Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63090

⸱

10 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Women's and Children's Health, Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 2Molecular and Integrative Cystic Fibrosis Research Centre (miCF RC), Faculty of Medicine and Health, University of New South Wales, 3Department of Respiratory Medicine, Sydney Children's Hospital, 4Department of Pathology, School of Medical Sciences, University of New South Wales Australia, 5Katharina Gaus Light Microscopy Facility, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Streszczenie

Pomiary funkcji rzęsek (częstotliwość uderzeń, wzór) zostały ustanowione jako narzędzia diagnostyczne dla chorób układu oddechowego, takich jak pierwotne dyskinezy rzęsek. Jednak szersze zastosowanie tych technik jest ograniczone przez ekstremalną podatność funkcji rzęsek na zmiany czynników środowiskowych, np. temperatury, wilgotności i pH. W drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą (CF) nagromadzenie śluzu utrudnia bicie rzęsek. Funkcja rzęsek została zbadana w pierwotnych modelach komórek dróg oddechowych jako wskaźnik aktywności kanału CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Jednak stwierdzono znaczną zmienność między pacjentami w częstości uderzania rzęsek w odpowiedzi na leki modulujące CFTR, nawet u pacjentów z tymi samymi mutacjami CFTR. Co więcej, wpływ dysfunkcyjnego wydzielania chlorków regulowanych przez CFTR na funkcję rzęsek jest słabo poznany. Obecnie nie ma kompleksowego protokołu demonstrującego przygotowanie próbek modeli dróg oddechowych in vitro, akwizycję obrazu i analizę częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF). Standaryzowane warunki hodowli i akwizycja obrazu przeprowadzone w warunkach kontrolowanych środowiskowo umożliwiłyby spójne, powtarzalne oznaczanie ilościowe CBF u różnych osób i w odpowiedzi na leki modulujące CFTR. Protokół ten opisuje kwantyfikację CBF w trzech różnych systemach modeli komórek nabłonka dróg oddechowych: 1) natywnych arkuszach nabłonka, 2) modelach interfejsu powietrze-ciecz zobrazowanych na przepuszczalnych wkładkach nośnych oraz 3) trójwymiarowych organoidach osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwa ostatnie odtwarzają fizjologię płuc in vivo, z biciem rzęsek i produkcją śluzu. Funkcja rzęsek jest rejestrowana za pomocą szybkiej kamery wideo w komorze kontrolowanej przez środowisko. Do analizy CBF wykorzystywane są niestandardowe skrypty. Przewiduje się, że przełożenie pomiarów CBF na praktykę kliniczną stanie się ważnym narzędziem klinicznym do przewidywania odpowiedzi na leki modulujące CFTR w przeliczeniu na pacjenta.

Wprowadzenie

Pomiary częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) oraz wzorca ich ruchu zostały uznane za narzędzia diagnostyczne w chorobach dróg oddechowych, takich jak pierwotna dyskinezja rzęsek (PCD)1. W mukowiscydozie (CF) dysfunkcja kanału chlorkowego regulatora przewodnictwa błonowego w włóknach cystycznych (CFTR) powoduje odwodnienie cieczy wyścielającej powierzchnię dróg oddechowych i upośledzenie klirensu śluzowo-rzęskowego2. Funkcję rzęsek badano in vitro w modelach pierwotnych komórek dróg oddechowych jako wskaźnik aktywności kanału CFTR3. Jednakże, w odpowiedzi na leki modulujące CFTR, obserwuje się znaczne różnice w CBF między pacjentami, nawet u osób z tymi samymi mutacjami CFTR3. Ponadto wpływ dysfunkcyjnego wydzielania chlorków regulowanego przez CFTR na funkcję rzęsek jest słabo rozpoznany. Obecnie brakuje kompleksowego protokołu demonstrującego przygotowanie próbek w modelach dróg oddechowych in vitro, akwizycję obrazów oraz analizę CBF.

Arkusze nabłonka nosowego izolowane z wycinków szczotkowych błony śluzowej nosa są bezpośrednio wykorzystywane do pomiarów funkcji rzęsek w diagnostyce PCD4. Jednakże, mimo braku kontroli nad rozmiarem lub jakością otrzymywanych arkuszy nabłonka nosowego, CBF różni się w zależności od tego, czy jest mierzony na pojedynczych komórkach czy na arkuszach komórkowych, a także na krawędziach rzęskowych arkusza nabłonka, które są uszkodzone lub nieuszkodzone5. W związku z tym wtórne dyskinezje wywołane uszkodzeniem komórek podczas pobierania wycinków szczotkowych błony śluzowej nosa mogą wpływać na CBF. Pierwotna hodowla komórek nabłonka nosowego i ich różnicowanie na granicy powietrze-ciecz (ALI) lub w trójwymiarowej macierzy błony podstawnej w organoidy nabłonka rzęskowego dróg oddechowych prowadzi do powstania rzęsek wolnych od wtórnych dyskinezji4,6,7,8. Komórki nabłonka dróg oddechowych różnicowane w systemie ALI (zwane dalej modelami ALI) zostały uznane za istotne pomocnicze narzędzie diagnostyczne, które replikują wzorce i częstotliwość uderzeń rzęsek w wycinkach szczotkowych błony śluzowej nosa ex vivo6 i umożliwiają analizę ultrastruktury, wzorca oraz częstotliwości uderzeń rzęsek przy zachowaniu defektów specyficznych dla pacjenta9. Niemniej jednak istnieją rozbieżności w metodologiach stosowanych do tworzenia tych pseudowielowarstwowych, różnicujących się w kierunku śluzowo-rzęskowym modeli komórkowych. Różne protokoły ekspansji hodowli lub różnicowania mogą indukować odmienne fenotypy nabłonka (rzęskowe lub wydzielnicze)10 i prowadzić do znaczących różnic w CBF11. CBF była kwantyfikowana w wycinkach szczotkowych nabłonka nosowego4,6,12,13,14,15,16, organoidach nabłonka dróg oddechowych14,17,18 oraz modelach ALI3,4,6,13,19,20,21. Jednakże wśród tych protokołów występują duże zmienności, a często wiele parametrów nie jest kontrolowanych. Na przykład w niektórych badaniach CBF jest obrazowana in situ, podczas gdy komórki modelu ALI pozostają na przepuszczalnej wkładce wspierającej3,19,20,21, podczas gdy w innych komórki są zeskrobane z przepuszczalnej wkładki wspierającej i obrazowane w zawiesinie w pożywce4,6,13.

