Artykuł metodologiczny

Test oparty na mikroskopii do badania i analizy endosomów recyklingu przy użyciu transportu SNARE

DOI:

10.3791/63087

⸱

12 lutego 2022

 , 
1Department of Microbiology and Cell Biology, Indian Institute of Science, Bangalore KA 560012, India

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy recyklingowe są częścią endosomalnej sieci kanalikowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania dynamiki recyklingu endosomów przy użyciu GFP-STX13 jako markera organelli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy recyklingowe (RE) to organelle rurkowo-pęcherzykowe generowane z wczesnych/sortujących endosomów we wszystkich typach komórek. Organelle te odgrywają kluczową rolę w biogenezie melanosomów, organelli związanych z lizosomami wytwarzanych przez melanocyty. RE dostarczają ładunek specyficzny dla melanocytów do przedwczesnych melanosomów podczas ich powstawania. Blokada w wytwarzaniu RE, obserwowana u kilku mutantów zespołu Hermansky'ego-Pudlaka, powoduje hipopigmentację skóry, włosów i oczu. Dlatego badanie dynamiki (odnosi się do liczby i długości) RE jest przydatne do zrozumienia funkcji tych organelli w warunkach normalnych i chorobowych. W tym badaniu staramy się zmierzyć dynamikę RE za pomocą rezydentnego SNARE STX13.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosynteza barwników melaniny zachodzi w melanosomach, specyficznych dla melanocytów organellach związanych z lizosomami (LRO), które współistnieją z konwencjonalnymi lizosomami. Układ endocytarny odgrywa kluczową rolę w biogenezie melanosomów, niezbędnej do zmiany koloru skóry i fotoochrony przed promieniowaniem jonizującym1,2,3. Podczas tego procesu enzymy syntetyzujące melaninę są sortowane na endosomy wczesne/sortujące, a następnie transportowane do przedwczesnych melanosomów przez endosomy kanalikowe lub pęcherzykowe zwane endosomami recyklingowymi (RE)4,5,6,7,8,9,10. Ukierunkowanie i fuzja tych organelli regulują dojrzewanie w pełni funkcjonalnych pigmentowanych melanosomów7,11,12,13,14. Wady w tworzeniu tych organelli lub sortowaniu ładunków do tych organelli powodują albinizm oczno-skórny i inne fenotypy kliniczne, obserwowane w zespole Hermansky'ego-Pudlaka15,16.

Tutaj opisujemy prostą technikę opartą na mikroskopii do badania i analizy RE. W tej metodzie wykorzystaliśmy białko transbłonowe, składnię Qa-SNARE (STX)13, które znajduje się w recyklingu endosomów17 i przełącza się między sortowaniem endosomów i melanosomów w melanocytach12,18. Co więcej, usunięcie N-końcowej nieustrukturyzowanej domeny regulatorowej (a mianowicie SynN lub STX13Δ129) pozwala SNARE utknąć w melanosomach, które mierzą szlak transportu do przodu w kierunku melanosomu12. W naszych badaniach użyliśmy znanego markera endosomalnego recyklingu Rab GTPase (Rab)11 w naszych badaniach14,19. Obrazowanie fluorescencyjne białek GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 i TYRP1 w melanocytach typu dzikiego, a następnie kwantyfikacja ich względnej lokalizacji, zapewni charakter i dynamikę RE oprócz ich ukierunkowania na melanosomy. Jest to zatem prosta technika, którą można wykorzystać do wizualizacji i pomiaru dynamiki RE w melanocytach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół obejmuje wysiewanie melanocytów, a następnie transfekcję plazmidów. Dalsze kroki obejmują utrwalanie, barwienie immunologiczne, obrazowanie i analizę komórek w celu zmierzenia długości i liczby RE. Szczegółowy opis protokołu znajduje się poniżej.

