Artykuł metodologiczny

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63090

⸱

10 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Streszczenie

Pomiary funkcji rzęsek (częstotliwość uderzeń, wzór) zostały ustanowione jako narzędzia diagnostyczne dla chorób układu oddechowego, takich jak pierwotne dyskinezy rzęsek. Jednak szersze zastosowanie tych technik jest ograniczone przez ekstremalną podatność funkcji rzęsek na zmiany czynników środowiskowych, np. temperatury, wilgotności i pH. W drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą (CF) nagromadzenie śluzu utrudnia bicie rzęsek. Funkcja rzęsek została zbadana w pierwotnych modelach komórek dróg oddechowych jako wskaźnik aktywności kanału CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Jednak stwierdzono znaczną zmienność między pacjentami w częstości uderzania rzęsek w odpowiedzi na leki modulujące CFTR, nawet u pacjentów z tymi samymi mutacjami CFTR. Co więcej, wpływ dysfunkcyjnego wydzielania chlorków regulowanych przez CFTR na funkcję rzęsek jest słabo poznany. Obecnie nie ma kompleksowego protokołu demonstrującego przygotowanie próbek modeli dróg oddechowych in vitro, akwizycję obrazu i analizę częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF). Standaryzowane warunki hodowli i akwizycja obrazu przeprowadzone w warunkach kontrolowanych środowiskowo umożliwiłyby spójne, powtarzalne oznaczanie ilościowe CBF u różnych osób i w odpowiedzi na leki modulujące CFTR. Protokół ten opisuje kwantyfikację CBF w trzech różnych systemach modeli komórek nabłonka dróg oddechowych: 1) natywnych arkuszach nabłonka, 2) modelach interfejsu powietrze-ciecz zobrazowanych na przepuszczalnych wkładkach nośnych oraz 3) trójwymiarowych organoidach osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwa ostatnie odtwarzają fizjologię płuc in vivo, z biciem rzęsek i produkcją śluzu. Funkcja rzęsek jest rejestrowana za pomocą szybkiej kamery wideo w komorze kontrolowanej przez środowisko. Do analizy CBF wykorzystywane są niestandardowe skrypty. Przewiduje się, że przełożenie pomiarów CBF na praktykę kliniczną stanie się ważnym narzędziem klinicznym do przewidywania odpowiedzi na leki modulujące CFTR w przeliczeniu na pacjenta.

Wprowadzenie

Pomiary częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) i wzorca zostały ustanowione jako narzędzia diagnostyczne dla chorób układu oddechowego, takich jak pierwotna dyskineza rzęsek (PCD)1. W mukowiscydozie (CF) dysfunkcja kanału chlorkowego CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) powoduje odwodnienie płynu powierzchniowego dróg oddechowych i upośledzony klirens śluzowo-rzęskowy 2. Funkcja rzęsek została zbadana in vitro w pierwotnych modelach komórek dróg oddechowych jako wskaźnik aktywności kanału CFTR3. Istnieje jednak znaczna zmienność między pacjentami w CBF w odpowiedzi na leki modulujące CFTR, nawet u pacjentów z tymi samymi mutacjami CFTR 3. Co więcej, wpływ dysfunkcyjnego wydzielania chlorków regulowanych przez CFTR na funkcję rzęsek jest słabo poznany. Obecnie nie ma kompleksowego protokołu demonstrującego przygotowanie próbek modeli dróg oddechowych in vitro, akwizycję obrazu i analizę CBF.

Arkusze nabłonka nosa wyizolowane z wyszczeraczek błony śluzowej nosa są bezpośrednio używane do pomiarów funkcji rzęsek w diagnostyce PCD4. Jednak, chociaż nie ma kontroli nad rozmiarem lub jakością uzyskanych arkuszy nabłonka nosa, CBF różni się w zależności od tego, czy jest mierzony na pojedynczych komórkach, czy na arkuszach komórkowych oraz na krawędziach rzęsek nabłonka, które są przerwane lub nienaruszone5. W związku z tym wtórne dyskinezy spowodowane uszkodzeniem komórek podczas pobierania szczarek błony śluzowej nosa mogą wpływać na CBF. Pierwotna hodowla komórkowa komórek nabłonka nosa i ich różnicowanie na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) lub w trójwymiarowej macierzy błony podstawnej w organoidy nabłonka rzęsek rzęsek prowadzi do powstania rzęsek, które są wolne od wtórnych dyskinez4,6,7,8. Komórki nabłonka dróg oddechowych różnicujące się w ALI (odtąd nazywane modelami ALI) zostały uznane za ważną wtórną pomoc diagnostyczną, która odtwarza wzorce uderzeń rzęsek i częstotliwość szczotkowania błony śluzowej nosa ex vivo6 i umożliwia analizę ultrastruktury rzęsek, wzorca dudnienia i częstotliwości uderzeń przy zachowaniu wad specyficznych dla pacjenta9. Istnieją jednak rozbieżności w metodologiach stosowanych do tworzenia tych pseudostratyfikowanych, śluzowo-rzęskowych zróżnicowanych modeli komórek. Różne protokoły ekspansji lub różnicowania kultur mogą indukować różne fenotypy nabłonkowe (rzęskowe lub wydzielnicze)10 i powodować znaczące różnice w CBF11. CBF został określony ilościowo w szczotkowaniu nabłonka nosa4,6,12,13,14,15,16, organoidy nabłonka dróg oddechowych14,17,18 i modele ALI3,4,6,13,19,20,21. Jednak wśród tych protokołów występują duże zmienności i często wiele parametrów nie jest kontrolowanych. Na przykład w niektórych badaniach CBF jest obrazowany in situ, podczas gdy komórki modelu ALI pozostają na przepuszczalnym nośniku insert3,19,20,21, jeszcze inne zeskrobują komórki z wkładu przepuszczalnej podpory i obrazują je zawieszone w media4,6,13.

Ponadto, szersze zastosowanie technik mierzących funkcję rzęsek jest ograniczone przez ekstremalną podatność funkcji rzęsek na zmiany czynników środowiskowych. Czynniki środowiskowe, takie jak temperatura22, wilgotność23,24 i pH25,26 wpływają na funkcję rzęsek i muszą być regulowane, aby dokładnie określić ilościowo CBF. Różne parametry fizjologiczne używane w różnych laboratoriach i ich wpływ na CBF zostały wcześniej przeanalizowane27.