Ponadto szersze zastosowanie technik mierzących funkcję rzęsek jest ograniczone przez niezwykłą podatność tej funkcji na zmiany czynników środowiskowych. Czynniki środowiskowe, takie jak temperatura22, wilgotność23,24 oraz pH25,26, wpływają na funkcję rzęsek i muszą być regulowane, aby dokładnie określić CBF. Różne parametry fizjologiczne stosowane w różnych laboratoriach oraz sposób, w jaki wpływają one na CBF, zostały opisane w poprzednich przeglądach27.

W literaturze opisano różne technologie obrazowania i podejścia do pomiaru CBF. W diagnostyce PCD wykorzystuje się mikroskopię wideo do pomiaru funkcji rzęsek28,29. Niedawno algorytm analizy wideo oparty na różniczkowej mikroskopii dynamicznej został wykorzystany do ilościowej oceny zarówno CBF, jak i koordynacji rzęsek w modelach ALI komórek nabłonka dróg oddechowych3,30. Metoda ta umożliwia szybką i w pełni zautomatyzowaną charakterystykę ruchów rzęsek w komórkach nabłonka dróg oddechowych, bez konieczności segmentacji lub wyboru obszarów. Różnorodne metody obrazowania i kwantyfikacji CBF mogą przyczyniać się do rozbieżności w raportowanych w literaturze wartościach CBF (Supplementary File 1).

Protokół obejmujący etapy od hodowli po kwantyfikację, mający na celu usprawnienie istniejących metod, standaryzację warunków hodowli oraz akwizycję obrazów, przeprowadzony w ścisłych warunkach kontroli środowiskowej, umożliwiłby spójną i powtarzalną kwantyfikację CBF w obrębie i pomiędzy osobnikami.

Niniejszy protokół zawiera kompletny opis pobierania komórek nabłonkowych, warunków hodowli w celu ich ekspansji i różnicowania oraz kwantyfikacji CBF w trzech różnych modelach systemów komórek nabłonkowych dróg oddechowych pochodzenia nosowego: 1) natywnych płatów nabłonkowych, 2) modeli ALI obrazowanych na wkładkach z przepuszczalnym wsparciem oraz 3) trójwymiarowych organoidów zatopionych w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (Rysunek 1). Komórki nabłonka nosowego uzyskane z wymazów z dolnej małżowiny nosowej są wykorzystywane jako reprezentatywne dla nabłonka dróg oddechowych, ponieważ stanowią one skuteczną alternatywę dla komórek nabłonka oskrzelowego31, pozwalając jednocześnie uniknąć inwazyjnego zabiegu związanego z pobieraniem wymazów z oskrzeli. Do ekspansji pierwotnych komórek nabłonkowych dróg oddechowych w celu stworzenia modeli ALI oraz organoidów trójwymiarowych zastosowano metodę warunkowego przeprogramowania komórek (CRC). Warunkowe przeprogramowanie komórek nabłonka dróg oddechowych do stanu przypominającego komórki macierzyste jest indukowane poprzez kokulturę z systemem komórek zasilających (feeder) z fibroblastów z zatrzymanym wzrostem oraz inhibitorem kinazy związanej z Rho (ROCK)32. Co istotne, metoda CRC zwiększa liczbę podwajań populacji komórek nabłonkowych dróg oddechowych, zachowując jednocześnie ich tkankowo specyficzny potencjał różnicowania33,34. We wszystkich modelach komórek nabłonkowych dróg oddechowych funkcja rzęsek jest rejestrowana w komorze z kontrolowaną temperaturą przy użyciu wysokoprędkościowej kamery wideo ze zstandaryzowanymi ustawieniami akwizycji obrazu. Do kwantyfikacji CBF wykorzystano skrypty opracowane na potrzeby badania.

Proces przeprogramowania nabłonka dróg oddechowych poprzez szczotkowanie nosa; schemat obejmuje konfigurację obrazowania rzęsek oraz analizę.
Rycina 1: Schemat procedury. Po pobraniu wymazu szczoteczką z małżowiny nosowej dolnej uczestników, komórki nabłonka dróg oddechowych są wykorzystywane w jeden z dwóch sposobów. Albo izoluje się płaty nabłonka dróg oddechowych i natychmiast obrazuje częstotliwość uderzeń rzęsek, albo komórki nabłonka dróg oddechowych są namnażane za pomocą metody warunkowego przeprogramowania komórek (CRC). Komórki nabłonka dróg oddechowych namnożone metodą CRC są różnicowane w celu uzyskania komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (air-liquid interface) lub kultur organoidów nabłonka dróg oddechowych. Obrazowanie częstotliwości uderzeń rzęsek jest realizowane przy użyciu mikroskopu do obrazowania żywych komórek z komorą środowiskową z kontrolą temperatury i wilgotności oraz naukowej kamery o wysokiej częstotliwości klatek (>100Hz). Analiza danych jest przeprowadzana przy użyciu dedykowanych skryptów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zgoda na przeprowadzenie badania została udzielona przez Komisję Etyki Sydney Children's Hospital Network (HREC/16/SCHN/120). Przed pobraniem biospecymentów uzyskano pisemną zgodę od wszystkich uczestników (lub opiekunów uczestników).

