In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Neurony to wysoce spolaryzowane komórki, które reprezentują podstawową jednostkę obliczeniową w układzie nerwowym. Odbierają i emitują informacje, które opierają się na podziałach na miejsca wejściowe i wyjściowe: odpowiednio dendryty i aksony¹. Podczas tworzenia aksony rozszerzają się, poruszając się w niewiarygodnie złożonym środowisku, aby dotrzeć do celu. Nawigacja w aksonach jest kierowana przez stożek wzrostu, strukturę czuciową znajdującą się na końcu rozwijającego się aksonu. Stożek wzrostu jest odpowiedzialny za wykrywanie sygnałów środowiskowych i przekształcanie ich w dynamiczną reorganizację przestrzenną swojego cytoszkieletu^2,3. Powstałe w ten sposób reakcje morfomechaniczne instruują stożek wzrostu, aby wysunął się lub wycofał z sygnału wyzwalającego, co prowadzi do określonych manewrów aksonów.

Obecne zrozumienie dynamiki rozciągania aksonów i wzrostu wynika z badań oceniających wzrost aksonów na dwuwymiarowych (2D) podłożach^2,4,5,6,7. Te pionierskie badania zidentyfikowały wyrafinowane wzajemne oddziaływanie między stożkami wzrostu a podłożami wzrostu i ujawniły uderzające różnice w zależności od cech podłoża, takich jak przyczepność i sztywność^8,9. Na podstawie tych spostrzeżeń postawiono hipotezę, że zewnątrzkomórkowe sygnały środowiskowe dyktują wzrost aksonów, przy czym cytoszkielet stożka wzrostu wykonuje ten wzrost^2,10,11,12. Warto zauważyć, że neurony mogą rozszerzać aksony w podłożach nieadhezyjnych (np. polilizyna, poliornityna)¹³. Co więcej, sztywność podłoża może wpływać na szybkość wzrostu aksonów niezależnie od kompleksów adhezyjnych komórek⁸. W związku z tym badanie dynamiki stożków wzrostu w samych substratach 2D nie może dokładnie modelować równowagi sił, które powstają w wyniku interakcji aksonalnych stożków wzrostu z fizjologicznie istotnymi środowiskami trójwymiarowymi (3D), takimi jak te występujące in vivo.

Aby przezwyciężyć ograniczenia testów 2D, wzrost aksonów i dynamika stożków wzrostu zostały zbadane w matrycach 3D^8,9. Macierze te stanowią bardziej fizjologiczny kontekst, a jednocześnie pozwalają na badanie wewnętrznych mechanizmów wzrostu aksonów w komórce. Umożliwia badanie stożka wzrostu w sposób jednokomórkowy w różnych warunkach i zabiegach farmakologicznych⁹. W takich środowiskach 3D aksony wykazywały wyraźną dynamikę cytoszkieletu i rosły szybciej niż te obserwowane w neuronach hodowanych w 2D⁹. Te eleganckie badania wykazały wpływ dodatkowego wymiaru na reorganizację cytoszkieletu stożka wzrostu, a w konsekwencji na jego zachowanie.

Pomimo oczywistych zalet prezentowanych przez matryce 3D w porównaniu z powierzchniami 2D we wspieraniu natywnego rozwoju neuronów i wzrostu aksonów, pozostają one uproszczonym syntetycznym rusztowaniem, które nie jest w stanie odzwierciedlić złożoności dynamiki obserwowanej w tkance ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W tym przypadku dostarczanie plazmidów reporterowych za pomocą elektroporacji ex utero i in utero połączono z organotypową hodowlą plastrów mózgu i obrazowaniem in situ w super rozdzielczości w celu analizy dynamiki stożków wzrostu w kontekście fizjologicznym. Metodologia ta pozwala na wizualizację rozwijających się aksonów przy jednoczesnym doświadczaniu trójwymiarowości środowisk in vivo i złożoności ich składu fizykochemicznego. Na koniec opisano przyjazne dla użytkownika procedury pomiaru wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu przy użyciu powszechnie licencjonowanego i publicznie dostępnego oprogramowania.

Eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne z odpowiednimi przepisami instytucjonalnymi i federalnymi. W protokole tym wykorzystano embrionalne samice myszy C57BL / 6JRj w dniu 15,5 i 12,5 (E15,5 i E12,5). Doświadczenia przeprowadzono zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt Krajowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV)).

1. Przygotowanie plazmidów do iniekcji

1. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu Maxiprep bez endotoksyn zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
2. Wymieszaj wybrane DNA w żądanym stężeniu (Tabela 1) i 10% roztwór Fast Green (patrz Tabela materiałów), aby zobrazować dostarczanie mieszaniny DNA do komór mózgu.
   UWAGA: Specyficzne plazmidy użyto do rzadkiego znakowania neuronów korowych (Figura 1A), nitkowatych struktur aktyny (F-aktyna) w stożku wzrostu (Figura 1B) oraz podwójnego znakowania stożków wzrostu w tej samej korze (Figura 1C). Wszystkie plazmidy (Tabela 1) użyte w tym protokole zostały zdeponowane w Addgene (patrz Tabela Materiałów).
3. Przygotować szklane kapilary za pomocą ściągacza do elektrod kapilarnych zgodnie z następującym programem: ciśnienie: 500, ciepło: 800, ciągnięcie: 30 i prędkość: 40.
4. Załaduj 15 μl mieszanki DNA/Fast Green do każdej szklanej kapilary za pomocą końcówek do pipet z mikroładowarką.
   UWAGA: Upewnij się, że nie tworzą się bąbelki.
5. Przechowuj naczynia włosowate wypełnione DNA w 10-centymetrowym naczyniu z kawałkiem plasteliny w poprzek średnicy naczynia. Kapilary można ładować i przechowywać w temperaturze 4 °C na dzień przed eksperymentem. Uszczelnij tylny koniec kapilary elastyczną folią, aby zapobiec wysuszeniu.

2. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj buforowany roztwór soli Hanka uzupełniony glukozą (HBSS-G).
   1. Dodaj 0,5% 20% bulionu glukozy do butelki 1x HBSS. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. W celu ekstrakcji zarodków należy na krótko przed pobraniem zarodków bąbelkować roztwór HBSS-G z karbogenem (95%_O2 i 5%_CO2) przy użyciu bulgoczącego kamienia.
2. Rozwiązanie Slice Media
   1. Świeże plastry zawierające Neurobasal 1x, 5% surowicę końską, 5% surowicę płodową cielęcą, suplement B27 1:50, suplement L-glutaminy 1:400, penicylinę-streptomycynę 1:200 i suplement Neuropan-2 1:100 (przy pH = 7,3), należy przygotować w sterylnych warunkach (patrz tabela materiałów).
   2. Przygotuj 3 cm naczynia z 1 ml pożywki w plastrach każde. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 35 °C z 5% CO₂ przez co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem w celu zrównoważenia pH podłoża poprzez wymianę gazową.
      UWAGA: Równowaga pH pożywki jest spowodowana zakwaszeniem pożywki przez CO₂ z inkubatora. Nośniki Slice można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
3. Roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (3%)
   1. Odważ żądaną ilość proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia i rozpuść w odpowiedniej objętości 1x HBSS-G w szklanej butelce. Potrzeba około 7 ml roztworu agarozy na mózg.
   2. Umieść butelkę w kuchence mikrofalowej na 2-3 minuty, z luźno umieszczoną nakrętką i potrząsaj co 10-20 s.
   3. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku umieścić butelkę w łaźni wodnej lub kąpieli perełkowej nastawionej na 37 °C co najmniej 1 godzinę przed eksperymentem, aby agaroza ostygła.
      UWAGA: Zaleca się dwukrotne podgrzanie agarozy w ciągu 15 minut, aby upewnić się, że proszek agarozy się rozpuścił. Ma to kluczowe znaczenie dla prawidłowego przylegania agarozy do tkanki mózgowej. Do pomiaru temperatury roztworu agarozy podczas osadzania mózgów należy użyć termometru, upewniając się, że wynosi ona 37-40 °C. Mózgi zwierząt w różnym wieku mają różną sztywność. Zaleca się badanie zakresu stężeń agarozy w celu znalezienia jednorodności między tkanką a agarozą.
   4. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,3% Triton X-100 (PBS-T).
   5. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,2% azydkiem sodu (PBS-NaN₃).
      UWAGA: Roztwory opisane w krokach 2.4-2.5 są przeznaczone do stosowania w późniejszym etapie immunohistochemii.

3. Przygotowanie stanowiska chirurgicznego

1. Oczyść stanowisko operacyjne 70%-96% etanolem i umieść podkład operacyjny na powierzchni stanowiska.
2. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, spłukując je 70%-96% etanolem, a następnie sterylizując na sucho w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
3. Wyczyść platynowe elektrody pęsety (patrz tabela materiałów) 70%-96% etanolu przed podłączeniem do generatora impulsów.
4. Włóż szklaną kapilę wypełnioną DNA/Fast Green do uchwytu kapilary. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie odłamać końcówkę kapilary za pomocą drobnych nożyczek i przebadać przepływ roztworu w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną lub wodą.
   UWAGA: Rysunek 2A,B pokazuje konfigurację stanowiska chirurgicznego i narzędzia używane do elektroporacji ex utero (EUE) i elektroporacji in utero (IUE).
5. W przypadku IUE należy rozgrzać roztwór soli fizjologicznej do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.

4. Ekstrakcja zarodków

1. Umieść ciężarną mysz w komorze induktora znieczulenia z 5% izofluranem, aż mysz zostanie głęboko znieczulona. Potwierdź znieczulenie przez brak odruchu wycofania pedału.
2. Przenieś mysz do podkładu operacyjnego i utrzymuj izofluran na poziomie 1,5%-2% przez stożek nosowy.
3. Nałóż maść na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
4. Ogol brzuch myszy, a następnie użyj gazy nasączonej etanolem o stężeniu 70%-96%, aby usunąć ogolone włosy. Oczyść obszar za pomocą betadyny.
5. Za pomocą sterylnych małych nożyczek chirurgicznych wykonaj 2 cm nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej brzucha, a następnie 1,5 cm nacięcie mięśni.
   UWAGA: Wielkość nacięcia zależy od wielkości zarodka. Rzeczywiście, większe zarodki będą wymagały większego nacięcia, aby umożliwić ich ekstrakcję.
6. Wytnij otwór w środku gazy wystarczająco szeroki, aby zmieścił się w nacięciu skóry (o średnicy ~2 cm), nasącz go ciepłą solą fizjologiczną i umieść wokół otworu brzusznego.
7. Wyciągnij oba rogi macicy za pomocą wacika nasączonego ciepłą solą fizjologiczną lub za pomocą kleszczy, ostrożnie chwytając przestrzenie między zarodkami, aby je wyciągnąć. Umieść zarodki na mokrej gazie (Rysunek 2C).
   UWAGA: Nawet niewielkie uszkodzenie naczyń krwionośnych i naczyń włosowatych wokół rogów macicy prawdopodobnie spowoduje obfite krwawienie. Dlatego należy zawsze unikać bezpośredniego dotykania tych unaczynionych obszarów.
8. Rozetnij worek maciczny i usuń każdy zarodek (Rysunek 2D).
9. Eutanazja każdego zarodka natychmiast po ekstrakcji za pomocą zstępującego cięcia ukośnego, zapewniającego całkowite przecięcie rdzenia kręgowego (Rysunek 2E).
10. Umieścić zarodki w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym HBSS-G na lodzie.
    UWAGA: Unika się ścinania zarodka, aby zapobiec wyciekowi DNA/mieszanki Fast Green z mózgu i ułatwić ustawienie zarodka w posiadaczu (patrz elektroporacja ex utero, krok 5).
11. Złożyć ofiarę matki natychmiast po ekstrakcji zarodków, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: W tym przypadku matka jest poddawana eutanazji pod narkozą, aby oszczędzić jej dalszego bólu lub cierpienia po zabiegu, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez ustawę o dobrostanie zwierząt Państwowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV).

