Artykuł metodologiczny

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63068

⸱

14 października 2021

 ,  , 
1Laboratory of Axon Growth and Regeneration, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

Streszczenie

Podczas rozwoju neuronów, aksony poruszają się po środowisku korowym, aby dotrzeć do swoich końcowych miejsc docelowych i ustanowić połączenia synaptyczne. Stożki wzrostu - struktury czuciowe znajdujące się na dystalnych końcach rozwijających się aksonów - wykonują ten proces. Badanie struktury i dynamiki stożka wzrostu ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozwoju aksonów i interakcji z otaczającym ośrodkowym układem nerwowym (OUN), które umożliwiają mu tworzenie obwodów nerwowych. Ma to zasadnicze znaczenie przy opracowywaniu metod reintegracji aksonów z obwodami neuronalnymi po urazie w badaniach podstawowych i kontekstach przedklinicznych. Dotychczasowe ogólne zrozumienie dynamiki stożków wzrostu opiera się przede wszystkim na badaniach neuronów hodowanych w dwóch wymiarach (2D). Chociaż niewątpliwie ma to fundamentalne znaczenie dla obecnej wiedzy na temat dynamiki strukturalnej stożków wzrostu i reakcji na bodźce, badania 2D błędnie przedstawiają fizjologiczne trójwymiarowe (3D) środowisko, z którym spotykają się stożki wzrostu neuronów w nienaruszonej tkance OUN. Niedawno zastosowano żele kolagenowe w celu przezwyciężenia niektórych z tych ograniczeń, umożliwiając badanie rozwoju neuronów w 3D. Jednak zarówno syntetyczne środowiska 2D, jak i 3D nie mają wskazówek sygnalizacyjnych w tkance OUN, które kierują rozszerzaniem i odnajdywaniem ścieżki rozwijających się aksonów. Protokół ten zapewnia metodę badania aksonów i stożków wzrostu przy użyciu organotypowych wycinków mózgu, w których rozwijające się aksony napotykają fizjologicznie istotne wskazówki fizyczne i chemiczne. Łącząc precyzyjnie dostrojoną elektroporację in utero i ex utero w celu rzadkiego dostarczania fluorescencyjnych reporterów wraz z mikroskopią superrozdzielczą, protokół ten przedstawia metodologiczną linię produkcyjną do wizualizacji dynamiki aksonów i stożków wzrostu in situ. Ponadto dołączono szczegółowy opis zestawu narzędzi do analizy danych z obrazowania długoterminowego i żywych komórek.

Wprowadzenie

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, które reprezentują podstawową jednostkę obliczeniową w układzie nerwowym. Odbierają i emitują informacje, które opierają się na podziałach na miejsca wejściowe i wyjściowe: odpowiednio dendryty i aksony1. Podczas tworzenia aksony rozszerzają się, poruszając się w niewiarygodnie złożonym środowisku, aby dotrzeć do celu. Nawigacja w aksonach jest kierowana przez stożek wzrostu, strukturę czuciową znajdującą się na końcu rozwijającego się aksonu. Stożek wzrostu jest odpowiedzialny za wykrywanie sygnałów środowiskowych i przekształcanie ich w dynamiczną reorganizację przestrzenną swojego cytoszkieletu2,3. Powstałe w ten sposób reakcje morfomechaniczne instruują stożek wzrostu, aby wysunął się lub wycofał z sygnału wyzwalającego, co prowadzi do określonych manewrów aksonów.

Obecne zrozumienie dynamiki rozciągania aksonów i wzrostu wynika z badań oceniających wzrost aksonów na dwuwymiarowych (2D) podłożach2,4,5,6,7. Te pionierskie badania zidentyfikowały wyrafinowane wzajemne oddziaływanie między stożkami wzrostu a podłożami wzrostu i ujawniły uderzające różnice w zależności od cech podłoża, takich jak przyczepność i sztywność8,9. Na podstawie tych spostrzeżeń postawiono hipotezę, że zewnątrzkomórkowe sygnały środowiskowe dyktują wzrost aksonów, przy czym cytoszkielet stożka wzrostu wykonuje ten wzrost2,10,11,12. Warto zauważyć, że neurony mogą rozszerzać aksony w podłożach nieadhezyjnych (np. polilizyna, poliornityna)13. Co więcej, sztywność podłoża może wpływać na szybkość wzrostu aksonów niezależnie od kompleksów adhezyjnych komórek8. W związku z tym badanie dynamiki stożków wzrostu w samych substratach 2D nie może dokładnie modelować równowagi sił, które powstają w wyniku interakcji aksonalnych stożków wzrostu z fizjologicznie istotnymi środowiskami trójwymiarowymi (3D), takimi jak te występujące in vivo.

Aby przezwyciężyć ograniczenia testów 2D, wzrost aksonów i dynamika stożków wzrostu zostały zbadane w matrycach 3D8,9. Macierze te stanowią bardziej fizjologiczny kontekst, a jednocześnie pozwalają na badanie wewnętrznych mechanizmów wzrostu aksonów w komórce. Umożliwia badanie stożka wzrostu w sposób jednokomórkowy w różnych warunkach i zabiegach farmakologicznych9. W takich środowiskach 3D aksony wykazywały wyraźną dynamikę cytoszkieletu i rosły szybciej niż te obserwowane w neuronach hodowanych w 2D9. Te eleganckie badania wykazały wpływ dodatkowego wymiaru na reorganizację cytoszkieletu stożka wzrostu, a w konsekwencji na jego zachowanie.

Pomimo oczywistych zalet prezentowanych przez matryce 3D w porównaniu z powierzchniami 2D we wspieraniu natywnego rozwoju neuronów i wzrostu aksonów, pozostają one uproszczonym syntetycznym rusztowaniem, które nie jest w stanie odzwierciedlić złożoności dynamiki obserwowanej w tkance ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W tym przypadku dostarczanie plazmidów reporterowych za pomocą elektroporacji ex utero i in utero połączono z organotypową hodowlą plastrów mózgu i obrazowaniem in situ w super rozdzielczości w celu analizy dynamiki stożków wzrostu w kontekście fizjologicznym. Metodologia ta pozwala na wizualizację rozwijających się aksonów przy jednoczesnym doświadczaniu trójwymiarowości środowisk in vivo i złożoności ich składu fizykochemicznego. Na koniec opisano przyjazne dla użytkownika procedury pomiaru wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu przy użyciu powszechnie licencjonowanego i publicznie dostępnego oprogramowania.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne z odpowiednimi przepisami instytucjonalnymi i federalnymi. W protokole tym wykorzystano embrionalne samice myszy C57BL / 6JRj w dniu 15,5 i 12,5 (E15,5 i E12,5). Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt Krajowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).

