Artykuł metodologiczny

Metody hodowli bezpośredniej i pośredniej w badaniu biodegradowalnych materiałów implantologicznych in vitro

DOI:

10.3791/63065

⸱

15 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy trzy metody hodowli bezpośredniej, hodowli bezpośredniej ekspozycji i kultury ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych. Te metody in vitro naśladują różne interakcje komórka-implant in vivo i mogą być stosowane do badania różnych materiałów biodegradowalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, materiały biodegradowalne były intensywnie badane do zastosowań biomedycznych, takich jak implanty ortopedyczne, dentystyczne i czaszkowo-szczękowo-twarzowe. Aby przeprowadzić badania przesiewowe materiałów biodegradowalnych do zastosowań biomedycznych, konieczna jest ocena tych materiałów pod kątem odpowiedzi komórek in vitro, cytokompatybilności i cytotoksyczności. Normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO) są szeroko stosowane w ocenie biomateriałów. Jednak większość norm ISO została pierwotnie ustanowiona w celu oceny cytotoksyczności materiałów nieulegających degradacji, zapewniając w ten sposób ograniczoną wartość dla badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych.

Ten artykuł przedstawia i omawia trzy różne metody hodowli, a mianowicie metodę hodowli bezpośredniej, metodę hodowli bezpośredniej ekspozycji oraz metodę hodowli ekspozycji do oceny cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych, w tym biodegradowalnych polimerów, ceramiki, metali i ich kompozytów, z różnymi typami komórek. Badania wykazały, że metody hodowli wpływają na reakcje komórek na materiały biodegradowalne, ponieważ ich dynamiczna degradacja wywołuje różnice czasoprzestrzenne na granicy faz i w środowisku lokalnym. W szczególności metoda hodowli bezpośredniej ujawnia reakcje komórek osadzonych bezpośrednio na implantach; metoda hodowli z bezpośrednim narażeniem wyjaśnia reakcje ustalonych komórek gospodarza wchodzących w kontakt z implantami; Metoda hodowli ekspozycyjnej ocenia ustalone komórki gospodarza, które nie mają bezpośredniego kontaktu z implantami, ale są pod wpływem zmian w środowisku lokalnym spowodowanych degradacją implantu.

Ten artykuł zawiera przykłady tych trzech metod hodowli do badania cytokompatybilności in vitro biodegradowalnych materiałów implantologicznych i ich interakcji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC). Opisuje również, jak zbierać, przechodzić, hodować, wysiewać, utrwalać, barwić, charakteryzować komórki oraz analizować pożywki i materiały postkulturowe. Metody in vitro opisane w tym artykule naśladują różne scenariusze środowiska in vivo, poszerzając zastosowanie i znaczenie badań cytokompatybilności in vitro różnych biomateriałów do różnych zastosowań biomedycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez dziesięciolecia, materiały biodegradowalne były szeroko badane i wykorzystywane w zastosowaniach biomedycznych, takich jak ortopedyczny1,2, dental3,4, oraz craniomaxillofacial5 zastosowań. W przeciwieństwie do implantów i materiałów trwałych, biodegradowalne metale, ceramika, polimery i ich kompozyty stopniowo rozkładają się w organizmie w czasie w wyniku różnych reakcji chemicznych w środowisku fizjologicznym. Na przykład metale ulegające biodegradacji, takie jak stopy magnezu (Mg)1,6,7 i stopy (Zn)8,9 są obiecującymi materiałami na urządzenia do mocowania kości. Ich biodegradowalność może wyeliminować konieczność wtórnych operacji w celu usunięcia implantów po wygojeniu kości. Biodegradowalna ceramika, taka jak cementy fosforanowo-wapniowe (CPC), wykazała ekscytujący potencjał w leczeniu osteoporotycznych złamań kompresyjnych kręgów w przezskórnej kyfoplastyce10. CPC zapewniają mechaniczne wsparcie dla złamanego trzonu kręgu i stopniowo ulegają degradacji po wygojeniu się złamania.

Biodegradowalne polimery, takie jak niektóre polisacharydy i poliestry, były również szeroko badane pod kątem zastosowań biomedycznych. Na przykład hydrożel chitozanowy jako biodegradowalny polisacharyd wykazał swoje zdolności do zapobiegania infekcjom i regeneracji tkanki skórnej11. Kwas poli-L-mlekowy (PLLA), poli(kwas glikolowy) (PGA) i poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) są szeroko badanymi poliestrami do produkcji porowatych rusztowań 2D lub 3D do zastosowań w inżynierii tkankowej12,13,14. Co więcej, materiały kompozytowe integrują dwie lub więcej faz metali, ceramiki i polimerów, aby zapewnić zaawansowane funkcje dla szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych15,16,17. Na przykład kompozyty PLGA i fosforanu wapnia mogą być używane do wytwarzania biodegradowalnych rusztowań do zastosowań takich jak naprawa ubytków kości czaszki18. Te biodegradowalne rusztowania i implanty mogą wspierać i promować wzrost komórek i tkanek, a następnie stopniowo ulegać degradacji w organizmie w miarę upływu czasu.