1. Wysiewanie mysich melanocytów na wstępnie przygotowanych szkiełkach nakrywkowych

  1. Szklane szkiełka nakrywkowe należy umieścić na szalce Petriego (tj. 4 - 5 sztuk w szalce o średnicy 35 mm) pożywką z matrycą błony podstawnej (1:20 w pełnej pożywce RPMI: RPMI + 10% inaktywowanego termicznie FBS + 1x Glutamina + 1x Mieszanka antybiotyków) i suszyć w kapturze do hodowli tkankowych przez 15 minut. Przed użyciem umyj szkiełka nakrywkowe raz 1x PBS.
  2. Utrzymuj melanocyty myszy typu dzikiego (melan-Ink4a-Arf-1 z myszy C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf-/-, opisane w20 i dostępne w The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) na szalce Petriego (tj. szalce 35 lub 60 mm) uzupełnionej kompletną pożywką RPMI.
    1. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS i dodaj 0,5 lub 1 ml roztworu Trypsyna-EDTA (0,25%) do trypsynizacji komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut do momentu oderwania od płytki Petriego.
    2. Dodać 1 - 2 ml kompletnej pożywki RPMI, zawiesić, a następnie przenieść komórki do probówki wirówkowej.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C, 376 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić osad w 1x PBS.
  4. Powtórzyć etap wirowania i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pełnej pożywki RPMI.
  5. Wysiewaj komórki na średnio pokrytych szkiełkach nakrywkowych błony podstawnej przy 50-60% zbiegu (około 6 x 10,5 komórek na 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowej zawierającym 4 - 5 szkiełek nakrywkowych). Zawsze dodawać 200 nM PMA (dodać 5 μL zapasu roboczego, 40 μM 12-mirystynianu 13-octanu) do platerowanej zawiesiny komórek w pełnym pożywce RPMI.
  6. Po wysianiu inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 12-24 godzin.

2. Transfekcja komórek za pomocą plazmidów STX13

  1. Użyj następujących odczynników: pEGFP-C1-STX13WT i pEGFP-C1-STX13Δ129 (opisane w12). mCherry-Rab11, był miłym prezentem od Graça Raposo, Institut Curie, Paryż (opisanym w reference19). Przeciwciało anty-TYRP1 firmy ATCC (TA99).
  2. Po 12 - 24 godzinach wysiewu należy przetransfekować komórki plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów. W przypadku szalki o średnicy 35 mm należy pobrać 5 μl odczynnika do transfekcji w 250 μl pożywki OPTI-MEM w probówce mikrowirówki i pobrać około 200 ng każdego plazmidu w 250 μl OPTI-MEM.
  3. Inkubować probówki zawierające DNA i odczynnik do transfekcji przez 5 minut. Mieszać bez wielokrotnego pipetowania (całkowita objętość wyniesie około 500 μl). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wykonuj ręczne stukanie w rurkę co 10 minut przez 30 minut przy suchym toarze.
  4. Podczas inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS, raz OPTI-MEM, a następnie dodać 1 ml OPTI-MEM do komórek.
  5. Po 30 minutach inkubacji dodać do komórek mieszaninę odczynnika do transfekcji i DNA w sposób kroplowy, przykrywając naczynie.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 6 godzin. Odessać pożywkę OPTI-MEM za pomocą odczynnika do transfekcji i dodać pełną pożywkę RPMI uzupełnioną 200 nM PMA.
  7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.

3. Utrwalenie komórek

UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana poza kapturem do hodowli tkankowej.