1. Przygotowanie plazmidów do iniekcji

  1. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu Maxiprep bez endotoksyn zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Wymieszaj wybrane DNA w żądanym stężeniu (Tabela 1) i 10% roztwór Fast Green (patrz Tabela materiałów), aby zobrazować dostarczanie mieszaniny DNA do komór mózgu.
    UWAGA: Specyficzne plazmidy użyto do rzadkiego znakowania neuronów korowych (Figura 1A), nitkowatych struktur aktyny (F-aktyna) w stożku wzrostu (Figura 1B) oraz podwójnego znakowania stożków wzrostu w tej samej korze (Figura 1C). Wszystkie plazmidy (Tabela 1) użyte w tym protokole zostały zdeponowane w Addgene (patrz Tabela Materiałów).
  3. Przygotować szklane kapilary za pomocą ściągacza do elektrod kapilarnych zgodnie z następującym programem: ciśnienie: 500, ciepło: 800, ciągnięcie: 30 i prędkość: 40.
  4. Załaduj 15 μl mieszanki DNA/Fast Green do każdej szklanej kapilary za pomocą końcówek do pipet z mikroładowarką.
    UWAGA: Upewnij się, że nie tworzą się bąbelki.
  5. Przechowuj naczynia włosowate wypełnione DNA w 10-centymetrowym naczyniu z kawałkiem plasteliny w poprzek średnicy naczynia. Kapilary można ładować i przechowywać w temperaturze 4 °C na dzień przed eksperymentem. Uszczelnij tylny koniec kapilary elastyczną folią, aby zapobiec wysuszeniu.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj buforowany roztwór soli Hanka uzupełniony glukozą (HBSS-G).
    1. Dodaj 0,5% 20% bulionu glukozy do butelki 1x HBSS. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. W celu ekstrakcji zarodków należy na krótko przed pobraniem zarodków bąbelkować roztwór HBSS-G z karbogenem (95%O2 i 5%CO2) przy użyciu bulgoczącego kamienia.
  2. Rozwiązanie Slice Media
    1. Świeże plastry zawierające Neurobasal 1x, 5% surowicę końską, 5% surowicę płodową cielęcą, suplement B27 1:50, suplement L-glutaminy 1:400, penicylinę-streptomycynę 1:200 i suplement Neuropan-2 1:100 (przy pH = 7,3), należy przygotować w sterylnych warunkach (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotuj 3 cm naczynia z 1 ml pożywki w plastrach każde. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 35 °C z 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem w celu zrównoważenia pH podłoża poprzez wymianę gazową.
      UWAGA: Równowaga pH pożywki jest spowodowana zakwaszeniem pożywki przez CO2 z inkubatora. Nośniki Slice można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  3. Roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (3%)
    1. Odważ żądaną ilość proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia i rozpuść w odpowiedniej objętości 1x HBSS-G w szklanej butelce. Potrzeba około 7 ml roztworu agarozy na mózg.
    2. Umieść butelkę w kuchence mikrofalowej na 2-3 minuty, z luźno umieszczoną nakrętką i potrząsaj co 10-20 s.
    3. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku umieścić butelkę w łaźni wodnej lub kąpieli perełkowej nastawionej na 37 °C co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem, aby agaroza ostygła.
      UWAGA: Zaleca się dwukrotne podgrzanie agarozy w ciągu 15 minut, aby upewnić się, że proszek agarozy się rozpuścił. Ma to kluczowe znaczenie dla prawidłowego przylegania agarozy do tkanki mózgowej. Do pomiaru temperatury roztworu agarozy podczas osadzania mózgów należy użyć termometru, upewniając się, że wynosi ona 37-40 °C. Mózgi zwierząt w różnym wieku mają różną sztywność. Zaleca się badanie zakresu stężeń agarozy w celu znalezienia jednorodności między tkanką a agarozą.
    4. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
    5. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,2% azydkiem sodu (PBS-NaN3).
      UWAGA: Roztwory opisane w krokach 2.4-2.5 są przeznaczone do stosowania w późniejszym etapie immunohistochemii.

3. Przygotowanie stanowiska chirurgicznego

  1. Oczyść stanowisko operacyjne 70%-96% etanolem i umieść podkład operacyjny na powierzchni stanowiska.
  2. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, spłukując je 70%-96% etanolem, a następnie sterylizując na sucho w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
  3. Wyczyść platynowe elektrody pęsety (patrz tabela materiałów) 70%-96% etanolu przed podłączeniem do generatora impulsów.
  4. Włóż szklaną kapilę wypełnioną DNA/Fast Green do uchwytu kapilary. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie odłamać końcówkę kapilary za pomocą drobnych nożyczek i przebadać przepływ roztworu w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną lub wodą.
    UWAGA: Rysunek 2A,B pokazuje konfigurację stanowiska chirurgicznego i narzędzia używane do elektroporacji ex utero (EUE) i elektroporacji in utero (IUE).
  5. W przypadku IUE należy rozgrzać roztwór soli fizjologicznej do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.

4. Ekstrakcja zarodków

  1. Umieść ciężarną mysz w komorze induktora znieczulenia z 5% izofluranem, aż mysz zostanie głęboko znieczulona. Potwierdź znieczulenie przez brak odruchu wycofania pedału.
  2. Przenieś mysz do podkładu operacyjnego i utrzymuj izofluran na poziomie 1,5%-2% przez stożek nosowy.
  3. Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  4. Ogol brzuch myszy, a następnie użyj gazy nasączonej etanolem o stężeniu 70%-96%, aby usunąć ogolone włosy. Oczyść obszar za pomocą betadyny.
  5. Za pomocą sterylnych małych nożyczek chirurgicznych wykonaj 2 cm nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej brzucha, a następnie 1,5 cm nacięcie mięśni.
    UWAGA: Wielkość nacięcia zależy od wielkości zarodka. Rzeczywiście, większe zarodki będą wymagały większego nacięcia, aby umożliwić ich ekstrakcję.
  6. Wytnij otwór w środku gazy wystarczająco szeroki, aby zmieścił się w nacięciu skóry (o średnicy ~2 cm), nasącz go ciepłą solą fizjologiczną i umieść wokół otworu brzusznego.
  7. Wyciągnij oba rogi macicy za pomocą wacika nasączonego ciepłą solą fizjologiczną lub za pomocą kleszczy, ostrożnie chwytając przestrzenie między zarodkami, aby je wyciągnąć. Umieść zarodki na mokrej gazie (Rysunek 2C).
    UWAGA: Nawet niewielkie uszkodzenie naczyń krwionośnych i naczyń włosowatych wokół rogów macicy prawdopodobnie spowoduje obfite krwawienie. Dlatego należy zawsze unikać bezpośredniego dotykania tych unaczynionych obszarów.
  8. Rozetnij worek maciczny i usuń każdy zarodek (Rysunek 2D).
  9. Eutanazja każdego zarodka natychmiast po ekstrakcji za pomocą zstępującego cięcia ukośnego, zapewniającego całkowite przecięcie rdzenia kręgowego (Rysunek 2E).
  10. Umieścić zarodki w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym HBSS-G na lodzie.
    UWAGA: Unika się ścinania zarodka, aby zapobiec wyciekowi DNA/mieszanki Fast Green z mózgu i ułatwić ustawienie zarodka w posiadaczu (patrz elektroporacja ex utero, krok 5).
  11. Złożyć ofiarę matki natychmiast po ekstrakcji zarodków, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: W tym przypadku matka jest poddawana eutanazji pod narkozą, aby oszczędzić jej dalszego bólu lub cierpienia po zabiegu, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez ustawę o dobrostanie zwierząt Państwowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV).

5. Elektroporacja ex utero (EUE)

  1. Weź zarodek i umieść go w uchwycie.
    UWAGA: Nacięta końcówka pipety o pojemności 1 ml przymocowana do końca skrobaka do komórek służy jako uchwyt na zarodki. Istotne jest, aby podczas zabiegu trzymać ramiona zarodków na zewnątrz końcówki, aby zapobiec ich wsunięciu się do końcówki (Rysunek 2F-I). Średnicę końcówki pipety można łatwo regulować, aby pomieścić zarodki o różnych rozmiarach. Wytnij drugą końcówkę na długość, w której średnica końcówki odpowiada rozmiarowi zarodka i użyj jej jako wkładki adaptera do wspomnianego powyżej uchwytu.
  2. Ostrożnie wprowadzić szklaną kapilarnę wypełnioną DNA/Fast Green przez czaszkę zarodka do komory bocznej i wstrzyknąć 2-3 μl mieszanki plazmidu DNA (Rysunek 1A,B; Tabela 1) do każdej komory (Rysunek 2F).
    UWAGA: Użyj szwów lambdoidalnych i strzałkowych jako wskazówki do lokalizacji wstrzyknięcia DNA. Szwy lambdoidalne i strzałkowe to włókniste stawy łączące płytkę kostną czaszki. Pierwsza z nich łączy kość ciemieniową z kością potyliczną, a druga łączy dwie kości ciemieniowe.
  3. Trzymaj głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby wycelować w żądany obszar mózgu (w tym przypadku kąt 60 °), z katodą skierowaną w stronę, w której planowany jest transfer DNA (Rysunek 2G-H).
  4. Zastosuj pięć impulsów przy napięciu 30 mV w odstępie 1 s i czasie trwania 50 ms za pomocą generatora impulsów o fali prostokątnej.
    UWAGA: Należy pamiętać, że mózgi w EUE doświadczają bardziej efektywnego pola elektrycznego niż te w IUE. W związku z tym, przy danym stężeniu DNA, EUE skutkuje wyższą efektywnością transferu DNA niż IUE, a stężenia DNA muszą być odpowiednio dostosowane.
  5. Jeśli pożądana jest obustronna elektroporacja, powtórz kroki 5.3-5.4 z katodą i anodą odzwierciedlającymi poprzednią pozycję, aby celować w korę przeciwległą.
    UWAGA: Ponieważ do obu komór wstrzyknięto DNA, kora obu półkul była celowana.
  6. Umieść elektropostowany zarodek w 6-centymetrowym naczyniu zawierającym lodowaty HBSS-G. Powtórzyć kroki 5.1-5.6 dla wszystkich wymaganych zarodków.