5. Elektroporacja ex utero (EUE)

1. Weź zarodek i umieść go w uchwycie.
   UWAGA: Nacięta końcówka pipety o pojemności 1 ml przymocowana do końca skrobaka do komórek służy jako uchwyt na zarodki. Istotne jest, aby podczas zabiegu trzymać ramiona zarodków na zewnątrz końcówki, aby zapobiec ich wsunięciu się do końcówki (Rysunek 2F-I). Średnicę końcówki pipety można łatwo regulować, aby pomieścić zarodki o różnych rozmiarach. Wytnij drugą końcówkę na długość, w której średnica końcówki odpowiada rozmiarowi zarodka i użyj jej jako wkładki adaptera do wspomnianego powyżej uchwytu.
2. Ostrożnie wprowadzić szklaną kapilarnę wypełnioną DNA/Fast Green przez czaszkę zarodka do komory bocznej i wstrzyknąć 2-3 μl mieszanki plazmidu DNA (Rysunek 1A,B; Tabela 1) do każdej komory (Rysunek 2F).
   UWAGA: Użyj szwów lambdoidalnych i strzałkowych jako wskazówki do lokalizacji wstrzyknięcia DNA. Szwy lambdoidalne i strzałkowe to włókniste stawy łączące płytkę kostną czaszki. Pierwsza z nich łączy kość ciemieniową z kością potyliczną, a druga łączy dwie kości ciemieniowe.
3. Trzymaj głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby wycelować w żądany obszar mózgu (w tym przypadku kąt 60 °), z katodą skierowaną w stronę, w której planowany jest transfer DNA (Rysunek 2G-H).
4. Zastosuj pięć impulsów przy napięciu 30 mV w odstępie 1 s i czasie trwania 50 ms za pomocą generatora impulsów o fali prostokątnej.
   UWAGA: Należy pamiętać, że mózgi w EUE doświadczają bardziej efektywnego pola elektrycznego niż te w IUE. W związku z tym, przy danym stężeniu DNA, EUE skutkuje wyższą efektywnością transferu DNA niż IUE, a stężenia DNA muszą być odpowiednio dostosowane.
5. Jeśli pożądana jest obustronna elektroporacja, powtórz kroki 5.3-5.4 z katodą i anodą odzwierciedlającymi poprzednią pozycję, aby celować w korę przeciwległą.
   UWAGA: Ponieważ do obu komór wstrzyknięto DNA, kora obu półkul była celowana.
6. Umieść elektropostowany zarodek w 6-centymetrowym naczyniu zawierającym lodowaty HBSS-G. Powtórzyć kroki 5.1-5.6 dla wszystkich wymaganych zarodków.

6. Elektroporacja in utero (IUE)

1. Ciężarnej myszy wstrzyknąć środek przeciwbólowy; 50 μl buprenorfiny (0,1 mg/kg) (patrz tabela materiałów) podskórnie, 20 minut przed zabiegiem.
2. Wykonaj kroki 4.1-4.8 z rozdziału dotyczącego ekstrakcji zarodków.
   UWAGA: Unikaj niepotrzebnego wystawiania zarodków na działanie promieni słonecznych, przykrywając je sterylną gazą nasączoną ciepłą solą fizjologiczną.
3. Za pomocą opuszków palców delikatnie obróć zarodek wewnątrz macicy, aż zostaną zlokalizowane szwy lambdoidalne i strzałkowe (Ryc. 2J). Ostrożnie wprowadź naczynia włosowate DNA/Fast Green glass przez ścianę macicy i czaszkę zarodka do komory bocznej i wstrzyknij 2-3 μl mieszanki plazmidu DNA (Rysunek 1A, C) do jednej lub obu komór zgodnie z życzeniem ( Rysunek 2K-L).
   UWAGA: Nadmierny nacisk palca na rogi macicy może prowadzić do zapadnięcia się worka owodniowego.
4. Trzymaj głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety pod odpowiednim kątem, aby celować w żądany obszar mózgu (w tym przypadku pod kątem 60°), z katodą skierowaną w stronę, w której ma być przeprowadzony transfer DNA. Unikaj ściskania macicy, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się worka owodniowego (Ryc. 2M).
5. Zastosuj pięć impulsów o napięciu 35 mV w odstępie 600 ms i czasie trwania 50 ms za pomocą generatora impulsów fali prostokątnej.
6. Jeśli wstrzyknięto obie komory boczne, powtórz kroki 6,5-6,6 z katodą i anodą odzwierciedlającymi poprzednią pozycję, aby celować w korę przeciwległą
.
7. Powtórzyć kroki 6.3-6.6 dla wszystkich wymaganych zarodków.
8. Gdy wszystkie wymagane zarodki zostaną poddane elektroporacji, użyj wacika nasączonego solą fizjologiczną, aby delikatnie umieścić rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej.
   UWAGA: Dodanie roztworu soli fizjologicznej do jamy otrzewnej pomoże rogom macicy przesunąć się z powrotem na miejsce.
9. Zszyj nacięcia mięśni i skóry za pomocą materiału do szycia 5-0. Użyj klipsów do szwów, aby zabezpieczyć ranę i zdezynfekować ranę szwową, spryskując ją betadyną (Rysunek 2N-P).
10. Wstrzyknąć myszowi 200 μl 5% glukozy podskórnie.
11. Wstrzyknąć myszowi antybiotyk; 50 μl enrofloksacyny (5 mg/kg) podskórnie (patrz tabela materiałów).
12. Umieść mysz z powrotem w klatce regeneracyjnej i utrzymuj ciepło za pomocą światła ocieplającego dalekiej podczerwieni lub poduszki grzewczej przez co najmniej 20 minut po zabiegu (Rysunek 2Q).
13. Codziennie monitoruj mysz i wstrzyknij meloksykam po zabiegu w celu złagodzenia bólu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i federalnymi.
14. Pobrać zarodki 2 dni po zabiegu (tj. E17.5) zgodnie z krokiem 4.