W literaturze opisano różne technologie obrazowania i podejścia do pomiarów CBF. W diagnostyce PCD do pomiaru funkcji rzęsek stosuje się mikroskopię wideo28,29. Niedawno algorytm analizy wideo oparty na różnicowej mikroskopii dynamicznej został wykorzystany do ilościowego określenia zarówno CBF, jak i koordynacji rzęsek w modelach ALI komórek nabłonka dróg oddechowych3,30. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie bicia rzęsek w komórkach nabłonka dróg oddechowych w szybki i w pełni zautomatyzowany sposób, bez konieczności segmentacji lub selekcji regionów. Różne metody obrazowania i oznaczania ilościowego CBF mogą przyczyniać się do różnic zgłaszanych w CBF w literaturze (plik uzupełniający 1).

Protokół od hodowli do kwantyfikacji w celu usprawnienia istniejących metod, standaryzacji warunków hodowli i pozyskiwania obrazów, przeprowadzany w ściśle kontrolowanych warunkach środowiskowych, umożliwiłby spójną, powtarzalną kwantyfikację CBF u osób i między osobami.

Ten protokół zawiera pełny opis zbioru komórek nabłonkowych, warunków hodowli ekspansji i różnicowania oraz kwantyfikacji CBF w trzech różnych systemach modeli komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzenia nosowego: 1) natywne arkusze nabłonka, 2) modele ALI obrazowane na przepuszczalnych wkładkach nośnych i 3) trójwymiarowe organoidy osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (Rysunek 1). Komórki nabłonka nosa uzyskane ze szczotkowania małżowin nosowych dolnych są używane jako przedstawiciele nabłonka dróg oddechowych, ponieważ są skutecznym substytutem komórek nabłonka oskrzeli31 podczas pokonywania inwazyjnej procedury związanej z pobieraniem szczotek oskrzelowych. Metoda warunkowego przeprogramowania komórki (CRC) służy do rozszerzania pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych w celu stworzenia modeli ALI i trójwymiarowych organoidów. Warunkowe przeprogramowanie komórek nabłonka dróg oddechowych do stanu podobnego do komórki macierzystej jest indukowane przez kohodowlę z systemem komórkowym odżywiającym fibroblasty z zatrzymanym wzrostem i inhibitorem kinazy związanej z Rho (ROCK)32. Co ważne, metoda CRC zwiększa populację podwajającą się w komórkach nabłonka dróg oddechowych, zachowując jednocześnie ich specyficzny tkankowo potencjał różnicowania33,34. We wszystkich modelach komórek nabłonka dróg oddechowych funkcja rzęsek jest rejestrowana w komorze o kontrolowanej temperaturze za pomocą szybkiej kamery wideo ze znormalizowanymi ustawieniami akwizycji obrazu. Do ilościowego określania CBF wykorzystywane są niestandardowe skrypty.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy. Po szczotkowaniu małżowiny nosowej dolnej uczestników, komórki nabłonka dróg oddechowych są wykorzystywane na jeden z dwóch sposobów. Albo arkusze nabłonka dróg oddechowych są izolowane, a częstotliwość bicia rzęsek jest natychmiast obrazowana, albo komórki nabłonka dróg oddechowych są rozszerzane za pomocą metody warunkowego przeprogramowania komórek. Komórki nabłonka dróg oddechowych rozszerzone przez CRC są różnicowane w celu utworzenia komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz lub kulturach organoidów nabłonka dróg oddechowych. Obrazowanie częstotliwości uderzeń rzęsek uzyskuje się za pomocą mikroskopu do obrazowania żywych komórek z komorą środowiskową do ogrzewania i wilgotności oraz kamerą naukową o dużej liczbie klatek na sekundę (>100 Hz). Analiza danych odbywa się za pomocą niestandardowych skryptów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Otrzymano zgodę na badanie od Komisji Etycznej Sieci Szpitali Dziecięcych w Sydney (HREC/16/SCHN/120). Przed pobraniem próbek biologicznych uzyskano pisemną zgodę od wszystkich uczestników (lub ich opiekunów).

1. Przygotowania do tworzenia modeli komórek nabłonka dróg oddechowych

  1. Przygotuj pożywkę do pobierania komórek nosa, łącząc 80% zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco i 20% płodowej surowicy bydlęcej. Suplement z 1 μl/ml penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  2. Pokryj kolby lub przepuszczalne wkładki podtrzymujące roztworem kolagenu w zależności od potrzeb, wykonując czynności 1.2.1-1.2.4. Nie przechowywać naczynek pokrytych kolagenem przez długi czas.
    1. Roztwór kolagenu typu I (3 mg/ml zapasu) należy rozcieńczyć w stosunku 1:100 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do stężenia końcowego 0,03 mg/ml. Dobrze wymieszaj.
    2. Kolby do hodowli komórkowych (sekcja 4) należy pokryć 160 μl/cm2 (tj. 4 ml na kolbę T25), a przepuszczalne wkładki nośne (sekcja 5) 455 μl/cm2 (tj. 150 μl na wkładkę 6,5 mm) przygotowanego roztworu kolagenu.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-24 godziny.
    4. Usuń roztwór kolagenu za pomocą pipety lub aspiratora próżniowego przed wysiewem komórek. Nie myj naczynia przed wysiewem komórek.
  3. Przygotuj nośnik CRC (Conditional Reprogramming Cell), łącząc komponenty32 wymienione w Tabeli 1. Filtruj sterylizację za pomocą systemu filtrów próżniowych w butelce. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy.
  4. W dniu stosowania należy dodać ludzki naskórkowy czynnik wzrostu, inhibitor ROCK i antybiotyki, jak wskazano w Tabeli 1.
składnikgłośność
DMEM, wysoki poziom glukozy156,7 ml
DMEM/F-12, HEPES313,3 ml
Hydrokortyzon55,6 μl
insulina1,25 ml
Toksyna21 μL
adenina1,2 ml
WYSOKI POZIOM FBS25 ml
Penicylina-Streptomycyna5 ml
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu1 μl/ml
Inhibitor ROCK1 μl/ml
Strefa grzybów2 μl/ml
Tobramycyna2 μl/ml
Hydrat ceftazydymu4 μl/ml
Roztwór gentamycyny1 μl/ml

Tabela 1: Składniki dla 500 ml warunkowego przeprogramowania nośnika komórkowego

2. Zbiór szczaczek małżowiny nosowej dolnej

UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga probówki (50 ml) z pożywką do pobierania komórek nosa, szczoteczkami do cytologii, tkankami i odpowiednim sprzętem ochrony osobistej. Unikaj szczotkowania podczas infekcji górnych dróg oddechowych. Istnieje niewielkie ryzyko krwawienia, które zwiększa się, jeśli występuje stan zapalny. Jeśli celem szczotkowania jest uzyskanie arkuszy nabłonka dróg oddechowych do pomiarów ex vivo CBF, szczotkowanie powinno nastąpić co najmniej 6 tygodni po infekcji górnych dróg oddechowych; Najlepiej ponad 10 tygodni po infekcji35.