1. Przygotowania do tworzenia modeli komórek nabłonkowych dróg oddechowych

  1. Przygotować pożywkę do zbierania komórek nosowych, łącząc 80% Dulbecco's Modified Eagle Medium i 20% Fetal Bovine Serum. Uzupełnić o 1 µL/mL Penicillin/Streptomycin. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 miesiące.
  2. Pokryć kolby lub wkłady z przepuszczalnego podłoża roztworem Collagen w zależności od potrzeb, zgodnie z krokami 1.2.1-1.2.4. Nie przechowywać naczyń pokrytych kolagenem przez długi czas.
    1. Przygotować rozcieńczenie 1:100 roztworu Type I Collagen (stok 3 mg/mL) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do końcowego stężenia 0,03 mg/mL. Dobrze wymieszać.
    2. Pokryć kolby do hodowli komórkowej (sekcja 4) ilością 160 µL/cm2 (tj. 4 mL na kolbę T25) oraz wkłady z przepuszczalnego podłoża (sekcja 5) ilością 455 µL/cm2 (tj. 150 µL na wkład 6,5 mm) przygotowanego roztworu Collagen.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-24 h.
    4. Usunąć roztwór Collagen za pomocą pipety lub aspiratora próżniowego przed wysiewaniem komórek. Nie myć naczynia przed wysiewaniem komórek.
  3. Przygotować pożywkę dla komórek w warunkach reprogramowania (CRC), łącząc składniki32 wymienione w Tabeli 1. Sterylizować przez filtr za pomocą systemu filtracji próżniowej nakładanej na butelkę. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące.
  4. W dniu użycia dodać ludzki czynnik wzrostu naskórka, inhibitor ROCK oraz antybiotyki zgodnie z Tabelą 1.
KomponentObjętość
DMEM, wysoka zawartość glukozy156,7 mL
DMEM/F-12, HEPES313,3 mL
Hydrokortyzon55.6 µL
Insulina1,25 mL
Toksyna cholery21 µL
Adenina1,2 ml
HI-FBS25 mL
Penicylina-streptomycyna5 ml
Ludzki czynnik wzrostu naskórka1 µL/mL
inhibitor ROCK1 µL/mL
Fungizone2 µl/ml
Tobramycyna2 µL/mL
Kefsul탄ydym hydrat4 µL/mL
Roztwór gentamycyny1 µL/mL

Tabela 1: Składniki do przygotowania 500 mL pożywki do kondycjonalnego przeprogramowania komórek

2. Pobieranie wymazów z dolnej małżowiny nosowej

UWAGA: Ta część protokołu wymaga probówki zbiorczej (50 mL) z podłożem do pobierania komórek nosa, szczoteczek cytologicznych, chusteczek oraz odpowiedniego środków ochrony osobistej. Należy unikać pobierania wymazów podczas infekcji górnych dróg oddechowych. Istnieje niewielkie ryzyko krwawienia, które wzrasta w przypadku występowania stanu zapalnego. Jeśli celem pobierania wymazów jest uzyskanie arkuszy nabłonka dróg oddechowych do pomiarów CBF ex vivo, procedura powinna zostać przeprowadzona minimum 6 tygodni po każdej infekcji górnych dróg oddechowych; idealnie powyżej 10 tygodni po infekcji35.

  1. Przygotować medium do pobierania komórek z nosa (sekcja 1) i przechowywać probówkę w lodzie.
  2. Opisać uczestnikowi procedurę jako niekomfortową. Wyjaśnić, że podczas szczotkowania w nozdrzu odczuwane jest pełne uczucie, podobne do skoku do oceanu/basenu i wdarcia się wody do dróg nosowych. Poinformować uczestników, że procedura wywoła odruchowe łzawienie.
  3. Ocenić, jaka pozycja jest odpowiednia dla uczestnika. Położyć uczestnika w pozycji na plecach, jeśli dostępna jest kozetka zabiegowa, ponieważ pozycja ta zapobiega odsuwaniu głowy uczestnika od szczoteczki podczas zabiegu. Alternatywnie, posadzić uczestnika przy ścianie, o którą może on oprzeć głowę.
  4. Obejrzeć drogi nosowe. Odnotować skrzywienie przegrody, polipy oraz wszelkie inne nieprawidłowości anatomiczne, które mogą utrudnić wprowadzenie szczoteczki do drogi nosowej i zwiększyć ryzyko krwawienia.
  5. Oczyścić nos z nadmiaru śluzu, prosząc uczestników o wydmuchanie nosa w chusteczkę.
  6. Poprosić uczestnika o oddychanie przez usta. Wziąć szczoteczkę cytologiczną do ręki dominującej. Opierając piąty palec o brodę uczestnika w celu stabilizacji dłoni, wprowadzić szczoteczkę cytologiczną do drogi nosowej uczestnika (Rycina 2). Wprowadzić szczoteczkę pod kątem ~45° do twarzy uczestnika, aby przeszła przez nozdrze.
  7. Obrócić szczoteczkę pionowo, tak aby była prostopadła do twarzy uczestnika. Przesuwać szczoteczkę delikatnie, ale zdecydowanie wzdłuż bocznej ściany nosa pod małżowiną dolną, aż znajdzie się ona w środkowej lub tylnej części małżowiny dolnej.
    UWAGA: Unikać zbyt głębokiego wprowadzenia; jeśli poczujmy nagły spadek oporu, oznacza to wejście do nosogardzieli i należy wycofać szczoteczkę, aż osoba wykonująca zabieg ponownie poczuje opór.
  8. Obrócić szczoteczkę o 360° do trzech razy. Wyjąć szczoteczkę delikatnie, wykonując manewr odwrotny do wprowadzania, aby komórki nie odpadły ze szczoteczki.
  9. Umieścić szczoteczkę w przygotowanej probówce z medium do pobierania komórek z nosa. Umieścić probówkę w lodzie.
  10. Powtórzyć szczotkowanie w drugim nozdrzu, jeśli uczestnik wyrazi zgodę lub wymagana jest duża liczba komórek (np. w celu zainicjowania hodowli komórkowej).
    UWAGA: Można ponownie przeprowadzić szczotkowanie w tym samym nozdrzu, jeśli na szczoteczce nie było widocznych komórek krwi, należy jednak pamiętać, że ryzyko krwawienia jest nieco zwiększone przy drugim szczotkowaniu w tym samym nozdrzu.

Technika pobierania wymazu z nosa, schemat pokazujący drogę wymazu podczas pobierania próbek do testów na COVID-19.
Rysunek 2: Pobieranie komórek nabłonka nosowego. Ilustracja położenia szczotki cytologicznej w środkowej i tylnej części małżowiny nosowej dolnej. Pozycję tę osiąga się poprzez wprowadzenie szczotki przez nozdrza, obrócenie jej pod kątem 90° do twarzy i prowadzenie szczotki wzdłuż przejścia nosowego poniżej małżowiny nosowej dolnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie arkuszy nabłonka dróg oddechowych

UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga probówki zbiorczej (pędzelka/pędzelki cytologiczne + 1 mL medium do pobierania komórek z nosa) (sekcja 2) oraz płytki 96-dołkowej z płaskim dnem. W przypadku pobierania wymazów z małżowin nosowych w celu obrazowania płatów nabłonka dróg oddechowych, należy użyć wyłącznie 1 mL medium do pobierania komórek z nosa bez antybiotyków; w przeciwnym razie płaty nabłonka będą zbyt rozproszone do obrazowania.

