, a z jednego hydrożelu usuwa się do 30 docelowych kolonii. Kluczową zaletą tego podejścia jest jego zdolność adaptacji do wielu różnych formatów testów, co wykazano w przypadku badań przesiewowych zarówno z hydrożeli luzem, jak i matryc mikrodołkowych. Proces separacji w obu formatach został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania bakterii, które wykazują unikalne zachowanie wzrostu, w celu dalszego genotypowania po hodowli i obserwacji mikroskopowej, co ma kluczowe znaczenie dla łączenia genotypu komórki z fenotypem. Do tej pory charakterystyka genomiczna bakterii wyekstrahowanych z tych interfejsów obejmowała sekwencjonowanie amplikonów 16S w celu identyfikacji wielogatunkowych kolekcji bakterii z mikrobiomów środowiskowych, które generują emergentne zachowania wzrostowe¹⁸, oraz sekwencjonowanie całego genomu w celu pomyślnej identyfikacji mutacji genetycznych, które powodują rzadkie profile wzrostu w komórkach obecnych w bibliotekach mutantów¹⁹.

Stosowanie hydrożeli luzem do badań przesiewowych i izolacji komórek jest najprostszym i najprostszym formatem. Hydrożele fotodegradowalne w dużej ilości tworzą się szybko (25 min) po zmieszaniu prekursorów z przezroczystymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w celu zamknięcia komórek w matrycy 3-D hodowli komórkowej, która jest obrazowana za pomocą standardowego pionowego lub odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W związku z tym metoda ta ma potencjał, aby zostać przeniesiona do powszechnych laboratoriów mikrobiologicznych, które nie dysponują zasobami ani wiedzą specjalistyczną w zakresie mikrowytwarzania. Wadą tego formatu jest to, że komórki są losowo zorientowane w trójwymiarowym hydrożelu. W związku z tym komórki mogą pojawiać się poza płaszczyzną ogniskową podczas obrazowania z obiektywami o większym powiększeniu, a ekstrakcja może być trudna, jeśli kolonie komórek są zorientowane zbyt blisko siebie lub jeśli występuje pionowe nakładanie się kolonii. Osadzanie cienkiego hydrożelu (<13 μm) zgodnie z opisem ma kluczowe znaczenie dla złagodzenia tej wady. Ekspozycja w przerwanych krzyżowych wzorach światła (ryc. 4B) jest tutaj lepsza, ponieważ ten wzór powoduje, że komórki są wolne od hydrożelu, które mają minimalną ekspozycję na światło UV i można je łatwo odzyskać poprzez powlekanie.

W przeciwieństwie do tego, format matrycy mikrostudzienkowej zapewnia lepiej kontrolowany interfejs, ponieważ komórki bakteryjne są podzielone na dyskretne mikrodołki, które służą jako małe kultury lub miejsca kokultur 17,18,26. Wymiary, skok i gęstość mikrostudzienki są precyzyjnie wytwarzane przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych. W porównaniu z hydrożelami luzem, bakterie można ekstrahować z układów mikrodołków o wyższym stopniu swoistości i mniejszym prawdopodobieństwie zanieczyszczenia krzyżowego, ponieważ komórki są obecne tylko w określonych miejscach, a nie losowo rozproszone w hydrożelu. Stężenie i proporcje komórek bakteryjnych w roztworze do wysiewu mogą być również zmieniane w celu kontrolowania ilości i składu inokulum mikrostudzienki poprzez proces wysiewu, który został scharakteryzowany w poprzednich raportach²⁶, co daje użytkownikowi elastyczność w eksperymentalnym projektowaniu sita. Podstawową wadą przesiewania za pomocą formatu matrycy mikrodołkowej jest dodatkowy czas i wiedza specjalistyczna wymagana do mikrowytwarzania. Szacuje się, że produkcja mikrostudni kosztowała ~10 USD za matrycę, co obejmuje koszty materiałów i wydatki na pomieszczenia czyste. Ponadto matryce mikrostudzienek są tradycyjnie wykonane z krzemu, co może powodować trudności z obrazowaniem, ponieważ podłoża są nieprzezroczyste. Co więcej, duże rozproszenie światła z powierzchni krzemu może ograniczać obrazowanie w mikrostudzienkach i może zmniejszać rozdzielczość wzoru podczas ekspozycji na hydrożel światłem UV z narzędzia do oświetlania wzorzystego (patrz rysunek 8A,B). Podobne mikrostudzienki zostały wyprodukowane na przezroczystych podłożach kwarcowych, aby rozwiązać tego typu ograniczenia²⁷; Jednak ta produkcja jest znacznie trudniejsza. Ekspozycja na wzory pierścieni, które oświetlają obwód studni, jest tutaj preferowana, aby uwolnić wolne komórki ze studzienek, jednocześnie minimalizując ekspozycję na promieniowanie UV.