  1. Przygotować pożywkę do pobierania komórek nosa (sekcja 1) i trzymać probówkę na lodzie.
  2. Opisz uczestnikowi procedurę jako niewygodną. Wyjaśnij, że podczas szczotkowania odczuwa się pełne uczucie w nozdrzu, podobne do skoku do oceanu/basenu i wody wdzierającej się do przewodu nosowego. Poinformuj uczestników, że zabieg wywoła produkcję łez jako odruch.
  3. Oceń, która pozycja jest odpowiednia dla uczestnika. Połóż uczestnika w pozycji leżącej, jeśli dostępna jest leżanka do badań, ponieważ ułożenie na plecach zapobiega odsuwaniu głowy uczestnika od szczotki podczas zabiegu. Alternatywnie, posadź uczestnika przy ścianie, o którą może przycisnąć głowę do tyłu.
  4. Sprawdź przewód nosowy. Zwróć uwagę na odchylenie przegrody, polipy i wszelkie inne nieprawidłowości anatomiczne, które mogą wpływać na przejście szczoteczki w przewodzie nosowym i zwiększać ryzyko krwawienia.
  5. Oczyść nos z nadmiaru śluzu, prosząc uczestników o wydmuchanie nosa w chusteczkę.
  6. Poproś uczestnika, aby oddychał przez usta. Weź szczoteczkę do cytologii w dominującą rękę. Opierając piątą cyfrę na brodzie uczestnika, aby zakotwiczyć dłoń, włóż szczoteczkę do cytologii do przewodu nosowego uczestnika (Rysunek 2). Włóż szczoteczkę pod kątem ~45° do twarzy uczestnika, aby przejść przez ujście nosowe.
  7. Obróć szczoteczkę pionowo tak, aby była prostopadła do twarzy uczestnika. Delikatnie, ale stanowczo dociśnij szczoteczkę do bocznej ściany nosa poniżej małżowiny dolnej, aż znajdzie się w środkowej lub tylnej części małżowiny usznej.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego włożenia; Jeśli odczuwalny jest nagły spadek oporu, oznacza to, że weszło się do gardła nosowego i szczoteczkę należy schować, aż opór zostanie ponownie odczuł proceduralista.
  8. Obróć szczotkę o 360° do trzech razy. Delikatnie wyjmij szczoteczkę w odwrotnej kolejności do manewru wkładania, aby komórki nie zostały usunięte ze szczoteczki.
  9. Umieść szczoteczkę w przygotowanej probówce z pożywką do pobierania komórek nosa. Umieść probówkę zbiorczą na lodzie.
  10. Powtórz szczotkowanie w drugim nozdrzu, jeśli uczestnik jest zgodny/wymagana jest duża liczba komórek (np. do zainicjowania hodowli komórkowej).
    UWAGA: To samo nozdrze można ponownie wyszczotkować, jeśli na szczoteczce nie było widocznych krwinek, zauważając jednak, że ryzyko krwawienia nieznacznie wzrasta przy drugim szczotkowaniu w tym samym nozdrzu.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zbiór komórek nabłonka nosa. Ilustracja położenia szczoteczki cytologicznej w środkowej i tylnej części małżowiny nosowej dolnej. Pozycję tę osiąga się poprzez włożenie szczoteczki przez nozdrza, obrócenie szczotki pod kątem 90° do twarzy i poprowadzenie szczoteczki wzdłuż przewodu nosowego poniżej małżowiny dolnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie arkuszy nabłonka dróg oddechowych

UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga probówki (szczoteczki cytologicznej + 1 ml pożywki do pobierania komórek nosa) (sekcja 2) i 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. W przypadku pobierania szczaczek małżowiny nosowej w celu obrazowania arkuszy nabłonka dróg oddechowych należy użyć tylko 1 ml pożywki do pobierania komórek nosa bez antybiotyków; W przeciwnym razie arkusze nabłonkowe będą zbyt rozproszone do obrazowania.

  1. Delikatnie zakręć probówką zawierającą szczoteczkę (szczoteczki) do cytologii, aby usunąć arkusze nabłonka dróg oddechowych ze szczoteczki (szczotek).
  2. Zbierz wszystkie media i komórki za pomocą pipety P1000. Dozuj 5-6 kropli do dołka z 96-dołkową płytką z płaskim dnem. Powtórz dla około siedmiu dołków.
  3. Przenieść płytkę do mikroskopu zgodnie z krokiem 7.1.4 i postępować zgodnie z pozostałą częścią sekcji 7, aby zobrazować częstotliwość uderzeń rzęsek.
  4. Arkusze nabłonka obrazu (Rysunek 1), a nie pojedyncze nieprzyłączone komórki, ponieważ wykazano, że funkcja rzęsek różni się między arkuszami nabłonka a pojedynczymi nieprzyłączonymi komórkami5.