6. Elektroporacja in utero (IUE)

  1. Ciężarnej myszy wstrzyknąć środek przeciwbólowy; 50 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) (patrz tabela materiałów) podskórnie, 20 minut przed zabiegiem.
  2. Wykonaj kroki 4.1-4.8 z rozdziału dotyczącego ekstrakcji zarodków.
    UWAGA: Unikaj niepotrzebnego wystawiania zarodków na działanie promieni słonecznych, przykrywając je sterylną gazą nasączoną ciepłą solą fizjologiczną.
  3. Za pomocą opuszków palców delikatnie obróć zarodek wewnątrz macicy, aż zostaną zlokalizowane szwy lambdoidalne i strzałkowe (Ryc. 2J). Ostrożnie wprowadź naczynia włosowate DNA/Fast Green glass przez ścianę macicy i czaszkę zarodka do komory bocznej i wstrzyknij 2-3 μl mieszanki plazmidu DNA (Rysunek 1A, C) do jednej lub obu komór zgodnie z życzeniem ( Rysunek 2K-L).
    UWAGA: Nadmierny nacisk palca na rogi macicy może prowadzić do zapadnięcia się worka owodniowego.
  4. Trzymaj głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby celować w żądany obszar mózgu (w tym przypadku pod kątem 60°), z katodą skierowaną w stronę, w której ma być przeprowadzony transfer DNA. Unikaj ściskania macicy, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się worka owodniowego (Ryc. 2M).
  5. Zastosuj pięć impulsów o napięciu 35 mV w odstępie 600 ms i czasie trwania 50 ms za pomocą generatora impulsów fali prostokątnej.
  6. Jeśli wstrzyknięto obie komory boczne, powtórz kroki 6,5-6,6 z katodą i anodą odzwierciedlającymi poprzednią pozycję, aby celować w korę przeciwległą
    7. .
  7. Powtórzyć kroki 6.3-6.6 dla wszystkich wymaganych zarodków.
  8. Gdy wszystkie wymagane zarodki zostaną poddane elektroporacji, użyj wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby delikatnie umieścić rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej.
    UWAGA: Dodanie roztworu soli fizjologicznej do jamy otrzewnej pomoże rogom macicy przesunąć się z powrotem na miejsce.
  9. Zszyj nacięcia mięśni i skóry za pomocą materiału do szycia 5-0. Użyj klipsów do szwów, aby zabezpieczyć ranę i zdezynfekować ranę szwową, spryskując ją betadyną (Rysunek 2N-P).
  10. Wstrzyknąć myszowi 200 μl 5% glukozy podskórnie.
  11. Wstrzyknąć myszowi antybiotyk; 50 μl enrofloksacyny (5 mg/kg) podskórnie (patrz tabela materiałów).
  12. Umieść mysz z powrotem w klatce regeneracyjnej i utrzymuj ciepło za pomocą światła ocieplającego dalekiej podczerwieni lub poduszki grzewczej przez co najmniej 20 minut po zabiegu (Rysunek 2Q).
  13. Codziennie monitoruj mysz i wstrzyknij meloksykam po zabiegu w celu złagodzenia bólu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i federalnymi.
  14. Pobrać zarodki 2 dni po zabiegu (tj. E17.5) zgodnie z krokiem 4.

7. Ekstrakcja mózgu i osadzenie w agarozie

UWAGA: Zaleca się wykonanie następujących kroków pod mikroskopem preparacyjnym dla lepszej precyzji. Uniknięcie uszkodzenia mózgu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu.

  1. Ustaw narzędzia do ekstrakcji w sterylnej przestrzeni roboczej pod okapem preparacyjnym (Rysunek 3A).
  2. Oddziel głowę zarodka od reszty ciała za pomocą nożyczek do preparowania.
  3. Napraw głowę, jak pokazano na Rysunek 3C, a następnie usuń skórę i czaszkę, przecinając wzdłuż linii środkowej, zaczynając od podstawy głowy w kierunku nosa (Rysunek 3D).
  4. Obierz skórę i czaszkę z boku, tworząc wystarczająco dużą szczelinę (~1 cm), aby można było wyciąć mózg.
  5. Aby usunąć mózg, włóż zamkniętą końcówkę sterylnych nożyczek preparacyjnych, zaczynając od spodu opuszki węchowej przesuwającej się w kierunku pnia mózgu (Ryc. 3E).
  6. Odetnij pień mózgu i przytnij luźne kawałki opon mózgowych wokół mózgu (Rysunek 3F).
    UWAGA: Luźne opony mózgowe często powodują, że plastry pozostają przyczepione do bloku agarozy po pokrojeniu, co prowadzi do oderwania tkanki od agarozy podczas zbierania plastrów.
  7. Powtórzyć kroki 7.1-7.6 dla wszystkich zarodków i trzymać mózgi na lodzie (najlepiej nie dłużej niż 30 minut) aż do etapu osadzania.
    UWAGA: Poniższe kroki 7.7.1-7.7.4 odnoszą się do ekstrakcji mózgu E12.5.
    1. Odizoluj czubek głowy tuż pod okiem, jak pokazano na Rysunek 3G.
    2. Przetnij skórę i czaszkę na pniu mózgu, podążając za linią przerywaną, jak pokazano na Rysunek 3H, bez usuwania pnia mózgu.
    3. Wykonaj 2-milimetrowe nacięcie skóry i czaszki z tyłu głowy, jak pokazano na Rysunek 3I (patrz rysunki dla jasności).
      UWAGA: To nacięcie zapewnia początkowe punkty chwytania do odklejania warstw skóry i czaszki. Zazwyczaj schodzą jako jedna warstwa. Typowy rozmiar nacięcia wynosi 2 mm, co odpowiada długości krawędzi tnącej zastosowanych nożyczek z mikrosprężyną.
    4. Rozpocznij odklejanie warstw skóry i czaszki, zabezpieczając jedną stronę nacięcia i ostrożnie pociągając drugą. Z taką samą ostrożnością zakończ, odklejając podstawę głowy, aż do uwolnienia mózgu (Rysunek 3J).
      UWAGA: Należy to zrobić z wielką ostrożnością, obserwując, że mózg nie jest ciągnięty wzdłuż warstw tkanki. Naprzemiennie boki, aby usunąć tkankę pokrywającą mózg
      5. .
  8. Wlej ciepłą agarozę (w temperaturze 37-40 °C) do 3 cm naczynia
    9. .
  9. Podnieś mózg za pomocą perforowanej łyżki i usuń nadmiar płynu, wcierając spód łyżki o suchą bibułkę. Umieść mózg w naczyniu z agarozą.
    UWAGA: Konieczne jest usunięcie jak największej ilości płynu z okolic mózgu, aby umożliwić lepsze przyleganie agarozy do tkanki.
  10. Naczynie z płynną agarozą wyłożyć na lód. Za pomocą mniejszej łyżki mieszaj agarozę przez 10 sekund, aby równomiernie ostygła. Manewruj mózgiem do środka naczynia. Umieść mózg poziomo w naczyniu grzbietem do góry, upewniając się, że jest całkowicie pokryty agarozą ze wszystkich kierunków (Rysunek 3K).
    UWAGA: Mózgi często opadają na dno naczynia po umieszczeniu w agarozie; Podnieś mózg za pomocą małej łyżki, aż utworzy się szczelina 1-2 mm pod mózgiem.
  11. Powtórz kroki 7.8-7.10 dla wszystkich mózgów.
  12. Po polimeryzacji agarozy dodaj 500 μl HBSS-G na blok agarozy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie przykryj naczynie lodem.
    UWAGA: Trzymaj próbkę na lodzie przez 5 minut przed podziałem na sekcje, aby temperatura mózgu osiągnęła 4 °C.

8. Organotypowa kultura plastrów

UWAGA: Oczyść wibratom i otaczające go powierzchnie etanolem o stężeniu 70%-96%, aby uniknąć zanieczyszczenia plasterków. Konfiguracja stacji roboczej z wibratomem (patrz tabela materiałów) jest pokazana w Rysunek 3B.

