Artykuł metodologiczny

Fluorescencja międzyfazowa in situ Hybrydyzacja rozmazów szpiku kostnego szpiczaka mnogiego

DOI:

10.3791/63083

⸱

15 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół poprawy skuteczności wykrywania hybrydyzacji fluorescencji międzyfazowej in situ na rozmazach szpiku kostnego od pacjentów ze szpiczakiem mnogim.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) jest nieodzowną metodą w genetycznej stratyfikacji ryzyka w szpiczaku mnogim (MM), który jest jednym z najczęstszych nowotworów hematologicznych. Cechą charakterystyczną szpiczaka mnogiego są nagromadzone złośliwe komórki plazmatyczne w szpiku kostnym. Raporty FISH dotyczące MM koncentrują się głównie na oczyszczonych lub zidentyfikowanych klonalnych komórkach plazmatycznych, a nie na wszystkich komórkach jądrzastych, poprzez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie cytoplazmatycznym łańcuchem lekkim immunoglobuliny κ lub λ. Jądra interfazowe szpiku kostnego są zwykle pozyskiwane ze świeżych komórek szpiku kostnego. Jednak zadowalające wzbogacenie próbek komórek plazmatycznych wymaga dużych ilości świeżego szpiku kostnego antykoagulowanego heparyną, którego nie można uzyskać w przypadku trudnego pobrania szpiku kostnego lub osuszenia szpiku kostnego. W tym artykule opracowujemy nowatorską metodę poprawy skuteczności wykrywania FISH w barwionych lub niebarwionych rozmazach szpiku kostnego. Rozmaz szpiku kostnego jest łatwiejszy do uzyskania niż próbki szpiku kostnego poddane antykoagulacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szpiczak mnogi (MM) jest złośliwą chorobą komórek plazmatycznych (PC) o silnej biologicznej heterogeniczności i dużych indywidualnych różnicach w skuteczności klinicznej, z okresami przeżycia od miesięcy do dziesięcioleci. Cechy cytogenetyczne są ważnymi wskaźnikami prognostycznymi szpiczaka mnogiego. System stratyfikacji ryzyka i zindywidualizowane terapie oparte na cechach genetycznych stały się tematami intensywnego zainteresowania w badaniach klinicznych nad MM1. Aberracje PC badane w panelu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) szpiku kostnego (BM) obejmują del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4; 14) (IGH/FGFR3), t(11; 14) (IGH/MYEOV), t(14; 16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), wzmocnienie/wzmocnienie 1q21 (CKS1B) i delecja 1p (CDKN2C).

Standardowa cytogenetyka metafazowa powinna być uwzględniona we wstępnej ocenie pacjentów z MM. Chociaż konwencjonalne kariotypowanie z pasmem G oferuje korzyści z analizy całego chromosomu, niska wydajność tej metody prowadzi do wielu fałszywie ujemnych wyników2. Tradycyjnie, PC były postrzegane jako w dużej mierze niezdolne do podziału, ponieważ są końcowymi produktami różnicowania limfocytów B. Utrudnia to uzyskanie podzielonych obrazów. Ulepszona analiza cytogenetyczna w MM z długoterminowymi posiewami (6 dni) i stymulacja kultur przez cytokiny może być obiecującą metodą identyfikacji nieprawidłowości cytogenetycznych u nowo zdiagnozowanych pacjentów z MM3. Jednak nawet gdy czas posiewu został wydłużony do 6 dni, nieprawidłowości cytogenetyczne zostały dokładnie opisane u 30%-50% pacjentów z MM4. Ponadto szpic szpiczakowa charakteryzuje się złożonymi aberracjami cytogenetycznymi, które odzwierciedlają jego niejednorodność prognostyczną. Jednak rozdzielczość tradycyjnej technologii prążkowania chromosomów jest niska, co może łatwo doprowadzić do pominięcia wykrycia nieprawidłowości chromosomowych w MM.

Interphase FISH, najlepiej po sortowaniu lub znakowaniu PC za pomocą CD138-dodatniego magnetycznego granulatu za pomocą cytoplazmatycznego łańcucha lekkiego immunoglobuliny κ/λ, jest niezbędny w analizie MM5,6. Zdecydowanie zaleca się wyselekcjonowaną próbkę CD138-dodatnią w celu uzyskania optymalnej wydajności komórek nowotworowych. Jednak dokładne ilościowe określenie aberracji cytogenetycznych wymaga co najmniej 4 ml antykoagulowanego BM do sortowania PC. Dodatkowo, kombinacje sortowania immunomagnetycznych kulek CD138 z FISH lub cytoplazmatycznej immunoglobuliny łańcucha lekkiego κ/λ z testem FISH (cIg-FISH) zwiększają liczne koszty eksperymentalne i są czasochłonne.