4. Rozbudowa i utrzymanie komórek nabłonka dróg oddechowych

  1. warunkowe przeprogramowanie nabłonka dróg oddechowych hodowla ekspansji komórek
    UWAGA: Naczynie pokryte roztworem kolagenu (sekcja 1), Napromieniowane embrionalne komórki zasilające myszy (NIH-3T3), pożywka dla komórek warunkowego przeprogramowania (CRC) (sekcja 1), szczoteczka (szczoteczki) cytologiczna w pożywce do pobierania komórek nosa (sekcja 2).
    1. Napromieniowane komórki zasilające należy umieścić na płytce w przygotowanym naczyniu hodowlanym pokrytym roztworem kolagenu o gęstości wysiewu 8 000 komórek/cm2 co najmniej 2 godziny i nie więcej niż 72 godziny przed kohodowlą z komórkami nabłonka dróg oddechowych (patrz36 dla hodowli komórek karmiących i napromieniania).
    2. Przenieś szczotkowane komórki w probówce zbiorczej (szczoteczka (szczoteczki do cytologii) + pożywka do pobierania komórek nosa) do wiru na lodzie. Przy niskiej prędkości rurka wirowa 10 s włączona, 10 s wyłączona (trzymaj na lodzie pomiędzy), aby usunąć komórki ze szczotek (szczotek). Energiczne wirowanie może zmniejszyć żywotność komórek. Sprawdź szczoteczkę (szczoteczki), aby sprawdzić, czy śluz nadal przylega. Jeśli tak, powtórz wirowanie.
    3. Przenieś probówkę (probówki) z lodem z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety serologicznej przenieś pożywkę z probówki zbiorczej do nowej probówki (probówki B), pozostawiając szczoteczki cytologiczne. Probówkę B odwirować przy 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Wyjąć probówkę B z wirówki, wyrzucić supernatant. Jeśli śluz jest widoczny, przemyj osad kolejnymi 5 ml pożywki do pobierania komórek nosa i ponownie odwiruj.
    5. Dodać 1 ml pożywki CRC, aby ponownie zawiesić osad komórkowy w probówce B. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przepuścić komórki przez sito komórkowe umieszczone na górze probówki o pojemności 50 ml (probówka C) ruchem okrężnym.
    6. Powtórz wiele razy, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową. Zebrać pozostałą pożywkę z dna sita i wymieszać ją z pożywką. Wyrzuć sito komórkowe.
    7. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml pobrać 1 ml pożywki z probówki C i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.
    8. Pobrać 10 μl tej zawiesiny komórek i dodać ją do probówki do mikrowirówki, która jest wstępnie porcjowana z 10 μl błękitu trypanowego. Dobrze wymieszaj i natychmiast użyj automatycznego licznika komórek, aby zarejestrować liczbę komórek i żywotność.
    9. Wysiewać komórki nabłonka dróg oddechowych do kolby T25 wstępnie obsianej napromieniowanymi komórkami zasilającymi.
  2. Utrzymanie i dysocjacja komórek nabłonka dróg oddechowych
    UWAGA: Pożywka CRC musi zostać podgrzana do 37 °C poprzez umieszczenie jej w laboratoryjnej łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze lub urządzeniu do kąpieli perełkowej przed dodaniem do komórek.
    1. Regularnie sprawdzaj komórki pod mikroskopem hodowli komórkowych (4× soczewka obiektywowa) pod kątem przyczepienia, zanieczyszczenia, morfologii i zbieżności.
    2. Zmieniaj pożywkę CRC co drugi dzień. Gdy obserwuje się przeprogramowane komórki (Rysunek 1) i nie ma w nich zanieczyszczenia, zmniejsz lub odstaw antybiotyki.
    3. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, użyj metody podwójnej trypsyny32, aby zdysocjować komórki i przeprowadzić zliczanie komórek zgodnie z opisem w kroku 4.1.8 (patrz Plik uzupełniający 2 dla dysocjacji i zamrażania komórek).

5. Wysiewanie i różnicowanie komórek nabłonka dróg oddechowych oraz utrzymanie zróżnicowanych modeli ALI

  1. Wysiewanie komórek nabłonka dróg oddechowych do przepuszczalnych wkładów podporowych
    1. Przenieść przepuszczalne wkładki nośne pokryte roztworem kolagenu (sekcja 1) z inkubatora CO2 do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odessać roztwór kolagenu i wyrzucić. Dodać 750 μl pożywki ekspancyjnej (bez antybiotyków) do komory podstawowej przepuszczalnych wkładów nośnych.
    2. Przenieś zdysocjowane komórki lub rozmrożone komórki na lodzie do komory bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj objętość podłoża ekspandacyjnego potrzebną do wysiewu 200 000-250 000 komórek w 150 μl do komory wierzchołkowej każdej przepuszczalnej wkładki nośnej.
    3. Uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków; dobrze wymieszaj, aby upewnić się, że komórki są jednorodne i w zawiesinie. Dodać 150 μl zawiesiny komórek do wierzchołkowej strony każdej przepuszczalnej wkładki nośnej.
    4. Ponownie zawiesić komórki po wysianiu co trzy przepuszczalne wkłady podporowe, aby utrzymać jednorodną zawiesinę komórek.
    5. Co drugi dzień, aż utworzy się zlewająca się monowarstwa komórek (zwykle do 4 dnia po wysiewie), wyrzuć pożywkę i dodaj świeżą pożywkę ekspandacyjną ogrzaną do temperatury pokojowej (RT, 15-25 °C).
  2. Różnicowanie komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz
    1. Ciepłe podłoże ALI (bez antybiotyków) do temperatury pokojowej (15-25 °C).
    2. Usunąć pożywkę eksplatacyjną i zmienić na pożywkę różnicującą (ALI) zarówno w przedziale wierzchołkowym, jak i podstawnym.
    3. Po 2 dniach hodowli w zanurzonych pożywkach ALI należy odessać i wyrzucić pożywkę.
    4. Dodać 750 μl pożywki ALI do komory podstawowej tylko w celu uzyskania granicy faz powietrze-ciecz.
      UWAGA: Jeśli po 1 tygodniu hodowli monowarstwa nie zlewa się i nadal obserwuje się, komórki mogą nie mieć już zdolności do rozszerzania się w puste obszary, rozważ odrzucenie komórek nabłonka dróg oddechowych.
  3. Utrzymanie zróżnicowanego modelu ALI i usuwanie śluzu
    1. Zmieniaj pożywkę wierzchołkową i podstawową co drugi dzień, aż do pełnego różnicowania (dzień 21-25 po ustaleniu granicy faz powietrze-ciecz).
    2. Raz w tygodniu przemyj śluz od strony wierzchołkowej, wykonując czynności 5.3.3-5.3.4.
    3. Ciepły PBS do RT (15-25 °C).
    4. Dodać 200 μl PBS do komory wierzchołkowej. Inkubować w inkubatorze CO2 przez 10 minut. Użyj urządzenia do aspiracji lub pipety, aby usunąć PBS.

6. Trójwymiarowe organoidy nabłonkowe dróg oddechowych

  1. Preparaty do hodowli organoidów nabłonka dróg oddechowych
    1. Umieścić 24-dołkową płytkę (płytki) w inkubatorze CO2 w celu ogrzania się do temperatury 37 °C przez noc.
    2. Rozmrozić 10 ml fiolkę ECM (tabela materiałów) na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj 500 μl porcji (jednorazowego użytku), aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie ECM o stężeniu białka >10,5 mg/ml w celu uzyskania najlepszych wyników hodowli. Niższe stężenie przyspieszy rozpad kopuły ECM i zwiększy występowanie organoidów wierzchołkowo-skierowanych na zewnątrz.
    3. Użyj zestawu organoidów do dróg oddechowych (tabela materiałów), aby przygotować podłoże do wysiewu organoidów dróg oddechowych (AOSM) i podłoże różnicujące (AODM) zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przygotować podłoża podstawowe organoidów dróg oddechowych zgodnie z tabelą 2.
składnikgłośność
Zaawansowany DMEM/F-12500 ml
HEPESY5 ml
Alanylo-glutamina5 ml
Penicylina-Streptomycyna5 ml