7. Ekstrakcja mózgu i osadzenie w agarozie

UWAGA: Zaleca się wykonanie następujących kroków pod mikroskopem preparacyjnym dla lepszej precyzji. Uniknięcie uszkodzenia mózgu ma kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu.

1. Ustaw narzędzia do ekstrakcji w sterylnej przestrzeni roboczej pod okapem preparacyjnym (Rysunek 3A).
2. Oddziel głowę zarodka od reszty ciała za pomocą nożyczek do preparowania.
3. Napraw głowę, jak pokazano na Rysunek 3C, a następnie usuń skórę i czaszkę, przecinając wzdłuż linii środkowej, zaczynając od podstawy głowy w kierunku nosa (Rysunek 3D).
4. Obierz skórę i czaszkę z boku, tworząc wystarczająco dużą szczelinę (~1 cm), aby można było wyciąć mózg.
5. Aby usunąć mózg, włóż zamkniętą końcówkę sterylnych nożyczek preparacyjnych, zaczynając od spodu opuszki węchowej przesuwającej się w kierunku pnia mózgu (Ryc. 3E).
6. Odetnij pień mózgu i przytnij luźne kawałki opon mózgowych wokół mózgu (Rysunek 3F).
   UWAGA: Luźne opony mózgowe często powodują, że plastry pozostają przyczepione do bloku agarozy po pokrojeniu, co prowadzi do oderwania tkanki od agarozy podczas zbierania plastrów.
7. Powtórzyć kroki 7.1-7.6 dla wszystkich zarodków i trzymać mózgi na lodzie (najlepiej nie dłużej niż 30 minut) aż do etapu osadzania.
   UWAGA: Poniższe kroki 7.7.1-7.7.4 odnoszą się do ekstrakcji mózgu E12.5.
   1. Odizoluj czubek głowy tuż pod okiem, jak pokazano na Rysunek 3G.
   2. Przetnij skórę i czaszkę na pniu mózgu, podążając za linią przerywaną, jak pokazano na Rysunek 3H, bez usuwania pnia mózgu.
   3. Wykonaj 2-milimetrowe nacięcie skóry i czaszki z tyłu głowy, jak pokazano na Rysunek 3I (patrz rysunki dla jasności).
      UWAGA: To nacięcie zapewnia początkowe punkty chwytania do odklejania warstw skóry i czaszki. Zazwyczaj schodzą jako jedna warstwa. Typowy rozmiar nacięcia wynosi 2 mm, co odpowiada długości krawędzi tnącej zastosowanych nożyczek z mikrosprężyną.
   4. Rozpocznij odklejanie warstw skóry i czaszki, zabezpieczając jedną stronę nacięcia i ostrożnie pociągając drugą. Z taką samą ostrożnością zakończ, odklejając podstawę głowy, aż do uwolnienia mózgu (Rysunek 3J).
      UWAGA: Należy to zrobić z wielką ostrożnością, obserwując, że mózg nie jest ciągnięty wzdłuż warstw tkanki. Naprzemiennie boki, aby usunąć tkankę pokrywającą mózg
   .
8. Wlej ciepłą agarozę (w temperaturze 37-40 °C) do 3 cm naczynia
.
9. Podnieś mózg za pomocą perforowanej łyżki i usuń nadmiar płynu, wcierając spód łyżki o suchą bibułkę. Umieść mózg w naczyniu z agarozą.
   UWAGA: Konieczne jest usunięcie jak największej ilości płynu z okolic mózgu, aby umożliwić lepsze przyleganie agarozy do tkanki.
10. Naczynie z płynną agarozą wyłożyć na lód. Za pomocą mniejszej łyżki mieszaj agarozę przez 10 sekund, aby równomiernie ostygła. Manewruj mózgiem do środka naczynia. Umieść mózg poziomo w naczyniu grzbietem do góry, upewniając się, że jest całkowicie pokryty agarozą ze wszystkich kierunków (Rysunek 3K).
    UWAGA: Mózgi często opadają na dno naczynia po umieszczeniu w agarozie; Podnieś mózg za pomocą małej łyżki, aż utworzy się szczelina 1-2 mm pod mózgiem.
11. Powtórz kroki 7.8-7.10 dla wszystkich mózgów.
12. Po polimeryzacji agarozy dodaj 500 μl HBSS-G na blok agarozy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie przykryj naczynie lodem.
    UWAGA: Trzymaj próbkę na lodzie przez 5 minut przed podziałem na sekcje, aby temperatura mózgu osiągnęła 4 °C.

8. Organotypowa kultura plastrów

UWAGA: Oczyść wibratom i otaczające go powierzchnie etanolem o stężeniu 70%-96%, aby uniknąć zanieczyszczenia plasterków. Konfiguracja stacji roboczej z wibratomem (patrz tabela materiałów) jest pokazana w Rysunek 3B.