  1. Delikatnie zamieszać probówkę zawierającą pędzelki do cytologii, aby uwolnić płaty nabłonka dróg oddechowych z pędzelka/pędzelków.
  2. zebrać całe medium wraz z komórkami za pomocą pipety P1000. Nanieść 5-6 kropli do dołka płaskodنnej płytki 96-dołkowej. Powtórzyć czynność dla około siedmiu dołków.
  3. Przenieść płytkę pod mikroskop zgodnie z krokiem 7.1.4 i postępować zgodnie z pozostałą częścią sekcji 7 w celu obrazowania częstotliwości uderzeń rzęsek.
  4. Obrazować płaty nabłonka (Rycina 1), a nie pojedyncze, nieprzytwierdzone komórki, ponieważ wykazano, że funkcja rzęsek różni się w zależności od tego, czy dotyczą one płatów nabłonka, czy pojedynczych, nieprzytwierdzonych komórek5.

4. Namnażanie i utrzymywanie komórek nabłonka dróg oddechowych

  1. Kultura ekspansji komórek nabłonkowych dróg oddechowych z warunkowym przeprogramowaniem
    UWAGA: Naczynie pokryte roztworem kolagenu (sekcja 1), napromieniowane embrionalne komórki zasilające myszy (NIH-3T3), pożywka do warunkowego przeprogramowania komórek (CRC) (sekcja 1), szczoteczka(i) cytologiczna(e) w pożywce do pobierania komórek nosa (sekcja 2).
    1. Wysiać napromieniowane komórki zasilające do przygotowanych naczyń hodowlanych pokrytych roztworem kolagenu z gęstością zasiewu 8,000 komórek/cm2 co najmniej 2 h i nie więcej niż 72 h przed kokulturą z komórkami nabłonkowymi dróg oddechowych (patrz 36 w zakresie hodowli i napromieniowania komórek zasilających).
    2. Przenieść pobrane szczoteczką komórki w probówce zbiorczej (szczoteczka(i) cytologiczna(e) + pożywka do pobierania komórek nosa) na wirownik wortex na lód. Przy niskiej prędkości wirować w vortexie w cyklach 10 s włączenia i 10 s przerwy (utrzymując na lodzie pomiędzy cyklami), aby odczepić komórki od szczoteczek. Intensywne wirowanie może zmniejszyć żywotność komórek. Sprawdzić, czy na szczoteczkach nadal znajduje się śluz. Jeśli tak, powtórzyć wirowanie.
    3. Przenieść schłodzone probówki z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pipety serologicznej przenieść pożywkę z probówki zbiorczej do nowej probówki (Probówka B), pozostawiając szczoteczki cytologiczne. Odwirować Probówkę B przy 300 × g przez 7 min w temperaturze 4 °C.
    4. Wyjąć Probówkę B z wirówki i odlać nadsącz. Jeśli śluz jest widoczny, przemyć osad kolejnymi 5 mL pożywki do pobierania komórek nosa i ponownie odwirować.
    5. Dodać 1 mL pożywki CRC, aby resuspendować osad komórkowy w Probówce B. Za pomocą pipety serologicznej 5 mL przepuścić komórki przez sito komórkowe umieszczone na probówce 50 mL (Probówka C), wykonując ruchy okrężne.
    6. Powtórzyć czynność wielokrotnie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Zebrać pozostałą pożywkę z dna sita i połączyć ją z resztą pożywki. Usunąć sito komórkowe.
    7. Za pomocą pipety serologicznej 5 mL pobrać 1 mL pożywki z Probówki C i przenieść do probówki do mikrocentryfugi.
    8. Pobrać 10 µL tej zawiesiny komórkowej i dodać do probówki do mikrocentryfugi z uprzednio naniesionymi 10 µL błękitu trypanu. Dobrze wymieszać i natychmiast użyć automatycznego licznika komórek, aby określić liczbę komórek i ich żywotność.
    9. Wysiać komórki nabłonka dróg oddechowych do kolby T25 z wcześniej wysianymi napromieniowanymi komórkami zasilającymi.
  2. Utrzymanie i dysocjacja komórek nabłonka dróg oddechowych
    UWAGA: Pożywkę CRC należy ogrzać do 37 °C w kontrolowanej temperaturowo laboratoryjnej łaźni wodnej lub urządzeniu do łaźni z kuleczkami przed dodaniem do komórek.
    1. Regularnie kontrolować komórki pod mikroskopem do hodowli komórkowych (obiektyw 4×) pod kątem adhezji, kontaminacji, morfologii i konfluencji.
    2. Wymieniać pożywkę CRC co drugi dzień. Po zaobserwowaniu przeprogramowanych komórek (Rysunek 1) i w przypadku braku kontaminacji, zmniejszyć dawkę antybiotyków lub całkowicie je odstawić.
    3. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, zastosować podwójną metodę trypsynizacji32, aby zdysocjować komórki i przeprowadzić liczenie komórek zgodnie z opisem w punkcie 4.1.8 (patrz Plik uzupełniający 2 w zakresie dysocjacji i zamrażania komórek).

