Artykuł metodologiczny

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

DOI:

10.3791/63052

⸱

15 października 2021

 ,  ,  ,  , 
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunopeptydomika to rozwijająca się dziedzina, która napędza i kieruje rozwojem szczepionek i immunoterapii. Dokładniej rzecz ujmując, odnosi się do nauki polegającej na badaniu składu peptydów prezentowanych przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i klasy II przy użyciu platform technologicznych spektrometrii mas (MS). Spośród wszystkich etapów procesu pracy immunopeptydomicznego opartego na stwardnieniu rozsianym, przygotowanie próbki jest niezwykle ważne dla uzyskania wysokiej jakości danych o znaczeniu terapeutycznym. W tym miejscu opisano instrukcje krok po kroku, jak wyizolować peptydy związane z MHC klasy I i II poprzez oczyszczanie immunopowinowactwa z próbek kontroli jakości, w szczególności z linii komórkowych myszy (EL4 i A20), a dokładniej ludzi (JY). Różne odczynniki i specyficzne przeciwciała są dokładnie opisane w celu wyizolowania peptydów związanych z MHC z tych linii komórkowych, w tym etapy weryfikacji skuteczności wiązania kulek przeciwciała i wydajności elucji kompleksów MHC-peptyd z kulek. Protokół może być wykorzystany do ustanowienia i standaryzacji przepływu pracy immunopeptydomiki, a także do analizy porównawczej nowych protokołów. Co więcej, protokół stanowi doskonały punkt wyjścia dla wszystkich laików, a także wspiera wewnątrz- i międzylaboratoryjną odtwarzalność procedury przygotowania próbki w immunopeptydomii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady zainteresowanie badaniem repertuaru peptydów związanych z MHC przekroczyło sektor akademicki i dotarło do przemysłu biotechnologicznego i farmaceutycznego. Rzeczywiście, w przypadku nowotworów odkrycie neoantygenów specyficznych dla nowotworu stanowi główny cel badań w sektorze przemysłowym w celu opracowania immunoterapii klinicznych prowadzących do spersonalizowanej onkologii1,2,3. Zasadniczo peptydy związane z MHC są obecne w całym ciele, odzwierciedlają wewnątrzkomórkowy etap komórki i są istotne w różnych stanach chorobowych, takich jak autoimmunizacja, przeszczepy, choroby zakaźne, stany zapalne, rak i alergie1,4. Tak więc peptydy związane z MHC lub ligandy ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) u ludzi mają duże znaczenie medyczne i są zbiorczo określane jako immunopeptydoma5.

MS to potężne analityczne podejście do charakteryzowania immunopeptydome6,7, w tym odkrycie neoantygenów specyficznych dla nowotworu8,9,10,11. Typowy przepływ pracy w celu przeprowadzenia eksperymentu immunopeptydomicznego obejmuje trzy główne kroki: 1) przygotowanie próbki do izolacji peptydów związanych z MHC, 2) akwizycję danych przez MS oraz 3) analizę danych przy użyciu różnych obliczeniowych narzędzi programowych12. Generowanie wysokiej jakości próbek opisanych w tym zobrazowanym protokole ma kluczowe znaczenie dla powodzenia każdego projektu dotyczącego immunopeptydomiki opartej na stwardnieniu rozsianym. Opisany poniżej protokół koncentruje się na izolowaniu peptydów związanych z MHC klasy I i II z dobrze ugruntowanych linii komórkowych, które są odpowiednie do generowania wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Reprezentatywne wyniki z tych linii komórkowych są pokazane w aktualnym protokole.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczony tutaj protokół został zaadaptowany z ustalonych protokołów13,14,15,16,17,18,19,20. Ogólna procedura oczyszczania powinowactwa immunologicznego (IP) peptydów MHC klasy I i II jest zilustrowana na Rysunek 1. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zastosowanych linii komórkowych i przeciwciał.

1. Koraliki sprzęgające się z przeciwciałami (Dzień 1): Sprzężenie przeciwciał z sefarozą kulkami aktywowanymi CNBr

UWAGA: Przygotuj nowe roztwory do każdego nowego eksperymentu. Zapoznaj się z Tabelą materiałów i Tabelą uzupełniającą 1, aby zapoznać się z listą receptur odczynników i roztworów. Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku stosowania nowego przeciwciała należy sprawdzić skuteczność wiązania, pobierając kluczowe porcje (patrz wskazanie OPCJONALNIE) i wykonując barwienie na niebiesko Coomassie SDS-PAGE (Rysunek 2).

  1. Aktywacja kulek sefarozy CNBr
    1. Zważyć 80 mg kulek aktywowanych CNBr sefarozy na próbkę i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Aby ułatwić ponowne zawieszenie wysuszonych kulek, najpierw dodaj 5 ml 1 ml HCl i pipetuj w górę i w dół 5 razy. Następnie napełnij stożkową probówkę dodatkowymi 8,5 ml 1 mM HCl.
    3. Obracaj z prędkością 20 obr./min (obrotów na minutę) przez 30 min przy prędkości obrotowej za pomocą urządzenia obrotowego. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację.
    4. Dodać 500 μl buforu sprzęgającego do osadu kulek i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml i odłożyć na krok 1.2.2.
  2. Sprzężenie przeciwciał z kulkami aktywowanymi CNBr
    1. Przygotować przeciwciało wybrane do izolacji peptydów MHC klasy I lub II w nowej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml, dodając 2 mg przeciwciała (zgodnie ze stężeniem określonym przez producenta). Uzupełnić objętość do 1 ml roztworem buforu sprzęgającego, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml.
    2. Odwirować kulki z etapu 1.1.4 przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
    3. Dodać roztwór przeciwciała do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml zawierającej aktywowane kulki.
    4. (OPCJONALNIE) Weź porcję 18 μL (WEJŚCIE), dodaj 6 μL bufora 4x SDS-PAGE i natychmiast zamroź.
    5. Obracać probówkę mikrowirówki z kroku 1.2.3 z prędkością 20 obr./min przez 120 minut za pomocą urządzenia rotatora. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant.
    6. (OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl supernatantu (przeciwciała niezwiązanego), dodać 6 μl buforu 4x SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.
  3. Blokowanie i mycie koralików sprzężonych z przeciwciałami
    1. Dodać 1 ml 0,2 M glicyny do probówki mikrowirówki zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami z kroku 1.2.5. Obracaj z prędkością 20 obr./min przez 60 minut przy prędkości obrotowej za pomocą urządzenia rotatora.
    2. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
    3. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant.
    4. (OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl supernatantu (przeciwciało niezwiązane, ostatnie płukanie), dodać 6 μl 4x buforu SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.
    5. Dodaj 1 ml PBS do kulek w kroku 1.3.3.
    6. (OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl mieszaniny kulek (kulki sprzężone z przeciwciałem), dodać 6 μl 4x buforu SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.
    7. Przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia tego samego dnia w kroku 2.5.
      UWAGA: Koraliki można przygotować dzień przed immunowychwytywaniem, ale dłuższe przechowywanie nie zostało przetestowane.

