Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Podsumowanie

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Streszczenie

Glikogen wątrobowy to hiperrozgałęziony polimer glukozy, który bierze udział w utrzymaniu poziomu cukru we krwi u zwierząt. Na właściwości glikogenu ma wpływ jego struktura. W związku z tym odpowiednia metoda ekstrakcji, która izoluje reprezentatywne próbki glikogenu, ma kluczowe znaczenie dla badania tej makrocząsteczki. W porównaniu z innymi metodami ekstrakcji, metoda wykorzystująca etap wirowania w gradiacji gęstości sacharozy może zminimalizować uszkodzenia molekularne. Opierając się na tej metodzie, niedawna publikacja opisuje, w jaki sposób zmieniano gęstość roztworu sacharozy używanego podczas wirowania (30%, 50%, 72,5%), aby znaleźć najbardziej odpowiednie stężenie do ekstrakcji cząstek glikogenu o różnych rozmiarach, ograniczając utratę mniejszych cząstek. Wprowadzono 10-minutowy etap wrzenia, aby przetestować jego zdolność do denaturacji enzymów rozkładających glikogen, zachowując w ten sposób glikogen. Wykazano, że najniższe stężenie sacharozy (30%) i dodanie etapu wrzenia pozwoliły na ekstrakcję najbardziej reprezentatywnych próbek glikogenu.

Wprowadzenie

Glikogen to złożony, rozgałęziony polimer glukozy występujący u zwierząt, grzybów i bakterii¹. U ssaków glikogen wątrobowy działa jako bufor glukozy we krwi, zachowując homeostazę, podczas gdy glikogen mięśniowy działa jako krótkoterminowy rezerwuar glukozy, który bezpośrednio dostarcza energię². Struktura glikogenu jest często opisywana przez trzy poziomy (pokazane na Rysunek 1): 1. Łańcuchy liniowe są tworzone przez monomery glukozy za pośrednictwem (1→4)-α wiązań glikozydowych, przy czym punkty rozgałęzień są połączone wiązaniami glikozydowymi (1→6)-α; 2. silnie rozgałęzione cząstki β (o średnicy ~20 nm), które, szczególnie w tkankach takich jak mięśnie szkieletowe, działają jak niezależne cząsteczki glikogenu3^,4; 3. Większe α cząstki glikogenu (do 300 nm średnicy), które składają się z mniejszych jednostek glikogenu β, które znajdują się w Liver⁵, heart⁶ oraz u niektórych gatunków niebędących ssakami⁷. Cząstki α wątroby myszy z cukrzycą są molekularnie kruche, z tendencją do degradacji do β cząstek po rozpuszczeniu w dimetylosulfotlenku (DMSO), podczas gdy cząstki α z kontroli bez cukrzycy na ogół pozostają niezmienione. Jedna z hipotez głosi, że ta kruchość może nasilać słabą równowagę glukozy we krwi obserwowaną w cukrzycy, przy czym kruche cząstki α potencjalnie skutkują wyższym odsetkiem szybciej degradowanych cząstek β^8,9,10,11.

Tradycyjne metody ekstrakcji glikogenu wykorzystują stosunkowo trudne warunki wystawiania tkanki wątroby na działanie gorącego roztworu alkalicznego¹² lub roztworów kwasów, takich jak kwas trichlorooctowy (TCA)¹³ lub kwas nadchlorowy (PCA)¹⁴. Chociaż metody te są skuteczne w oddzielaniu glikogenu od innych składników tkanki wątroby, nieuchronnie degradują strukturę glikogenu do pewnego stopnia^15,16. Chociaż metody te są odpowiednie do ilościowego pomiaru zawartości glikogenu, nie są idealne do badań skoncentrowanych na uzyskaniu informacji strukturalnych na glikogenie z powodu tego uszkodzenia strukturalnego. Od czasu opracowania tych metod opracowano łagodniejszą procedurę ekstrakcji, która wykorzystuje zimny bufor Tris (wykazano, że hamuje degradację glukozydazy) z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości sacharozy^17,18,19. Przy pH kontrolowanym na poziomie ~8 metoda ta nie poddaje glikogenu hydrolizie kwasowej lub zasadowej obserwowanej w poprzednich procedurach.