  1. Po 48 godzinach transfekcji przemyć komórki dwukrotnie 1x PBS, a następnie utrwalić komórki 3% formaldehydem (świeżo przygotowanym w 1x PBS) przez 30 min.
  2. Po utrwaleniu przemyj komórki dwukrotnie 1x PBS i przechowuj szkiełka nakrywkowe w 1x PBS do dalszego użycia. Alternatywnie ogniwa mogą być montowane na szkiełkach podstawowych (patrz poniżej) lub przechowywane w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie immunologiczne komórek

  1. Przygotuj wilgotną komorę: umieść wycięty kawałek folii parafinowej na wilgotnej bibule filtracyjnej na szalce Petriego, przykrytej folią aluminiową.
  2. Przygotuj 25 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (0,2% saponiny w 1x PBS, 0,1% BSA w 1x PBS i 0,02% azydku sodu w 1x PBS). Dodać przeciwciało w rozcieńczeniu 1:200. Dodaj ten roztwór jako kroplę na folię parafinową w wilgotnej komorze.
  3. Ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy, odwróć je na tej kropli roztworu barwiącego przeciwciała pierwotne, a następnie przykryj pokrywę wilgotnej komory. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Podobnie przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w rozcieńczeniu 1:500 i umieścić go na folii parafinowej obok szkiełka nakrywkowego w wilgotnej komorze. Aby zabarwić jądro, dodaj DAPI (1:20 000 do 1:30 000) do roztworu.
  5. Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe z pierwotnego roztworu przeciwciała i zanurz je trzykrotnie w 1x PBS (w szklanej zlewce).
  6. Postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego. Umieść go na wtórnym roztworze barwiącym przeciwciała w wilgotnej komorze i nie wystawiaj go na działanie światła ze względu na obecność fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał w roztworze.
  7. Ponownie inkubować szkiełko nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zawsze zanotuj stronę szkiełka nakrywkowego, na której znajdują się komórki podczas tych kroków.
  8. Po inkubacji ostrożnie pobrać szkiełko nakrywkowe z roztworu przeciwciał drugorzędowych, a następnie zanurzyć je trzykrotnie w 1x PBS. Następnie postukaj w szkiełko nakrywkowe na bibułce, aby usunąć nadmiar PBS z szkiełka nakrywkowego.
  9. Umieść 12 μl odczynnika montażowego Fluoromount-G na szkiełku podstawowym i ostrożnie umieść poplamione szkiełko nakrywkowe (skierowane w stronę szkła) na odczynniku montażowym. Odwróć szkiełko na bibułce, a następnie delikatnie dociśnij.

5. Mikroskopia fluorescencyjna komórek

  1. Zobrazuj wybarwione komórki pod filtrami jasnego pola (BF) i fluorescencji (IF) za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD przy użyciu 60-krotnego (olejowego) obiektywu apochromatycznego lub dowolnego innego mikroskopu o podobnej konfiguracji.

6. Kwantyfikacja nakładania się białek zlokalizowanych RE i melanosomów:

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w celu ilościowego określenia współczynnika nakładania się białek Mandera za pomocą oprogramowania Fiji (do pobrania za darmo z linku: https://imagej.net/software/fiji/). Obrazu TIFF można używać z wieloma kanałami.

  1. Otwórz obraz raw. Przejdź do opcji Obraz, wybierz Kolor | Podziel kanały i użyj dwóch kanałów do analizy.
  2. Otwórz wtyczkę JACoP w opcji Wtyczka.
  3. Ustaw próg dla obu kanałów w taki sposób, aby wszystkie jasne punkty były zaznaczone, a tło wyeliminowane.
  4. Przejdź do opcji Analiza, wybierz współczynniki M1 i M2, aby uzyskać współczynnik nakładania się Mandera.
  5. Naciśnij opcję Analizuj we wtyczce JACoP i zobacz wynik, który wyświetla współczynnik nakładania się Mandera.

7. Kwantyfikacja liczby i długości rurkowych endosomów recyklingu:

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w celu ilościowego określenia liczby i długości kanalików za pomocą oprogramowania Fidżi.