Jak pokazano w Tabeli Uzupełniającej 1, różne materiały biodegradowalne mogą mieć różne mechanizmy degradacji, produkty i szybkości. Na przykład stopy magnezu, takie jak Mg-2 % wag. Zn-0,5 % wag. Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19 i Mg-9 wt% Al-1 wt% (AZ91)20, ulegają degradacji w reakcji z wodą, a produkty ich degradacji obejmują głównie jonyMg2+, jony OH-, gazH2 i osadzanie minerałów. Szybkość degradacji metali ulegających biodegradacji różni się w zależności od ich składu, geometrii i środowiska degradacji. Na przykład Cipriano i wsp.19 poinformowali, że druty ZSr41 (Ø1,1 × 15 mm) straciły 85% masy, podczas gdy czyste druty Mg o tej samej geometrii straciły 40% masy po wszczepieniu do kości piszczelowej szczura przez 47 dni. Biodegradowalne materiały ceramiczne, takie jak hydroksyapatyt (HA) i fosforan β-triwapniowy (β-TCP), mogą ulegać degradacji w wyniku rozpuszczania cieczy zewnątrzkomórkowej pod wpływem roztworu lub rozpadać się na małe cząstki, a następnie rozkładać się zarówno w wyniku rozpuszczania cieczy zewnątrzkomórkowej, jak i procesów resorpcji za pośrednictwem komórek. Produkty degradacji tych ceramiki na bazie fosforanu wapnia mogą obejmować jony Ca2+, jony (PO4)3-, jony OH- i depozycje mineralne21. Na szybkość degradacji ceramiki fosforanowo-wapniowej istotny wpływ ma jej struktura krystaliczna. Na przykład Van Blitterswijk i wsp.22 stwierdzili, że kwas hialuronowy z mikroporami 40% obj. nie stracił masy, podczas gdy β-TCP z mikroporami 40% obj. stracił 30 ± 4% masy po wszczepieniu do kości piszczelowych królików przez 3 miesiące. Polimery takie jak PLGA14,23 mogą ulegać degradacji w wyniku hydrolizy wiązań estrowych w obecności wody, a produkty degradacji obejmują głównie kwas mlekowy i glikolowy. W przypadku PLGA 50/50 może minąć jeden miesiąc, a w przypadku PLGA 95/5 kilka miesięcy, aby osiągnąć całkowitą degradację24.

Testy odpowiedzi komórkowej i cytokompatybilności są kluczowe dla oceny i badań przesiewowych tych biodegradowalnych materiałów implantologicznych do zastosowań biomedycznych. Jednak obecne normy Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO), takie jak ISO 10993-5:2009 "Biologiczna ocena wyrobów medycznych - Część 5 Testy cytotoksyczności in vitro", zostały początkowo zaprojektowane do oceny cytotoksyczności nieulegających degradacji biomateriałów, takich jak stopy Ti i stopy Cr-Co in vitro25. W szczególności norma ISO 10993-5:2009 obejmuje jedynie badania cytotoksyczności ekstraktu in vitro, badania bezpośredniego kontaktu i pośredniego kontaktu. W teście ekstraktu ekstrakt przygotowuje się przez zanurzenie próbek w płynach ekstrakcyjnych, takich jak pożywki hodowlane z surowicą i roztworami soli fizjologicznej, w jednym ze standardowych warunków czasu i temperatury. Zebrany ekstrakt lub rozcieńczenie dodaje się następnie do hodowli komórkowej w celu zbadania cytotoksyczności. W przypadku testu bezpośredniego kontaktu bezpośredni kontakt między próbką a komórkami uzyskuje się poprzez umieszczenie badanej próbki na ustalonej (przylegającej) warstwie komórek. W pośrednim badaniu kontaktowym pożywka hodowlana zawierająca surowicę i stopiony agar jest pipetowana w celu pokrycia ustalonych komórek. Próbkę umieszcza się następnie na zestalonej warstwie agaru z filtrem lub bez.

Standardy ISO wykazały pewne ograniczenia, gdy są stosowane do oceny materiałów biodegradowalnych in vitro. W przeciwieństwie do materiałów nieulegających degradacji, zachowania degradacyjne materiałów biodegradowalnych są dynamiczne i mogą się zmieniać w różnym czasie lub w różnych warunkach środowiskowych (np. temperaturze, wilgotności, składzie mediów i typie ogniw). Test ekstraktu ocenia jedynie cytotoksyczność produktów degradacji materiału i nie odzwierciedla dynamicznego procesu degradacji próbki. Zarówno testy kontaktu bezpośredniego, jak i pośredniego zgodnie z normą ISO charakteryzują jedynie interakcje między ustalonymi komórkami a próbkami. Ponadto w badaniu kontaktu pośredniego materiały i komórki znajdują się w różnych mikrośrodowiskach, które nie odzwierciedlają środowiska in vivo i nie uwzględniają dynamicznej degradacji materiałów biodegradowalnych.

Celem tego artykułu jest wprowadzenie i omówienie metod testowania cytokompatybilności dla różnych biodegradowalnych materiałów implantologicznych, aby rozwiązać wyżej wymienione ograniczenia metod opisanych w obecnych normach ISO. Metody przedstawione w tym artykule uwzględniają dynamiczne zachowanie degradacyjne materiałów implantów oraz różne okoliczności interakcji komórka-materiał in vivo. W szczególności w tym artykule przedstawiono trzy metody testowania cytokompatybilności, a mianowicie hodowlę bezpośrednią, kulturę bezpośredniej ekspozycji i kulturę ekspozycji dla różnych materiałów biodegradowalnych, w tym polimerów biodegradowalnych, ceramiki, metali i ich kompozytów do zastosowań w implantach medycznych.