2. Liza komórek i wychwytywanie immunologiczne za pomocą sprzężonych kulek przeciwciał (Dzień 1)

UWAGA: Poziom cząsteczek MHC różni się w zależności od typu komórki, a kwantyfikacja cząsteczek MHC/HLA na komórkę jest sugerowana21 (Rysunek 4A). Zalecamy co najmniej 1 x 108 komórek dla każdego adresu IP. Ta liczba komórek odpowiada 6-10 mg białka z komórek JY, EL4 i A20 rozpuszczonych 0,5% buforem Chaps. Aby przygotować granulki komórkowe dla IP, komórki należy zebrać, odwirować i dwukrotnie przemyć 5 ml PBS. Następnie granulki komórkowe można przechowywać w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml lub probówce stożkowej o pojemności 15 ml w temperaturze -80 °C do czasu IP. Należy pamiętać, że IP można wykonać na świeżo zebranych lub zamrożonych granulkach komórek.

  1. Aby wyizolować peptydy MHC klasy I lub II, rozmrozić zamrożony granulat 1 x 108 komórek, ogrzewając dno probówki dłonią. Dodać 500 μl PBS do granulki i pipetować w górę i w dół, aż zawiesina będzie jednorodna.
    UWAGA: W zależności od typu ogniwa, objętość osadu komórkowego może się znacznie różnić. Jeśli 500 μl PBS nie wystarczy do rozpuszczenia osadu komórkowego, użyj więcej PBS, aż komórki łatwo się rozlegną podczas pipetowania w górę iw dół.
  2. Zmierzyć całkowitą objętość osadu zawieszonego w PBS i przenieść do nowej probówki o pojemności 2 ml do mikrowirówki. W razie potrzeby podziel na więcej rurek.
  3. Dodać objętość buforu do lizy komórek (1% buforu chaps w PBS zawierającym inhibitory proteazy, 1 osadka/10 ml buforu) równoważną objętości osadu komórkowego ponownie zawieszonego w PBS zmierzonej w poprzednim kroku. Końcowe stężenie buforu do lizy wynosi 0,5% Chaps.
  4. Obracać z prędkością 10 obr./min przez 60 min w temperaturze 4 °C za pomocą rotatora. Odwirować lizat komórkowy przy 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C z pełnym hamowaniem i przenieść supernatant (zawierający kompleksy MHC-peptydy) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.
  5. Odzyskać kulki sprzężone z przeciwciałami z kroku 1.3.7 przez odwirowanie przy 200 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
  6. Przenieść supernatant lizatu komórkowego opisany w kroku 2.4 do kulek sprzężonych z przeciwciałami i inkubować z rotacją (10 obr./min) przez 14-18 godzin (przez noc) w temperaturze 4 °C za pomocą urządzenia rotatorowego.

3. Elucja peptydów MHC (Dzień 2)

UWAGA: Kolumna polipropylenowa umożliwia elucję kompleksów MHC-peptyd, jednocześnie zatrzymując kulki w kolumnie. W celu oceny proporcji kompleksów MHC-peptydy związanych z kulkami przed i po kwaśnej elucji z 1% TFA (kwas trifluorooctowy), możliwe jest wykonanie western blot z podwielokrotnościami pobranymi na kluczowych etapach protokołu (patrz wskazanie OPCJONALNIE). Western blot pokazany w Rysunek 3 pokazuje wzbogacenie kompleksów MHC-peptyd po kwaśnej elucji z 1% TFA. Brak sygnału w tej frakcji wskazywałby, że etap elucji nie powiódł się. Należy zauważyć, że proporcja niezwiązanych kompleksów peptydów MHC do kulek może być również oceniana równolegle przez western blot przy użyciu podwielokrotności opisanej w kroku 3.1.6.