  1. Napełnij tackę buforową wibratomu zimnym HBSS-G, a zewnętrzną tacę lodem, aby utrzymać HBSS-G w niskiej temperaturze przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Stale zaopatrywać HBSS-G w tacę buforową w karbogen za pomocą bulgoczącego kamienia.
  3. Używając świeżego ostrza, wykonaj duże cięcie (~2 x 2 cm) wokół mózgu i usuń blok agarozy zawierający mózg, z wystarczającą ilością otaczającej agarozy, aby przyciąć agarozę do małego prostokątnego bloku.
    UWAGA: Ten krok umożliwia regulację kąta bloku tak, aby oś strzałkowa mózgu była prostopadła do płytki wibratomowej, a oś koronalna była wyrównana równolegle do ostrza. Pozostaw około 5 mm agarozy po grzbietowej stronie mózgu, aby ułatwić obchodzenie się z plastrami.
  4. Umieść małą kroplę szybkoprzylepnego, bezrozpuszczalnikowego kleju superglu na środku uchwytu próbki i rozprowadź w obszarze, który pokryje spód bloku agarozy.
  5. Delikatnie podnieś blok agarozy i osusz spód, wcierając w bibułę. Umieść klocek na sklejonym obszarze uchwytu na próbki, rostralną stroną mózgu do góry. Umieść uchwyt na próbkę na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 1 minutę.
  6. Po wyschnięciu kleju umieść uchwyt próbki w tacy buforowej.
  7. Pokrój mózg w plastry koronalne pod kątem 15°.
    UWAGA: Grubość plastrów może się różnić w zależności od zastosowania. Tutaj mózgi zostały pocięte na grubość 150 μm. Ustaw prędkość wibratomu na 1,0-1,5 mm/s, aby przyciąć nadmiar agarozy na wierzchu i przyciąć opuszki węchowe. Zmniejsz prędkość cięcia do 0,5 mm/s w celu zbierania wycinków kory mózgowej do analizy. Większość wibratomii można zatrzymać, aby zebrać każdy plasterek. Jeśli wystąpi obniżona jakość plastrów lub oderwanie tkanki od agarozy, pomocne może być zmniejszenie prędkości cięcia lub wymiana ostrza wibratomu.
  8. Za pomocą czystych szpatułek zbierz plastry mózgu i umieść je na membranie z politetrafluoroetylenu (PTFE), unieruchomione w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm przy użyciu parafiny (do pięciu plasterków mózgu / membrana) (Rysunek 3L-M).
    UWAGA: Zamocuj membranę PTFE w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm za pomocą wosku. To ustabilizuje błonę podczas dodawania pożywki do hodowli plastrów, a także podczas obrazowania.
  9. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl usuń nadmiar HBSS-G z okolic plastrów na membranie PTFE, pozostawiając plastry do półsucha.
  10. Dodać 500 μl podłoża warstwowego (wstępnie podgrzanego do 35 °C) bezpośrednio do przestrzeni pod membraną PTFE.
    UWAGA: Podczas dodawania podłoża pod membraną nie mogą tworzyć się pęcherzyki. Spowoduje to pozostawienie całych lub częściowych plasterków bez wymiany mediów. Wymieniaj 200 μl pożywki co 2 dni w hodowli lub po każdej sesji obrazowania.
  11. Inkubować plastry w temperaturze 35 °C z 5% CO2 .

9. Immunohistochemia

  1. Utrwal plastry 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) uzupełnionego 4% sacharozą na naczynie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Wykonaj czynności utrwalające pod maską chemiczną i odpowiednio zutylizuj odpady PFA.
  2. Umyj plastry dwukrotnie 300 μl PBS przez 5 minut. Przenieś plastry na płytkę 24-dołkową.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać. Dodać PBS-NaN3 do plastrów i przechowywać w temperaturze 4 °C. NaN3 jest związkiem toksycznym; Podczas obchodzenia się z roztworami należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Kroki 9.3-9.10 należy wykonać w wytrząsarce orbitalnej.
  3. Plastry zalać 300 μl 0,1 M glicyny w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Wypłukać glicynę za pomocą PBS w temperaturze RT 3x przez 10 min.
  5. Przepuszczać plastry za pomocą 300 μl PBS-T w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  6. Blokuj przy użyciu 10% surowicy koziej w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  7. Dodać 300 μl przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-wimentynowe w rozcieńczeniu 1:200; patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w 10% surowicy koziej w roztworze PBS-T w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: W krokach 9.8-9.12 plastry były chronione przed światłem, aby zapobiec utracie fluorescencji.
  8. Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe PBS w temperaturze 3x RT przez 20 min.
    UWAGA: PBS został użyty zamiast PBS-T do wymywania Triton X-100.
  9. Dodać 300 μl przeciwciała drugorzędowego (Alexa Fluor 488 lub 647 w rozcieńczeniu 1:400; patrz tabela materiałów) w PBS w temperaturze RT przez 2 godz.
    UWAGA: DAPI dodaje się natychmiast po usunięciu przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:10 000 przez 5 min.
  10. Przemyć przeciwciało drugorzędowe PBS w temperaturze 3x RT przez 20 min. Przemyć wodą destylowaną 2x przez 1 min.
  11. Za pomocą cienkiego pędzla przenieść plastry na szkiełko do szkiełka, a następnie wysuszyć w temperaturze 30 °C przez 20 minut.
  12. Zamontuj plastry za pomocą wodnego podłoża montażowego. Trzymaj slajdy w RT przez noc, aby nośnik montażowy mógł się zamocować.

10. Akwizycja obrazowania

UWAGA: Niezależnie od podejścia do dostarczania DNA (IUE lub EUE), wycinki były analizowane w tym samym przedziale wieku rozwojowego (E17.5-E18.5). IUE pozwala neuronalnym przodkom dzielić się i rozwijać przez kolejne dwa dni in vivo. Z drugiej strony EUE pozwala na śledzenie wczesnych zdarzeń rozwojowych.

  1. Włączyć inkubator komorowy i ustawić go na 35 °C z 5% CO2 - najlepiej 4 godziny przed obrazowaniem - aby umożliwić zrównoważenie elementów mikroskopu w temperaturze 35 °C.
  2. Do głębokiego obrazowania plastrów należy użyć obiektywów zanurzonych w wodzie, aby zmniejszyć niezgodność współczynnika załamania światła między tkanką a obiektywem.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano tryb obrazowania w super rozdzielczości. Obrazowanie przez membranę PTFE wymaga obiektywu o dużej odległości roboczej (~1 mm). Jeśli obiektyw o dużej odległości roboczej nie jest dostępny, plastry można przenieść do 8-dołkowego naczynia ze szklanym dnem. Aby przenieść plastry, dodaj 1 ml pożywki w plastrach na wierzch membrany, a następnie użyj szpatułki, aby podnieść plasterek i przenieść go do studzienki zawierającej 200 μl podłoża. Usuń nadmiar pożywki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając plastry do półsuchości.
  3. Aby zobrazować wzrost aksonów, zlokalizuj obszar kory o niskiej lub średniej gęstości komórek. Aby zobrazować dynamikę stożka wzrostu, zlokalizuj stożek wzrostu w strefie pośredniej kory lub strefie podkomorowej.
  4. Zdefiniuj rozmiar stosu Z w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów). W przypadku wzrostu aksonów w dużym stosie Z ustaw rozmiar kroku 2 μm. W przypadku stożków wzrostu w mniejszym stosie Z ustaw rozmiar kroku 1 μm.
    UWAGA: Zawsze uwzględniaj potencjalny ruch stożka wzrostu i aksonu przez płaszczyzny x, y i z. Aksony rosną znacznie szybciej w kulturach organotypowych niż w kulturach in vitro. W tym przypadku wystarczający był stos z o wielkości około 80 μm, aby zobrazować wzrost aksonów. Dla dynamiki stożka wzrostu odpowiedni był stos z wynoszący ~6 μm.
  5. Aby zobrazować wzrost aksonów neuronów na większym obszarze, zdefiniuj skan kafelkowy.
  6. Użyj najniższej możliwej mocy lasera, aby zminimalizować ryzyko bielenia stożków wzrostu podczas akwizycji.
  7. Aby zobrazować wzrost aksonów, należy wykonać filmy poklatkowe przez 2 godziny w odstępie 5 minut. Aby zobrazować dynamikę stożka wzrostu, należy wykonać zdjęcia poklatkowe przez 2-5 minut w odstępie 2,5-3 s.