W metodzie hodowli bezpośredniej, komórki zawieszone w pożywce hodowlanej są bezpośrednio umieszczane na próbkach, oceniając w ten sposób interakcje między nowo zasianymi komórkami a implantami. W hodowli z bezpośrednią ekspozycją próbki umieszcza się bezpośrednio na ustalonej warstwie komórkowej, aby naśladować interakcje implantów z ustalonymi komórkami gospodarza w organizmie. W hodowli ekspozycyjnej próbki umieszcza się w odpowiednich wkładkach studzienkowych, a następnie wprowadza do dołków hodowlanych z ustalonymi komórkami, co charakteryzuje reakcje ustalonych komórek na zmiany w środowisku lokalnym wywołane degradacją implantu, gdy nie mają one bezpośredniego kontaktu z implantami. Metody hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją oceniają komórki mające bezpośredni lub pośredni kontakt z materiałami implantów w tej samej hodowli. Kultura ekspozycyjna charakteryzuje komórki mające pośredni kontakt z materiałami implantu w określonej odległości w tej samej studzience.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy opis testów cytokompatybilności dla różnych materiałów biodegradowalnych i ich interakcji z komórkami modelowymi, czyli mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMSC). Protokoły obejmują zbieranie, hodowlę, wysiew, utrwalanie, barwienie i obrazowanie komórek, a także analizy materiałów i pożywek postkulturowych, które mają zastosowanie do różnych biodegradowalnych materiałów implantologicznych i szerokiej gamy typów komórek. Metody te są przydatne do badań przesiewowych materiałów biodegradowalnych do różnych zastosowań biomedycznych pod względem odpowiedzi komórek i cytokompatybilności in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside (UCR) do pobierania komórek i tkanek. 12-tygodniowa samica szczura Sprague-Dawley (SD) jest pokazana na filmie jako przykład. Preferowane są młodsze samice i samce szczurów.

1. Przygotowanie hodowli komórkowej

UWAGA: Trzy metody hodowli opisane w tym artykule mają ogólne zastosowanie do różnych typów komórek, które są przylegające. W tym przypadku BMSC zebrane od szczurów odsadzonych od odsadzonych szczurów zostaną przedstawione jako przykład przygotowania hodowli komórkowych. W zależności od ich znaczenia dla konkretnych zastosowań medycznych, można wykorzystać różne typy komórek, w tym komórki pierwotne pobrane od dawców zwierzęcych lub ludzkich oraz linie komórkowe z banku komórek/tkanek.