  1. Elucja kompleksów MHC-peptyd z kulek sprzężonych z przeciwciałami
    1. Zdejmij dolną pokrywę kolumny polipropylenowej, umieść kolumnę na stojaku kolumny polipropylenowej i zainstaluj pod spodem pusty pojemnik, aby zbierać przepływ.
      UWAGA: Wymagana jest jedna kolumna na próbkę.
    2. Przepłukać kolumnę polipropylenową 10 ml buforu A i pozostawić do spłynięcia grawitacyjnie. Jeśli prędkość przepływu płynnej elucji jest zbyt niska, należy dodatkowo przyciąć dolną końcówkę kolumny polipropylenowej.
    3. Odmierz i zbierz mieszaninę kulek i lizatu (~2 ml) z kroku 2.5 i przenieś ją do kolumny polipropylenowej.
    4. (OPCJONALNIE) Pobrać porcję 20 μl (lub 1/100 z całkowitej objętości) do western blotting i natychmiast zamrozić. Frakcja ta odpowiada całkowitym kompleksom MHC-peptydów inkubowanym z kulkami.
    5. Pozwól, aby płynna mieszanina wymyła się grawitacyjnie.
    6. (OPCJONALNIE) Zebrać i zmierzyć przepływ, a następnie pobrać podwielokrotność 20 μl (lub 1/100 z całkowitej objętości) do western blot i natychmiast zamrozić. Frakcja ta reprezentuje resztkowe niezwiązane kompleksy peptydów MHC.
    7. Aby w jak największym stopniu odzyskać mieszaninę kulek i lizatu, należy przepłukać probówkę z kroku 3.1.3 1 ml buforu A i przenieść ją do kolumny polipropylenowej.
    8. Przemyć kulki zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, dodając 10 ml buforu A. Pozwól, aby bufor myjący wymywa się grawitacyjnie.
    9. Powtórzyć etap przemywania z 10 ml buforu B, 10 ml buforu A, a następnie 10 ml buforu C.
    10. Wyjmij kolumnę polipropylenową ze stojaka i umieść ją na nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 2.0 ml. Trzymaj kolumnę i rurkę razem ręką.
    11. Dodać 300 μl 1% TFA do kolumny polipropylenowej i wymieszać kulki, pipetując w górę i w dół 5 razy.
      UWAGA: Kulki zostaną zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, a peptydy związane z MHC zostaną wymyte w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.
    12. Przenieść eluat do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Powtórzyć krok 3.1.11 i połączyć 2 eluaty (eluaty zawierające kompleksy MHC-peptyd powinny odpowiadać całkowitej ilości 600 μl i zostaną użyte w kroku 3.2.4).
    13. (OPCJONALNIE) Zebrać porcję 6 μl (lub 1/100 całkowitej objętości) do western blotting i natychmiast zamrozić. Frakcja ta odpowiada kompleksom MHC-peptydy eluowane z kulek.
  2. Odsalanie i elucja peptydów MHC
    UWAGA: Etapy odsalania i elucji peptydów MHC można wykonać, instalując kolumnę C18 na probówce mikrowirówki o pojemności 2.0 ml. Aby uzyskać lepsze dopasowanie, zainstaluj wyżarzacze dostarczone przez producenta między kolumną C18 a probówką mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. W tym protokole używana jest kolumna C18 o pojemności objętościowej 5-200 μL (6-60 μg). Wszystkie kroki są wykonywane w RT.
    1. Dodać 200 μl metanolu na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Odrzucić przepływ.
    2. Dodać 200 μl 80% ACN (acetonitryl)/0,1% TFA na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.
    3. Dodać 200 μl 0,1% TFA na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.
    4. Załadować 200 μl kompleksów peptydowych MHC z kroku 3.1.12 na kolumnę C18. Wirować przy 1546 x g przez 3 minuty i odrzucić przepływ
      5. .
    5. Powtórz krok 3.2.4 dwukrotnie, aż zostanie załadowany cały wolumin. Należy pamiętać, że peptydy MHC są zatrzymywane w kolumnie C18.
    6. Dodać 200 μl 0,1% TFA do kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.
    7. Przenieść kolumnę C18 do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. Elute peptydy MHC z kolumny C18 przez dodanie 150 μL 28%ACN/0,1%TFA.
    8. Wirować przy 1546 x g przez 3 min.
    9. Przenieś przepływ do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby nie wyrzucić przepływu; zawiera wyizolowane peptydy MHC klasy I lub II.
    10. Powtórzyć kroki 3.2.7-3.2.9 dwukrotnie, uzyskując całkowitą objętość 450 μl.
    11. Zamrozić 450 μl eluatu (oczyszczone peptydy MHC klasy I lub II) w temperaturze -20 °C do czasu analizy próbek za pomocą LC-MSMS.
    12. Przed analizą LC-MS/MS oczyszczone peptydy MHC klasy I lub II z kroku 3.2.11 są odparowywane do sucha za pomocą koncentratora próżniowego z ustawieniami wstępnymi 45 °C przez 2 godziny, poziomem próżni: 100 mTorr i rampą podciśnienia: 5,
      UWAGA: Odparowywanie zamrożonych próbek jest bardzo wydajne. Wysuszone peptydy można ponownie zamrozić do czasu analizy.

4. Identyfikacja peptydów MHC klasy I i II przez LC-MS/MS

UWAGA: Analizuj immunopeptydome MHC klasy I i II za pomocą wysokowydajnego Orbitrapu i kwadrupolowych spektrometrów masowych czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości6. Poniższe informacje mają jedynie charakter orientacyjny, biorąc pod uwagę, że różne istniejące przyrządy do tandemowej spektrometrii mas działają zgodnie z różnymi normami operacyjnymi. Krótki zarys kroków omówiono poniżej:

  1. Wysuszone próbki należy rozpuścić (z etapu 3.2.12) w 50 μl 4% kwasu mrówkowego (FA).
  2. Załaduj trzy wstrzyknięcia po 16 μl na każdą próbkę i oddziel na domowej roboty kolumnie z odwróconymi fazami (średnica wewnętrzna 150 μm na długość 250 mm, Jowisz 3 μm C18 300 A) o nachyleniu od 5%-30% ACN-0,1% FA i natężeniu przepływu 600 nL/min na nanoprzepływowym UHPLC podłączonym do MS.
  3. Uzyskaj każde pełne widmo MS w rozdzielczości 120000, AGC 4 x 105 z trybem automatycznym dla czasu wtrysku i widm za pomocą tandem-MS (MS-MS) na najliczniej występujących wielokrotnie naładowanych jonach prekursorowych dla maksymalnie 3 s.
    UWAGA: Eksperymenty Tandem-MS są przeprowadzane przy użyciu dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD) przy energii zderzenia 30%, rozdzielczości 30 000, AGC 1,5 x 10,5 i czasie wtrysku 300 ms.
  4. Przetwarzaj pliki danych z trzech wstrzyknięć/próbki za pomocą oprogramowania do analizy proteomicznej LC-MS/MS (np. PEAKS X) przy użyciu baz danych myszy i ludzi (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Wybierz "Nieokreślone trawienie enzymatyczne" dla parametru enzymu oraz 10 ppm i 0,01 Da dla tolerancji masy odpowiednio dla jonów prekursorowych i fragmentacyjnych.
    UWAGA: Zmiennymi modyfikacjami są deamidacja (NQ) i utlenianie (M). Wszystkie inne parametry wyszukiwania są wartościami domyślnymi. Końcowe listy peptydów są filtrowane przy użyciu ALC wynoszącego 80% i ze wskaźnikiem fałszywych wykryć (FDR) wynoszącym 1% przy użyciu oprogramowania do analizy proteomicznej LC-MS/MS.