Najczęstszym problemem, który występuje w obu formatach, jest oderwanie hydrożelu od podłoża znajdującego się pod spodem podczas hodowli z powodu pęcznienia hydrożelu. Jeżeli stanowi to problem w przypadku hydrożeli luzem, obecność, gęstość i jednorodność grup tiolowych w warstwie przyłączającej substancji chemicznej (MTPS) na powierzchni szkiełka nakrywkowego ze szkła bazowego należy zweryfikować przy użyciu odpowiedniej techniki charakteryzacji powierzchni (XPS, ATR-FTIR, AFM itp.). Niskie gęstości powierzchniowych grup tiolowych spowodowane nieefektywną funkcjonalizacją powierzchni mogą prowadzić do słabej interakcji między substratem a hydrożelem. W przypadku wystąpienia niskiego poziomu tiolizacji powierzchniowej należy sprawdzić stabilność roztworu MTPS. Należy zachować ostrożność podczas wstępnego czyszczenia szkiełka podstawowego, aby zapewnić czystą powierzchnię przed obróbką MTPS, a także należy zachować ostrożność, aby zapewnić użycie bezwodnego toluenu podczas reakcji powierzchniowej MTPS (sekcja 4 protokołu). W przypadku układów mikrostudzienkowych powierzchnie nie są tiolowane, a zamiast tego hydrożele przyłączają się poprzez częściowe wypełnienie studzienek hydrożelem, który zakotwicza hydrożel w podłożu krzemowym¹⁷. Jeśli w tym systemie problemem jest odklejanie hydrożelu, w matrycy można wytrawić więcej mikrostudzienek lub innych elementów w mikroskali, aby jeszcze bardziej zakotwiczyć hydrożel w podłożu i promować silniejsze przyczepienie.

Ograniczeniem techniki w obu formatach jest ograniczona stabilność hydrożeli w obecności bakterii. Zauważono, że niektóre bakterie, takie jak A. tumefaciens, mogą rozkładać hydrożel w ciągu 5-7 dni^17,19, co ogranicza czas eksperymentu. Obecnie prowadzone są badania nad mechanizmami degradacji bakterii; Przypuszcza się, że grupy estrowe obecne w monomerach diakrylanowych podlegają hydrolizie i/lub degradacji enzymatycznej za pośrednictwem bakterii, jak zauważono w innych układach¹⁷. Opracowanie bardziej stabilnych chemii hydrożelowej wydłuży czas, w którym bakterie mogą pozostać w hydrożelu i rozszerzy ekran na mikroorganizmy o wolniejszym tempie wzrostu. Drugim ograniczeniem jest to, że w obu formatach odzyskiwanie i ekstrakcja komórek odbywa się w otwartym środowisku, co skutkuje stosunkowo dużymi objętościami ekstrakcji (30-100 μl), które mogą być podatne na zanieczyszczenie zewnętrzne. Dlatego należy zadbać o to, aby zapewnić wystarczającą ilość komórek z docelowych kolonii, jednocześnie minimalizując objętość roztworu ekstrakcyjnego. Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do posiewu i odzysku lub do ekstrakcji materiału DNA, zaobserwowano, że w hydrożelach luzem komórki muszą być hodowane wystarczająco długo, aby osiągnąć średnicę kolonii co najmniej 10 μm. Aby obniżyć wymaganą objętość do ekstrakcji komórek, zaobserwowano, że użycie mikrolitrowej strzykawki i rurki (ryc. 2) było bardziej efektywne niż pipetowanie. Rurki pozwoliły na dokładniejsze pobieranie izolatów z punktu uwalniania, wymagając mniejszej objętości roztworu i zmniejszając ryzyko zanieczyszczenia.