  1. Zbieranie BMSC od warchlaków szczurów
    UWAGA: Schemat ideowy w Rysunek 1 pokazuje kroki zbierania BMSC od szczurów odsadzonych.
    1. Poddać eutanazji szczura Sprague Dawley (SD) przez wdychanie CO2 .
    2. Usuń skórę i mięśnie oraz tkanki łączne, aby wyciąć kość udową z uśpionego szczura. Umieść kości udowe w stożkowej probówce (polipropylenowej) o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych. Umieść stożkowe probówki na lodzie do czasu wykonania ekstrakcji komórek.
      UWAGA: Tibia może być również używana do zbierania BMSC. Pożywką do hodowli komórkowych jest zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S).
    3. Przenieść kości na szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odetnij końce kości za pomocą ostrza chirurgicznego i przepłucz szpik kostny do stożkowej probówki (polipropylenowej) o pojemności 50 ml, przemywając jamę szpiku kostnego pożywką do hodowli komórkowych za pomocą strzykawki z igłą 251/2 G.
      UWAGA: Wprowadzić strzykawkę z igłą 18 G do podłoża ze szpikiem kostnym. Powoli i delikatnie nabierz i dozuj pożywkę, aby rozbić duży fragment szpiku, aż nie będzie widocznych aglomeratów komórek/tkanek.
    4. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą filtra 70 μm, a następnie odwirować przy 126 × g (1 000 obr./min) przez 5 minut, aby uzyskać granulki komórek.
    5. Odessać pożywkę sklarowaną nad osadem i uzupełnić 10 ml świeżej pożywki. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
    6. Odpipetować zawiesinę bezpośrednio na wewnętrznym dnie kolby T-75 i dodać pożywkę, aby zwiększyć objętość do 25 ml. Hodować komórki w inkubatorze w standardowym, sterylnym środowisku hodowli komórek (tj. 37 °C, wilgotna atmosfera z 5% CO2 i 95% powietrzem).
    7. Po 3-7 dniach wypłucz nieprzylegające komórki, odsysając stare podłoże i uzupełniając świeżą pożywką. Kontynuuj hodowlę i karmienie komórek świeżą pożywką, aż będą gotowe do przejścia przez komórkę, zamrożenia lub użycia w eksperymencie.
  2. Konserwacja komórek
    1. Regularnie zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych, aby usunąć produkty przemiany materii i uzupełniać składniki odżywcze mniej więcej co drugi dzień, aż komórki będą zlewać się w 90%-100%. Przy 90% zbieganiu, pasażu, zamrażaniu lub użyciu komórek w eksperymencie.
    2. Komórki pasażacyjne
      UWAGA: Pasażowanie, zwane również subkulturą, to termin, który ma zastosowanie, gdy komórki są przenoszone z jednej kultury do drugiej. Świeżo pobrane komórki znajdują się w fazie pasażu 0 (P0). Ilości roztworu kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (trypsyna-EDTA) i pożywki opisane w tym artykule dotyczą kolby T-75.
      1. Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym, aby potwierdzić, że komórki są w 90% zlewne.
      2. Odessać pożywkę z kolby komórkowej.
      3. Dozować 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do kolby za pomocą pipety serologicznej. Delikatnie kołysać kolbą, aby przepłukać komórki PBS; zassać wszystkie PBS.
        UWAGA: Ten krok służy jako dodatkowe płukanie, aby upewnić się, że podczas pasażu nie zostaną przeniesione żadne martwe komórki ani odpady komórkowe.
      4. Dozować 3 ml trypsyny-EDTA do kolby komórkowej bezpośrednio na powierzchnię komórek. Delikatnie kołysz kolbą, aby upewnić się, że cała powierzchnia z komórkami jest pokryta trypsyną-EDTA.
      5. Umieścić kolbę komórkową z trypsyną-EDTA w inkubatorze na 5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek.
      6. Po 5 minutach w inkubatorze sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym, aby upewnić się, że komórki są odłączone. Jeśli niektóre komórki nie zostały odłączone, delikatnie postukaj w bok kolby i ponownie sprawdź kolbę.
      7. Dodać 9 ml świeżej pożywki do kolby komórkowej w celu rozcieńczenia trypsyny-EDTA. Zapewnia to bardziej dostępne białka, z którymi trypsyna-EDTA może się wiązać zamiast lizować komórki.
      8. Odpipetować komórki w pożywce i trypsyno-EDTA i dozować je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki pod ciśnieniem 126 × g (1 000 obr./min) przez 5 minut.
      9. Nie naruszając osadu komórkowego, odessać pożywkę za pomocą trypsyny-EDTA.
      10. Dodać 5-10 ml świeżej pożywki do probówki wirówkowej i delikatnie zawiesić komórki w pożywce za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
      11. Odpipetować komórki zawieszone w pożywce z probówki wirówkowej i podzielić objętość na 2-3 świeże kolby hodowlane. Dodać tyle podłoża, aby całkowita objętość pożywki wynosiła 25 ml dla każdej kolby.
        UWAGA: Współczynnik podziału podczas subhodowli może się różnić w zależności od typów komórek i specyficznych cech wzrostu.
      12. Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym i umieść je z powrotem w inkubatorze.
    3. Zamrażanie komórek
      1. Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym, aby potwierdzić, że komórki są w 90% zlewne.
      2. Powtórz kroki od 1.2.2.2 do 1.2.2.9.
      3. Dodać 900 μl świeżej pożywki do probówki wirówkowej za pomocą mikropipety o pojemności 100-1000 μl. Powoli i delikatnie zawiesić komórki w pożywce za pomocą tej samej mikropipety.
      4. Przenieś zawiesinę komórek o objętości 900 μl do kriowialu. Dodać 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
      5. Tak szybko, jak to możliwe, umieść kriowial w cylindrycznym pojemniku piankowym przeznaczonym do regulacji spadku temperatury (patrz Tabela materiałów). Umieść pojemnik na piankę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    4. Rozmrażanie komórek
      1. Rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej. Weź sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml wypełnioną 5 ml świeżej pożywki, umieść komórki w stożkowej probówce i odwiruj przy 126 × g (1,000 obr./min) przez 5 minut.
      2. Odessać pożywkę zawierającą DMSO.
      3. Dodaj 5-10 ml świeżej pożywki do stożkowej probówki z komórkami o pojemności 15 ml. Powoli i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
      4. Odpipetować komórki zawieszone w podłożu z probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przelać do nowej kolby T-75. Podczas dozowania komórek należy wykonywać ruchy zamiatające, aby rozprowadzić komórki tak równomiernie, jak to możliwe na dnie kolby komórkowej.
      5. Dodać tyle świeżego podłoża, aby całkowita objętość podłoża wynosiła 25 ml dla każdej kolby T-75.
      6. Sprawdzić komórki pod mikroskopem optycznym i umieścić kolbę komórkową z powrotem w inkubatorze.