Ultrawirowanie gradientu gęstości sacharozy homogenizowanej tkanki wątroby może oddzielić cząsteczki glikogenu od większości materiału komórkowego. W razie potrzeby dodatkowe oczyszczanie można przeprowadzić za pomocą preparatywnej chromatografii wykluczającej wielkość, w wyniku czego uzyskuje się pobranie oczyszczonego glikogenu z przyłączonymi białkami asocjującymi glikogen²⁰. Chociaż ta metoda, w łagodniejszych warunkach, z większym prawdopodobieństwem zachowa strukturę glikogenu, trudno jest zapobiec utracie części glikogenu w supernatancie, zwłaszcza mniejszych cząstkach glikogenu, które są mniej gęste¹⁵. Inną potencjalną przyczyną utraty glikogenu jest to, że łagodniejsze warunki pozwalają na pewną degradację enzymatyczną, co skutkuje niższą wydajnością glikogenu w porównaniu z ostrzejszymi metodami ekstrakcji. Ostatnie badania wykazały optymalizację metody ekstrakcji glikogenu w wątrobie w celu zachowania struktury glikogenu²¹. Tutaj przetestowano różne stężenia sacharozy (30%, 50%, 72,5%) w celu ustalenia, czy niższe stężenia sacharozy minimalizują utratę mniejszych cząstek glikogenu. Uzasadnieniem było to, że mniejsza gęstość pozwoliłaby mniejszym, mniej gęstym cząstkom przeniknąć do warstwy sacharozy i zagregować się w granulce z resztą glikogenu.

W tym badaniu, metody ekstrakcji z i bez 10-minutowego etapu gotowania zostały porównane, aby sprawdzić, czy enzymy rozkładu glikogenu mogą zostać zdenaturowane, co skutkuje ekstrakcją większej ilości glikogenu, który był również wolny od częściowej degradacji. Do określenia struktury ekstrahowanego glikogenu wykorzystano rozkłady całkowitej wielkości cząsteczki i rozkłady długości łańcucha glikogenu, podobnie jak w przypadku optymalizacji ekstrakcji skrobi opublikowanej wcześniej²². Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) z detekcją różnicowego indeksu refrakcji (DRI) została wykorzystana do uzyskania rozkładów wielkości glikogenu, które opisują całkowitą masę cząsteczkową w funkcji wielkości cząsteczki. Elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE) została wykorzystana do analizy rozkładów długości łańcuchów, które opisują względną liczbę łańcuchów glukozydowych o każdej danej wielkości (lub stopniu polimeryzacji). W artykule opisano metodologię ekstrakcji glikogenu z tkanek wątroby w oparciu o poprzednie badanie optymalizacyjne²¹. Dane sugerują, że metodą najbardziej odpowiednią do zachowania struktury glikogenu jest stężenie sacharozy wynoszące 30% w 10-minutowym etapie wrzenia.

Protokół

Wątroby myszy użyte do optymalizacji tej procedury²¹ pochodziły od 12 samców myszy tła BKS-DB/Nju (7,2 tygodnia, zobacz Tabelę Materiałów). Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Renmin Hospital of Wuhan University Animal Care and Ethics Committee, IACUC Issue No. WDRM 20181113.