5. Wizualizacja danych immunopeptydomicznych

UWAGA: Jakość danych immunopeptydomicznych generowanych przez SM może być oceniana na wiele sposobów, jak ostatnio opisano22,23. Do wizualizacji danych i oceny ich ogólnej jakości, składu i specyficzności MHC można użyć narzędzia programowego MhcVizPipe (MVP).

  1. Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami i powiązaną dokumentacją, aby zainstalować i uruchomić oprogramowanie MVP dostępne na stronie Caron Lab GitHub 24.
    UWAGA: MVP zapewnia szybki i skonsolidowany wgląd w jakość, skład i swoistość próbki MHC. MVP równolegle wykorzystuje sprawdzone algorytmy immunopeptydomiczne (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 i GibbsCluster27) i generuje zorganizowane i łatwe do zrozumienia raporty w formacie HTML (HyperText Markup Language). Raporty są w pełni przenośne i można je przeglądać na dowolnym komputerze z nowoczesną przeglądarką internetową. Zobacz Dane uzupełniające 1-4, aby zapoznać się z przykładami raportów HTML.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny proces izolowania kompleksów MHC-peptydowych do analizy immunopeptydomów przez MS jest zilustrowany w Rysunek 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki weryfikacji skuteczności wiązania kulek przez przeciwciało (Rysunek 2) (przy użyciu przeciwciała anty-H2Kb Y3) oraz skuteczność elucji kompleksów peptydowych MHC z kulek (Rysunek 3) (przy użyciu przeciwciała anty-HLA-ABC W6/32). Testy kwantyfikacyjne oparte na cytometrii przepływowej 21 zastosowano również do pomiaru bezwzględnej liczby cząsteczek MHC klasy I na komórkę EL4 (H2Kb i H2Db) i komórkę JY (HLA-ABC), jak pokazano na Rysunek 4A.

Wewnątrz- i międzyosobnicza powtarzalność wyników przy użyciu obecnego protokołu jest pokazana w Rysunek 4B-E. Reprezentatywne wyniki przedstawiono dla peptydów MHC klasy I zidentyfikowanych z 1 x 108 komórek EL4 i 1 x 108 komórek JY. Wyniki zostały wygenerowane przez dwóch różnych członków laboratorium (Użytkownik 1 i Użytkownik 2). Dla użytkownika 1 średnia liczba peptydów specyficznych dla MHCI wykrytych w komórkach EL4 i JY wynosiła odpowiednio 1341 i 6361; dla Użytkownika 2, odpowiednio 1933 i 7238 (Rysunek 4B,D). Średni współczynnik zmienności (CV) dla liczby peptydów wykrytych w trzech różnych kontrpróbach/eksperymentach biologicznych waha się od 1,9% do 11% (Rysunek 4B,D). Chociaż CV dla liczby peptydów wykrytych w trzech różnych eksperymentach było stosunkowo niewielkie, tożsamość peptydów różniła się znacznie (Rysunek 4C,E). Rzeczywiście, reprezentatywne diagramy Venna pokazują, że odsetek peptydów, które zostały wykryte w sposób powtarzalny w trzech kontrpróbach biologicznych, wahał się od 39% (Użytkownik 2, komórki EL4) do 63% (Użytkownik 1, komórki JY) (Rysunek 4C, E i Tabela Uzupełniająca 2).

Mapy cieplne wygenerowane przez oprogramowanie MVP pokazują przewidywaną siłę wiązania MHC zidentyfikowanych peptydów za pomocą narzędzi pakietu NetMHCpan25,26,28. Dwie opcje procedury GibbsCluster, które są określane jako "Unsupervised GibbsCluster" i "Allel-Specific GibbsCluster", są również wykonywane przez MVP w celu wyodrębnienia motywów wiążących peptyd MHC. Należy pamiętać, że MVP ma ograniczenia; jego głównym celem nie jest ekstrakcja motywów specyficznych dla alleli i opisywanie peptydów w bardzo dokładny sposób, ale raczej zapewnienie widoku z lotu ptaka na ogólną jakość, skład i specyficzność MHC próbek.

Dla mysich peptydów MHC klasy I (H2Db i H2Kb) w komórkach EL4 (Rysunek 5A; górne panele i Dane uzupełniające 1), reprezentatywna mapa cieplna pokazuje, że 89% wszystkich wykrytych peptydów 8-12-merowych jest przewidzianych jako silne spoiwa (SB: NetMHCpan %Rank <0,5) lub słabe spoiwa (WB: NetMHCpan %Rank <2) dla H2Db lub H2Kb Cząsteczek. Klastry sekwencji wygenerowane z peptydów 8-12-merowych są zgodne z zgłoszonymi logotypami dla H2Db (asparagina w P5 i leucyna w P9) i H2Kb (fenyloalanina w P5 i leucyna w P8) (Rysunek 5)29. Warto wspomnieć, że trzeci motyw dominujący (histydyna w P7 i leucyna w P9), a także dodatkowe motywy "artefakty" można zaobserwować przy użyciu przeciwciała M1 (Dane uzupełniające 1). W rzeczywistości wiadomo, że przeciwciało M1 reaguje krzyżowo z nieklasyczną cząsteczką Qa2, a zatem peptydy związane z Qa2 są również wykrywane przez MS (dane uzupełniające 1). Tutaj, dla uproszczenia, Rysunek 5 skupia się na pokazaniu dobrze znanych motywów wiązania peptydów dla dwóch klasycznych alleli H2b (tj. H2Db lub H2Kb) wyrażonych w komórkach EL4.

Dla ludzkich peptydów HLA klasy I (HLA-ABC) w komórkach JY (Rysunek 5A; dolne panele i Dane Uzupełniające 2), reprezentatywna mapa cieplna pokazuje, że 97% wszystkich wykrytych peptydów 8-12-merowych to SB lub WB dla HLA-A*0201, -B*0702 lub -C*0702. Peptydy pogrupowano w celu uwidocznienia motywów wiążących peptydy dla HLA-A*0201 i -B*0702. Motyw wiązania dla HLA-C*0702 nie jest pokazany w Rysunek 5A, ponieważ allel C*0702 ma stosunkowo niski poziom ekspresji. W związku z tym wyizolowano i zidentyfikowano zbyt mało peptydów C*0702, aby wygenerować reprezentatywny motyw C*0702. Zwróć uwagę, że motyw C*0702 można zwizualizować w innych badaniach30,31,32 lub na stronie NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33.