Zazwyczaj, stosunek PC jest najpierw oceniany na podstawie badania morfologicznego barwionych rozmazów BM lub biopsji BM7,8. Do badań morfologicznych wykorzystuje się próbki BM najwyższej jakości (próbki aspiratu do szpiku pierwotnego), natomiast te wysyłane do FISH lub innego wykrywania są często wtórnymi próbkami aspiracyjnymi o wysokim współczynniku rozcieńczenia z krwią obwodową.

Już w latach dziewięćdziesiątych liczne badania wykazały, że rozmazy BM mogą być bezpośrednio używane do śródmiąższowych badań FISH, co okazało się niezawodną i powtarzalną metodą9. Eleganckie badanie oparte na morfologii komórek i cytochemii esterazy w połączeniu z FISH krwi obwodowej i rozmazami BM potwierdziło jego ogromne znaczenie kliniczne w wyjaśnianiu nieprawidłowości chromosomalnych u pacjentów z białaczką granulocytarną i limfocytową10.

Niniejszym przedstawiamy nowatorską metodę poprawy skuteczności wykrywania interfazowego FISH u pacjentów z MM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (nr 2019065). Próbki pobrano od pacjenta z MM w Klinice Hematologii Szpitala Zhongnan Uniwersytetu Wuhan (Chiny).

1. Przygotowanie rozmazów BM

  1. Umieść pierwsze 0,2 ml roztworu BM na czystym jednorazowym szkiełku podstawowym.
  2. Rozprowadź smugi BM na jednolitą grubość z ostrymi ogonami, szybko usuwając BM. Następnie wysuszyć naturalnie.
  3. Przykryj folie BM 1 ml roztworu Wrighta-Giemsy przez około 10 s w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 1 ml buforu fosforanowego do szkiełek.
    UWAGA: Uważaj, aby roztwór barwnika nie wysychał ani nie spływał ze szkiełek.
  5. Delikatnie wymieszaj roztwór barwnika i utrzymuj go przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Opłucz szkiełka czystą wodą i wysusz je na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  7. Użyj mikroskopii światła do przodu, aby wykryć złośliwe komputery. BG powinny być dobrze rozproszone.

2. Wstępne przetwarzanie rozmazów BM FISH

  1. Przykryj hybrydyzowany obszar roztworem utrwalającym przez 10 minut, aby odbarwić i utrwalić komputery.
    1. Aby przygotować świeży roztwór utrwalający, zmieszaj metanol z lodowatym kwasem octowym w stosunku objętościowym 3:1.
  2. Opłukać szkiełko wodą dejonizowaną (dH2O) i wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
  3. Podgrzej słoik zawierający 2x bufor SSC do 56 °C w łaźni wodnej. Przed użyciem świeżo rozcieńczyć bufor do 20x SSC.
    1. Aby przygotować 20x SSC, dokładnie wymieszaj 176 g chlorku sodu i 88 g cytrynianu sodu z 800 mldH2O. Zmierz pH i dostosuj do pH 5,3 ± 0,2. Następnie dodać dH2O, aby doprowadzić ostateczną objętość do 1 L.
  4. Przygotowany rozmaz BM przemyć w podgrzanym buforze 2x SSC przez 10 minut, a następnie zanurzyć go w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej.
  5. Odwodnić rozmaz w gradiencie etanolu (70%, 85% i 100% etanolu, każdy przez 1 minutę). Suszyć rozmaz na powietrzu przez 10 minut.

3. BM rozmazuje RYBY i mycie

UWAGA: Wszystkie kroki zostały wykonane w ciemnym pomieszczeniu, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.

  1. Dodaj mieszaninę sondy TP53/centromer chromosomu 17 (CEP17) do obszaru hybrydyzacji i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie dociśnij drobno spiczastą pęsetą, aby usunąć pęcherzyki powietrza spod spodu.
  2. Uszczelnij wszystkie boki szkiełka nakrywkowego cementem gumowym, aby zapewnić dobrą szczelność.
  3. Po zestaleniu się cementu gumowego umieść szkiełko na automatycznej maszynie FISH. Przeprowadzić denaturację w temperaturze 78 °C przez 5 minut, a następnie hybrydyzację w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. Podnieś zjeżdżalnię z automatu FISH. Użyj drobno zakończonej pęsety, aby delikatnie usunąć cement kauczukowy.
  5. Zanurz szkiełko w 2x SSC w temperaturze pokojowej na około 1 lub 2 minuty, aby zmyć szkiełko nakrywkowe.
  6. Szkiełko myć w 68 °C nagrzanym buforze 0,4x SSC/0,3% NP-40 w łaźni wodnej przez 2 minuty.
    1. Przygotować 0,4 x SSC/0,3% roztwór NP-40, dokładnie mieszając 20 ml 20 x SSC (pH 5,3) z 950 ml dH2O. Następnie dodaj 3 ml NP-40 i dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Zmierz pH i dostosuj do 7,0-7,5 za pomocą NaOH. Następnie dodaćdH 2O, aby doprowadzić końcową objętość całkowitego roztworu do 1 l.
  7. Myć szkiełka z 2x SSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 min. Ustawić pionowo w ciemności do całkowitego wyschnięcia przez 10 min.
  8. Dodaj 10 μl DAPI do hybrydyzowanego obszaru i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