5. Wysiew i różnicowanie komórek nabłonkowych dróg oddechowych oraz utrzymanie zróżnicowanych modeli ALI

  1. Wysiewanie komórek nabłonkowych dróg oddechowych na wkłady z przepuszczalnego podłoża
    1. Przenieś powlekane roztworem kolagenu wkłady z przepuszczalnego podłoża (sekcja 1) z inkubatora CO2 do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odssij roztwór kolagenu i go usuń. Dodaj 750 µL pożywki do ekspansji (bez antybiotyków) do komory dolnej wkładów z przepuszczalnego podłoża.
    2. Przenieś dysocjowane lub rozmrożone komórki w lodzie do komory z laminarnym przepływem powietrza. Dodaj objętość pożywki do ekspansji niezbędną do wysiewania 200 000-250 000 komórek w 150 µL do komory górnej każdego wkładu z przepuszczalnego podłoża.
    3. Uważając, aby nie utworzyć pęcherzyków powietrza, wymieszaj zawiesinę, aby upewnić się, że komórki są homogeniczne i pozostają w zawiesinie. Dodaj 150 µL zawiesiny komórkowej na stronę górną każdego wkładu z przepuszczalnego podłoża.
    4. Resuspenduj komórki po każdym wysianiu trzech wkładów z przepuszczalnego podłoża, aby utrzymać homogeniczną zawiesinę komórkową.
    5. Co drugi dzień, aż do utworzenia się zbieżnej monowarstwy komórek (zazwyczaj do 4. dnia po wysianiu), usuń pożywkę i dodaj świeżą pożywkę do ekspansji ogrzaną do temperatury pokojowej (RT, 15-25 °C).
  2. Różnicowanie komórek nabłonkowych dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (ALI)
    1. Ogrzej pożywkę ALI (bez antybiotyków) do temperatury pokojowej (RT, 15-25 °C).
    2. Usuń pożywkę do ekspansji i zastąp ją pożywką do różnicowania (ALI) w obu komorach, górnej i dolnej.
    3. Po 2 dniach hodowli w zanurzonej pożywce ALI, odssij i usuń pożywkę.
    4. Dodaj 750 µL pożywki ALI wyłącznie do komory dolnej, aby stworzyć granicę faz powietrze-ciecz.
      UWAGA: Jeśli po 1 tygodniu hodowli monowarstwa nie jest zbieżna i nadal widoczne są przerwy, komórki mogą nie mieć już zdolności do ekspansji w obszary pustych przestrzeni; w takim przypadku należy rozważyć utylizację komórek nabłonkowych dróg oddechowych.
  3. Utrzymanie zróżnicowanego modelu ALI i usuwanie śluzu
    1. Wymieniaj pożywki w komorze górnej i dolnej co drugi dzień aż do pełnego zróżnicowania (21-25 dzień po ustanowieniu granicy faz powietrze-ciecz).
    2. Raz w tygodniu wypłukuj śluz ze strony górnej zgodnie z krokami 5.3.3-5.3.4.
    3. Ogrzej PBS do temperatury pokojowej (RT, 15-25 °C).
    4. Dodaj 200 µL PBS do komory górnej. Inkubuj w inkubatorze CO2 przez 10 min. Użyj aspiratora lub pipety do usunięcia PBS.

6. Trójwymiarowe organoidy nabłonka dróg oddechowych

  1. Przygotowanie do hodowli organoidów nabłonka dróg oddechowych
    1. Umieść płytkę(i) 24-dołkową w inkubatorze CO22 inkubator do ogrzewania do 37 °C przez noc.
    2. Rozmrozić fiolkę o pojemności 10 ml zawierającą ECM (Tabela materiałów) na lodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 500 µL alikwoty (do jednorazowego użycia), aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: Należy stosować ECM o określonym stężeniu białka >Zaleca się stężenie 10,5 mg/ml dla uzyskania najlepszych efektów hodowli. Niższe stężenie przyspieszy dezintegrację kopułki ECM i zwiększy częstotliwość występowania organoidów z powierzchnią apikalną skierowaną na zewnątrz.
    3. Użyj zestawu do hodowli organoidów dróg oddechowych (Airway Organoid Kit (Tabela materiałów) aby przygotować pożywkę do siewania organoidów dróg oddechowych (AOSM) oraz pożywkę różnicującą (AODM) zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Przygotować pożywkę podstawową do organoidów dróg oddechowych zgodnie z Tabela 2.
SkładnikObjętość
Advanced DMEM/F-12500 mL
HEPES5 mL
L-alanylo-L-glutamina5 mL
Penicylina-streptomycyna5 mL

Tabela 2: Składniki podstawowej pożywki do organoidów dróg oddechowych

  1. Wykorzystaj liczbę żywych komórek nabłonka dróg oddechowych rozdzielonych w sekcji 4.2, aby obliczyć, ile studni można zasiać przy gęstości zasiewu 10 000 komórek (patrz Tabela 3).
  2. Oblicz całkowitą objętość ECM i AOSM potrzebną do przygotowania 1 x 50 µL kopułki 90% ECM (45 µL ECM i 5 µL AOSM) na studnię.
    UWAGA: Zalecana gęstość zasiewu 10 000 komórek na studnię dotyczy komórek nabłonka nosa rozszerzonych w CRC w pasażu 1. Komórki z późniejszych pasaży mogą wymagać wyższej gęstości zasiewu w celu uzyskania tej samej liczby organoidów.
Liczba dołkówLiczba komórekLiczba kopułObjętość Matrigel ECMObjętość AOSM
110 000 komórek145 µL x 1.15 µL x 1.1
220 000 komórek290 µL x 1,110 µL x 1.1
550 000 komórek5225 µL x 1.125 µL x 1,1
………………komórki………………µL x 1,1………µL x 1.1

Tabela 3: Obliczenia dotyczące wysiewu komórek nabłonka dróg oddechowych w kopułach ECM