Tabela 2: Składniki podłoża podstawnego organoidów dróg oddechowych

  1. Użyć liczby żywych komórek nabłonka dróg oddechowych zdysocjowanych w sekcji 4.2, aby obliczyć, ile studzienek można wysiać przy gęstości wysiewu 10 000 komórek (patrz Tabela 3).
  2. Oblicz całkowitą objętość ECM i AOSM potrzebną do wytworzenia 1 x 50 μL 90% kopuły ECM (45 μL ECM i 5 μL AOSM) na studzienkę.
    UWAGA: Zalecana gęstość wysiewu 10 000 komórek na studzienkę jest przeznaczona dla rozszerzonych komórek nabłonka nosa CRC w pasażu 1. Późniejsze komórki pasażujące mogą wymagać większej gęstości wysiewu, aby osiągnąć tę samą liczbę organoidów.
Liczba studniLiczba komórekLiczba kopułTom Matrigel ECMTom AOSM
110 000 komórek145 μL x 1,15 μL x 1,1
cyfra arabska20 000 komórekcyfra arabska90 μL x 1,110 μL x 1,1
550 000 komórek5225 μL x 1,125 μL x 1,1
..................Komórek..................μL x 1,1.........μL x 1,1

Tabela 3: Obliczenia dotyczące wysiewu komórek nabłonka dróg oddechowych w kopułach ECM

  1. Wysiewanie komórek nabłonka dróg oddechowych w kopułach ECM
    UWAGA: Utrzymuj ECM na lodzie przez cały czas i wykonuj wszystkie czynności związane z ECM na lodzie, ponieważ ECM zacznie krzepnąć w temperaturach >10°C.
    1. Zawiesić komórki nabłonka dróg oddechowych zdysocjowane w sekcji 4.2 z obliczoną objętością 90% ECM, jak podano w Tabeli 3.
    2. Trzymając pipetę pod kątem 90° (pionowo) jak najbliżej dna studzienki, dozować 50 μl (do pierwszego oporu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków) zawiesiny komórek ECM do środka studzienki. Unikaj dotykania ściany studni.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aż ECM zestala się. Podczas krzepnięcia ECM, podgrzej AOSM do temperatury RT (15-25 °C), aby zapobiec ponownemu skropleniu i rozpadowi kopułki ECM po dodaniu.
    4. Dodaj 500 μl podgrzanego AOSM do każdej studzienki, dozując w dół ścianę studzienki. Nie pipetować mediów bezpośrednio na kopułę ECM.
    5. Zmieniaj nośniki co 2 dni przez 4-7 dni. Aby zassać pożywkę, przechyl płytkę pod kątem 45° i odsysaj od dolnej krawędzi studzienki z dala od kopuły ECM.
    6. Po 4-7 dniach rozpocząć różnicowanie organoidów, dodając 500 μl AODM (15-25 °C) do każdego dołka i zmieniaj pożywkę co 2 dni przez 7 dni.
  2. Powtórzenie organoidów nabłonka dróg oddechowych w 7. dniu różnicowania
    UWAGA: Powtarzanie organoidów nabłonka dróg oddechowych jest konieczne, ponieważ krawędź kopuł ECM stopniowo rozpada się w ciągu 2-tygodniowego okresu hodowli. Organoidy nabłonka dróg oddechowych na krawędzi kopuły mogą zostać utracone (przemieścić się do podłoża) lub mieć orientację wierzchołkową skierowaną na zewnątrz, jeśli nie są w pełni osadzone w ECM. Etap ponownego powlekania również "oczyszcza" kopułę ECM poprzez usunięcie komórek/zanieczyszczeń, które nie tworzą skutecznie organoidów.
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki. Dodać 500 μl pożywki podstawowej z organoidów z zimnych dróg oddechowych (zwanych dalej pożywką podstawową) do każdej studzienki.
    2. Należy używać pipety P1000, ponieważ ta końcówka pipety ma największy otwór i zmniejsza prawdopodobieństwo pęknięcia organoidów podczas pipetowania. Ustaw pipetę na 350 μl, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, a następnie delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby zakłócić działanie kopuły ECM w każdym dołku. Zebrać wszystkie ECM/podłoża podstawowe do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    3. Przepłukać każdą studzienkę 500 μl zimnego podłoża podstawowego. Zebrać podłoże podstawowe zawierające pozostałe ECM i organoidy do tej samej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, co powyżej.
    4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Z trzech warstw widocznych po odwirowaniu - (1) supernatantu, (2) ECM zawierającego resztki komórkowe (puszyste) i (3) osadu zawierającego organoidy - należy odrzucić warstwę supernatantu i ECM i zachować osad organoidowy.
    5. Dodać 1 ml zimnej pożywki podstawowej do osadu organoidowego i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby oddzielić pozostały ECM. Dodaj 6 ml zimnego podłoża podstawowego do probówki i delikatnie wymieszaj.
    6. Odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    7. Jeśli nadmiar ECM jest nadal widoczny, powtórz kroki 6.3.5-6.3.6, aby wykonać kolejne mycie.
    8. Ponownie zawiesić osad organoidowy o odpowiedniej objętości 90% ECM (użyj AODM zamiast AOSM), aby umieścić na płytce ~30 organoidów na 50 μL kopuły.
    9. Sprawdź gęstość organoidów pod mikroskopem hodowli komórkowych (soczewka obiektywowa 4x) po posianiu pierwszej kopuły. Jeśli jest zbyt gęsty, dodaj dodatkowe 90% ECM, aby osiągnąć pożądaną gęstość ~30 organoidów.
    10. Wykonaj kroki 6.2.3-6.2.4, aby zestalić ECM i karmić komórki co drugi dzień 500 μl podgrzanego AODM do każdej studzienki przez kolejne 14 dni, aż osiągną dojrzałość (po 21 dniach różnicowania) z tworzeniem światła otoczonego skierowanym do wewnątrz pseudostratyfikowanym nabłonkiem zawierającym komórki podstawne, komórki rzęskowe i komórki kubkowe.
      UWAGA: Opisane tutaj organoidy nabłonka dróg oddechowych są nieuleczalnie zróżnicowane i nie mogą być pasażowane ani kriokonserwowane.

7. Obrazowanie częstotliwości uderzeń rzęsek

UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga mikroskopu do obrazowania na żywych komórkach z komorą środowiskową do ogrzewania i wilgotności, kamery naukowej o dużej częstotliwości odświeżania (>100 Hz), obiektywu o dużej odległości roboczej 20x i oprogramowania do obrazowania (patrz >Tabela materiałów dla zalecanego sprzętu używanego w tym protokole).

