Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63089

⸱

22 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Streszczenie

Glikozylaza uracylo-DNA (UDG) jest kluczowym składnikiem szlaku naprawy przez wycinanie zasady do korekcji uracylu powstałego z hydrolitycznej deaminacji cytozyny. W związku z tym ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genomu. Opracowano wysoce specyficzną, nieznakowaną, nieradioizotopową metodę pomiaru aktywności UDG. Syntetyczny dupleks DNA zawierający specyficzny dla miejsca uracyl został rozszczepiony przez UDG, a następnie poddany analizie spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS). Ustanowiono protokół mający na celu zachowanie produktu miejsca apurynowego/apirymidynowego (AP) w DNA bez pęknięcia nici. Zmianę wartości m/z z substratu na produkt wykorzystano do oceny hydrolizy uracylu przez UDG. Do analizy kinetycznej UDG użyto substratu G:U, który dał Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s i Kcat = 9,31 s-1. Zastosowanie tej metody do testu inhibitora glikozylazy uracylu (UGI) dało wartość IC50 wynoszącą 7,6 pM. Swoistość UDG przy użyciu uracylu w różnych pozycjach w jednoniciowych i dwuniciowych substratach DNA wykazała różną skuteczność rozszczepiania. Tak więc ta prosta, szybka i wszechstronna metoda MALDI-TOF MS może być doskonałą metodą referencyjną dla różnych monofunkcyjnych glikozylaz DNA. Ma również potencjał jako narzędzie do badań przesiewowych inhibitorów glikozylazy DNA.

Wprowadzenie

Chociaż uracyl jest normalną zasadą w RNA, jest to powszechna i wysoce mutagenna zmiana w genomowym DNA. Uracyl może powstać w wyniku spontanicznej/enzymatycznej deaminacji hydrolitycznej deoksycytydyny. W każdej żywej komórce ta deaminacja zachodzi 100-500 razy dziennie w warunkach fizjologicznych1,2. Jeśli te zmiany nie zostaną naprawione, może dojść do zmiany w składzie sekwencji DNA, powodując mutację. Ponieważ uracyl w DNA preferuje parowanie z dATP podczas replikacji, jeśli cytozyna deaminuje się do uracylu, w dwóch zdarzeniach replikacji nastąpi nowa mutacja przejściowa G:C do A:T w połowie potomstwa DNA3.

Wśród strategii komórkowych mających na celu utrzymanie stabilności genetycznej, naprawa przez wycinanie zasad (BER) jest podstawowym mechanizmem naprawiającym uszkodzone zasady, takie jak uracyl, w DNA4. BER jest procesem wysoce konserwatywnym ewolucyjnie. Istnieją dwie ogólne ścieżki BER: ścieżka krótkiej łaty prowadząca do drogi naprawczej pojedynczego nukleotydu i ścieżka długiej łaty, która wytwarza drogę naprawczą składającą się z co najmniej dwóch nukleotydów5. BER to skoordynowany mechanizm, który składa się z kilku etapów. Pierwszym krokiem w BER jest enzymatyczna hydroliza uszkodzonej zasady nukleotydowej przez specyficzną dla uszkodzenia glikozylazę DNA w celu wytworzenia miejsca pośredniego apurynowego/apirymidynowego (AP)6. Następnie następuje rozszczepienie szkieletu cukrowo-fosforanowego w miejscu AP przez endonukleazę, oczyszczenie końców DNA przez liazę, wypełnienie luki przez polimerazę DNA i uszczelnienie końcowego nacięcia za pomocą ligazy5.

Glikozylaza uracylo-DNA (UDG) hydrolizuje uracyl z DNA zawierającego uracyl na BER w Escherichia coli. Konwencjonalne testy UDG wykorzystujące znakowane radioaktywnie DNA z wykorzystaniem różnych technik separacji6,7,8,9,10,11,12,13 są zwykle czasochłonne, pracochłonne, wiążą się z kosztownymi odczynnikami do etykietowania, skomplikowanymi procedurami oraz wymagają intensywnego szkolenia i praktyki w celu zmniejszenia ryzyka narażenia na materiały radioaktywne. Fluorometryczne testy oligonukleotydowe zostały opracowane jako zamiennik znakowania radioizotopowego14, oprócz molekularnych latarni i technologii transferu energii rezonansu Förster15,16,17,18,19,20. Jednak dla wszystkich wyżej wymienionych metod wymagane jest specjalne etykietowanie. Niedawno opracowano testy biosensorów bez etykiet21,22,23 oraz metody kolorymetryczne oparte na tworzeniu G-quadruplex24,25,26. Jednak wiele par A:U lub specjalnie zaprojektowane sekwencje w sondach komplikują definicję jednostek enzymatycznych.