  1. Otwórz surowy obraz Przejdź do opcji Obraz, wybierz Kolor | Podziel kanały i użyj żądanego kanału do analizy.
  2. Ponownie przejdź do opcji Obraz, wybierz pozycję Typ | Konwertuj na obraz 8-bitowy.
  3. Następnie przejdź do Wtyczki, wybierz Analizuj | Rurkowość. Ustaw wartość sigma na 0,1075 . Naciśnij przycisk OK.
  4. Ponownie przejdź do opcji Obraz, wybierz pozycję Typ | Konwertuj na obraz 8-bitowy.
  5. Przejdź do obrazu | Dostosuj | Próg (Użyj tych samych wartości progowych dla wszystkich obrazów. Obrazy powinny mieć w przybliżeniu równą intensywność).
  6. Przejdź do punktu menu Proces | Binarny | Konwertuj na maskę.
  7. Przejdź do pozycji Proces, wybierz pozycję Binarny, a następnie wybierz pozycję Szkieletuj.
  8. Przejdź do pozycji Analizuj, wybierz pozycję Szkielet i wybierz pozycję Analizuj szkielet. W wyniku i na wyjściu | wybierz (a) Oblicz największą najkrótszą drogę | (b) pokaż szczegółowe informacje | (c) wyświetl oznaczony szkielet. Naciśnij przycisk Ok.
    UWAGA: Wynik otworzy się w formacie tabelarycznym. Kolumna Średnia długość gałęzi pokazuje długość wszystkich różnych kanalików w wybranej komórce (ustaw skalę do uzyskiwania wartości w mikrometrach).
  9. Aby uzyskać liczbę kanalików w komórce, przejdź do Analizuj i wybierz opcję Analizuj cząstki. Naciśnij przycisk Ok.
    UWAGA: W uzyskanych wynikach kolumna liczba pokazuje liczbę kanalików w tej konkretnej komórce.
  10. Zapisz dane i przeanalizuj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantyfikacja lokalizacji mutacji STX13Δ129 w melanosomach
Mikroskopia immunofluorescencyjna STX13 w mysich melanocytach typu dzikiego wykazała, że GFP-STX13WT jest zlokalizowany jako struktury pęcherzykowe i kanalikowe oraz GFP-STX13Δ129 zlokalizowany jako struktury pierścieniowe oprócz powierzchni komórki (Figura 1A). Co więcej, wewnątrzkomórkowy, pierścieniowaty GFP-STX13Δ129 wykazywał kolokalizację z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy recyklingowe są kohortą organelli endocytarnych i pośredniczą w recyklingu ładunku na powierzchnię komórki we wszystkich typach komórek 21,22,23,24,25. W wyspecjalizowanych typach komórek, takich jak melanocyty, organelle te częściowo przekierowują swoją trasę transportu w kierunku melanosomów w celu ich biogenezy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Departament Biotechnologii (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 do SRGS); Rada ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (CRG/2019/000281 do SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 do SRGS) oraz program partnerski IISc-DBT (do SRGS). Infrastruktura w dziale była wspierana przez DST-FIST, DBT i UGC. AMB był wspierany przez DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

przeciwciało

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-TYRP1 (TA99)ATCCHB-8704
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668-500
MatrixBD Biosciences356231
OPTI-MEMThermoFisher Scientific022600-050
Phorbol 12- 13-octan mirystynianuSigma-AldrichP8139
RPMI Medium 1640ThermoFisher Scientific31800-022

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dell'Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
  2. Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
  3. Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-608 (2020).
  4. Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
  5. Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
  6. Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
  7. Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
  8. Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
  9. Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
  10. Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
  11. Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
  12. Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
  13. Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918(2018).
  14. Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173(2021).
  15. Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
  16. Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
  17. Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
  18. Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
  19. Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
  20. Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
  21. Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
  22. Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
  23. Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
  24. Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
  25. Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
  26. Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
  27. Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
  28. Desfougeres, Y., D'Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
  29. Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Melanosome BiogenesisImmunofluorescence MicroscopySyntaxin 13Melanocyte Cargo DeliveryEndosomal DynamicsRab11 MarkerTubule QuantificationImageJ Analysis

Powiązane artykuły