11. Analiza danych

  1. Mierz szybkość wzrostu aksonów za pomocą kymografów
    1. Otwórz plik obrazu w Fiji14 za pomocą File > Open i wybierz obraz.
    2. Uzyskaj projekcję maksymalnej intensywności filmu poklatkowego za pomocą stosów obrazu > > projekcji Z > projekcji maksymalnej intensywności.
    3. Przejdź przez film poklatkowy i zlokalizuj rosnący akson.
    4. Po zlokalizowaniu narysuj linię przez rosnący akson. Zacznij od czubka aksonu w pierwszej klatce i podążaj za aksonem przez cały film poklatkowy.
    5. Wygeneruj kimograf za pomocą wtyczki KymoResliceWide.
    6. Ustaw skalę kimografu, przechodząc do Właściwości > obrazu. Ustaw odległość w μm w polu Szerokość piksela i ustaw czas w s lub min w polu Wysokość piksela.
    7. Przejdź do pozycji Analizuj > mierz.
      UWAGA: Podany zostanie kąt względem osi x.
    8. Oblicz prędkość wzrostu aksonów, podstawiając kąt w następującym równaniu: SIN(RADIANY(θ))/COS(RADIANY(θ)) w arkuszu kalkulacyjnym.
  2. Zmierz objętość stożka wzrostu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
    1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu za pomocą opcji Plik > Otwórz i wybierz interesujący Cię plik.
    2. Wybierz Kreatora dodawania nowych powierzchni.
      UWAGA: W lewym dolnym rogu pojawi się sekcja z sześcioma krokami do ręcznej edycji.
    3. W kroku 1 - w obszarze Ustawienia algorytmu - wybierz opcję Segmentuj tylko region zainteresowania. W kroku 2 przytnij ramkę, aby zmieściła się w całym stożku wzrostu we wszystkich ramkach.
    4. Utrzymuj próg intensywności bezwzględnej w kroku 3 i upewnij się, że cały obszar stożka wzrostu jest progowany w kroku 4.
    5. W kroku 5 wybierz opcję Liczba wokseli lmg = 1 w obszarze Typ filtra.
      UWAGA: W ostatnim kroku może zostać utworzonych wiele zestawów pomiarów. W tym przypadku utworzono tylko jeden pomiar objętości.
    6. Wybierz przycisk Wykonaj, aby wykonać wszystkie kroki tworzenia i zakończyć działanie Kreatora dodawania nowych powierzchni.
    7. Na karcie Statystyki w górnej części okna kreatora wybierz pozycję Określone wartości i wolumin na karcie Szczegółowe.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy zastosowaniu opisanego schematu metody. W niniejszej demonstracji wykorzystano myszy w stadium E15.5, choć protokół ten można z łatwością dostosować do niemal wszystkich etapów rozwoju zarodkowego od E11 do późnego E17. W niniejszym protokole zastosowano albo ex utero elektroporacja (EUE; Rysunek 2A, 2C-I) lub wewnątrzmacicznie elektroporacja (IUE; Rysunek 2B,C oraz 2J-Q) wykorzystano do wprowadzenia plazmidów do neuronów progenitorowych wyścielających komory boczne. Progenitory te stanowią źródło przyszłych neuronów rzutujących do kory (CPN)15,16Przygotowano mieszaniny plazmidów w celu uzyskania rzadkiej, specyficznej dla neuronów ekspresji albo białka skierowanego do błony komórkowej (Lyn)-mNeonGreen (Rysunek 1A) lub (E)GFP wzmocnione LifeAct (Rysunek 1B) w celu oceny odpowiednio ogólnego zachowania oraz dynamiki aktyny w stożkach wzrostu. Ponadto zastosowano mieszaninę plazmidów mającą na celu znakowanie poszczególnych neuronów białkiem turbo(t)-RFP lub zielonym białkiem fluorescencyjnym zoanthus sp. (ZsGreen) (Rysunek 1C) został uwzględniony. Ułatwia to monitorowanie zachowania stożków wzrostu niezależnych, sąsiadujących neuronów.

Disekcja mózgu z elektroporowanych embrionów jest kluczowym krokiem, który musi być przeprowadzony z dużą starannością w celu uzyskania wysokiej jakości przekrojów przy zachowaniu natywnej struktury mózgu. Narzędzia do disekcji oraz wibratom przygotowano wcześniej i starannie wysterylizowano etanolem (Rysunek 3A,B). Następnie starannie wypreparowano głowy elektroporowanych embrionów i wyekstrahowano mózgi. Przedstawiono tutaj reprezentatywną disekcję mózgów embrionów poddanych EUE na etapie E15 (Rysunek 3C-F) oraz E12.5 (Rysunek 3G-J). Mózgi są niezwłocznie zamykane w matrycy agarozowej, cięte w plastry i umieszczane na wkładkach z membrany PTFE w naczyniu z szklanym dnem w celu inkubacji (Rysunek 3K-M).

Stan zdrowia skrawków mózgu jest istotnym punktem kontrolnym, zapewniającym wiarygodność wyników. Codziennie przeprowadzano wizualną inspekcję w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń. Ponadto, po zakończeniu hodowli, skrawki mózgu utrwalano i poddawano immunohistochemii. W tym celu zastosowano 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) do kontroli ogólnej organizacji komórkowej oraz barwienie na wimentynę w celu uwidocznienia organizacji glejowej, w szczególności rusztowania glej radialny (RG). Zazwyczaj pomyślnie wyhodowane skrawki mózgu pochodzące z elektroporacji IUE lub EUE wykazują prawidłowy rozkład komórek w barwieniu DAPI oraz w pewnym stopniu zorganizowany układ RG z procesami kontaktującymi się z oponą miękką, zorientowanymi apikalnie17 (Rycina 4A, B odpowiednio). Okazjonalnie w hodowanych skrawkach mózgu obserwuje się wyraźne zaburzenia rusztowania RG, szczególnie w tych pochodzących z elektroporacji EUE (Rycina 4C). Skrawki mózgu z niezwykle zdezorganizowanym rusztowaniem RG wykazują upośledzoną migrację neuronów i wadliwy wzrost aksonów (nie pokazano). Zatem kontrola rusztowania RG jest prostą metodą po hodowli, pozwalającą na selekcję danych uzyskanych z wiarygodnych skrawków mózgu.

Przekroje mózgu uzyskane zarówno z IUE, jak i EUE z mieszaniną plazmidów wykazujących ekspresję Lyn-mNeonGreen prowadzą do podobnego rzadkiego znakowania neuronów. Jako przykład przedstawiono reprezentatywny piramidowy neuron projekcyjny kory (CPN) wykazujący ekspresję Lyn-mNeonGreen oraz dynamiczne zachowanie jego stożka wzrostu (Rysunek 5A i Film uzupełniający 1, (lewy górny róg). Dodatkowo neurony oznakowano za pomocą plazmidu wykazującego ekspresję sondy aktynowej w celu analizy dynamiki aktyny w stożkach wzrostu aksonów in situ (Rycina 5B i Film uzupełniający 1, lewy dolny róg). In situ eksperymenty przeprowadzono również z wykorzystaniem plazmidu o podwójnym projekcie, wykazującego ekspresję fluoroforów sterowaną przez Cre i Dre (Rycina 1C i Wideo uzupełniające 1, prawo). fluorofory tRFP lub ZsGreen w tym plazmidzie mogłyby zostać aktywowane specyficznie i indywidualnie przez rekombinazy Dre lub Cre, odpowiednio, w sąsiednich neuronach (Rysunek 5C). Taki układ eksperymentalny umożliwia równoległą analizę stożków wzrostu neuronów kontrolnych oraz sąsiadujących z nimi neuronów zmodyfikowanych (w przypadku dowolnej utraty lub uzyskania funkcji). Pozwala to uniknąć zmienności wynikającej z zastosowania różnych przekrojów do testowania warunków kontrolnych i eksperymentalnych.