Przyszłe prace obejmują zrozumienie wpływu właściwości mechanicznych hydrożelu na wzrost komórek, ponieważ cechy mechaniczne tych hydrożeli są dobrze kontrolowane przez dobór odpowiednich prekursorów monomerów na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych²⁸, a interakcje mechaniczne prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w zachowaniu bakterii²⁹. Ponieważ materiały hydrożelowe mogą być łatwo włączane do wielu różnych systemów i urządzeń, dalszy rozwój koncentruje się również na integracji tego materiału z układami mikroprzepływowymi. Pozwoliłoby to zredukować roztwór ekstrakcyjny do objętości femtolitrów do pikolitrów, w porównaniu z tradycyjnymi objętościami 30-100 μl, które są obecnie wymagane w formacie otwartego zbioru. Mniejsze objętości roztworu znacznie zmniejszyłyby potencjalne zanieczyszczenie i przesunęłyby podejście w kierunku izolacji i charakterystyki pojedynczych komórek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-merkaptopropylo)trietoksysilan	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
proszek do prania Alconox Alconox		1104
Siarczan amonu	Fisher Chemical	A702-500	Certyfikowany
autoklaw granulowany ACS SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Centrum Zapasów Genetycznych Bacillus	1A1135
Mikroskop pionowy	Brightfield Olympus Corporation	BX51
Chlorek wapnia, bezwodny	Fisher Chemical	C614-500	do dezykatorów Granulki, Wirówka siatkowa 4-20
5702	Eppendorf	5702
Monohydrat kwasu cytrynowego	Sigma-Aldrich	C1909-500G	odczynnik ACS, > 99,0%
D-glukozy ( Dekstroza)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Zestaw tkanek	Qiagen	69504	Zestaw do oczyszczania DNA
DOWSIL 184 silikonowa baza elastomerowa	Dow Silicones Corporation		Temperatura przechowywania: -30-60 ° C
DOWSIL 184 utwardzacz z elastomeru silikonowego	Dow Silicones Corporation		Temperatura przechowywania: < 32 C
Spektrofotometr mikropłytkowy EPOCH2	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Etanol, bezwodny	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand Szkło osłonowe mikroskopu	Fisher Scientific	12540A
Szkiełka mikroskopowe premium Fisherfinest gładkie	Fisher Scientific	12-544-4
Roztwór nadtlenku wodoru	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Zawiera inhibitor, 30% wag. w H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Siarczan magnezu, 7-hydrat	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Metanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Odczynnik ACS, > 99,8%
NanoDrop Jeden spektrofotometr	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Azot, sprężony	Matheson	UN1066
Tlenowy środek do czyszczenia plazmy	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerytrytol tetra(merkaptoetylo) polioksyetylen (4 ramiona-PEG)	NOF Ameryka Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Przechowywać między 15 stopniami; C– 30 &stopni; C
Polidimetylosiloksan (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Szkiełka mikroskopowe premium	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Chlorek sodu	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, granulki (bezwodne)
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, do biologii molekularnej, > 99.0% (T)
Grubościomierz ze stali nierdzewnej	Precision Brand Products	77739
Kwas siarkowy	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluen, bezwodny, 99,8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Bezwodny, > 99,8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooktylo)silan (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptyczny bulion sojowy	Sigma-Aldrich	22092-500G	Do mikrobiologii
Super Nuova Cyfrowe mieszadło z płytą grzejną	Thermo Scientific S131825
Ultradźwiękowy sonograf	Fischer Scientific	FS-110H