1 Tkanki zwierzęce

1. Zważ wątrobę myszy (1-1,8 g całej wątroby z każdej myszy).
2. Szybko zamrozić wątrobę myszy w ciekłym azocie i przechowywać ją w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie buforu i odczynników

1. Przygotować bufor izolacyjny glikogenu zawierający 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF i 5 mM pirofosforanu sodu z wodą dejonizowaną i dostosować pH do 8.
2. Przygotuj 30% (w/w) roztwór sacharozy (uznany za najbardziej optymalny dla glikogenu wątrobowego²¹).
3. Przygotować bufor octanu sodu (1 M, pH 4,5), bufor kwasu octowego (0,1 M, pH 3,5), roztwór wodorotlenku sodu (0,1 M) i cyjanoborowodorek sodu (1 M).
4. Przygotować roztwór 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonianu (APTS), dodając 5 mg APTS do 50 μl 15% lodowatego kwasu octowego.
5. Przygotować roztwór azotanu amonu zawierający 50 mM azotanu amonu z 0,02% azydkiem sodu.

3. Ekstrakcja glikogenu (Rysunek 2)

1. Przenieść zamrożoną tkankę wątroby (~1 g) do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 6 ml buforu do izolacji glikogenu.
2. Trzymając go na lodzie, homogenizuj tkankę wątroby za pomocą homogenizatora tkankowego.
3. Przenieść połowę zawiesiny (3 ml) do nowej probówki i gotować przez 10 minut (optymalne do badań strukturalnych glikogenu²¹). Drugą połowę zawiesiny (3 ml) należy przechowywać na lodzie w celu ekstrakcji glikogenu zawierającego powiązane białka, które nie są denaturowane.
   UWAGA: Niegotowane próbki należy zawsze przechowywać na lodzie podczas etapów ekstrakcji glikogenu. Jeśli białka glikogenu nie są ważne dla badania, cała próbka może zostać poddana 10-minutowemu etapowi wrzenia.
4. Z każdej probówki wyjąć podwielokrotność o objętości 8 μl, utrzymać podwielokrotności na lodzie i użyć ich do oznaczenia zawartości glikogenu (patrz sekcja 4).
5. Pozostałą zawiesinę odwirować w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
6. Przenieść supernatanty do probówek ultrawirówek i odwirować je w temperaturze 3,6 × 10⁵ g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
7. Pozostałe supernatanty należy odrzucić i ponownie zawiesić granulki w 1,5 ml buforu izolacyjnego do izolacji glikogenu.
8. Próbki należy umieścić warstwami na 1,5 ml 30% roztworu sacharozy w probówkach ultrawirówek o pojemności 4 ml i odwirować w temperaturze 3,6 × 10-5 g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
9. Pozostałe supernatanty należy wyrzucić i ponownie zawiesić granulki w 200 μl wody dejonizowanej.
10. Dodać 800 μl bezwzględnego etanolu do zawiesin i dobrze wymieszać, aby wytrącić glikogen^23,24. Mieszaniny należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić wytrącenie się powietrza.
11. Odwirować próbki o masie 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 200 μl wody dejonizowanej.
12. Powtórz ten proces wytrącania etanolu 3x i ponownie zawieś końcowe granulki glikogenu w 200 μl wody dejonizowanej.
13. Usunąć podwielokrotność 8 μl z każdej probówki w celu oznaczenia zawartości glikogenu (patrz sekcja 4).
14. Pozostałe supernatanty zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować (liofilizować) przez noc. Suche próbki glikogenu należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Suche próbki glikogenu powinny być stabilne w temperaturze -20 °C; Nie ma jednak danych wskazujących, jak długo utrzymują się one bez żadnych zmian strukturalnych.