Przeanalizowano kymografy wygenerowane z zarejestrowanego filmu, z których można łatwo uzyskać dynamiczne parametry wzrostu, takie jak aktywność protruzywna w czasie oraz długość wzrostu (Rycina 6A). Należy zauważyć, że prosta regulacja rozdzielczości czasowej filmu poklatkowego pozwala na pomiar prędkości elongacji aksonu przez 2 h (Rycina 6A). Ponadto, przy użyciu licencjonowanego oprogramowania, można łatwo uzyskać informację o zmianie objętości stożka wzrostu w czasie – mierniku ogólnej dynamicznej aktywności stożka wzrostu (Rycina 6B i Rycina 6E,F). Może to służyć do oceny prędkości treadmillingu aktyny oraz równowagi między filopodiami a lamelipodiami podczas aktywności eksploracyjnej stożka wzrostu.

Schemat edycji genów; metoda rekombinazy Cre/Dre; funkcja promotora eukariotycznego; ekspresja GFP.
Rycina 1: Schematy plazmidów użytych w protokole. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Istotne informacje dotyczące komponentów plazmidowych i pochodzenia fluoroforów znajdują się w ramkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układy do elektroporacji: techniki ex utero i in utero, w tym sprzęt i kroki eksperymentalne.
Rycina 2: Schemat elektroporacji ex utero oraz in utero u myszy w dniu E15.5. (A) Konfiguracja stanowiska chirurgicznego do elektroporacji ex utero. (B) Konfiguracja stanowiska chirurgicznego do elektroporacji in utero. (C) Rogi macicy wyciągnięte poza jamę brzuszną znieczulonej myszy. (D) Wyjęcie zarodka z woreczka macicznego. (E) Uśmiercenie zarodka poprzez całkowite przecięcie rdzenia kręgowego via cięcie ukośne; należy zauważyć, że uniknięto dekapitacji. (F) Umieszczenie zarodka w uchwycie i wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do lewego komory bocznej. (G,H) Ułożenie głowy zarodka między platynowymi elektrodami pęsetowymi z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (I) Umieszczenie kończyn zarodka (czarne strzałki) na zewnątrz uchwytu, aby zapobiec przesuwaniu się zarodka podczas procedury. (J) Obrócenie zarodka wewnątrz woreczka macicznego w celu odsłonięcia głowy. (K,L) Wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do komór bocznych zarodka przez ścianę macicy. (M) Ułożenie głowy zarodka między platynowymi elektrodami pęsetowymi z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (N) Zaszycie nacięcia mięśni via szew ciągły z blokowaniem. (O) Zaszycie nacięcia skóry via szew przerywany. (P) Zabezpieczenie rany za pomocą chirurgicznych klipsów do ran i dezynfekcja betadyną. (Q) Umieszczenie myszy w klatce rekonwalescencyjnej z lampą grzewczą emitującą daleką podczerwień. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyjęcie mózgu i przygotowanie hodowli organotypowej; obrazy mikroskopowe przedstawiające sekcję zarodkowego mózgu.
Rysunek 3: Procedura wyjęcia mózgów zarodków w dniach E15,5 i E12,5 oraz hodowla organotypowa plastrów tkankowych. (A) Narzędzia użyte do procedury wyjęcia mózgu. (B) Konfiguracja stacji hodowli organotypowej. (C-F) Wyjęcie mózgu w dniu E15,5. (G-J) Wyjęcie mózgu w dniu E12,5. Linie przerywane wskazują miejsca nacięć. Czerwone strzałki wskazują kierunek pociągnięcia pęsetą. (K) Osadzanie mózgu w naczyniu o średnicy 3 cm zawierającym 3% niskotopliwą agarozę, z pozostawieniem 1-2 mm przerwy z agarozy pod mózgiem. (L) Pobranie plastra mózgu o grubości 150 µm. (M) Umieszczenie plastrów mózgu na wkładkach z membrany PTFE unieruchomionych w naczyniu o średnicy 35 mm za pomocą folii parafinowej (niebieska strzałka). Czerwona gwiazdka oznacza pobranie konkretnego plastra mózgu z wibratomu (L) i jego przeniesienie na membranę PTFE (M). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie metod elektroporacji; barwienie wimentyną i DAPI; schemat mikroskopowy; analiza neuronalna.
Rysunek 4: Zachowana struktura komórek glei radialnej w zdrowych skrawkach organotypowych. Obrazy konfokalne skrawków mózgu E17.5 ukazujące układ RG (vimentin; zielony) oraz ogólną organizację komórek (DAPI; magenta) po IUE (A) i EUE (B,C). Należy zwrócić uwagę na silne zaburzenia w układzie RG, które mogą sporadycznie wynikać z EUE (C). Powiększenia odpowiadają czerwonym przerywanym ramkom na głównym rysunku: paski skali, 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna neuronów, markery tRFP/ZsGreen, uwidaczniające strukturę cytoszkieletu.
Rysunek 5: In situ wizualizacja dynamiki stożków wzrostu w ostrych skrawkach organotypowych. (A,B) Neurony i odpowiadające im stożki wzrostu znakowane odpowiednio Lyn-mNeonGreen oraz LifeAct-GFP. Czerwona gwiazdka oznacza stożek wzrostu neuronu wykazującego ekspresję Lyn-mNeonGreen. Niebieski asterysk oznacza stożek wzrostu neuronu wykazującego ekspresję LifeAct-GFP. (C) Sąsiadujące neurony znakowane podwójnym systemem plazmidowym zawierającym tRFP (magenta) i ZsGreen (zielony) oraz odpowiadające im stożki wzrostu. Stożki wzrostu obrazowane (po prawej) znajdowały się poza uchwyconą klatką (po lewej), uzyskane krótko po zarejestrowaniu time-lapse stożka wzrostu; paski skali, 5 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzrostu aksonów Lyn-mNeonGreen; mikroskopia fluorescencyjna, wykresy prędkości wzrostu, wykres objętości.
Rysunek 6: Analiza prędkości wzrostu aksonów i objętości stożka wzrostu. (A) Śledzenie aksonu w neuronie wykazującym ekspresję Lyn-mNeonGreen (góra) oraz odpowiadający mu kymograf (dół) wygenerowany w programie ImageJ. (B) Rekonstrukcja wideo z serii obrazów z-stack stożka wzrostu z wykorzystaniem oprogramowania do analizy obrazu (góra) oraz ten sam stożek wzrostu zaznaczony za pomocą narzędzia pomiaru powierzchni (dół). (C) Wykresy przedstawiające zmiany prędkości wzrostu w czasie dla kilku aksonów. (D) Ilościowe określenie średniej prędkości wzrostu aksonów z wykresów w punkcie (C). (E) Wykres przedstawiający zmiany objętości stożka wzrostu w czasie. (F) Ilościowe określenie średniej objętości stożków wzrostu z wykresu w punkcie (E); pasek skali, 5 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat migracji neuronów; od VZ do CP; proces rozwoju mózgu; pozycjonowanie neuronów; narzędzie badawcze.
Rysunek 7: Migracja radialna i polaryzacja neuronów piramidowych kory. Schemat ilustrujący rozwijające się neurony piramidowe kory (różowe) migrujące radialnie z zarodkowej strefy komorowej (VZ) w kierunku powierzchni opon opiłkowatych. Prowadzone przez wypustki glejowe radialne (szare), migrujące spolaryzowane neurony tworzą wypustkę prowadzącą (przyszła dendryta) oraz wypustkę podążającą (przyszły akson), która nadal rozrasta się w dół w kierunku strefy pośredniej (IZ). Czerwone przerywane ramki reprezentują obszary kory, w których obrazowano stożki wzrostu. Konkretnie w IZ, strefie podkomorowej (SVZ) lub łączących się pęczkach aksonów (zielone). Ilustracja została stworzona za pomocą narzędzia internetowego BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PlazmidStężenie (µg/µL)Przeznaczenie
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen0.25Znakowanie białka skierowanego do błony (Lyn)
++
p-Tub-alpha-1-iCre0.08
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP0.125znakowanie aktyny włóknistej (F-aktyny) w stożkach wzrostu
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen1Niezależne znakowanie dwóch populacji sąsiadujących neuronów
++
p-Tub-alpha-1-iCre0.004
++
p-Tub-alpha-1-Dre0.2

Tabela 1: Lista plazmidów użytych w protokole. Nazwa, stężenie i przeznaczenie każdego wykorzystanego plazmidu.