Dla ludzkich peptydów HLA klasy II (HLA-DR) w komórkach JY (Rysunek 5B; górne panele i dane uzupełniające S3), reprezentatywna mapa cieplna pokazuje, że przewiduje się, że 70% wszystkich wykrytych peptydów 9-22-merowych to SB lub WB dla HLA-DRB1*0404 i -DRB1*1301. Pokazano motywy wiązania peptydów dla tych dwóch alleli (Rysunek 5B). Zauważ, że pokazane tutaj motywy wiążące peptydy mogą nie być w pełnej zgodności z ostatnio zgłoszonymi logotypami dla HLA-DRB1*0404 i -DRB1*130134. Ta rozbieżność podkreśla obecną niezdolność MVP/NetMHCpan do precyzyjnego opisywania peptydów do alleli HLA klasy II, które są mniej scharakteryzowane, takich jak HLA-DRB1*0404 i -DRB1*1301 ulegające ekspresji w komórkach JY. Dodatkowe informacje na temat motywów wiążących peptydy klasy II można znaleźć w innych badaniach34,35 oraz na stronie NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36.

Na koniec, dla mysich peptydów MHC klasy II (H2-IAd i H2-IEd) w komórkach A20 (Rysunek 5B; dolne panele i Dane uzupełniające 4), reprezentatywna mapa cieplna pokazuje, że 87% wszystkich wykrytych peptydów 9-22-merowych jest przewidzianych jako SB lub WB dla H2-IAd lub H2-IEd. Motywy wiążące peptydy dla tych dwóch alleli są zgodne z zgłoszonymi logos37.

Kompletne raporty HTML generowane przez oprogramowanie MVP w celu oceny ogólnej jakości i specyficzności MHC próbek są dostępne w Danych uzupełniających 1-4.

Schemat przepływu pracy izolacji peptydów MHC; Analiza LC-MS/MS; wychwytywanie immunologiczne; wizualizacja danych.
Rysunek 1: Schemat pełnej procedury izolacji peptydów MHC klasy I i II. (A-B) 100 milionów komórek jest granulowanych i poddanych lizie z 0,5% buforem Chaps. (C) Lizat komórkowy jest odwirowywany, a supernatant dodawany jest do kulek sefarozy CNBr sprzężonych wcześniej z pożądanym przeciwciałem i (D) inkubowany przez 14-18 godzin w temperaturze 4 °C. (E) Po wychwyceniu immunologicznym kulki przenosi się do kolumny polipropylenowej i przemywa, a kompleksy MHC-peptyd eluuje się 1% roztworem TFA. (F) Peptydy są odsalane i eluowane przy użyciu kolumny C18. (G) Następnie peptydy są suszone próżniowo i analizowane za pomocą tandemowej spektrometrii mas. (H) Jakość wyizolowanych peptydów MHC klasy I i II można ocenić na podstawie podtypów HLA przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania MhcVizPipe. Figura utworzona za pomocą BioRender.com (NT22ZL8QSL). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wynik elektroforezy; Wiązanie anty-H2Kb; żel białkowy z ciężkimi, lekkimi łańcuchami; Widoczne znaczniki kDa.
Rysunek 2: Barwienie żelem Coomassie w celu śledzenia skuteczności wiązania przeciwciał z sefarozą aktywowanymi kulkami CNBr. Podwielokrotności o równoważnych objętościach załadowano do 12% żelu SDS-PAGE, a następnie zabarwiono na niebiesko Coomassie: kulki + przeciwciało przed sprzęgnięciem (1), niezwiązane przeciwciało po etapie sprzęgania (2), supernatant po ostatnim płukaniu po sprzęgnięciu (3) i kulki sprzężone z przeciwciałem (4). Skuteczność wiązania ilustruje znaczny spadek intensywności barwienia sygnału lekkich i ciężkich łańcuchów H2Kb, gdy kulki są kowalencyjnie związane (tor 4) z kulkami CNBr w porównaniu z przeciwciałem przed sprzężeniem (tor 1). Rysunek został przedrukowany i zaadaptowany z bioRxiv38. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Western blot z ciężkim łańcuchem HLA-ABC (33-44 kDa) z zastosowaniem anty-HLA-ABC; Kompleksy peptydowe MHC.
Rysunek 3: Western blot do śledzenia kompleksów MHC-peptide po kwaśnej elucji z kulek aktywowanych CNBr sprzężonych z przeciwciałami. Podwielokrotności pobrane z kroków wskazanych w protokole (1/100 całkowitej zmierzonej objętości) załadowano na 12% żel SDS-PAGE i przeniesiono na membranę nitrocelulozową: Kulki + lizat po wychwyceniu immunologicznym i ostatnim płukaniu (A); supernatant ostatniego płukania (B) i kompleksy peptydów MHC wymyte z kulek (C). Silny sygnał detekcji kompleksów MHC-peptyd w (C) przy użyciu przeciwciała łańcucha ciężkiego anty-HLA-ABC (Abcam, #ab 70328, 1:5000) potwierdził izolację kompleksów MHC-peptyd po elucji kwasowej. Należy zauważyć, że możliwe jest oszacowanie proporcji kompleksów peptydowych MHC, które nie zostały wychwycone przez kulki sprzężone z przeciwciałami, zbierając przepływ z kroku 3.1.6. Do western blot można dodać podwielokrotność (nie pokazano na tym żelu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe i diagramy Venna przedstawiające ilości ligandów peptydowych w analizie komórek mysich i ludzkich.
Rysunek 4: Identyfikacja peptydów MHC klasy I z komórek JY i EL4. (A) Histogram przedstawiający bezwzględną liczbę cząsteczek H2Db i H2Kb na powierzchni komórki na komórkę EL4 oraz cząsteczek HLA-ABC na komórkę JY. Oznaczanie ilościowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Średnią i błąd standardowy średniej uzyskano z trzech kontrprób biologicznych. (B, D) Histogram przedstawiający średnią liczbę i odchylenie standardowe średniej peptydów MHC klasy I zidentyfikowanych przez dwóch niezależnych użytkowników (USER_1 [U1] i USER_2 [U2]). Pokazano średnią liczbę i odchylenie standardowe średniej peptydów MHC klasy I wykrytych w mysich komórkach EL4 (B) i ludzkich komórkach JY (D). Wskazano współczynniki zmienności (CV) dla trzech niezależnych kontrprób biologicznych. (C, E) Diagramy Venna przedstawiające liczbę peptydów, które zostały powtarzalnie wykryte w komórkach EL4 (C) i JY (E) przez dwóch niezależnych użytkowników (U1 i U2) w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych. Rysunek 4A został przedrukowany i zaadaptowany z bioRxiv38. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza wiązania peptydów MHC klasy I/II, wykres słupkowy i logo sekwencji, porównanie gatunków EL4/JY A20.
Rysunek 5: Wizualizacja danych immunopeptydomicznych za pomocą narzędzia MVP. Analiza danych mysich i ludzkich (A) peptydów MHC klasy I i (B) MHC klasy II. Pokazano reprezentatywne mapy cieplne powinowactwa do wiązania (lewe panele) i motywy wiązania peptydów (prawe panele). Kolory map cieplnych reprezentują powinowactwo powiązania MHC przewidywane przez NetMHCpan 4.1 (%rank). Silne spoiwa są czerwone (%ranga <0.5), słabe spoiwa są niebieskie (%ranga <2), a niewiążące są żółte (%ranga >2). Proporcja (%) peptydów 8-12mer (A) i 9-22mer peptydów (B), które są SB lub WB, jest podana w nawiasach. Motywy wiążące peptydy zostały wygenerowane przez MVP przy użyciu opcji "Cluster Gibbsa specyficzny dla alleli". Te reprezentatywne wyniki uzyskano z 1 x 108 komórek i przy użyciu następujących przeciwciał i linii komórkowych: przeciwciało M1 i komórki EL4 dla mysich peptydów MHC klasy I; przeciwciało W6/32 i komórki JY dla ludzkich peptydów MHC klasy I; przeciwciało M5 i komórki A20 dla mysich peptydów MHC klasy II; Przeciwciało L243 i komórki JY dla ludzkich peptydów MHC klasy II. Zapoznaj się z danymi uzupełniającymi 1-4, aby uzyskać dostęp do pełnych raportów HTML generowanych przez oprogramowanie MVP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dane uzupełniające 1-4: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dane uzupełniające 1: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów, które zostały wyizolowane z 1 x 108 komórek EL4 przy użyciu przeciwciała M1. Pokazano trzy powtórzenia biologiczne. Ten raport jest powiązany z Rysunek 4 i Rysunek 5 i reprezentatywne peptydy są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 2.