  1. Wysiewanie komórek nabłonka dróg oddechowych w kopułkach ECM
    UWAGA: Przez cały czas należy przechowywać ECM w lodzie i wykonywać wszystkie kroki z użyciem ECM w lodzie, ponieważ ECM zacznie krzepnąć w temperaturach >10°C.
    1. Resuspender komórki nabłonka dróg oddechowych rozdzielone w sekcji 4.2 w obliczonej objętości 90% ECM zgodnie z Tabelą 3.
    2. Trzymając pipetę pod kątem 90° (pionowo) jak najbliżej dna dołka, nanieść 50 µL (do pierwszego stopnia, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza) zawiesiny komórek w ECM na środek dołka. Należy unikać dotykania ścianki dołka.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 min, aż ECM zakrzepnie. Podczas krzepnięcia ECM ogrzać AOSM do temperatury pokojowej (15-25 °C), aby zapobiec ponownemu upłynnieniu i rozpadowi kopułki ECM po dodaniu medium.
    4. Dodać 500 µL ogrzanego AOSM do każdego dołka, nanieosząc medium po ściance dołka. Nie pipetować medium bezpośrednio na kopułkę ECM.
    5. Wymieniać medium co 2 dni przez okres od 4 do 7 dni. Aby odessać medium, przechylić płytkę pod kątem 45° i odessać je z dolnej krawędzi dołka, z dala od kopułki ECM.
    6. Po 4-7 dniach rozpocząć różnicowanie organoidów poprzez dodanie 500 µL AODM (15-25 °C) do każdego dołka i wymieniać medium co 2 dni przez 7 dni.
  2. Ponowne wysiewanie organoidów nabłonka dróg oddechowych w 7. dniu różnicowania
    UWAGA: Ponowne wysiewanie organoidów nabłonka dróg oddechowych jest konieczne, ponieważ brzegi kopułek ECM stopniowo ulegają rozpadowi w ciągu 2-tygodniowego okresu hodowli. Organoidy nabłonka dróg oddechowych znajdujące się na brzegu kopułki mogą zostać utracone (odczepić się do medium) lub przyjąć orientację z powierzchnią apikalną skierowaną na zewnątrz, jeśli nie są w pełni zatopione w ECM. Krok ponownego wysiewania służy również do „oczyszczenia” kopułki ECM poprzez usunięcie komórek/debris, które nie utworzyły pomyślnie organoidów.
    1. Odessać medium z każdego dołka. Dodać 500 µL zimnego podstawowego medium do organoidów dróg oddechowych (dalej nazywanego medium podstawowym) do każdego dołka.
    2. Użyć pipety P1000, ponieważ posiada ona końcówkę z największym otworem, co zmniejszy prawdopodobieństwo rozpadnięcia się organoidów podczas pipetowania. Ustawić pipetę na 350 µL, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, a następnie delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozbić kopułkę ECM w każdym dołku. Zebrać całe ECM wraz z medium podstawowym do probówki wirówkowej 15 mL.
    3. Przepłukać każdy dołek 500 µL zimnego medium podstawowego. Zebrać medium podstawowe zawierające pozostałości ECM i organoidy do tej samej probówki wirówkowej 15 mL co powyżej.
    4. Wirować przy 300 x g przez 5 min w 4 °C. Z trzech warstw widocznych po wirowaniu – (1) nadosadu, (2) ECM zawierającego debris komórkowy (kłaczkowaty) oraz (3) osadu zawierającego organoidy – usunąć nadosad oraz warstwę ECM i zachować osad z organoidami.
    5. Dodać 1 mL zimnego medium podstawowego do osadu organoidów i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby oddzielić pozostałości ECM. Dodać 6 mL zimnego medium podstawowego do probówki i delikatnie wymieszać.
    6. Wirować przy 300 × g przez 5 min w 4 °C. Usunąć nadosad.
    7. Jeśli nadmiar ECM jest nadal widoczny, powtórzyć kroki 6.3.5- 6.3.6 w celu wykonania kolejnego przemycia.
    8. Resuspender osad organoidów w odpowiedniej objętości 90% ECM (użyć AODM zamiast AOSM), aby wysiać ~30 organoidów na 50 µL kopułki.
    9. Sprawdzić gęstość organoidów pod mikroskopem hodowli komórkowych (obiektyw 4x) po wysianiu pierwszej kopułki. Jeśli gęstość jest zbyt wysoka, dodać dodatkowe 90% ECM, aby osiągnąć pożądaną gęstość ~30 organoidów.
    10. Postępować zgodnie z krokami 6.2.3- 6.2.4 w celu zakrzepnięcia ECM i dokarmiać komórki co drugi dzień, dodając 500 µL ogrzanego AODM do każdego dołka przez kolejne 14 dni, aż osiągną dojrzałość (po 21 dniach różnicowania) z formowaniem światła otoczonego skierowanym do wewnątrz nabłonkiem rzekomo wielowarstwowym zawierającym komórki podstawne, komórki rzęsiste i komórki kubkowe.
      UWAGA: Opisane tutaj organoidy nabłonka dróg oddechowych są terminalnie zróżnicowane i nie mogą być pasażowane ani krio konserwowane.

7. Obrazowanie częstotliwości uderzeń rzęsek

UWAGA: Ta część protokołu wymaga mikroskopu do obrazowania żywych komórek z komorą środowiskową z kontrolą temperatury i wilgotności, szybkiej kamery naukowej (częstotliwość odświeżania >100 Hz), obiektywu 20x z dużą odległością roboczą oraz oprogramowania do obrazowania (zalecany sprzęt użyty w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów).

  1. Przygotowanie mikroskopu
    1. Upewnij się, że system ogrzewania mikroskopu jest włączony i ustabilizowany w temperaturze 37 °C. Włącz mikroskop. Ustaw stężenie gazu na 5% CO2 za pomocą mieszalnika gazów CO2/powietrze.
    2. Uzupełnij wodą oczyszczoną butelkę modułu wilgotności, przez którą przepływa CO2 . Ustaw wilgotność względną na 85% za pomocą kontrolera górnej części stolika, aby woda została podgrzana, a komórki otrzymywały nawilżone powietrze. Stabilizuj komorę przez 30 min.
    3. Umieść wkład do płytek mikroskopowych w uchwycie mikroskopu.
    4. Przenieś modele komórek nabłonkowych dróg oddechowych z inkubatora do mikroskopu, używając bloku grzejnego lub koralików termicznych ustabilizowanych w temperaturze 37 °C, aby utrzymać próbkę w temperaturze fizjologicznej.
    5. Umieść płytkę hodowlaną zawierającą modele komórek nabłonkowych dróg oddechowych we wkładzie do płytek mikroskopowych. Zamknij komorę środowiskową mikroskopu.
    6. Pozostaw próbkę do stabilizacji w wstępnie ogrzanej do 37 °C komorze mikroskopu wypełnionej 5% CO2 przez 30 min.
      UWAGA: Może wystarczyć krótszy czas stabilizacji. Można to ustalić, przeprowadzając eksperyment w celu zidentyfikowania czasu wymaganego do stabilizacji CBF (patrz Rycina 3).