4. Oznaczanie zawartości glikogenu (Rysunek 3)

1. Dodać 8 μl supernatantów glikogenu (patrz sekcje 3.13 i 3.4), 5 μl amyloglukozydazy (3269 j./ml) i 100 μl buforu octanu sodu (1 M, pH 4,5) do probówki mikrowirówki i napełnić probówkę do oznaczenia 500 μl wodą dejonizowaną.
2. Przygotuj kontrole, które wykorzystują wodę dejonizowaną zamiast amyloglukozydazy.
3. Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut, utrzymując kontrole na lodzie.
4. Odwirować przy 6 000 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zmieszać 300 μl każdego otrzymanego supernatantu z 1 ml odczynnika oksydazy/peroksydazy glukozydazy (GOPOD).
5. Skonstruuj krzywą kalibracyjną, mieszając 300 μl denionizowanej wody zawierającej 0, 10, 20, 30, 40 i 50 μg D-glukozy z 1 ml odczynnika GOPOD.
6. Inkubować mieszaniny w temperaturze 50 °C przez kolejne 30 minut.
7. Odczytać absorbancję (510 nm) każdej próbki za pomocą 96-dołkowych płytek (150 μl na studzienkę) za pomocą spektrofotometru UV-vis.
8. Odjąć absorbancję próbek kontrolnych (bez amyloglukozydazy) od absorbancji próbek doświadczalnych, a następnie obliczyć zawartość glikogenu na podstawie krzywej wzorcowej D-glukozy.

5. Uzysk surowy, uzysk glikogenu i oznaczanie czystości

1. Aby uzyskać surowy plon, zważyć liofilizowaną próbkę glikogenu i obliczyć wydajność jako procent mokrej tkanki wątroby.
   UWAGA: Wydajność tę należy dostosować w celu skorygowania o podwielokrotności pobrane na każdym etapie zawartości glikogenu.
2. W celu zapewnienia czystości glikogenu należy oznaczyć zawartość glikogenu w końcowych granulkach, jak opisano w sekcji 4. Obliczyć czystość jako procent oznaczonej zawartości glikogenu w stosunku do uzysku surowego (patrz krok 5.1).
3. W celu uzyskania uzysku glikogenu należy oznaczyć zawartość glikogenu w homogenizowanych próbkach bez gotowania i przed odwirowaniem, jak opisano w sekcji 4. Obliczyć uzysk glikogenu jako procent zawartości glikogenu w końcowych granulkach (patrz krok 5.2) w stosunku do zawartości glikogenu oznaczonej w początkowym homogenacie.

6. Analiza rozkładów długości łańcucha (Rysunek 4)

1. Odważyć 0,5 mg liofilizowanego glikogenu w probówkach o pojemności 1,5 ml.
2. Do probówek dodać 90 μl wody dejonizowanej i 1,5 μl azydku sodu (0,04 g/ml).
3. Dodać 5 μl buforu kwasu octowego (0,1 M, pH 3,5) i 2 μl roztworu izoamylazy (180 U/mg) do probówek w celu rozgałęzienia glikogenu.
4. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
5. Dodać 5 μl roztworu wodorotlenku sodu (0,1 M) do próbek, aby zwiększyć pH do 7,0.
6. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować (liofilizować) przez noc.
7. Do liofilizowanego rozgałęzionego glikogenu dodać 2 μl roztworu APTS (5 mg APTS w 50 μl 15% lodowatego kwasu octowego) i 2 μl cyjanoborowodorku sodu (1 M).
8. Odwirować próbki o masie 4 000 × g przez 2 minuty.
9. Próbki inkubować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny w ciemności.
   UWAGA: Tubę można przykryć folią aluminiową, aby chronić zawartość przed światłem.
10. Dodać 200 μl wody dejonizowanej do próbek i wirować je, aż cały osad się rozpuści.
11. Odwirować próbki o masie 4 000 × g przez 2 minuty.
12. Przenieść podwielokrotności 50 μl do mikrofiolek do elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) w celu analizy.
    UWAGA: Dane przedstawiono jako względną obfitość (rozgałęzionych) łańcuchów (N_de(X)) dla każdego stopnia polimeryzacji (DP, symbol X).