2. Przygotowanie próbki i sterylizacja

  1. Przygotowanie próbki
    1. Do eksperymentów z hodowlą komórkową opisanych w tym artykule należy używać płytek poddanych działaniu kultur tkankowych, takich jak płytki 6-, 12-, 24-, 48- lub 96-dołkowe. Należy wybrać rodzaj płytek do hodowli tkankowej i objętość pożywki w każdym dołku w oparciu o różne projekty eksperymentalne, takie jak wymiar próbki.
  2. Wysterylizuj lub zdezynfekuj wszystkie próbki ulegające biodegradacji przed hodowlą komórkową.
    UWAGA: Dezynfekcja jest dopuszczalna w badaniach in vitro, gdy próbki są podatne na zmiany chemiczne i/lub powierzchniowe w pewnych warunkach sterylizacji obejmujących wysoką temperaturę, utleniacz i/lub rodniki. Metody sterylizacji lub dezynfekcji dla różnych typów próbek różnią się w zależności od różnych właściwości materiałów, takich jak polimery, metale i ceramika. Proces sterylizacji lub dezynfekcji może obejmować ciepło, gaz, promieniowanie, chemikalia, wysokie ciśnienie lub ich kombinację.
    1. Metale biodegradowalne
      1. Ogólnie rzecz biorąc, należy używać promieniowania ultrafioletowego (UV) do dezynfekcji metali biodegradowalnych w badaniach in vitro.
        UWAGA: Na przykład Zhang i in. poinformowali, że próbki czystego magnezu (Mg) i stopu ZC21 Mg były dezynfekowane pod wpływem promieniowania UV przez 4 godziny, zanim zostały wykorzystane w badaniach komórkowych1. W przypadku badań in vivo próbki muszą być na ogół sterylizowane. W przypadku wielu metali biodegradowalnych, takich jak magnez lub stopy magnezu, należy unikać autoklawowania przy użyciu pary, ponieważ próbki te mogą ulec utlenieniu lub korozji w wodzie6. Naczynie kwarcowe jest zalecane do dezynfekcji UV, ponieważ zapewnia lepszą przezroczystość UV niż większość szklanych i plastikowych.
      2. Próbki stopu Mg sterylizować na sucho w suchym ogniu w piecu lub autoklawie w zakresie temperatur 100-200 °C.
        UWAGA: Ponieważ niektóre stopy metali mogą nadal utleniać się na powierzchni w wysokich temperaturach powietrza, w niektórych przypadkach alternatywą może być promieniowanie o dużej intensywności. Jednak podczas sterylizacji cienkich folii metalicznych należy unikać promieniowania o dużym natężeniu, takiego jak promieniowanie alfa lub gamma. Może powodować przemieszczenie atomów w materiałach, zmieniając mikrostrukturę materiałów.
      3. Użyj sterylizacji tlenkiem etylenu (EtO) jako alternatywnej metody dla metali biodegradowalnych wrażliwych na ciepło i promieniowanie26.
    2. Ceramika biodegradowalna
      1. Ogólnie rzecz biorąc, przed badaniami in vitro należy dezynfekować ceramikę biodegradowalną za pomocą promieniowania UV lub 70% roztworu etanolu.
        UWAGA: Na przykład Liu i in. stwierdzili, że próbki fosforanu wapnia zostały zdezynfekowane poprzez zanurzenie w 70% etanolu przez 1 godzinę i wystawienie na działanie światła UV przez 12 godzin z każdej strony, zanim zostały użyte w testach cytokompatybilności in vitro27.
      2. Używaj autoklawów do sterylizacji ceramiki biodegradowalnej, jeśli wysoka temperatura i para wodna nie uszkadzają ich kompozycji i mikrostruktur.
        UWAGA: Autoklawowanie może mieć wpływ na niektóre materiały ceramiczne. Na przykład przemianę fazową i chropowatość powierzchni stwierdzono, gdy stabilizowaną tlenkiem itru ceramikę cyrkonową sterylizowano w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Ponadto CPC nie mogą być sterylizowane w autoklawie z parą wodną, ponieważ próbki będą reagować z wodą.
      3. Użyj alternatywnych metod sterylizacji, takich jak promieniowanie kobaltu-60 dla wyżej wymienionej ceramiki cyrkonowej stabilizowanej tlenkiem itru i próbek CPC28.
    3. Polimery biodegradowalne
      1. Ogólnie rzecz biorąc, polimery biodegradowalne należy dezynfekować za pomocą promieniowania UV lub 70% etanolu przed użyciem ich w badaniach komórkowych in vitro.
        UWAGA: Niektóre polimery mogą ulegać przemianom chemicznym pod wpływem promieniowania UV. Do sterylizacji można zastosować obróbkę promieniowaniem gamma, taką jak promieniowanie kobaltu-60. Na przykład, proszki skrobiowe były sterylizowane pod promieniowaniem kobaltu-60 przed wykorzystaniem w badaniach komórkowych in vitro29.
      2. Autoklaw materiałów polimerowych, które są odporne na wysoką temperaturę i wilgoć.
        UWAGA: Na przykład polimery, takie jak polipropylen, mogą być sterylizowane w autoklawie, ponieważ tolerują temperatury autoklawowania (tj. 121-134 °C). Niektóre polimery, takie jak polikaprolakton (PCL), nie mogą być sterylizowane w autoklawie ze względu na ich stosunkowo niską temperaturę topnienia (tj. około 60 °C)30.
      3. Użyj gazu EtO do sterylizacji materiałów polimerowych wrażliwych na sterylizację termiczną lub radiacyjną.