Dane uzupełniające 2: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów, które zostały wyizolowane z komórek 1 x10 8 JY przy użyciu przeciwciała W6/32. Pokazane są trzy biologiczne replate'y. Ten raport jest powiązany z Rysunek 4 i Rysunek 5, a reprezentatywne peptydy są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 2.

Dane uzupełniające 3: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów, które zostały wyizolowane z komórek 1 x 108 JY przy użyciu przeciwciała L243. Ten raport jest powiązany z Rysunek 5, a reprezentatywne peptydy są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 2.

Dane uzupełniające 4: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów, które zostały wyizolowane z komórek 1 x 108 A20 przy użyciu przeciwciała M5. Ten raport jest powiązany z Rysunek 5, a reprezentatywne peptydy są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 2.

Tabela uzupełniająca 1: Lista. Opisano receptury dla wszystkich stosowanych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Reprezentatywne listy peptydów związanych z H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR i H2-IAd/IEd. Poniższa tabela zawiera wykazy reprezentatywnych peptydów MHC klasy I i II wyizolowanych odpowiednio z mysich linii komórkowych EL4 i A20 oraz HLA klasy I i II z ludzkiej linii komórkowej JY. Dane te zostały zdeponowane na ProteomeXchange (PXD028633). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Zestawy danych użyte w tym manuskrypcie zostały zdeponowane na ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie mysie linie komórkowe (EL4 i A20), jedna ludzka linia komórkowa (JY) i pięć komercyjnie dostępnych przeciwciał [M1 (anty-H2Db/Kb), Y3 (anty-H2Kb), M5 (anty-H2-IAd/IEd), W6/32 (anty-HLA-ABC) i L243 (anty-HLA-DR)] zostały przetestowane i zwalidowane w kontekście tego protokołu i dostarczają wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Dostępne są inne przeciwciała anty-HLA (np. anty-HLA-A2 BB7.2), ale nie zostały tutaj przetestowane. Należy zauważyć, że przeciwciało W6/32 jest szeroko stosowane i jest najbardziej znanym przeciwciałem w tej dziedzinie; umożliwia izolację peptydów prezentowanych przez wszystkie cząsteczki HLA-ABC u ludzi i był wcześniej zgłaszany przez laboratoria eksperckie do pracy z różnych źródeł biologicznych, takich jak świeże lub mrożone tkanki 8,39, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej i komórki jednojądrzaste szpiku kostnego40, biopsje41, ksenografty41,42, autopsje43 i próbki osocza44,45.

Przygotowanie świeżych roztworów, które są stosowane w całym protokole, ma kluczowe znaczenie. W szczególności stosowanie świeżych roztworów kwasowych w szklanych butelkach ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia późniejszego zanieczyszczenia próbek analizowanych przez MS. Ponadto, gdy protokół jest wykonywany po raz pierwszy i/lub z nowym przeciwciałem, ważne jest, aby ocenić, czy przeciwciało jest rzeczywiście sprzężone z kulkami CNBr Sepharose za pomocą niebieskiego żelu Coomassie. Etapy płukania kulek sprzężonych z przeciwciałami po immunowychwytywaniu kompleksów MHC-peptyd mają również kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia peptydów innych niż MHC. Wreszcie, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wyrzucić eluatów po elucji kompleksów MHC-peptyd z 1% TFA i elucji peptydów z kolumny C18 z ACN28%/0,1% FA.