7. Analiza rozkładu wielkości cząsteczek (Rysunek 5)

1. Rozpuścić 0,5 mg liofilizowanego glikogenu w 50 mM azotanu amonu i 0,02% azydku sodu w stężeniu 1 mg/ml.
2. Próbki inkubować w termomieszalniku w temperaturze 80 °C przez 3 godziny przy 300 obr./min.
3. Wstrzykiwać próbki do systemu SEC za pomocą kolumny wstępnej i kolumn 1000 A i 10 000 A w temperaturze 80 °C przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min (patrz tabela materiałów). Użyj detektora indeksu refrakcji, aby określić względną masę cząsteczek w każdej objętości elucji.
4. Stosując wzorce pullulanu (PSS) o masach molowych w zakresie od 342 do 1,22 × 10⁶, należy wykreślić uniwersalną krzywą kalibracyjną SEC, aby przeliczyć czas elucji na R_h (promień hydrodynamiczny). Wyrazić dane z detektora różnicowego indeksu refrakcji (DRI) jako rozkład masy SEC w (log R_h) w funkcji R_h.

Wyniki

Podczas gdy opisana powyżej procedura dotyczy metody najbardziej optymalnej (30% sacharozy z dodatkiem etapu gotowania przez 10 min), tutaj przedstawiono dane dla glikogenu ekstrahowanego przy użyciu trzech stężeń sacharozy (30%, 50%, 72,5%), z etapem gotowania i bez niego, zgodnie z wcześniejszym opisem²¹. Zgodnie z protokołem, czystość, wydajność całkowita i wydajność glikogenu dla suchego glikogenu ekstrahowanego w różnych warunkach podano w Tabeli 1, powielonej z

Dyskusja

Wcześniejsze badania wykazały, że struktura glikogenu jest ważna dla jego właściwości; Na przykład wielkość cząsteczki wpływa na szybkość degradacji glikogenu¹⁰, a rozkład długości łańcucha wpływa na jego rozpuszczalność²⁶. Aby właściwie zrozumieć te zależności, ważne jest, aby wyekstrahować glikogen za pomocą procedury, która w jak największym stopniu izoluje reprezentatywną i nieuszkodzoną próbkę. Tradycyjne metody ekstrakcji wykorzystywały albo gorące warunki alkaliczne,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
8-aminopireno-1,3,6-trisulfonian (APTS)	SIGMA Aldrich	9341	0,1 M roztwór
Kwas octowy	SIGMA Aldrich	695092	0,1 M, roztwór pH 3,5
System SEC Agilent 1260 Infinity	Agilent, Santa Clara, CA, USA		Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)
BKS-DB/Nju myszy tła	Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University Nanjing
Zestaw do oznaczania D-glukozy (format GOPOD)	Megazyme	K-GLUC
Kwas etylenoditrilotetraoctowy (EDTA)	SIGMA Aldrich	431788
Homogenizator	IKA	T 25
Kwas solny	SIGMA Aldrich	2104	0,1 M roztwór
Kwas solny	SIGMA Aldrich	2104	0,1 M roztwór
P/ACE MDQ plus system	Ab Sciex, US		Elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE)
Detektor indeksu refrakcji	Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA)		Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)
Octan sodu	SIGMA Aldrich	241245	1 M, roztwór pH 4,5
Azydek sodu	SIGMA Aldrich	S2002
Chlorek sodu	SIGMA Aldrich	S9888
Sicynoborowodorek sodu	SIGMA Aldrich	156159	1 M roztwór
Fluorek sodu	SIGMA Aldrich	201154
Wodorotlenek sodu	SIGMA Aldrich	43617	0,1 M roztwór
Azotan sodu	SIGMA Aldrich	NISTRM8569
Pirofosforan sodu	SIGMA Aldrich	221368
Sacharoza	SIGMA Aldrich	V90016
Kolumna wstępna SUPREMA, 1 000 i 10 000 kolumn	Usługi w zakresie standardów polimerów, Moguncja, Niemcy		Chromatografia wykluczania według wielkości (SEC)
Trizma	SIGMA Aldrich	T 1503
Probówki do ultrawirówek	Beckman		4 mL, Otwarta cienkościenna probówka ultraprzezroczysta, 11 x 60 mm