3. Metody hodowli komórkowej

  1. Metody hodowli bezpośredniej
    UWAGA: Schemat ideowy w Rysunek 2A pokazuje etapy metody hodowli bezpośredniej. W tym artykule BMSC hodowano na płytce pochodzącej z Mg umieszczonej w studzienkach 12-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej jako przykład ilustrujący metodę hodowli.
    1. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w krokach 1.2.2.1-1.2.2.10, aby uzyskać zawiesinę komórek.
    2. Użyj 90% kolby zlewającej się, aby określić stężenie komórek w zawiesinie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową przy użyciu świeżej pożywki do zalecanego stężenia komórek potrzebnego do badania na komórkach in vitro.
      UWAGA: Gęstość wysiewu komórek jest określana przez projekt eksperymentalny. Na przykład gęstość komórek wynosząca 2 000-40 000 komórek/cm2 została wykorzystana w różnych badaniach komórkowych z materiałami biodegradowalnymi.
    3. Umieścić próbki (płytka Mg) na środku 12-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Kolejno przepłucz płytki hodowlane 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na interesujące nas próbki.
    4. Hodować komórki w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny
      UWAGA: Czas hodowli może być dłuższy lub krótszy niż 24 godziny, w zależności od projektu doświadczalnego.
  2. Kultury ekspozycji bezpośredniej
    UWAGA: Schemat ideowy w Rysunek 2B pokazuje etapy hodowli ekspozycji bezpośredniej.
    1. Jak opisano w krokach 3.1.1 i 3.1.2, przygotować zawiesinę komórek o wymaganych stężeniach komórek w oparciu o projekt doświadczalny dla różnych typów komórek i zamierzonych zastosowań.
    2. Przepłukać płytki hodowlane kolejno 2 ml PBS i 2 ml DMEM, aby skalibrować ciśnienie osmotyczne w sterylnych warunkach. Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Hodować komórki w nawilżanym inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórek przez 24 godziny lub do momentu, gdy komórki osiągną 50-80% konfluencji.
      UWAGA: Poziom konfluencji komórek może się różnić w zależności od typu komórki i projektu eksperymentalnego.
    3. Po 24 godzinach przepłukać komórki w płytce studzienki PBS za pomocą pipety w celu usunięcia pływających martwych komórek.
    4. Zdezynfekowane lub wysterylizowane próbki należy umieścić bezpośrednio na przylegających komórkach. Dodaj 3 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.
    5. Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny
      UWAGA: Czas hodowli może być dłuższy lub krótszy niż 24 godziny, w zależności od projektu doświadczalnego.
  3. Kultury ekspozycji
    UWAGA: Schemat ideowy w Rysunek 2C przedstawia etapy metody hodowli ekspozycji.
    1. Początkowe etapy przygotowania komórek są takie same jak w przypadku hodowli ekspozycyjnej. Jak opisano w krokach 3.1.1 i 3.1.2, przygotować zawiesinę komórek z żądanymi komórkami. Podobnie jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2, należy wysiać komórki w płytce dołka o żądanej gęstości i hodować je w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez 24 godziny.
    2. Po 24 godzinach przepłukać przylegające komórki PBS w celu usunięcia pływających martwych komórek, a następnie dodać 3 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.
    3. Następnie umieść próbki we wkładkach studzienkowych o wielkości porów membrany 0,4 μm i umieść wkładki studzienkowe z próbkami w każdej studzience z komórkami.
    4. Hodować komórki w standardowych warunkach hodowli komórkowej przez kolejne 24 godziny
      UWAGA: Czas hodowli może być dłuższy lub krótszy niż 24 godziny, w zależności od projektu doświadczalnego.

4. Postkulturowa charakterystyka komórek

UWAGA: Dla hodowli bezpośredniej i hodowli bezpośredniej ekspozycji, utrwalaj, barw, obrazuj i analizuj komórki przylegające zarówno do płytek studzienek, jak i próbek. W celu hodowli ekspozycyjnej przeanalizuj komórki przylegające do płytek studzienkowych.