1. Napełnij tackę buforową wibratomu zimnym HBSS-G, a zewnętrzną tacę lodem, aby utrzymać HBSS-G w niskiej temperaturze przez cały czas trwania zabiegu.
2. Stale zaopatrywać HBSS-G w tacę buforową w karbogen za pomocą bulgoczącego kamienia.
3. Używając świeżego ostrza, wykonaj duże cięcie (~2 x 2 cm) wokół mózgu i usuń blok agarozy zawierający mózg, z wystarczającą ilością otaczającej agarozy, aby przyciąć agarozę do małego prostokątnego bloku.
   UWAGA: Ten krok umożliwia regulację kąta bloku tak, aby oś strzałkowa mózgu była prostopadła do płytki wibratomowej, a oś koronalna była wyrównana równolegle do ostrza. Pozostaw około 5 mm agarozy po grzbietowej stronie mózgu, aby ułatwić obchodzenie się z plastrami.
4. Umieść małą kroplę szybkoprzylepnego, bezrozpuszczalnikowego kleju superglu na środku uchwytu próbki i rozprowadź w obszarze, który pokryje spód bloku agarozy.
5. Delikatnie podnieś blok agarozy i osusz spód, wcierając w bibułę. Umieść klocek na sklejonym obszarze uchwytu na próbki, rostralną stroną mózgu do góry. Umieść uchwyt na próbkę na lodzie i pozostaw klej do wyschnięcia na 1 minutę.
6. Po wyschnięciu kleju umieść uchwyt próbki w tacy buforowej.
7. Pokrój mózg w plastry koronalne pod kątem 15°.
   UWAGA: Grubość plastrów może się różnić w zależności od zastosowania. Tutaj mózgi zostały pocięte na grubość 150 μm. Ustaw prędkość wibratomu na 1,0-1,5 mm/s, aby przyciąć nadmiar agarozy na wierzchu i przyciąć opuszki węchowe. Zmniejsz prędkość cięcia do 0,5 mm/s w celu zbierania wycinków kory mózgowej do analizy. Większość wibratomii można zatrzymać, aby zebrać każdy plasterek. Jeśli wystąpi obniżona jakość plastrów lub oderwanie tkanki od agarozy, pomocne może być zmniejszenie prędkości cięcia lub wymiana ostrza wibratomu.
8. Za pomocą czystych szpatułek zbierz plastry mózgu i umieść je na membranie z politetrafluoroetylenu (PTFE), unieruchomione w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm przy użyciu parafiny (do pięciu plasterków mózgu / membrana) (Rysunek 3L-M).
   UWAGA: Zamocuj membranę PTFE w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm za pomocą wosku. To ustabilizuje błonę podczas dodawania pożywki do hodowli plastrów, a także podczas obrazowania.
9. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl usuń nadmiar HBSS-G z okolic plastrów na membranie PTFE, pozostawiając plastry do półsucha.
10. Dodać 500 μl podłoża warstwowego (wstępnie podgrzanego do 35 °C) bezpośrednio do przestrzeni pod membraną PTFE.
    UWAGA: Podczas dodawania podłoża pod membraną nie mogą tworzyć się pęcherzyki. Spowoduje to pozostawienie całych lub częściowych plasterków bez wymiany mediów. Wymieniaj 200 μl pożywki co 2 dni w hodowli lub po każdej sesji obrazowania.
11. Inkubować plastry w temperaturze 35 °C z 5% CO₂ .

9. Immunohistochemia

1. Utrwal plastry 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) uzupełnionego 4% sacharozą na naczynie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
   UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Wykonaj czynności utrwalające pod maską chemiczną i odpowiednio zutylizuj odpady PFA.
2. Umyj plastry dwukrotnie 300 μl PBS przez 5 minut. Przenieś plastry na płytkę 24-dołkową.
   UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać. Dodać PBS-NaN₃ do plastrów i przechowywać w temperaturze 4 °C. NaN₃ jest związkiem toksycznym; Podczas obchodzenia się z roztworami należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawice. Kroki 9.3-9.10 należy wykonać w wytrząsarce orbitalnej.
3. Plastry zalać 300 μl 0,1 M glicyny w temperaturze 4 °C przez noc.
4. Wypłukać glicynę za pomocą PBS w temperaturze RT 3x przez 10 min.
5. Przepuszczać plastry za pomocą 300 μl PBS-T w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
6. Blokuj przy użyciu 10% surowicy koziej w PBS-T w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
7. Dodać 300 μl przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-wimentynowe w rozcieńczeniu 1:200; patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w 10% surowicy koziej w roztworze PBS-T w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: W krokach 9.8-9.12 plastry były chronione przed światłem, aby zapobiec utracie fluorescencji.
8. Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe PBS w temperaturze 3x RT przez 20 min.
   UWAGA: PBS został użyty zamiast PBS-T do wymywania Triton X-100.
9. Dodać 300 μl przeciwciała drugorzędowego (Alexa Fluor 488 lub 647 w rozcieńczeniu 1:400; patrz tabela materiałów) w PBS w temperaturze RT przez 2 godz.
   UWAGA: DAPI dodaje się natychmiast po usunięciu przeciwciała drugorzędowego w rozcieńczeniu 1:10 000 przez 5 min.
10. Przemyć przeciwciało drugorzędowe PBS w temperaturze 3x RT przez 20 min. Przemyć wodą destylowaną 2x przez 1 min.
11. Za pomocą cienkiego pędzla przenieść plastry na szkiełko do szkiełka, a następnie wysuszyć w temperaturze 30 °C przez 20 minut.
12. Zamontuj plastry za pomocą wodnego podłoża montażowego. Trzymaj slajdy w RT przez noc, aby nośnik montażowy mógł się zamocować.

10. Akwizycja obrazowania

UWAGA: Niezależnie od podejścia do dostarczania DNA (IUE lub EUE), wycinki były analizowane w tym samym przedziale wieku rozwojowego (E17.5-E18.5). IUE pozwala neuronalnym przodkom dzielić się i rozwijać przez kolejne dwa dni in vivo. Z drugiej strony EUE pozwala na śledzenie wczesnych zdarzeń rozwojowych.