MALDI-TOF MS to technologia, która może być bardzo przydatna w analizie DNA. Opracowane aplikacje obejmują genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu27,28, zmodyfikowaną analizę nukleotydów29 oraz pośrednią identyfikację naprawy DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS powinien być łatwo stosowany do analizy glikozylazy DNA w celu wykrycia produktów DNA zawierających miejsce AP. Jednak miejsca AP w DNA są podatne na pękanie nici w wielu warunkach eksperymentalnych33. Przedstawiono tutaj test UDG wykorzystujący MALDI-TOF MS do bezpośredniego pomiaru produkcji AP bez znacznego szumu zrywania nici. Ta bezznacznikowa metoda jest łatwa w obsłudze i ma duży potencjał w farmaceutycznych zastosowaniach badań przesiewowych inhibitorów glikozylazy DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża/szablonu

  1. Zaprojektuj dupleks z uracylu o zrównoważonej zawartości G+C ~50 ± 10% i minimalnej temperaturze topnienia 50 °C dla obszaru dupleksu.
    UWAGA: Jedna różnica nukleotydów między substratami 18 nt a matrycami 19 nt (Tabela 1 i Rysunek 1) pomaga w lepszej interpretacji sygnału MS i odpowiednim wyżarzaniu. Nić matrycowa służy jako komplementarne DNA do generowania niedopasowań A-U lub G-U (Tabela 1), ale może być również używana jako sygnał odniesienia w pomiarach MS. Zastosowanie syntetycznych oligonukleotydów oczyszczonych metodą HPLC jest zadowalające dla tego badania.
  2. Rozpuścić DNA w 1 mM EDTA i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C) (TE) w stężeniu 100 μmol/l jako podstawa i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć ten 20 μl bulionu TE do końcowej objętości 800 μL (25-krotne rozcieńczenie do 4 μmol/l). Zmierzyć absorbancję roztworu DNA w spektrofotometrze w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV przy λ = 260 nm, aby zapewnić stężenie przypisane przez producenta. Na przykład: A260 = 0,204 dla 4 μmol/L U+9 i A260 = 0,192 dla 4 μmol/L T1 (tabela 1).
  3. Wykonaj analizę MS MALDI-TOF (sekcje 4-6) w celu kontroli jakości oligonukleotydów, sprawdzając unikalne sygnały szczytowe przy wyznaczonych wartościach m/z, a także sprawdzając, czy stosunek sygnału do szumu wynosi >100 (Rysunek 1B i Rysunek 1D).