Wideo uzupełniające 1: In situ wizualizacja dynamiki stożka wzrostu w ostrych plastrach organotypowych. Dynamika stożków wzrostu znakowanych Lyn-mNeonGreen (lewa góra) i LifeAct-GFP (lewa dół). Sąsiednie stożki wzrostu są różnie znakowane za pomocą dualnego systemu plazmidowego zawierającego tRFP (magenta; prawa góra) i ZsGreen (zielony; prawa dół). Interwał obrazowania: 2,5 s. Paski skali: 5 µm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

To, w jaki sposób stożki wzrostu wyczuwają i reagują na otaczające je środowisko, aby koordynować jednoczesne rozszerzanie aksonów i prowadzenie, jest nadal przedmiotem dyskusji 3,18. Pionierskie badania nad substratami 2D dały wgląd w podstawowe mechanizmy molekularne generujące siły, które napędzają dynamikę stożka wzrostu podczas formowania aksonów, wzrostu i nawigacji 2,10,11,12,19. Niedawne badania nad matrycami 3D ujawniły, jak duży wpływ ma trzeci wymiar na zachowanie stożka wzrostu, a w konsekwencji na wzrost aksonów 8,9. Niemniej jednak skomplikowane mechanizmy instruujące dynamikę stożków wzrostu in vivo wymagają jeszcze dokładnego zbadania.

Przygotowanie organotypowych kultur warstwowych z mózgów IUE lub EUE jest szeroko stosowane i dobrze udokumentowane. Stała się złotym standardem, pozwalającym naukowcom uzyskać wgląd w rozwój i zachowanie neuronów w żywej tkance mózgowej20,21. Rzeczywiście, technika ta została z powodzeniem wykorzystana w połączeniu z różnymi technikami obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji określonych procesów molekularnych i zdarzeń morfologicznych in situ. Badania takie obejmują między innymi tworzenie i wydłużanie aksonów19,22, migrację neuronów korowych 19,22,23,24, dynamikę centrosomów 25,26, dynamikę mikrotubul27, a także dynamikę funkcjonalną przedziałów pre- i postsynaptycznych 28,29.

Protokół ten wypełnia lukę w neurobiologii eksperymentalnej, wizualizując dynamikę stożka wzrostu rozwijających się neuronów korowych in situ, w ostrych kulturach wycinków mózgu ex vivo oraz narzędzia do analizy uzyskanych danych.

Do ustalenia tego protokołu wykorzystano ostre kultury wycinków mózgu, ponieważ (1) przy odrobinie praktyki są one łatwe do wygenerowania; (2) przedstawić dostępny system do badania stożków wzrostu osadzonych w quasi-całkowicie fizjologicznym środowisku, a jednocześnie wystarczająco przezroczysty, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości; (3) może być rozszerzony do użytku o niezliczoną ilość transgenicznych linii myszy; (4) w połączeniu z IUE lub EUE, zapewniają praktycznie nieograniczony potencjał dostarczania narzędzi molekularnych do oceny wydajności stożków wzrostu i aksonów in vivo w reżimach utraty/wzmocnienia funkcji, wraz z fluorescencyjnymi reporterami i sondami cytoszkieletowymi.

Metodologia ta została opisana zarówno w kontekście EUE, jak i IUE. Chociaż nadal jest to wysoce wiarygodna metoda, EUE spowodowała zwiększoną częstość występowania wycinków mózgu wykazujących zdezorganizowaną sieć RG w porównaniu z tymi uzyskanymi za pomocą IUE jako metody dostarczania (Figura 4C). Zaburzenia w matrycy RG silnie wpływają na migrację neuronów i wzorzec wydłużania aksonów30,31. Są to kluczowe parametry, które przewidują, gdzie w danym momencie znaleźć aksony do analizy i rodzaj środowiska, w którym się poruszają. Wycinki mózgu ze znacznie zakłóconą siecią RG zazwyczaj mają upośledzoną stratyfikację neuronów korowych. To z kolei wytwarza aksony o chaotycznych trajektoriach. Dlatego zdecydowanie zaleca się kontrolę integralności strukturalnej sieci RG. Co ciekawe, słaba integralność strukturalna koreluje ze zwiększonym wiekiem mózgu embrionalnego. Rzeczywiście, takich efektów u młodszych zarodków E12.5-E13.5 zazwyczaj nieobserwowano19.

Obecny protokół jest dokładny i prosty. Niemniej jednak istnieje kilka krytycznych kroków, w których należy zachować szczególną ostrożność i uwagę, aby uzyskać optymalne wyniki. Zostały one wyraźnie zaznaczone w protokole i obejmują (1) dostrojenie ilości DNA używanego w elektroporacji w celu uzyskania rzadkiego znakowania; (2) unikanie uszkodzeń podczas ekstrakcji mózgu; (3) kontrolowanie temperatury agarozy podczas obudowy mózgu; (4) rozwiązywanie problemów z ustaleniem idealnego procentu agarozy dla mózgu w danym wieku; oraz (5) dobór fluoroforów, których doświadczenie następuje. Podczas optymalizacji protokołu przetestowano działanie kilku fluoroforów w obrazowaniu in situ żywych komórek. Do tego protokołu wybrano monomeryczne warianty GFP EGFP i NeonGreen do przygotowania plazmidów znakowanych LifeAct i Lyn (Figura 5A,B). Dodatkowo przetestowano wariant RFP mScarlet i uznano, że jest bardzo odpowiedni dla tej konfiguracji (dane nie pokazane). Przetestowano również multimeryczny tRFP (dimer) i ZsGreen (tetramer) (Rysunek 5C i Dodatkowe wideo 1, po prawej). Te szybko składające, super jasne fluorofory są zalecane, gdy metoda wymaga szybkiego generowania sygnału fluorescencyjnego po dostarczeniu DNA.

Powszechną praktyką w stosowaniu kultur warstwowych jest wykorzystywanie wycinków z różnych mózgów do testowania warunków kontrolnych i eksperymentalnych. Stanowi to nieodłączne źródło niepożądanej zmienności. W tym przypadku zastosowano system ekspresji, który umożliwia niezależną modyfikację sąsiednich neuronów i ekspresji reporterów w celu identyfikacji. Zauważ, że w tej demonstracji (Figura 5C) nie było różnic między neuronami wyrażającymi którykolwiek z fluoroforów. Jednak, na przykład, taka mieszanka plazmidów w połączeniu z transgeniczną linią myszy zawierającą gen wrażliwy na Cre oznaczy neuronami tRFP (Dre-wrażliwymi), które pozostały jako dzikie typy. W przeciwieństwie do tego, ZsGreen (również wrażliwy na Cre) oznaczy zrekombinowane neurony. W związku z tym stożki wzrostu dwóch różnych genotypów, a prawdopodobnie także fenotypy, mogą być badane obok siebie jednocześnie w tym samym wycinku mózgu.

Lokalizacja aksonów i stożków wzrostu do analizy jest ważną kwestią. Neurony korowe polaryzują się podczas promieniowej migracji ze strefy komorowej (VZ) w kierunku płytki korowej (CP). Podczas tego procesu neurony tworzą proces wiodący (przyszły dendryt) i proces końcowy, który stanie się aksonem, ostatecznie łącząc się z pionierskimi aksonami w strefie pośredniej (IZ), ustanawiając drogi aksonów32. Dlatego, aby uchwycić stożki wzrostu aksonów, przeprowadzono obrazowanie na włóknach aksonalnych w IZ, w tym aksonach wychodzących z CP i wcześnie wygenerowanych aksonach już związanych z wiązkami aksonalnymi; lub ostatecznie we włóknach, które przecinają IZ i rozciągają się poniżej niego (ryc. 7).