  1. Konfiguracja mikroskopu
    1. Upewnij się, że system ogrzewania mikroskopu jest włączony i wyrównany do 37 °C. Włącz mikroskop. Dostosuj gaz do 5% CO2 za pomocą mieszalnika gazów CO2 / powietrze.
    2. Uzupełnij butelkę modułu wilgotności, przez którą przechodzi CO2 oczyszczoną wodą. Ustaw wilgotność względną na 85% za pomocą sterownika stage top, aby woda była podgrzewana, a ogniwa były zaopatrywane w nawilżone powietrze. Równoważ komorę przez 30 minut.
    3. Umieść wkładkę płytki mikroskopu w uchwycie mikroskopu.
    4. Przenieść modele komórek nabłonka dróg oddechowych z inkubatora do mikroskopu na bloku grzewczym lub kulkach termicznych zrównoważonych do 37 °C w celu utrzymania próbki w temperaturze fizjologicznej.
    5. Umieścić płytkę hodowlaną zawierającą modele komórek nabłonka dróg oddechowych we wkładce płytki mikroskopu. Zamknij komorę środowiskową mikroskopu.
    6. Pozostawić próbkę do zrównoważenia we wstępnie ogrzanej komorze mikroskopu wypełnionej 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut
      UWAGA: Krótszy czas równoważenia może być wystarczający. Można to ustalić, przeprowadzając eksperyment w celu określenia czasu wymaganego do ustabilizowania CBF (patrz Rysunek 3).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Stabilizacja częstotliwości dudnienia rzęsek w mikroskopie obrazowania żywych komórek. Wykresy kropkowe średniej częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) w komórkach nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (modele ALI) po przeniesieniu do mikroskopu obrazowania żywych komórek z komorą środowiskową. Komora była zrównoważona i utrzymywana w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej 85% przez 30 minut przed otwarciem drzwi komory i umieszczeniem płytki hodowlanej we wkładzie płytki mikroskopu. Modele komórkowe obrazowano przez 60 minut we wskazanych odstępach czasu. Modele ALI uzyskano od dwóch uczestników z mukowiscydozą. Na każdy model ALI uzyskano sześć obrazów pola widzenia (FOV). Każda kropka (niebieska) reprezentuje średni CBF na obrazach FOV od 12 do 36. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM, przy czym średnia jest połączona linią przerywaną. Do wyznaczenia różnic statystycznych wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). P < 0,0001, ns: brak znaczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. W okresie równoważenia na komputerze otwórz oprogramowanie do akwizycji. Wybierz soczewkę obiektywową o dużej odległości roboczej 20x.
  2. W okularze mikroskopu ustaw ostrość na modelu komórkowym (~Z = 8000 μm).
  3. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony na oświetlenie Kohlera w taki sposób, aby żarówki żarówki źródła światła transmisyjnego nie skupiały się na płaszczyźnie próbki, unikając artefaktów w obrazowaniu. W tym celu wykonaj kroki 7.1.10-7.1.13
  4. Całkowicie zamknij przysłonę irysową pola nad kondensatorem. Powoli otwórz przysłonę przysłony irysowej i przesuwaj kondensator góra/dół, aż pojawi się kształt ośmiokąta.
  5. Jeśli przysłona przysłony pola przysłony nie jest wyrównana (tj. ośmiokąt nie znajduje się w środku pola widzenia (FOV)), wyrównaj ją do środka za pomocą kluczy imbusowych.
  6. Po wyrównaniu przysłony przysłony pola wyreguluj ostrość kondensora, aby ustawić ostrość ośmiokąta.
  7. Otwórz przysłonę przysłony pola do momentu, aż przestanie być widoczna w polu widzenia.
  8. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, kliknij L100, aby przełączyć ścieżkę światła na port, w którym zamontowana jest kamera. Kliknij zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby zobrazować pole widzenia mikroskopu za pomocą oprogramowania. Sprawdź, czy rzęski są ostre i dostosuj w razie potrzeby.
  9. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, skonfiguruj mikroskop z następującymi ustawieniami: Filtry: puste; Skraplacz: pusty; Format: bez binningu; Czas naświetlania: 0,003 s; Tryb odczytu: rolling shutter; ROI: 512 × 512 pikseli.
    UWAGA: Czas ekspozycji jest oparty na najwyższej częstotliwości, którą należy zmierzyć, ponieważ 1/czas ekspozycji musi być co najmniej dwukrotnie dłuższy od częstotliwości. Np. jeśli maksymalny fizjologiczny zakres bicia rzęsek = 30 Hz, to 1/czas ekspozycji = 60, a czas ekspozycji musi wynosić ≤ 0,016 s. ROI zależy od specyfikacji liczby klatek na sekundę aparatu. Wybierz zwrot z inwestycji, który rejestruje liczbę klatek na sekundę >100 Hz.
  1. Akwizycja obrazu
    1. Aby uzyskać zdjęcia poklatkowe z menu, kliknij Pobierz, a następnie kliknij Szybki upływ czasu. W wyskakującym okienku wybierz lokalizację zapisu i nazwę pliku. Zdobądź 1000 klatek.
    2. Kliknij Zastosuj. Kliknij zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby wyświetlić podgląd rzęsek w polu widzenia mikroskopu i w razie potrzeby dostosować ostrość Z. Kliknij przycisk Uruchom teraz, aby uchwycić szybki film poklatkowy.
    3. Po uchwyceniu szybkiego filmu poklatkowego kliknij zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby wyświetlić pole widzenia mikroskopu. Za pomocą joysticka mikroskopu przesuń wzdłuż osi X/Y do innego pola widzenia.
    4. Dostosuj ostrość Z, aby ustawić ostrość rzęsek. Kliknij Uruchom teraz, aby nagrać kolejny szybki film poklatkowy.
    5. Powtórz kroki 7.2.3-7.2.4. W przypadku modeli ALI i organoidów dróg oddechowych należy zobrazować 6x FOV w każdej z 3 powtórzonych próbek. W przypadku arkuszy nabłonka dróg oddechowych należy wykonać co najmniej 4 razy powtórzone obrazy na uczestnika.