1. Włączyć inkubator komorowy i ustawić go na 35 °C z 5% CO₂ - najlepiej 4 godziny przed obrazowaniem - aby umożliwić zrównoważenie elementów mikroskopu w temperaturze 35 °C.
2. Do głębokiego obrazowania plastrów należy użyć obiektywów zanurzonych w wodzie, aby zmniejszyć niezgodność współczynnika załamania światła między tkanką a obiektywem.
   UWAGA: W tym przypadku zastosowano tryb obrazowania w super rozdzielczości. Obrazowanie przez membranę PTFE wymaga obiektywu o dużej odległości roboczej (~1 mm). Jeśli obiektyw o dużej odległości roboczej nie jest dostępny, plastry można przenieść do 8-dołkowego naczynia ze szklanym dnem. Aby przenieść plastry, dodaj 1 ml pożywki w plastrach na wierzch membrany, a następnie użyj szpatułki, aby podnieść plasterek i przenieść go do studzienki zawierającej 200 μl podłoża. Usuń nadmiar pożywki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając plastry do półsuchości.
3. Aby zobrazować wzrost aksonów, zlokalizuj obszar kory o niskiej lub średniej gęstości komórek. Aby zobrazować dynamikę stożka wzrostu, zlokalizuj stożek wzrostu w strefie pośredniej kory lub strefie podkomorowej.
4. Zdefiniuj rozmiar stosu Z w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów). W przypadku wzrostu aksonów w dużym stosie Z ustaw rozmiar kroku 2 μm. W przypadku stożków wzrostu w mniejszym stosie Z ustaw rozmiar kroku 1 μm.
   UWAGA: Zawsze uwzględniaj potencjalny ruch stożka wzrostu i aksonu przez płaszczyzny x, y i z. Aksony rosną znacznie szybciej w kulturach organotypowych niż w kulturach in vitro. W tym przypadku wystarczający był stos z o wielkości około 80 μm, aby zobrazować wzrost aksonów. Dla dynamiki stożka wzrostu odpowiedni był stos z wynoszący ~6 μm.
5. Aby zobrazować wzrost aksonów neuronów na większym obszarze, zdefiniuj skan kafelkowy.
6. Użyj najniższej możliwej mocy lasera, aby zminimalizować ryzyko bielenia stożków wzrostu podczas akwizycji.
7. Aby zobrazować wzrost aksonów, należy wykonać filmy poklatkowe przez 2 godziny w odstępie 5 minut. Aby zobrazować dynamikę stożka wzrostu, należy wykonać zdjęcia poklatkowe przez 2-5 minut w odstępie 2,5-3 s.

11. Analiza danych

1. Mierz szybkość wzrostu aksonów za pomocą kymografów
   1. Otwórz plik obrazu w Fiji¹⁴ za pomocą File > Open i wybierz obraz.
   2. Uzyskaj projekcję maksymalnej intensywności filmu poklatkowego za pomocą stosów obrazu > > projekcji Z > projekcji maksymalnej intensywności.
   3. Przejdź przez film poklatkowy i zlokalizuj rosnący akson.
   4. Po zlokalizowaniu narysuj linię przez rosnący akson. Zacznij od czubka aksonu w pierwszej klatce i podążaj za aksonem przez cały film poklatkowy.
   5. Wygeneruj kimograf za pomocą wtyczki KymoResliceWide.
   6. Ustaw skalę kimografu, przechodząc do Właściwości > obrazu. Ustaw odległość w μm w polu Szerokość piksela i ustaw czas w s lub min w polu Wysokość piksela.
   7. Przejdź do pozycji Analizuj > mierz.
      UWAGA: Podany zostanie kąt względem osi x.
   8. Oblicz prędkość wzrostu aksonów, podstawiając kąt w następującym równaniu: SIN(RADIANY(θ))/COS(RADIANY(θ)) w arkuszu kalkulacyjnym.
2. Zmierz objętość stożka wzrostu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów).
   1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu za pomocą opcji Plik > Otwórz i wybierz interesujący Cię plik.
   2. Wybierz Kreatora dodawania nowych powierzchni.
      UWAGA: W lewym dolnym rogu pojawi się sekcja z sześcioma krokami do ręcznej edycji.
   3. W kroku 1 - w obszarze Ustawienia algorytmu - wybierz opcję Segmentuj tylko region zainteresowania. W kroku 2 przytnij ramkę, aby zmieściła się w całym stożku wzrostu we wszystkich ramkach.
   4. Utrzymuj próg intensywności bezwzględnej w kroku 3 i upewnij się, że cały obszar stożka wzrostu jest progowany w kroku 4.
   5. W kroku 5 wybierz opcję Liczba wokseli lmg = 1 w obszarze Typ filtra.
      UWAGA: W ostatnim kroku może zostać utworzonych wiele zestawów pomiarów. W tym przypadku utworzono tylko jeden pomiar objętości.
   6. Wybierz przycisk Wykonaj, aby wykonać wszystkie kroki tworzenia i zakończyć działanie Kreatora dodawania nowych powierzchni.
   7. Na karcie Statystyki w górnej części okna kreatora wybierz pozycję Określone wartości i wolumin na karcie Szczegółowe.

Pokazane są reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą opisanej metody workflow. W niniejszej demonstracji wykorzystano myszy E15.5, chociaż protokół ten można łatwo dostosować do praktycznie wszystkich grup wiekowych embrionalnych, od E11 do późnego E17. W niniejszym protokole elektroporacja ex utero (EUE; Rysunek 2A, 2C-I) lub elektroporacja in utero (IUE; Rysunek 2B,C i 2J-Q) zostały użyte do dostarczenia plazmidów do neuronów progenitorowych wyściełających boczne komory. Te progenitory są źródłem przyszłych neuronów projekcyjnych kory mózgowej (CPN)15,16. Mieszanki plazmidowe przygotowano w celu stymulowania rzadkiej, specyficznej dla neuronów ekspresji ukierunkowanej na błonę (Lyn)-mNeonGreen (Figura 1A) lub wzmocnionej LifeAct (E)GFP (Figura 1B) w celu oceny ogólnego zachowania i dynamiki aktyny odpowiednio w stożkach wzrostu. Ponadto uwzględniono mieszankę plazmidów mającą na celu znakowanie pojedynczych neuronów za pomocą turbo(t)-RFP lub zoanthus sp. (Zs) zielonego białka fluorescencyjnego (ZsGreen) (Figura 1C). Ułatwia to monitorowanie zachowania stożków wzrostu z niezależnych sąsiednich neuronów.