Protokół ten umożliwia wykonywanie obrazowania neuronów w superrozdzielczości w wycinkach organotypowych. Historycznie rzecz biorąc, rozpraszanie światła było poważnym problemem, z jakim borykano się podczas obrazowania grubych próbek. W ciągu ostatnich dwóch dekad znaczny postęp w technologiach optycznych umożliwił obrazowanie grubych próbek. W tym przypadku wykorzystano obiektyw o dużej odległości roboczej, aby lepiej uwidocznić mniejsze struktury, takie jak stożki wzrostu. Nieuchronnie protokół ten nie obejmuje bardziej szczegółowych zdarzeń, takich jak wsteczny przepływ aktyny lub dynamika mikrotubul. Obiektyw o dużej odległości roboczej, który wymaga mniejszej apertury numerycznej (NA), zachowuje informacje z grubych warstw. Możliwe było jednak również dostosowanie tego protokołu do użytku z celami o krótszej odległości roboczej. Wymagało to płynnego przeniesienia plastrów do naczynia ze szklanym dnem, aby zachować integralność strukturalną. Jednak zastosowanie tej metody skutkowało krótszym przeżyciem – ~15 h – ze względu na utratę wymiany gazowej (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do kultur 2D, stożki wzrostu w 3D zajmują większą objętość i wymagają kompensacji artefaktu ruchu w osi z. Aby zwiększyć zdolność obrazowania szczegółowych zdarzeń, należy zastosować nowoczesną technologię konfokalną. Dlatego zaleca się stosowanie szybko skanującego silnika z-stack, takiego jak z-Galvo dostępny w bardzo czułych mikroskopach konfokalnych33.

Warto zauważyć, że protokół ten ma trzy główne ograniczenia. Po pierwsze, często trudno jest kontrolować poziomy ekspresji/liczbę komórek eksprymujących dowolny plazmid in vivo. Wprowadza to zmienność między wszystkimi warstwami, nawet przy utrzymaniu tego samego stężenia plazmidu. W związku z tym wybór elementów regulacyjnych w stosowanych wektorach ekspresji musi być z góry określony z ostrożnością. Po drugie, obrazowanie szczegółowych zdarzeń za pomocą wkładek membranowych nie jest obecnie możliwe. To drugie ograniczenie może zostać przezwyciężone dzięki aktualizacjom metodologicznym zaproponowanym w poprzednim ustępie. Wreszcie, stożki wzrostu są bardzo wrażliwe na światło i mogą szybko ulec fotowybielaniu. Dlatego częste obrazowanie stożków wzrostu, trwające zaledwie 5 minut przy użyciu laserowych mikroskopów skaningowych, często może spowodować zapadnięcie się stożków wzrostu. W związku z tym nowe osiągnięcia w dziedzinie urządzeń generowanych za pomocą mikroskopii świetlnej mogą być dostosowane do długoterminowego obrazowania wycinków mózgu34.

Tego typu protokoły mają otworzyć nowe ścieżki badawcze, pozwalając lepiej zrozumieć, co jest potrzebne, aby stożek wzrostu odczytywał i reagował na złożone środowisko in vivo , a co ważniejsze, aby rozwikłać mechanikę tej wyrafinowanej interakcji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Marii Eugenii Bernis za sfotografowanie zabiegów. Dziękujemy również Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Maxowi Schelskiemu i Sinie Stern za przeczytanie i omówienie manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni naszym znakomitym asystentkom technicznym, Jessice Gonyer, Blanci Randel i Anh-Tuan Pham. Doceniamy cenne wsparcie ze strony zakładu mikroskopów świetlnych i zakładu dla zwierząt DZNE. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), Międzynarodową Fundację Badań nad Paraplegią (IRP) oraz Wings for Life (przy FB). F.B. jest członkiem klastra doskonałości ImmunoSensation2, SFB 1089 i 1158 oraz laureatem Nagrody Rogera De Spoelbercha.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adson KleszczeFine Science Tools11006-12
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Goat Anti-Mouse
Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Goat Anti-Mouse
Anti-Vimentin przeciwciałosigma-AldrichV2258-.2MLMysz monoklonalna, klon LN-6, płyn wodobrzuszny
Suplement B27ThermoFisher Scientific
BetadineB. Braun3864154
Biozym Sieve GP AgaroseBiozyme850080
Braunol, Sprü hflascheB. Braun3864073
Buprenorfina (Temgesic)GEHE Pharma345928
DAPIsigma-AldrichD9542
Ściągacz elektrod DMZZeitzNA
Elektryczna maszynka do goleniaAndesNAModel ProClip UltraEdge Super 2-Speed
Enrofloksacyna (Baytril)Bayer35432382,5% (wt/vol)
Końcówki do pipet do mikroładowarek EppendorfFischerScientific10289651
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5GZawartość barwnika > 85 %
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher Scientific10500064
Fiji 2.1.0NIHNAhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Drobne nożyczkiFine Science Tools14058-09ToughCut/Straight/9cm
FluoroDish Naczynie do hodowli komórkowychWorld Precision InstrumentsFD5040-100
Fluoromount Wodne mediummontażowe sigma-AldrichF4680-25ML
GlukozaMedPex3705391Suplement 5%
GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061
GlycineSigma-AldrichG8898
HBSSLife Technologies14025092wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej
Surowica dla koniPan-BiotechP30-0711
Imaris 9.7.2BitplaneNAhttps://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists
IsofluraneVirbacNA
Sól fizjologiczna rozwiązanieB. Braun86092610.90%
Leica VT1200 S wibratomeLeica14048142066
LSM 880 z AiryscanMyszy ZeissNA
MetacamVenusberg 88902175 mg/ml
JanvierLabsNAC57BL/6JRj
Kleszcze Micro-AdsonNarzędzia do nauki11018-12
Słoik do przechowywania mikropipetWorld Precision InstrumentsE210  16.16.27
Microsoft ExcelMicrosoftNAhttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab
Millicell Cell Culture InsertEMD MilliporePICM0RG5030  mm, hydrofilowy PTFE, 0.4  &mikro; m
Łyżki perforowane MoriaFine Science Tools10370-18
Moria SpoonFine Science Tools10321-08
Neurobasal Medium, minus czerwień fenolowaThermoFisher Scientific12348017
Suplement Neuropan-2Pan-BiotechP07-11010
Normalna surowica koziaAbcamab138478
Olsen-Hegar Uchwyt na igły z nożyczkamiFine Science Tools12002-12
p-Tub-alpha-1-DreAddgene133925
p-Tub-alpha-1-iCreAddgene133924
p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFPAddgene175437
ParafilmVWR52858-000
Paraformaldehydsigma-AldrichP6148
PBSSigma-AldrichP3813-10PAK
pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreenAddgene175438
pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreenAddgene175257
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific15140122
Zestaw dysz PicoNozzle v2World Precision Instruments5430-ALL
Platynowa pęsetaAparat Harvard45-04871 mm / 3 mm
Zestaw QIAGEN MaxiQIAGEN12162
Odblaskowe zamykanie ran ClipWorld Precision Instruments500344-107 mm
Sekundenkleber Pattex Mini TrioLyreco4722659
System elektroporacji fali prostokątnej ECM830Harvard AparatW3 45-0052
Sterylna gazaBraun Askina9031216
Sterylna lubrykantna maść do oczuBayer VitalPZN1578675
Sterylne rękawice chirurgiczneSempermed14C0451
SacharozaRoth4621.2
Supramid 5-0 jedwabne szwy chirurgiczneB. BraunNA
Cienkościenne szklane kapilaryWorld Precision InstrumentsTW100-4
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Nożyczki sprężynowe VannasFine Science Tools15000-03
i mikro;-Slide 8 Well Szklane dnoIbidi80827
17504044

Bibliografia

  1. Schelski, M., Bradke, F. Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics. Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).
  2. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  3. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
  4. Bradke, F., Dotti, C. G. The role of local actin instability in axon formation. Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).
  5. Neukirchen, D., Bradke, F. Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics. Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).
  6. Witte, H., Bradke, F. The role of the cytoskeleton during neuronal polarization. Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).
  7. Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).
  8. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  9. Santos, T. E., et al. Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions. Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).
  10. Mitchison, T., Kirschner, M. Cytoskeletal dynamics and nerve growth. Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).
  11. Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility. Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).
  12. Myers, J. P., Gomez, T. M. Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones. Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).
  13. Turney, S. G., et al. Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance. Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).
  18. Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).
  19. Dupraz, S., et al. RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain. Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).
  20. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  21. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  22. Namba, T., et al. Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex. Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).
  23. Shah, B., et al. Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex. Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).
  24. Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).
  25. de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex. Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).
  26. Sakakibara, A., et al. Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization. Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).
  27. Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures. Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).
  28. Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices. STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).
  29. Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).
  30. Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models. Development. 146 (1), (2019).
  31. Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration. Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).
  32. Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).
  33. Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ (2021).
  34. ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przekroje organotypoweelektroporacja in uteroelektroporacja ex uteromikroskopia superrozdzielczaobrazowanie żywych komórekdynamika aktynyanaliza kymograficzna
In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.