2. Test glikozylazy DNA

  1. Używając substratu G:U dupleksu T1/U+9 (Tabela 1 i Rysunek 1A) do reakcji glikozylazy, na przykład w sterylnej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 70 μlH2O, 10 μl buforu reakcyjnego 10x UDG, 5 μl materiału T1 i 5 μl materiału U+9 (krok 1.2.).
    UWAGA: Wybierz odpowiedni typ mikropipety i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby poradzić sobie z wymaganą objętością. Na przykład użyj pipety o pojemności 2 μl do dozowania 0,1-2 μl płynu, użyj pipety o pojemności 10 μl do dozowania 2-10 μl płynu i użyj pipety o pojemności 100 μl do dozowania 20-100 μl płynu, aby zapewnić dokładność i precyzję wyników. Opisana objętość mieszaniny odczynników jest przeznaczona dla 10 testów; Dostosuj głośność do żądanej liczby reakcji. Bufor reakcyjny 1x UDG zawiera 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol i 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C). Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze źródłem 10x buforu reakcyjnego UDG.
  2. Dokładnie zamknąć probówkę; inkubować w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 65 °C, następnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a na koniec na lodzie przez 3 minuty, aby zapewnić prawidłowe wyżarzanie substratu/matrycy dupleksowej.
  3. W sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 49 μl lodowatego buforu reakcyjnego 1x UDG i 1 μl UDG (5 000 jednostek/ml; patrz Tabela materiałów), rozcieńczając do 0,1 jednostki/μl. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1x buforem UDG do pożądanych stężeń enzymów 0,05, 0,02 lub 0,01 jednostki/μl. Zawsze trzymaj rozcieńczony UDG na lodzie.
    UWAGA: W reakcji 10 μl 0,1 jednostki UDG mogą rozszczepić ponad 30 pmol uracylu z dupleksu T1/U+9 w ciągu 3 minut.
  4. Do sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 9,0 μl mieszaniny substratu z kroku 2.2 i podgrzać probówkę do temperatury 37 °C. Dodać 1,0 μl rozcieńczonego UDG z kroku 2.3. Użyj timera, aby określić czas reakcji i przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość.
    UWAGA: W przypadku testu z definicją jednostki czas inkubacji wynosi 30 minut. W przypadku testu kinetycznego należy użyć analizy przebiegu w czasie wynoszącej 0,5, 1, 2, 3, 5 minut, aby uzyskać szybkość początkową. W przypadku testu inhibicji UGI czas reakcji wynosi 15 minut.
  5. Odwirować probówki z mieszaniną reakcyjną przez 3-5 s w temperaturze 3 200 × g w temperaturze otoczenia. Następnie natychmiast przenieść reakcję do temperatury 37 °C.
  6. Zakończenie reakcji
    1. Przygotować roztwory 0,25 M HCl i 0,23 M zasady Tris. W probówce o pojemności 15 ml dodaj 10 ml roztworu 1 mM EDTA i 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C), aby naśladować 1x bufor reakcyjny UDG. Zakwasić 1 ml 0,25 M HCl i sprawdzić za pomocą pH-metru, aby upewnić się, że pH wynosi ~2 ± 0,5. Zneutralizować za pomocą 1 ml 0,23 M zasady Tris i sprawdzić za pomocą pH-metru, czy końcowe pH wynosi 6,5 ± 0,5,
      UWAGA: Korzystanie z pasków testowych pH to szybki i łatwy sposób na ponowne potwierdzenie poziomu pH mieszaniny odczynników.
    2. Dodać 1 μl 0,25 M HCl w celu zakwaszenia 10 μl mieszaniny reakcyjnej w celu dezaktywacji enzymu i umieścić go na lodzie na 6 minut. Dodać 1 μl 0,23 M zasady Tris w celu zneutralizowania produktów DNA, aby uniknąć pęknięcia miejsca AP przez długotrwałe wystawienie na działanie kwasu. Dodać 13 μl TE, aby zwiększyć objętość mieszaniny produktów do transferu wiórów matrycowych, a następnie umieścić ją na lodzie.
      UWAGA: Produkt AP jest niestabilny chemicznie i powinien zostać przeanalizowany przez MALDI-TOF MS w ciągu 2 dni. Po długotrwałym przechowywaniu przez ponad tydzień, akumulacja znacznej części pęknięć nici następuje w wyniku reakcji eliminacji produktów AP β/δ ( Rysunek 1D-G).
  7. Przenieść wszystkie 25 μl produktów reakcji UDG z probówek mikrowirówek na 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania.
    UWAGA: Wysokie stężenia kationów, takich jak sód lub potas w, powodują zakłócenia w analizie MALDI-TOF MS i dlatego wymagają odsalania. Ponieważ bufor reakcyjny UDG E. coli zawiera bardzo niskie stężenia kationów, odsalanie nie jest konieczne. Należy jednak zmodyfikować ten protokół, aby zmierzyć inne reakcje glikozylazy DNA zawierające kationy metali, które wymagają odsalania, jak opisano wcześniej35.

3. Przenieś produkty reakcji UDG do układu matrycowego

  1. Otwórz drzwiczki dozownika nanolitrów (patrz Tabela materiałów) i załaduj 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z kroku 2.7 na uchwyt płytki pokładu.
  2. Włóż matrycę chipową do odpowiedniej pozycji płytki zwiadowczej. Umieść załadowaną płytkę zwiadowczą na pokładzie obróbczym dozownika nanolitrów i zamknij drzwiczki.
  3. Dotknij przycisku uruchamiania na ekranie transferu i poczekaj, aż urządzenie zacznie dozować próbki z 384-dołkowej płytki mikromiareczkowej do chipa matrycy.
  4. Użyj opcji zakładki Wizja, aby wyświetlić obraz chipa i objętości dozowania dla każdego miejsca podczas dozowania. Upewnij się, że zauważona wolumin na chipie mieści się w zakresie 5-10 nL.