8. Analiza danych i kwantyfikacja CBF

  1. Przygotowania do analizy danych
    UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga niestandardowych skryptów analitycznych (plik uzupełniający 3), surowych plików obrazów (uzyskanych w sekcji 7.2), oprogramowania komputerowego i oprogramowania do analizy.
    1. Zainstaluj oprogramowanie komputerowe, najlepiej w najnowszej wersji, na komputerze do analizy. Upewnij się, że zainstalowane są standardowe zestawy narzędzi oprogramowania komputerowego (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, audiovideo) oraz zestawy narzędzi do przetwarzania obrazów i sygnałów.
    2. Skopiuj foldery niestandardowych skryptów analizy "BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m" i "LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m" oraz "skrypty pomocnicze" na dysk lokalny komputera.
    3. W oprogramowaniu komputerowym kliknij kartę Strona główna. Następnie kliknij na Ustaw ścieżkę (Rysunek 4A-B).
    4. W wyskakującym okienku kliknij Dodaj z podfolderami (Rysunek 4C). W sekcji "Ścieżka wyszukiwania MATLAB" wybierz foldery pokazane w Rysunek 4D, a następnie kliknij Zapisz i zamknij (Rysunek 4E-F).
    5. Upewnij się, że skrypty analizy są połączone z oprogramowaniem komputerowym, sprawdzając, czy są wyświetlane w panelu po lewej stronie (Rysunek 4G).
    6. Przenieś surowe pliki obrazów (format OME) uzyskane w sekcji 7.2 na dysk lokalny komputera.
      UWAGA: Dostęp do przykładowych plików obrazów RAW można uzyskać pod adresem: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Konfiguracja oprogramowania komputerowego do analizy danych. (A) Otwórz kartę Strona główna. (B) Wybierz opcję Ustaw ścieżkę. (C) Wybierz opcję Dodaj z podfolderami. (D) Wybierz foldery zawierające skrypty analizy. (E) Wybierz opcję Zapisz. (f) Wybierz opcję Zamknij. (G) Skrypty analizy pojawią się w panelu po lewej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Kwantyfikacja CBF przez detekcję piku widma intensywności pojedynczych pikseli
    1. Otwórz oprogramowanie komputerowe. Kliknij plik skryptu analizy "BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m" (Rysunek 5A).
    2. Kliknij zakładkę Edytor, a następnie kliknij zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby uruchomić skrypt (Rysunek 5B-C). W oknie monitu wybierz surowe pliki obrazów do analizy (Rysunek 5D).
    3. Wprowadź czas naświetlania z kroku 7.1.15 w oknie monitu o czas akwizycji na klatkę, a następnie kliknij OK (Rysunek 5E).
    4. Poczekaj ~15 minut na plik, podczas gdy skrypt obliczy i wyprowadzi CBF w pliku "AveSpectrum" (plik uzupełniający 4), który jest automatycznie zapisywany w tym samym folderze, co pliki obrazów raw. Wizualizuj postęp za pomocą paska postępu (Rysunek 5F).

figure-protocol-4
Rysunek 5: Uruchamianie skryptów analitycznych za pomocą oprogramowania komputerowego. (A) Otwórz skrypt do analizy CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') lub tworzenia filmu o biciu rzęsek ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Otwórz zakładkę Edytor. (C) Wybierz zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby uruchomić skrypt analizy. (D) Okno monitu będzie wymagało wyboru plików do analizy lub tworzenia filmu. (E) Podczas uruchamiania skryptu "BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m" pojawi się monit o ręczne wprowadzenie czasu akwizycji na klatkę (s) w przypadku, gdy skrypt odczytujący plik nie odczytuje poprawnie metadanych. (F) Pasek postępu wskazujący obliczaną częstotliwość uderzeń rzęsek. (G) Podczas uruchamiania skryptu "LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m" pojawi się monit o ręczne wprowadzenie typu filmu, który ma być wyświetlany (mp4 lub avi), liczby klatek na sekundę filmu (fps), tego, czy nieruchomy komponent został usunięty z danych filmu ("y" lub "n"), czasu klatki (s) oraz rozmiaru piksela (mikrony) danych eksportowanych do filmu. Zaleca się użycie "y" do filtrowania nieruchomego, ponieważ usunie to śluz lub inne przeszkadzające warstwy nieruchome w danych. (H) Pasek postępu wskazujący eksportowany film. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Uruchom skrypt "GetFirstAmplitude.m" w folderze zawierającym pliki "AveSpectrum", korzystając z procesu opisanego w krokach 8.2.1-8.2.2. Poczekaj, aż skrypt wygeneruje plik "FirstAmplitudeStacked.xlsx", który zawiera częstotliwość o największej amplitudzie i mieści się w fizjologicznym zakresie bicia rzęsek nabłonka dróg oddechowych, ≥3 i <30 Hz.
  2. Skopiuj wartości częstotliwości z pliku "FirstAmplitudeStacked.xlsx" i wykreśl je za pomocą oprogramowania do analizy naukowej.
    UWAGA: Wyjaśnienie, w jaki sposób niestandardowy skrypt analizy określa ilościowo CBF, znajduje się w pliku uzupełniającym 5. Przykładowe analizowane zestawy danych są dostępne pod adresem: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
  1. Eksportowanie filmu z biciem rzęsek
    1. Otwórz oprogramowanie komputerowe. Kliknij plik skryptu "LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m" (Rysunek 5A), aby załadować skrypt.
    2. Kliknij zakładkę Edytor, a następnie kliknij zielony przycisk odtwarzania (Uruchom), aby uruchomić skrypt (Rysunek 5C). W oknie monitu wybierz surowe pliki obrazów, które mają zostać wyeksportowane do plików filmowych (Rysunek 5D).
    3. Wprowadź ustawienia wyszczególnione w Tabeli 4 do wyskakującego okienka "Utwórz film" (Rysunek 5G).
    4. Poczekaj ~ 8 minut na plik, podczas gdy skrypt utworzy pliki filmowe i wyprowadzi je do lokalizacji plików obrazów raw. Wizualizuj postęp za pomocą paska postępu (Rysunek 5H).
Wejścia filmoweopis
Typ plikuWprowadź typ pliku, który chcesz wyeksportować (mp4 lub avi).
KlatekWprowadź liczbę klatek na sekundę, z jaką film ma zostać wyeksportowany. Jeśli masz ~1000 klatek na uzyskany szereg czasowy, zaleca się ustawienie liczby klatek na sekundę ~30 kl./s.
Filtrowanie nieruchomeDostępne opcje to 'y' lub 'n'. Domyślnie jest to 'y', a skrypt filtrujący czas usuwa, używając przestrzeni Fouriera, wszystkie nieruchome komponenty z danych filmu. Zazwyczaj wszelkie warstwy komórek pod rzęskami lub nieruchomym śluzem wnoszą do sygnału składową przesunięcia o zerowej częstotliwości lub składową niezmienniczą w czasie, którą można odfiltrować.
Czas akwizycji na klatkęCzas akwizycji na klatkę pozyskanych danych. Służy do wyświetlania znacznika czasu w filmie w sekundach.
Rozmiar w pikselachRozmiar piksela w mikrometrach służy do wyświetlania skali w filmie w mikrometrach.