Istniejące protokoły dostępne w literaturze opisują dodatkowe etapy dalszego oczyszczania peptydów na końcu procedury izolacji, np. frakcjonowanie peptydów różnymi metodami14,46 lub ultrafiltrację przy użyciu filtrów 10-30 kDa13,47. Obecny protokół nie zawiera szczegółowych informacji na temat tych dodatkowych kroków i jest wystarczający do zapewnienia wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Jednak takie kroki mogą być rozważane przez osoby niebędące ekspertami w celu modyfikacji i rozwiązywania problemów w celu dalszej optymalizacji procedury izolacji peptydów.

Rodzaj kulek i rodzaj kwaśnego buforu elucyjnego, które są używane do elucji kompleksów MHC z kulek, można również zmodyfikować w celu rozwiązywania problemów 13,14,15,16,17,18,19. W związku z tym kulki aktywowane sefarozą CNBr są na ogół dobrym punktem wyjścia, ponieważ są stosunkowo niedrogie, a ponadto wykazują elastyczność w zakresie wiązania z różnymi typami przeciwciał. W obecnym protokole wykazano, że kulki aktywowane sefarozą CNBr działają stosunkowo dobrze przy użyciu pięciu różnych dostępnych na rynku przeciwciał (tj. M1, Y3, W6/32, L243 i M5). Oprócz kulek aktywowanych sefarozą CNBr, kulki Protein A lub G lub A/G sepharose 4 Fast Flow są również łatwe w obsłudze i chociaż są stosunkowo droższe, mogą generować podobne wyniki. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest powinowactwo przeciwciała do białka A lub G. Co więcej, kulki magnetyczne sefarozy są również bardzo łatwe w użyciu, ale są stosunkowo drogie. Niezależnie od rodzaju kulek wybranych przez osoby niebędące ekspertami, zachęca się do zbierania podwielokrotności na krytycznych etapach protokołu i wykonywania niebieskich żeli SDS-PAGE barwionych Coomassie w celu śledzenia skuteczności wiązania przeciwciała z kulkami, jak pokazano na rysunku 2.

Innym ważnym czynnikiem wpływającym na skuteczność izolacji peptydów MHC jest rodzaj kwaśnego buforu elucyjnego używanego do izolacji kompleksów MHC-peptyd z kulek. Zgłaszano różne, w tym 0,1%, 1% lub 10% TFA, 0,2% FA i 10% kwas octowy. 1% TFA był buforem elucyjnym działającym dla wszystkich badanych przeciwciał. Etap ten można również prześledzić za pomocą western blot w stosunku do cząsteczek MHC używanych do wychwytywania peptydów MHC, jak pokazano na rysunku 3.

Wszystkie zawierające acetonitryl (ACN) i/lub kwas trifluorooctowy (TFA) są agresywne i mogą prowadzić do zanieczyszczenia próbki substancjami drobnocząsteczkowymi i polimerowymi, takimi jak plastyfikatory w kontakcie z tworzywem sztucznym. Aby uniknąć takich problemów, wszystkie roztwory zawierające rozpuszczalnik organiczny i/lub tłuszcz tłuszczowy są codziennie przygotowywane świeże i przechowywane w szklanej butelce do czasu użycia. Większość kroków jest wykonywana w plastikowej tubie Protein LoBind. Rurki te są specjalnie zaprojektowane do proteomiki i są wykonane z najwyższej jakości pierwotnego polipropylenu wolnego od biocydów, plastyfikatorów i lateksu. Produkowane są również ze zoptymalizowanych, wypolerowanych na wysoki połysk form bez użycia środków poślizgowych. Te środki ostrożności są ważne do rozważenia, aby umożliwić generowanie wysokiej jakości danych immunopeptydomowych.

Przeciwciało jest ważnym ograniczeniem izolacji peptydów związanych z MHC. Przeciwciało W6/32 umożliwia izolację peptydów prezentowanych przez wszystkie cząsteczki HLA-ABC klasy I u ludzi i jest najczęściej stosowanym i uznanym przeciwciałem w tej dziedzinie. Typowanie HLA w wysokiej rozdzielczości niescharakteryzowanych ludzkich linii komórkowych lub próbek biologicznych nie jest konieczne po zastosowaniu przeciwciała W6/32, niemniej jednak jest zalecane w przypadku niektórych zastosowań w celu ułatwienia interpretacji danych48. Informacje o typowaniu HLA/MHC można również znaleźć w zasobach publicznych dla wielu linii komórkowych i modeli myszy49. Oprócz przeciwciała W6/32, cztery inne przeciwciała (M1, M5, Y3 i L243), które zostały przetestowane i zwalidowane w kontekście tego protokołu, są dostępne na rynku. Z drugiej strony, wiele innych przeciwciał, które zostały zgłoszone w poprzednich badaniach immunopeptydomicznych, nie zostało w dużej mierze przyjętych przez społeczność i nie są dostępne komercyjnie lub są dostępne poprzez hodowlę linii komórkowych hybrydomy, co jest stosunkowo drogie.