Sekcja mózgu z elektroporowanych embrionów jest kluczowym krokiem, który musi być starannie wykonany, aby uzyskać wysokiej jakości plastry, zachowując natywną strukturę mózgu. Narzędzia do preparacji i wibratom zostały wcześniej przygotowane i starannie wysterylizowane etanolem (Rysunek 3A,B). Następnie głowy embrionów poddanych elektroporacji zostały starannie wypreparowane i pobrano mózgi. Pokazano tu reprezentatywną sekcję mózgów z embrionów poddanych EUE w E15 (Ryc. 3C-F) i E12.5 (Ryc. 3G-J). Mózgi są natychmiast zamykane w matrycy agarozowej, krojone w plastry i umieszczane na wkładkach membrany PTFE w naczyniu z dolnej szklanki w celu inkubacji (Rysunek 3K-M).

Stan zdrowia wycinków mózgu jest istotnym punktem dla kontroli, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Codziennie przeprowadzana była kontrola wzrokowa pod kątem wszelkich zanieczyszczeń. Dodatkowo, po sfinalizowaniu hodowli, wycinki mózgu są utrwalane i poddawane immunohistochemii. Tutaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) został użyty do kontrolowania ogólnej organizacji komórkowej i barwienia wimentyny w celu ujawnienia organizacji gleju; w szczególności rusztowanie promieniste glejowe (RG). Zazwyczaj pomyślnie wyhodowane wycinki mózgu pochodzące z IUE lub EUE wykazują normalną dystrybucję komórkową, jak ujawniono za pomocą DAPI i nieco zorganizowanej tablicy RG z wierzchołkowo zorientowanymi procesami kontaktowymi z pial17 (Rysunek 4A,B odpowiednio). Od czasu do czasu obserwuje się wyraźne zaburzenia w rusztowaniu RG w hodowanych wycinkach mózgu, zwłaszcza w tych pochodzących z elektroporacji EUE (Rysunek 4C). Wycinki mózgu ze skrajnie zdezorganizowanym rusztowaniem RG wykazują upośledzoną migrację neuronów i wadliwy wzrost aksonów (nie pokazano). W związku z tym kontrolowanie rusztowania RG jest łatwą metodą post-hodowlaną do sortowania danych uzyskanych z wiarygodnych wycinków mózgu.

Wycinki mózgu pochodzące z IUE lub EUE z mieszanką plazmidu eksprymującego Lyn-mNeonGreen powodują podobnie rzadkie znakowanie neuronów. Reprezentatywny piramidalny CPN wyrażający Lyn-mNeonGreen i dynamiczne zachowanie jego stożka wzrostu jest pokazany jako przykład (Rysunek 5A i Dodatkowe wideo 1, u góry po lewej). Ponadto neurony znakowano za pomocą plazmidu wyrażającego sondę aktynową w celu analizy dynamiki aktyny w aksonalnych stożkach wzrostu in situ (Figura 5B i dodatkowe wideo 1, na dole po lewej). Eksperymenty in situ przeprowadzono również z podwójnym projektem plazmidu Cre/Dre z ekspresją fluoroforu (Rysunek 1C i Dodatkowe wideo 1, po prawej). Fluorofory tRFP lub ZsGreen w tym plazmidzie mogą być specyficznie i indywidualnie aktywowane odpowiednio przez rekombinazy Dre lub Cre w sąsiednich neuronach (Ryc. 5C). Ten eksperymentalny zestaw pozwala na równoległą analizę stożków wzrostu z neuronów kontrolnych z sąsiednimi zmodyfikowanymi neuronami (dowolna utrata lub zysk funkcji). Pozwala to uniknąć zmienności wynikającej z używania różnych wycinków do testowania warunków kontrolnych i eksperymentalnych.

Przeanalizowano kimografy wygenerowane z nagranego filmu, z których można łatwo uzyskać dynamiczne parametry wzrostu, takie jak aktywność wystająca w czasie i długość wzrostu (Rysunek 6A). Zauważ, że prosta regulacja rozdzielczości czasowej filmu poklatkowego pozwala na pomiar prędkości wydłużania aksonów przez 2 godziny (Rysunek 6A). Co więcej, zmienność objętości stożka wzrostu w czasie - miara ogólnej dynamicznej aktywności stożka wzrostu - może być łatwo uzyskana, w tym przypadku za pomocą licencjonowanego oprogramowania (Rysunek 6B i Rysunek 6E,F). Można to wykorzystać do oceny szybkości bieżni aktynowej i równowagi filopodiów/lamellipodiów podczas eksploracji stożków wzrostu.