Wykres częstotliwości w funkcji czasu ilustrujący istotność statystyczną, punkty danych i słupki błędów.
Rycina 3: Stabilizacja częstotliwości uderzeń rzęsek w mikroskopie do obrazowania żywych komórek. Wykresy punktowe średniej częstotliwości uderzeń rzęsek (CBF) w komórkach nabłonka dróg oddechowych na granicy powietrze-ciecz (modele ALI) po przeniesieniu do mikroskopu do obrazowania żywych komórek z komorą środowiskową. Komorę równoważono i utrzymywano w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i wilgotności względnej 85% przez 30 min przed otwarciem drzwi komory i umieszczeniem płytki hodowlanej w insertcie mikroskopowym. Modele komórkowe obrazowano przez 60 min w określonych odstępach czasu. Modele ALI pochodziły od dwóch uczestników z CF. Dla każdego modelu ALI wykonano sześć obrazów pola widzenia (FOV). Każda kropka (niebieska) reprezentuje średnią CBF w 12-36 obrazach FOV. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM, ze średnimi połączonymi linią przerywaną. Do wyznaczenia różnic statystycznych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA). **** P < 0.0001, ns: brak istotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Podczas okresu stabilizacji otwórz oprogramowanie do akwizycji na komputerze. Wybierz obiektyw 20x o dużej odległości roboczej.
  2. Używając okularu mikroskopu, ustaw ostrość na modelu komórkowym (~Z = 8000 µm).
  3. Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony zgodnie z zasadą oświetlenia Koehlera, tak aby włókna żarówki źródła światła przechodzącego nie były ogniskowane w płaszczyźnie próbki, co zapobiegnie powstawaniu artefaktów w obrazowaniu. W tym celu wykonaj kroki 7.1.10-7.1.13
  4. Całkowicie zamknij przysłonę polową nad kondensorem. Powoli otwieraj przysłonę polową i przesuwaj kondensator w górę/w dół, aż pojawi się kształt ośmiokąta.
  5. Jeśli przysłona polowa nie jest wycentrowana (tj. ośmiokąt nie znajduje się w centrum pola widzenia (FOV)), wycentruj ją za pomocą kluczy imbusowych.
  6. Po wycentrowaniu przysłony polowej dostosuj ostrość kondensora, aby ośmiokąt stał się wyraźny.
  7. Otwieraj przysłonę polową do momentu, aż przestanie być widoczna w polu FOV.
  8. W oprogramowaniu do akwizycji kliknij L100 , aby przełączyć drogę światła na port, w którym zamontowana jest kamera. Kliknij zielony przycisk odtwarzania (Run), aby zwizualizować pole FOV mikroskopu za pomocą oprogramowania. Sprawdź, czy rzęski są w ostrości i w razie potrzeby dokonaj korekty.
  9. W oprogramowaniu do akwizycji skonfiguruj mikroskop z następującymi ustawieniami: Filtry: puste; Kondensor: pusty; Format: brak binningu; Czas ekspozycji: 0.003 s; Tryb odczytu: rolling shutter; ROI: 512 × 512 pikseli.
    UWAGA: Czas ekspozycji opiera się na najwyższej częstotliwości, którą należy zmierzyć, ponieważ wartość 1/czas ekspozycji musi być co najmniej dwukrotnie większa od tej częstotliwości. Np. jeśli maksymalny fizjologiczny zakres uderzeń rzęsek = 30 Hz, to 1/czas ekspozycji = 60, a czas ekspozycji musi być ≤ 0.016 s. ROI zależy od specyfikacji częstotliwości klatek kamery. Wybierz ROI, który umożliwia uzyskanie częstotliwości klatek >100 Hz.
  1. Akwizycja obrazów
    1. Aby pozyskać obrazy time-lapse z menu, kliknij Acquire, a następnie kliknij Fast Time Lapse. W oknie wyskakującym wybierz lokalizację zapisu i nazwę pliku. Pozyskaj 1000 klatek.
    2. Kliknij Apply. Kliknij zielony przycisk odtwarzania (Run), aby podejrzeć rzęski w polu widzenia (FOV) mikroskopu i w razie potrzeby dostosować ostrość w osi Z. Kliknij Run Now, aby zarejestrować szybki film time-lapse.
    3. Po zarejestrowaniu szybkiego filmu time-lapse kliknij zielony przycisk odtwarzania (Run), aby zwizualizować pole widzenia mikroskopu. Używając joysticka mikroskopu, przesuń się wzdłuż osi X/Y do innego pola widzenia.
    4. Dostosuj ostrość w osi Z, aby rzęski stały się wyraźne. Kliknij Run Now, aby zarejestrować kolejny szybki film time-lapse.
    5. Powtórz kroki 7.2.3-7.2.4. W przypadku modeli ALI i organoidów dróg oddechowych wykonaj obrazowanie 6x FOV w każдной z 3x próbek powtórzonych. W przypadku arkuszy nabłonka dróg oddechowych wykonaj minimum 4x obrazów powtórzonych na uczestnika.

8. Analiza danych i kwantyfikacja CBF

  1. Przygotowania do analizy danych
    UWAGA: Ta sekcja protokołu wymaga specjalistycznych skryptów analitycznych (Supplementary File 3), surowych plików obrazów (pozyskanych w sekcji 7.2), oprogramowania obliczeniowego oraz oprogramowania do analizy.
    1. Zainstaluj oprogramowanie obliczeniowe, najlepiej w najnowszej wersji, na komputerze analitycznym. Upewnij się, że zainstalowane są standardowe biblioteki oprogramowania obliczeniowego (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, audiovideo) oraz biblioteki Image and Signal Processing.
    2. Skopiuj specjalistyczne skrypty analityczne „BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m” i „LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m” oraz folder „support scripts” na dysk lokalny komputera.
    3. W oprogramowaniu obliczeniowym kliknij kartę Home. Następnie kliknij Set Path (Rysunek 4A-B).
    4. W wyskakującym oknie kliknij Add With Subfolders (Rysunek 4C). W sekcji „MATLAB search path” wybierz foldery pokazane na Rysunku 4D, a następnie kliknij Save i Close (Rysunek 4E-F).
    5. Potwierdź, że skrypty analityczne są powiązane z oprogramowaniem obliczeniowym, sprawdzając, czy pojawiają się one w lewym panelu (Rysunek 4G).
    6. Przenieś surowe pliki obrazów (w formacie open microscopy environment (OME)) pozyskane w sekcji 7.2 na dysk lokalny komputera.
      UWAGA: Przykładowe surowe pliki obrazów są dostępne pod adresem: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.