Innym ważnym ograniczeniem izolacji peptydów związanych z MHC jest wymagana ilość materiału wyjściowego. Wymagana ilość jest odwrotnie proporcjonalna do poziomu ekspresji cząsteczek MHC na powierzchni komórki, który można określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 4A). Komórki wykazujące wysoki poziom ekspresji cząsteczek MHC (np. komórki dendrytyczne i ogólnie komórki hematopoetyczne) na ogół dostarczają wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Laboratoria eksperckie używają już od 50 milionów komórek50, ale dla osób niebędących ekspertami zaleca się od 100 milionów do 1 miliarda komórek. Zgłoszono również zastosowanie biopsji tkanek (<13 mg)41, ksenoprzeszczepu42,43, autopsji44 i próbki osocza45,46, które nadal stanowią wyzwanie dla laboratoriów niebędących ekspertami. Również całkowita liczba oczekiwanych peptydów związanych z MHC jest dobrze udokumentowana dla ustalonych linii komórkowych (tutaj od ~ 2000 do ~ 10000 peptydów w zależności od użytej linii komórkowej i przeciwciała), ale bezwzględne ilości naturalnie prezentowanych peptydów, które są skutecznie ściągane w dół przez tę technikę, pozostają przedmiotem dyskusji. Rzeczywiście, w poprzednich badaniach szacowano, że skuteczność procedury izolacji jest zależna od peptydów i może wynosić nawet od 0,5% do 2%51. Inne ograniczenia w immunopeptydomikach to powtarzalność metod i niezdolność narzędzi zestawu NetMHCpan do prawidłowego opisywania peptydów do alleli MHC, które są mniej scharakteryzowane. W związku z tym dalszy rozwój i zastosowanie stosunkowo nowych, niezależnych od danych metod akwizycji MS 7,32,52, a także nowych algorytmów grupowania peptydów i przewidywania wiązania peptydów MHC3 1,34,53,54 Oczekuje się, że poprawią odtwarzalność i dokładność adnotacji peptydów w immunopeptydomikach. Immunopeptydomika napotyka inne ograniczenia dotyczące pozyskiwania stwardnienia rozsianego i analizy obliczeniowej peptydów związanych z MHC i są omówione w innym miejscu 1,6,55.

Podczasgdy izolacja peptydów związanych z HLA-ABC z próbek ludzkich przy użyciu przeciwciała W6/32 jest dobrze znana i szeroko stosowana przez wiele grup badawczych, izolacja mysich peptydów związanych z MHC klasy I i II jest stosunkowo mniej znana. W związku z tym potrzebne są solidne protokoły izolacji mysich ligandów MHC. Tutaj zapewniamy protokół zoptymalizowany pod kątem izolacji peptydów MHC klasy I i peptydów MHC klasy II z dwóch linii komórkowych myszy odpowiednio pochodzenia C57BL/6 i BALB/c. W szczególności protokół umożliwia izolację peptydów związanych z H2Kb i H2Db klasy I przy użyciu przeciwciała M1, a także peptydów związanych z H2-IAi H2-IEd klasy II przy użyciu przeciwciała M5. W związku z tym rozpowszechnienie i zastosowanie obecnego protokołu powinno ułatwić podstawowe i translacyjne badania immunopeptydomiczne w różnych modelach mysich.

Protokół może być wykorzystany do ustanowienia i standaryzacji przepływu pracy immunopeptydomiki, a także do analizy porównawczej nowych protokołów. Na przykład, można go dostosować i dalej optymalizować do wykonywania badań przesiewowych immunopeptydomicznych w różnych matrycach biologicznych, od krwi/osocza po świeże lub zamrożone tkanki do FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Ponadto protokół będzie sprzyjał wewnątrz- i międzylaboratoryjnej odtwarzalności procedury przygotowania próbek w immunopeptydomikach i dlatego oczekuje się, że znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych i klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pierre'owi Thibaultowi, Ericowi Bonneilowi, Joëlowi Lanoix, Caroline Côté (Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal) i Anthony'emu Purcellowi (Monash University) za ich wnikliwe komentarze. Prace te były wspierane przez fundusze z Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Fundacji Cole'a, CHU Sainte-Justine oraz Fundacji Charlesa-Bruneau, Kanadyjskiej Fundacji Innowacji, Narodowej Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) oraz Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) (#174924).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa A20ATCCTIB-208mysi limfoblast B
Acetonitryl, LC/MS GradeFisherScientificA955-4
anty-ludzki HLA A, B, C (W6/32) - MHC klasa IBioXcellBE0079
anty-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC klasa IIBioXcellBE0308
anty-mysz H2 (M1/42.3.9.8) - MHC klasa IBioXcellBE0077
anty-mysie H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC klasa IIBioXcellBE00108
anty-mysie H2Kb (Y3) - MHC klasa IBioXcellBE0172
BupH Pakiety soli fizjologicznej buforowane fosforanem (PBS)ThermoFisher28372Zawartość torebki rozpuszczona w końcowej objętości 500 ml wody dejonizowanej (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1- propanosulfonian)EMDMilipore220201-10MG
Cytiviaaktywowana CNBr# 17-0430-01
Linia komórkowa EL4ATCCTIB-39mysi limfoblast T
epTIPS Końcówki LoRetencji, 1000 i mikro; L/EppendorfFisherScientific02-717-352Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji
epTIPS Końcówki LoRetention Tips, 200 µ L/EppendorfFisherScientific02-717-351Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji
Kwas mrówkowy, klasa LC/MSFisherScientificA117-50
GlicynaFisherScientificRDCG0250500
Roztwór kwasu solnegoFisherScientific60-007-11
Linia komórkowa JYSigma Aldrich94022533-1VLUnieśmiertelniona przez EBV linia limfoblastoidów komórek B
Metanol, klasa LC/MSFisherScientificA456-4
Kolumny do chromatografii polipropylenowej (kolumna polipropylenowa)Bio-Rad731-1550określany jako kolumna polipropylenowa w protokole
Inhibitor proteazThermoFisherA329631 granulka na 10 ml buforu do lizy komórek
QifikitDakoK007811-8
Wodorowęglan soduAmresco# 0865-1kg
Chlorek soduFisherScientificMSX04201
Dysk ekstrakcyjny do fazy stałej, kolumna ultramikrospinowa C18Grupa gniazdowaSEMSS18Vpojemność 6– 60 &mikro; g, maksymalna głośność 200 i mikro; Kwas
trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MSFisherScientificPI85183
TrisFisherScientificT395-500
Tris-HClFisherScientific#10812846001
Probówka LoBind 1,5 mL/EppendorfFisherScientificE925000090Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji
Tubka LoBind 2 mL/EppendorfFisherScientific13-698-795Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji
Woda, klasa LC/MSFisherScientificW64
Sepharose

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533(2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661(2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404(2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577(2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516(2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110(2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152(2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157(2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251(2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409(2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111(2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110(2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796(2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080(2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558(2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071(2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893(2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133(2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MHC klasy IIizolacja peptyd woczyszczanie immunoafinitywnelinie kom rkowe myszylinie kom rkowe ludzielucja peptyd wLC MS MS

Powiązane artykuły