  1. Utrwalanie komórek
    1. Zebrać pożywkę postkulturową z każdej studzienki do odpowiedniej stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu dalszej analizy. Zebrać wszystkie próbki po hodowli do dalszej analizy.
    2. Przepłukać komórki przylegające zarówno do próbek, jak i na płytkach studzienkowych 3 razy za pomocą PBS.
    3. Dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA, 10% neutralnej buforowanej formaliny) do każdej płytki dołka. Umieść pokrywkę z powrotem na płytce studzienki i pozwól PFA zareagować przez 20 minut.
    4. Po 20 minutach odessać PFA i przelać go do butelki na odpady. Przepłukać płytkę studzienki 3 razy za pomocą PBS w celu usunięcia PFA i przenieść odpady do butelki na odpady.
  2. Barwienie komórek
    1. Przygotować zapasy robocze środków barwiących zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Na przykład falloidyna Alexa Fluor 488 służy do barwienia F-aktyny, a 4′, 6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) służy do barwienia jąder komórkowych. Czas barwienia może ulec skróceniu, jeśli próbki ulegną szybkiej degradacji w roztworach barwiących.
    2. Dodaj 200-400 μl rozcieńczonego środka barwiącego Alexa Fluor 488 Phalloidin do każdej studzienki, aby pokryć komórki na płytce dołka i próbkę. Owiń płytkę studzienkową folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło, i pozwól Alexa Fluor 488 Phalloidin reagować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zbierz środek barwiący Alexa Fluor 488 Phalloidin i dozuj go do odpowiedniej butelki na odpady. Opłucz płytkę studzienki 3 razy za pomocą PBS, aby usunąć nadmiar Alexa Fluor 488 Phalloidin, a następnie dozuj zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady.
    4. Dodaj 200-400 μl rozcieńczonego DAPI do każdego dołka, aby pokryć komórki w studzience i na próbce. Zawiń płytkę studzienki w folię aluminiową i pozwól DAPI reagować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Zbierz DAPI i przelej go do odpowiedniej butelki na odpady. Opłucz płytkę studzienki 3 razy za pomocą PBS, aby usunąć DAPI, a następnie przelej zużyty PBS do odpowiedniej butelki na odpady.
  3. Obrazowanie komórek
    1. Po barwieniu zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli to możliwe, oprócz obrazów fluorescencyjnych należy wykonywać obrazy komórek z kontrastem fazowym. Należy zobrazować komórki na próbkach ulegających biodegradacji tak szybko, jak to możliwe lub natychmiast po barwieniu, aby uniknąć lub ograniczyć możliwe zmiany spowodowane ciągłą degradacją próbek. Po utrwaleniu należy przechowywać komórki w płytkach studzienkowych w roztworze buforowym w temperaturze 2–8 °C i obrazować komórki tak szybko, jak to możliwe po barwieniu, aby uniknąć utraty sygnałów fluorescencyjnych.
    2. W przypadku hodowli bezpośredniej i hodowli z bezpośrednią ekspozycją należy zobrazować i ocenić dwa typy komórek: (1) komórki na próbkach (w bezpośrednim kontakcie z próbkami) i (2) komórki przylegające do płytki studzienki otaczającej próbki (pośredni kontakt z próbkami), jak pokazano na Rysunek 3A.
    3. W przypadku hodowli ekspozycyjnej, jak pokazano na Rysunek 3B, użyj przewodnika obrazowego podczas wykonywania obrazów fluorescencyjnych komórek, aby określić, czy odpowiedź komórki byłaby inna w odpowiedzi na dynamiczny gradient degradacji próbek. Zobrazuj i przeanalizuj oddzielnie komórki znajdujące się w obszarze pierścienia wewnętrznego (3,5 mm od środka) i pierścienia zewnętrznego (7 mm od środka).
      UWAGA: Prowadnica obrazu służy do definiowania odległości między komórkami a próbkami.
    4. Dla każdej próbki i studzienki na płytkach hodowlanych należy losowo wykonać co najmniej pięć zdjęć z każdego obszaru zainteresowania, w którym komórki stykają się bezpośrednio lub pośrednio z próbkami w określonej odległości.
  4. Analiza obrazu
    1. W przypadku wszystkich obrazów komórek uzyskanych w kroku 4.3 określ ilościowo morfologię komórki, mierząc obszar rozprzestrzeniania się komórek i współczynnik proporcji za pomocą oprogramowania, takiego jak ImageJ, do analizy obrazu.
    2. Policz liczbę komórek w każdym obszarze obrazu. Obliczyć gęstość adhezji komórek w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu jako liczbę komórek na jednostkę powierzchni.