Tabela 4: Ustawienia wejściowe do tworzenia filmów

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność tego protokołu w ilościowym określaniu CBF, przedstawiono wyniki CBF zmierzone w modelach ALI komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od trzech uczestników z mukowiscydozą i trzech zdrowych uczestników kontrolnych. W 14 dniu różnicowania kultur obecne były rzęski bijące (Ryc. 6). Od 14 do 21 dnia różnicowania kultur zaobserwowano statystycznie istotny (P < 0,0345) wzrost CBF w obu kohortach. W 21 dniu różnicowania kultur średni CBF dla zdrowych uczestników kont...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje wiele czynników, które mogą zaciemniać ilościowe określenie CBF w arkuszach nabłonka nosa. Arkusze nabłonkowe należy zobrazować w ciągu 3-9 godzin od pobrania próbki, ponieważ funkcja rzęsek jest w tym czasie najbardziej stabilna37. Mniej czerwonych krwinek i zanieczyszczeń jest najbardziej optymalnych do obrazowania, ponieważ zakłócają one pozyskiwanie danych. Wybierając zwrot z inwestycji do obrazowania, ważne jest, aby wybrać arkusz nabłonka, którego krawędź nie została uszkodzona ani ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy uczestnikom badania i ich rodzinom za ich wkład. Doceniamy pomoc ze strony oddziału chorób układu oddechowego Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick w organizacji i zbieraniu próbek biologicznych pacjentów - specjalne podziękowania dla dr Johna Widgera, dr Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amandy Thompson i Rhondy Bell. Dziękujemy za pomoc Ivecie Slapetovej i Renee Whan z Zakładu Mikroskopii Świetlnej Kathariny Gaus w Centrum Analitycznym Marka Wainwrighta w UNSW Sydney. Praca ta jest wspierana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia i Sydney Children's Hospital Foundation. Autorzy pragną podziękować organizacji Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health za jej wkład i wsparcie. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health to wspólne przedsięwzięcie non-profit pomiędzy Siecią Szpitali Dziecięcych w Sydney, Dziecięcym Instytutem Badań Medycznych i Dziecięcym Instytutem Raka. Został ustanowiony przy wsparciu rządu Nowej Południowej Walii w celu koordynowania i integrowania badań pediatrycznych. Luminesce Alliance jest również stowarzyszony z Uniwersytetem w Sydney i Uniwersytetem Nowej Południowej Walii w Sydney. KMA jest wspierane przez stypendium Australijskiego Programu Szkoleń Badawczych. LKF jest wspierany przez Rotary Club of Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation oraz stypendia podyplomowe Uniwersytetu UNSW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdeninaSigma-AldrichA278610 mg/ml
Zaawansowany DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanylo-glutaminaSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford InstrumentsSzybka liczba klatek na sekundę (>100 Hz) kamera naukowa
System filtrów próżniowych typu butelkowegoSigma-Aldrich
Hydrat ceftazydymuSigma-AldrichA698750 mg/ml
Mikroskop do hodowli komórkowychOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Soczewka obiektywowa o dużej odległości roboczej. NA0.45 WD 8.2-6.9
ToksynaSigma-AldrichC8052-1MG200 µ g/ml
Sitko do żelu Corning 40 UMSigma-AldrichCLS431750Wielkość porów 40 μ m
Corning Matrigel Matrix (bez czerwieni fenolu)Corning356231Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
System filtrów próżniowych butelkowych CorningSigma-AldrichCLS431098
Pojemnik do zamrażania komórek Corning CoolCell LXSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrowąSigma-AldrichCLS3470Przepuszczalne wkłady podporowe. 6,5 mm Transwell z 0,4 μ Wkładka z membrany poliestrowej o porach m.
Szkiełka do komory do liczenia komórek CountessThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificAMQAX1000Automatyczny licznik komórek
Szczoteczki cytologiczneMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-Termo Fisher o wysokiej zawartości glukozyScientific11965-092
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikonMikroskop do obrazowania żywych komórek.
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, Stany ZjednoczoneThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amfoterycyna B)Thermo Fisher Scientific15290018250 &mikro; g/ml
Roztwór gentamycynySigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpadOprogramowanie do analizy naukowej
Greiner Fiolki Cryo.sSigma-AldrichV3135Fiolki kriogeniczne
Roztwór HEPESSigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
HydrokortyzonSigma-AldrichH08883,6 mg/ml
Inkubator NL Ti2 BLACK 2000Mikroskop PeConkomora środowiskowa. Umożliwia inkubację ciepłego powietrza i miejscowe gazowanie CO2 i O2
InsulinaSigma-AldrichI26432 mg/ml
Lab Armor 74220 706 Bezwodna kąpiel perełkowa 6LJohn Morris Group74220 706Wanna z koralikami
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Koraliki termiczne
MATLABMathWorksOprogramowanie komputerowe
Microsoft ExcelOprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych
mikroskopu NIH/3T3Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-1658Napromieniowane embrionalne komórki zasilające NIH-3T3 myszy
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Oprogramowanie do akwizycji obrazu
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP433310 000 jednostek penicyliny i 10  mg streptomycyny/ml
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zestaw organoidów do udrażniania dróg oddechowych PneumaCultStemCell Technologies5060Zestaw organoidów dróg oddechowych
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type I Roztwór kolagenu
ReagentPack Subculture OdczynnikiLonzaCC-5034
rhEGF (naskórkowy czynnik wzrostu, ludzki)Sigma-AldrichE964425 &mikro; g / ml
Y-27632 2HCl (inhibitor ROCK)SelleckchemS104910 mM
TobramycynaSigma-AldrichT4014100 mg / ml
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT81540,4%
UNO Stage Top InkubatorOkolabMicroscope. Umożliwia kondycjonowanie temperatury, wilgotności i CO2
CLS431098

Bibliografia

  1. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  3. Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763(2019).
  4. Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
  5. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  6. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
  7. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  8. Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
  9. Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455(2021).
  10. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  12. Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
  13. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675(2014).
  14. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3(2017).
  15. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  16. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  17. Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
  18. Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
  19. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  20. Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41(2018).
  21. Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340(2020).
  22. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  23. Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
  24. Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
  25. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
  26. Salathe, M. Regulation of mammalian ciliary beating. Annual Review of Physiology. 69, 401-422 (2007).
  27. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  28. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  29. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  30. Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  31. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  32. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  33. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  34. Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971(2017).
  35. Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
  36. Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
  37. Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
  38. Ratjen, F., et al. Cystic fibrosis. Nature Reviews Disease Primers. 1, 15010(2015).
  39. Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
  40. Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
  41. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki nab onka nosamodele kom rek dr g oddechowychinterfejs powietrze cieczr nicowanie organoid wmukowiscydozapierwotne zaburzenia rz sekobrazowanie wysokiej pr dko cikomora rodowiskowamodulatory CFTR

Powiązane artykuły