4. Analiza i obrazowanie FISH

  1. Obejrzyj hybrydyzowany szkiełko za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów w mikroskopie fluorescencyjnym.
  2. Użyj monochromatycznego niebieskiego filtra optycznego fluoroforowego, aby obserwować intensywność fluorescencji jądra komórkowego. Wykonaj obrazy jądra komórkowego pod zestawem filtrów DAPI.
  3. Użyj sondy centromerów chromosomowych, aby pokazać, ile chromosomów zawiera komórka. Oznaczenie CEP17 z zieloną fluorescencją. Użyj filtra optycznego z zielonym fluoroforem, aby obserwować lokalizację CEP17. Wykonaj obraz sygnałów CEP17 pod zielonym zestawem filtrów.
  4. Oznacz gen TP53 pomarańczową fluorescencją. Użyj pomarańczowego filtra optycznego fluoroforowego o widmie, aby obserwować TP53. Zrób obraz sygnałów TP53 pod tym zestawem.
  5. Scal te trzy obrazy i sprawdź je pod kątem nieprawidłowości numerycznych.
    UWAGA: W normalnej komórce interfazowej dwa pomarańczowe i dwa zielone sygnały są obserwowane wewnątrz jądra o niebieskiej fluorescencji, co wskazuje na jedną parę normalnego chromosomu 17 (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W początkowej ocenie morfologicznej nowo zdiagnozowanego pacjenta z MM, stwierdzono, że 15% PC w rozmazie BM ma większe i ciemniejsze jądra wraz z większą ilością cytoplazmy niż normalne PC (Rysunek 2A). Pierwsza probówka BM z antykoagulacją heparyny wykryta techniką immunofenotypu ujawniła tylko 2,3% monoklonalnych nieprawidłowych PC. Immunomagnetyczne sortowanie kulek CD138 w połączeniu z techniką FISH lub cIg-FISH jest niezbędne do uzyskania dokładnego wyniku FISH. Jednak zasysany BM jest ograniczo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie FISH do stratyfikacji ryzyka genetycznego w MM ma zasadnicze znaczenie. Krytyczną częścią raportów FISH nie są wszystkie komórki jądrzaste, ale klonalne PC specjalnie oczyszczone lub zidentyfikowane przez sortowanie za pomocą kulek magnetycznych anty-CD138 lub znakowanie cytoplazmatycznym łańcuchem lekkim immunoglobuliny κ lub λ. Stwierdzono, że interphase FISH po sortowaniu PC lub cIg-FISH jest istotny w diagnostyce MM ze względu na stosunkowo niższy odsetek PC w BM. Metody te mają jednak pewne wady, w tym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Fundusz Innowacji WNLO 2018WNLOKF023.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
automatyczna maszyna FISHLeica  KorporacjaS500-24FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPIAbbott Molecular Inc.06J49-001Oprogramowanie do analizy ryb DAPI Counterstain
IMSTAR  KorporacjaIMSTAROprogramowanie do analizy ryb
Sonda FISHAbbott Molecular Inc.05N56-020Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / 17 Zestaw sond FISH
Pipeta o stałej objętościEppendorf China Ltd.M33768H10  mikrolitrowy
mikroskop fluorescencyjnyOlympus CorporationBX53Forward Fluorescencyjny
mikroskop Oprogramowanie do analizy kariotypuIMSTAR  KorporacjaIMSTAROprogramowanie do analizy kariotypu
świetlnyOlympus  CorporationBX41Mikroskop światła do przodu
NP-40Abbott Molecular Inc.07J05-001NP-40
Plastikowy stojak do barwieniaGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.Złącze RSJ-501  24 slajdy
Plastikowy zbiornik do barwieniaGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.Złącze RSJ-516  24 slajdy
Cement gumowyMarabu  Sp. z o.o. & Co. KGFixoGum Cement kauczukowy
SSCAbbott Molecular Inc.02J10-03220 razy; SSC
Kąpiel wodnaSzanghaj Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.DK-8DŁaźnia wodna o wielu temperaturach
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
  2. Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
  3. Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
  4. Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
  5. Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
  6. Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
  7. Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
  8. Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).
  9. Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
  10. Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
  11. Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
  12. Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
  13. McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  14. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

FISH w interfazierozmaz szpiku kostnegokom rki plazmatycznegenetyczna stratyfikacja ryzykamikroskopia fluorescencyjnadetekcja TP53sonda dla chromosomu 17sortowanie CD138cytoplazmatyczna immunoglobulina

Powiązane artykuły