5. Postkulturowe analizy mediów i próbek

  1. Zmierz pH pożywki postkulturowej.
    UWAGA: Niektóre próbki zmieniają wartość pH pożywki podczas ich degradacji. Na przykład metale ulegające biodegradacji, takie jak stopy magnezu, zwykle zwiększają wartość pH podłoża ze względu na ich degradację31. W przeciwieństwie do tego, polimery biodegradowalne, takie jak PLGA, często obniżają wartość pH podłoża podczas degradacji32. Pomiar wartości pH pożywki postkulturowej może wskazywać na degradację tych próbek in vitro.
    1. Przed utrwaleniem komórek należy pobrać pożywkę po hodowli, jak w kroku 4.1.1.
    2. Zmierzyć wartości pH pożywki postkulturowej w każdym dołku natychmiast po pobraniu, używając wstępnie skalibrowanego pH-metru.
      UWAGA: pH podłoża może z czasem ulegać zmianom ze względu na warunki środowiskowe, takie jak poziom CO2 i temperatura, które należy wziąć pod uwagę.
  2. Przeanalizuj składy pożywki pod kątem degradacji próbek biodegradowalnych. W przypadku niektórych próbek, które powodują zmianę koloru pożywki, należy zmierzyć wartość gęstości optycznej (OD) pożywki postkulturowej za pomocą spektrofotometru lub czytnika mikropłytek, aby określić zachowanie degradacji. Alternatywnie, użyj spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej (UV-VIS) i spektroskopii całkowitego odbicia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR-ATR) do analizy produktów degradacji w pożywce postkulturowej.
    UWAGA: Pomiar produktów degradacji w pożywce po hodowli jest cenny dla zrozumienia zachowania próbek podczas degradacji. Jednym z najczęstszych podejść jest pomiar interesujących jonów w pożywce postkulturowej za pomocą indukcyjnie sprzężonego plazmowo-optycznego spektrometru emisyjnego (ICP-OES). ICP-OES może być stosowany do pomiaru składu pożywki postkulturowej metali i ceramiki, ale może nie być odpowiedni dla polimerów. Polimery zwykle składają się z węgla, wodoru i tlenu, a dokładne określenie ilościowe tych pierwiastków jest trudne dla ICP-OES.
    1. Postępując zgodnie z krokiem 5.1.2 dotyczącym pomiaru pH, zebrać i rozcieńczyć pożywkę, stosując pożądany współczynnik rozcieńczenia w celu uzyskania optymalnych pomiarów stężeń jonów.
    2. Zmierz stężenia jonów będących przedmiotem zainteresowania w pożywce postkulturowej za pomocą ICP-OES.
  3. Analiza postkulturowa próbek
    UWAGA: Po badaniu komórkowym in vitro próbki biodegradowalne mogą zmieniać wymiary, masę, morfologię powierzchni, mikrostrukturę i skład. Analiza postkulturowa próbek pomaga zrozumieć mechanizm degradacji próbek.
    1. Po hodowli komórkowej należy wykonać zdjęcia próbek, aby pokazać możliwe zmiany w wymiarach próbki, kolorze, morfologii i innych widocznych cechach.
    2. Wysuszyć lub odwodnić próbki postkulturowe i zmierzyć masę, wymiar i objętość próbki, aby określić ilościowo wszelkie zmiany masy, wymiaru i objętości.
    3. Użyj skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), aby scharakteryzować mikrostrukturę i morfologię próbek. Użyj spektroskopii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX) i dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), aby scharakteryzować skład i fazę produktów degradacji na próbkach. Użyj FTIR-ATR, aby wykryć wiązanie chemiczne na powierzchniach próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne obrazy fluorescencyjne BMSC w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu przy użyciu różnych metod hodowli. Rysunek 4A,B pokazuje BMSC w warunkach bezpośredniego i pośredniego kontaktu po tej samej 24-godzinnej bezpośredniej hodowli ze stopami magnezu ZC211. Stopy ZC21 składają się z 97,5% magnezu, 2% i 0,5% wapnia. Ogniwa, które nie mają bezpośredniego kontaktu z próbkami stopu ZC21, rozprze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne metody hodowli komórkowych mogą być stosowane do oceny cytokompatybilności in vitro biomateriałów będących przedmiotem zainteresowania w różnych aspektach zastosowań in vivo. W artykule przedstawiono trzy metody hodowli in vitro , tj. hodowlę bezpośrednią, hodowlę bezpośrednią i hodowlę ekspozycji, w celu naśladowania różnych scenariuszy in vivo , w których biodegradowalne materiały implantologiczne są używane wewnątrz ludzkiego ciała. Metoda hodowli bezpośredniej jest stosowana ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają wsparcie finansowe ze strony U.S. National Science Foundation (nagroda NSF CBET 1512764 i NSF PIRE 1545852), National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) oraz UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). Autorzy doceniają Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside za wykorzystanie SEM/EDS oraz dr Perry Cheung za użycie instrumentów XRD. Autorzy doceniają również Thanh Vy Nguyen i Queenie Xu za częściową redakcję. Autorzy chcieliby również podziękować Cindy Lee za nagranie narracji do filmu. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym artykule są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation lub National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta serologiczna 10 mlVWR490019-704
12-dołkowe płytki poddane kulturom tkankowymThermo Fisher Scientific353043
Probówka stożkowa 15 ml (polipropylen)VWR89039-666
Igła 18 GBD305196
25½ Igła GBD305122
4&,6-diamidyn-2-dilekan fenyloindolu (DAPI)InvitrogenD3571
50 ml probówka stożkowa (polipropylen)VWR89039-658
70 μ m nylonowe sitkoFisher Scientific50-105-0135
Alexa Mąka 488-falloidynaTechnologie życiaA12379
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLABCONCOKlasa II, typ A2
WirówkaEppendorfRotor F-35-6-30, Wirówka5430
Przezroczyste okrągłe naczynie z topionego kwarcuTechnologia AdValueFQ-4085
Inkubator CO2SANYOMCO-19AIC
Pojemnik zamrażarki CoolCellCorning432000przeznaczony do regulacji spadku temperatury
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX oprogramowanie analityczneOxford InstrumentsAztecSynergy
Spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse Ti
FormaldehydVWR100496-496
HemacytometrHausser Scientific3520
ImageJ oprogramowanieNational Institutes of Health i Laboratorium Oprzyrządowania Optycznego i Obliczeniowego (LOCI, University of Wisconsin)
Opcyjna spektrometria emisyjna z plazmą sprzężoną indukcyjnie
(ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
VWRVistaVision
Penicylina/streptomycyna (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH-metrVWRmodel SB70P
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)VWR97062-730
Elektroniczny mikroskop skaningowy (SEM)OstrzeFEI Nova NanoSEM 450
VWR76353-728
Kolby do hodowli tkankowychVWRT-75, MSPP-90076
Wkładki TranswellCorning3460
Roztwór kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (Trypsin-EDTA)Sigma-AldrichT4049
Przyrząd do dyfrakcji rentgenowskiej (XRD)PANalyticalEmpireum serii 2
Pojemnik piankowy SH30910Mikroskop optyczny chirurgiczne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212(2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614(2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410(2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904(2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018(2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157(2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , The Ohio State University. (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytokompatybilno in vitrometoda bezpo redniej hodowlimetoda hodowli z ekspozycjkom rki macierzyste szpiku kostnegog sto adhezji kom rekskaningowa mikroskopia elektronowaspektroskopia rentgenowska z dyspersj energiist enie jon w magnezustandardy ISO dla biomateria w

Powiązane artykuły