4. Ustaw parametry testu na spektrometrze masowym

  1. Za pomocą programu aplikacyjnego (patrz Tabela materiałów) przygotuj plik .xlsx zawierający przewidywaną wartość sygnału m/z do importu.
    UWAGA: Ustawienia w PLIKU I.xlsx (Tabela 2) są przykładowymi ustawieniami dla testu UDG substratu G:U w sekcji 2.
  2. Użyj aplikacji, aby utworzyć i zdefiniować nowy test UDG, klikając prawym przyciskiem myszy opcję Importuj grupę testów w formacie projektanta i wybierając plik .xlsx z listy rozwijanej (np. PLIK I.xlsx z kroku 4.1).
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk Klient:Projekt:Płyta i kliknij na górze rozwijanego drzewa opcji, aby ustanowić nową płytkę testową. W oknie dialogowym wpisz nazwę pliku (np. CTT20210620 kodu laboratoryjnego i daty testu), a następnie z listy rozwijanej typu płytki wybierz typ płytki 384-dołkowej i naciśnij przycisk OK. Poszukaj pustej płytki, która pojawi się po prawej stronie ekranu.
  4. Kliknij opcję Test; wybierz test (np. FILE I.xlsx) z listy rozwijanej.
  5. Aby przypisać wybrany test (np. FILE I.xlsx) do każdej pozycji plamki próbki na płytce, przesuń kursor do każdej pozycji pustej płytki, kliknij, aby podświetlić studzienkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Dodaj pleks.
  6. Za pomocą komputera stacjonarnego lub laptopa przygotuj listę roboczą w formacie .xlsx bez nagłówka (np. 0620.xlsx z tabeli 3) dla wszystkich próbek na chipie z kroku 2.7. Kliknij przycisk Dodaj nowy przykładowy projekt; Wybierz plik (np. 0620.xlsx) z listy rozwijanej, aby zaimportować listę roboczą.
  7. Poszukaj wszystkich kodów próbek testowych na liście roboczej (np. od 0620.xlsx) po lewej stronie ekranu. Kliknij przykładowy kod na liście roboczej i kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednią pozycję płytki, aby połączyć testy z każdą pozycją.

5. Działanie spektrometru masowego

  1. Użyj aplikacji, aby połączyć spektrometr mas (patrz tabela materiałów) z chipem próbki (z sekcji 3), który ma być analizowany.
  2. Kliknij ustawienie domyślne. W oknie dialogowym wpisz nazwę pliku z kroku 4.3 (np. CTT20210620); w polu Nazwa eksperymentu wpisz identyfikator chipa w kodzie kreskowym chipa i zapisz ustawienia.
  3. Uruchom program sterujący spektrometrem mas (patrz Tabela materiałów).
  4. Naciśnij przycisk In/Out spektrometru mas i pozwól pokładowi się wysunąć. Wyjmij uchwyt na wióry i włóż sample chip z kroku 3.4 do uchwytu na wióry. Umieść załadowany uchwyt na wióry na przedłużonym pokładzie i naciśnij przycisk Wejście/Wyjęcie, aby sample chip wszedł do urządzenia.
  5. Kliknij dwukrotnie ikonę Pobierz w aplikacji. W oknie Acquire (Akwizycja) kliknij zakładkę auto run, aby uruchomić instrument i uzyskać widma masy z próbek na chipie.

6. Przeglądanie widm mas i analiza danych

  1. Uruchom program do analizy danych (patrz Tabela materiałów).
  2. Przejrzyj drzewo bazy danych i wybierz identyfikator chipa z kroku 5.2. Kliknij, aby podświetlić pole docelowe na chipie, a następnie kliknij ikonę widma, aby wyświetlić widmo masowe.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Okno dialogowe dostosowywania, aby przyciąć określony zakres widma w nowym oknie. Kliknij oś X, aby wpisać górną i dolną granicę m/z, a następnie naciśnij OK, aby wyświetlić określone spektrum zakresu, w tym interesujące sygnały.
    UWAGA: Ilość DNA jest proporcjonalna do intensywności piku przy każdej jednostce wartości m/z.
  4. Zmierz wysokość piku wartości m/z sygnałów odpowiadających podłożem U, produktowi AP i szablonowi. Kliknij szczyt i wyświetl wysokość szczytu w lewym górnym rogu ekranu.
    UWAGA: Widmo 1,600 szerokości/1,200 jednostki to rozsądny wymiar do kontroli na ekranie komputera, a także do prowadzenia dokumentacji.
  5. Aby zapisać widmo do prowadzenia dokumentacji, kliknij prawym przyciskiem myszy Eksportuj i wybierz typ pliku JPEG z listy rozwijanej. Kliknij Miejsce docelowe i Przeglądaj dysk, aby wybrać urządzenie pamięci masowej z listy rozwijanej (np. dysk flash E:). Wpisz nazwę pliku (np. 0620_1-2.jpg) i kliknij przycisk Eksportuj.
  6. W razie potrzeby wydrukuj wyeksportowany plik JPEG i ręcznie zmierz wysokość piku za pomocą linijki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szablony i substraty
Na przykładzie syntetycznych oligonukleotydów z uracylem w centrum (U+9) sparowanych z matrycą zawierającą guaninę (Rycina 1A), można wykorzystać kontrolę bez dodatku enzymu, zawierającą stechiometryczne ilości matrycy i substratu z uracylem, do kontroli jakości czystości syntetycznych oligonukleotydów (Rycina 1B; sygnały odpowiadają wyznaczonym wartościom m/z, a tło jest niskie). W analizie danych MS mierzono wys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono szczegółową procedurę stosowania metody oznaczania UDG MALDI-TOF MS do bezpośredniego wykrywania produktów DNA zawierających AP. Głównymi zaletami tej metody jest to, że podłoża zawierające uracyl są bezznacznikowe, skalowalne, łatwe w obróbce i zapewniają większą elastyczność w projektowaniu substratów.