Rysunek 1: Schematy plazmidów używanych w protokole. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Istotne informacje dotyczące składników plazmidu i pochodzenia fluoroforu znajdują się w pudełkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przebieg pracy elektroporacji ex utero i in utero myszy E15.5. (A) Ustawienie stanowiska chirurgicznego do elektroporacji ex utero. (B) Ustawienie stanowiska chirurgicznego do elektroporacji in utero. (C) Rogi macicy wyciągnięte na zewnątrz jamy brzusznej znieczulonej myszy. (D) Ekstrakcja zarodka z worka macicy. (E) Ofiarowanie zarodka poprzez całkowite przecięcie rdzenia kręgowego przez nacięcie ukośne; Zauważ, że uniknięto ścięcia. (F) Umieszczenie zarodka w posiadaczu i wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do lewej komory bocznej. (G,H) Umieść głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (I) Umieszczenie ramion zarodka (czarne strzałki) na zewnątrz posiadacza, aby zapobiec przesuwaniu się zarodka podczas zabiegu. (J) Rotacja zarodka wewnątrz worka macicy w celu odsłonięcia głowy. (K,L) Wstrzyknięcie mieszaniny DNA/Fast Green do bocznych komór zarodka przez ścianę macicy. (M) Umieść głowę zarodka między platynowymi elektrodami pęsety z katodą (czerwona strzałka) nad korą pod kątem 60°. (N) Zszyte nacięcie mięśnia za pomocą biegnącego szwu blokującego. (O) Zszyte nacięcie skóry za pomocą przerwanego szwu. (P) Zabezpieczenie rany za pomocą klipsów chirurgicznych do ran i dezynfekcja za pomocą betadyny. (Q) Umieszczenie myszy w klatce regeneracyjnej ze światłem ocieplającym dalekiej podczerwieni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ekstrakcja mózgów E15.5 i E12.5 oraz procedura hodowli plastrów organotypowych. (A) Narzędzia używane do procedury ekstrakcji mózgu. (B) Założenie stacji hodowli organotypowych. (C-F) Ekstrakcja mózgu E15.5. (G-J) Ekstrakcja E12.5 mózgu. Przerywane linie podkreślają miejsce nacięć. Czerwone strzałki wskazują kierunek ciągnięcia kleszczami. (K) Umieszczenie mózgu w 3-centymetrowym naczyniu zawierającym 3% niskotopliwej agarozy, pozostawiając 1-2 mm odstępy między agarozą pod mózgiem. (L) Pobranie wycinka mózgu o grubości 150 μm. (M) Umieszczenie wycinków mózgu na wkładkach membrany PTFE unieruchomionych w naczyniu o średnicy 35 mm za pomocą filmu parafinowego (niebieska strzałka). Oznaczenie czerwoną gwiazdką oznacza pobranie danego wycinka mózgu z wibratomu (L) i jego przeniesienie do membrany PTFE (M). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zachowana radialna struktura komórek glejowych w zdrowych warstwach organotypowych. Konfokalne obrazy wycinków mózgu E17.5 ujawniające macierz RG (wimentyna; zielony) i ogólna organizacja komórek (DAPI; magenta) po IUE (A) i EUE (B, C). Zwróć uwagę na silne zakłócenia w tablicy RG, które mogą czasami wynikać z EUE (C). Powiększenia odpowiadają czerwonym kropkowanym ramkom na głównym rysunku: podziałka skali, 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wizualizacja in situ dynamiki stożka wzrostu w ostrych warstwach organotypowych. Panie przewodniczący, panie i panowie! Neurony i odpowiadające im stożki wzrostu oznaczone odpowiednio Lyn-mNeonGreen i LifeAct-GFP. Czerwona gwiazda oznaczająca stożek wzrostu neuronu wyrażającego Lyn-mNeonGreen. Niebieska gwiazdka oznaczająca stożek wzrostu neuronu wyrażającego LifeAct-GFP. (C) Sąsiednie neurony znakowane podwójnym systemem plazmidowym zawierającym tRFP (magenta) i ZsGreen (zielony) oraz odpowiadające im stożki wzrostu. Stożki wzrostu sfotografowane (po prawej) znajdowały się poza uchwyconym kadrem (po lewej), uzyskane wkrótce po uzyskaniu stożka wzrostu w trybie poklatkowym; podziałka skali, 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza szybkości wzrostu aksonów i objętości stożka wzrostu. (A) Śledzenie aksonów na neuronie wyrażającym Lyn-mNeonGreen (na górze) i odpowiadającym mu kymografie (poniżej) wygenerowanym za pomocą ImageJ. (B) Rekonstrukcja filmu stożka wzrostu ze stosem z użyciem oprogramowania do analizy obrazu (u góry) i tego samego stożka wzrostu podświetlonego za pomocą narzędzia do pomiaru powierzchni (poniżej). (C) Wykresy przedstawiające zmiany prędkości wzrostu w czasie dla kilku aksonów. (D) Średnia prędkość wzrostu aksonów jest określona ilościowo w (C). (E) Wykres przedstawiający zmiany objętości stożka wzrostu w czasie. (F) Średnia objętość stożków wzrostu jest określana ilościowo w (E); Podziałka skali, 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Migracja promieniowa i polaryzacja neuronów piramidowych w korze mózgowej. Diagram ilustrujący rozwój neuronów kory piramidowej (różowy) migrujących promieniście ze strefy komory rozrodczej (VZ) w kierunku powierzchni pia. Kierując się radialnymi procesami glejowymi (szary), migrujące spolaryzowane neurony ustanawiają proces wiodący, przyszły dendryt i proces końcowy, przyszły akson, które kontynuują rozciąganie się w dół w kierunku strefy pośredniej (IZ). Przerywane czerwone pola reprezentują obszary kory mózgowej, w których zobrazowano stożki wzrostu. Szczególnie w IZ, strefie podkomorowej (SVZ) lub łączeniu wiązek aksonów (zielony). Ilustracja została stworzona za pomocą narzędzia internetowego BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Lista plazmidów używanych w Protokole. Nazwa, stężenie i przeznaczenie każdego użytego plazmidu.

Dodatkowe wideo 1: Wizualizacja in situ dynamiki stożka wzrostu w ostrych warstwach organotypowych. Dynamika wzrostu stożków oznaczonych Lyn-mNeonGreen (u góry po lewej) i LifeAct-GFP (u dołu po lewej). Sąsiednie stożki wzrostu są różnie oznaczone podwójnym systemem plazmidowym zawierającym tRFP (magenta; u góry po prawej) i ZsGreen (zielony; u dołu po prawej). Interwał obrazowania, 2,5 s. Podziałka liniowa, 5 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.