Zalecana przez dostawcę UDG ekstrakcja fenolu/chloroformu umożliwia inaktywację enzymu, aby zapobiec degradacji DNA produktu. Jednak protokół ekstrakcji fenolu wiąże s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Tajpej, Tajwan) oraz NRPB Pharmacogenomics Lab (Tajpej, Tajwan) za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu, R.O.C. [grant nr MOST109-2314-B-002 -186 dla K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 dla S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 dla W.-h.F.]. H.-L. C. jest stypendystką National Taiwan University. Finansowanie w ramach opłaty za otwarty dostęp: Ministerstwo Nauki i Technologii, R.O.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-amino-2-hydroksymetylo-propano-1,3-diol (zasada Tris)J.T bakerProtokół 1,2
Autoklawizowana woda dejonizowanaMILLIPOREProtokół 1,2
EDTAJ.T BakerProtokół 1,2
RękawiceAQUAGLOVEProtokół 1,2,3
Kwas solny (HCl)SIGMAProtokół 1,2
Wiadro na lódTaiwan.IncProtocol 2
Końcówki do pipet o niskiej retencji (0,5-10 i mikro; L)dodatkowy genProtokół 1,2
Końcówki do pipet o niskiej retencji (1,250 i mikro; L)krajowe zaopatrzenie naukowe co, Inc.Protokół 1,2
Końcówki do pipet o niskiej retencji (200 &mikro; L)krajowe zaopatrzenie naukowe co, Inc.Protokół 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Programy kontrolne spektrometrii mas obejmują Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE i Start RT Process.
MassARRAY NanodozownikAAT Bioquest, Inc.RS1000Protokół 3
MikrowirówkaKubotaProtokół 2
MikrowirówkaClubioProtokół 2
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)National scientific supply co, Inc.Protokół 2
Stojak na probówki do mikrowirówekTaiwan.IncProtokół 1,2
Mikropipeta  (P1000)Mikropipeta z protokołemGilsona
  (P2)Gilsona1,2
Mikropipeta (P10)Gilsona1,2
Mikropipeta (P100)Gilsona1,2
P200)Gilsona1,2
SL2)Protokół Rainin1,2
OligonukleotydyZintegrowane technologie DNA (Singapur)Protokół 1,2
Kalkulator wykresu zadań IC50 (v.1)AAT Bioquest, Inc.Rys. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
wodorotlenku sodu (NaOH)WAKOProtocol 2
  Agena Bioscience, CA#01509Protokół 3, 5
TimerTaiwan.IncProtokół 2
Oprogramowanie Typer 4.0  Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 składa się z czterech programów, w tym Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor i Typer Analyzer.
Bufor reakcyjny UDG (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtokół 2
Inhibitor glikozylazy uracyluNew England Biolabs, MAM0281SProtokół 2
Glikozylaza uracylo-DNANew England Biolabs, MAM0280LProtokół 2
Spektrofotometr UV-VISBLE UV-1601SHIMADZUProtokół 1
Łaźnia wodnaZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc)Protokół 2
1,2Protokół Protokół Mikropipeta (Mikropipeta ( Układ SpectroCHIP

Bibliografia

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741(2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155(2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039(2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862(2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028(2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894(2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektrometria mas MALDI-TOFnaprawa przez wycinanie zasaddetekcja miejsc APmechanizmy naprawy DNAhydroliza uracyluscreening inhibitorów glikozylazsyntetyczny dupleks DNAtest aktywności enzymatycznej
Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.