Konfiguracja interfejsu MATLAB dla zarządzania ścieżkami, przedstawiająca wybór katalogów i opcje zapisu.
Rycina 4: Konfiguracja oprogramowania komputerowego do analizy danych. (A) Otwórz kartę Home. (B) Wybierz Set Path. (C) Wybierz Add with Subfolders. (D) Wybierz foldery zawierające skrypty analizy. (E) Wybierz Save. (F) Wybierz Close. (G) Skrypty analizy pojawią się w lewym panelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Ilościowe oznaczenie CBF poprzez detekcję szczytów widma intensywności pojedynczych pikseli
    1. Otwórz oprogramowanie obliczeniowe. Kliknij plik skryptu analizy „BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m” (Rysunek 5A).
    2. Przejdź do karty Editor, a następnie kliknij zielony przycisk odtwarzania (Run), aby uruchomić skrypt (Rysunek 5B-C). W oknie monitu wybierz surowe pliki obrazów do analizy (Rysunek 5D).
    3. Wpisz czas ekspozycji z kroku 7.1.15 w oknie monitu dla czasu akwizycji na klatkę, a następnie kliknij OK (Rysunek 5E).
    4. Odczekaj ok. 15 min na plik, podczas gdy skrypt oblicza i generuje wartość CBF w pliku „AveSpectrum” (Plik uzupełniający 4), który jest automatycznie zapisywany w tym samym folderze co surowe pliki obrazów. Monitoruj postęp za pomocą paska postępu (Rysunek 5F).

Wykonanie skryptu MATLAB; interfejs edytora kodu dla etapów przetwarzania danych i eksportu filmu.
Rysunek 5: Uruchamianie skryptów analizy za pomocą oprogramowania obliczeniowego. (A) Otwórz skrypt do analizy CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') lub tworzenia filmu z ruchów rzęsek ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Otwórz kartę Editor. (C) Wybierz zielony przycisk odtwarzania (Run), aby uruchomić skrypt analizy. (D) Pojawi się okno z prośbą o wybór plików do analizy lub tworzenia filmu. (E) Podczas uruchamiania skryptu 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' pojawi się prośba o ręczne wprowadzenie czasu akwizycji na klatkę (s) w przypadku, gdy skrypt odczytujący pliki nie odczyta poprawnie metadanych. (F) Pasek postępu wskazujący obliczanie częstotliwości uderzeń rzęsek. (G) Podczas uruchamiania skryptu 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' pojawi się prośba o ręczne wprowadzenie typu filmu do eksportu (mp4 lub avi), częstotliwości klatek filmu (fps), informacji, czy komponent nieruchomy ma zostać usunięty z danych filmu ('y' lub 'n'), czasu klatki (s) oraz rozmiaru piksela (mikrony) danych eksportowanych do filmu. Zaleca się wybranie 'y' dla filtrowania elementów nieruchomych, ponieważ usunie to śluz lub jakiekolwiek inne blokujące, nieruchome warstwy w danych. (H) Pasek postępu wskazujący eksport filmu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Uruchom skrypt 'GetFirstAmplitude.m' w folderze zawierającym pliki 'AveSpectrum', stosując procedurę opisaną w krokach 8.2.1-8.2.2. Poczekaj, aż skrypt wygeneruje plik 'FirstAmplitudeStacked.xlsx', który zawiera częstotliwość o najwyższej amplitudzie mieszczącą się w zakresie fizjologicznym częstotliwości uderzeń rzęsek nabłonka dróg oddechowych, tj. ≥3 i <30 Hz.
  2. Skopiuj wartości częstotliwości z pliku 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' i przedstaw je na wykresie przy użyciu oprogramowania do analizy naukowej.
    UWAGA: Wyjaśnienie sposobu, w jaki niestandardowy skrypt analizy kwantyfikuje CBF, znajduje się w Pliku uzupełniającym 5. Przykładowe przeanalizowane zestawy danych są dostępne pod adresem: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
  1. Eksportowanie filmu z ruchami rzęsek
    1. Uruchom oprogramowanie obliczeniowe. Kliknij plik skryptu „LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m” (Rysunek 5A), aby załadować skrypt.
    2. Przejdź do karty Editor (Edytor), a następnie kliknij zielony przycisk odtwarzania (Run - Uruchom), aby uruchomić skrypt (Rysunek 5C). W oknie promptu wybierz surowe pliki obrazów, które mają zostać wyeksportowane do plików filmowych (Rysunek 5D).
    3. Wprowadź ustawienia szczegółowo opisane w Tabeli 4 w wyskakującym oknie „Make Movie” (Rysunek 5G).
    4. Odczekaj około 8 min na plik, podczas gdy skrypt tworzy pliki filmowe i zapisuje je w lokalizacji surowych plików obrazów. Monitoruj postęp za pomocą paska postępu (Rysunek 5H).
Wejścia wideoOpis
Typ plikuWprowadź typ pliku, do którego chcesz wyeksportować dane (mp4 lub avi).
Częstotliwość odświeżania klatekWprowadź liczbę klatek na sekundę, z jaką ma zostać wyeksportowany film. Jeśli dla każdej pozyskanej serii czasowej zarejestrowano ok. 1000 klatek, zaleca się ustawienie liczby klatek na ok. 30 fps.
Filtrowanie nieruchomeDostępne opcje to „y” lub „n”. Domyślną wartością jest „y”. Skrypt filtrowania czasowego usuwa, z wykorzystaniem przestrzeni Fouriera, wszelkie nieruchome komponenty z danych filmowych. Zazwyczaj wszelkie warstwy komórek pod rzęskami lub nieruchomy śluz będą generować komponent przesunięcia o częstotliwości zero lub komponent niezmiennikowy w czasie w sygnale, który można odfiltrować. 
Czas akwizycji na klatkęCzas akwizycji pojedynczej klatki pozyskanych danych. Służy on do wyświetlania w filmie znacznika czasu w sekundach.
Rozmiar pikselaRozmiar piksela w mikrometrach jest wykorzystywany do wyświetlenia w filmie paska skali w mikrometrach.

Tabela 4: Ustawienia wejściowe dla tworzenia filmu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność niniejszego protokołu w ilościowym określaniu CBF, przedstawiono wyniki pomiarów CBF w modelach ALI komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od trzech uczestników z CF oraz trzech zdrowych uczestników kontrolnych. W 14. dniu różnicowania hodowli stwierdzono obecność bijących rzęsek (Rysunek 6). Od 14. do 21. dnia różnicowania hodowli zaobserwowano statystycznie istotny (P < 0,0345) wzrost CBF w obu kohortach. W 21. dniu różnicowania hodowli średnia war...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje wiele czynników, które mogą zaciemniać ilościowe określenie CBF w arkuszach nabłonka nosa. Arkusze nabłonkowe należy zobrazować w ciągu 3-9 godzin od pobrania próbki, ponieważ funkcja rzęsek jest w tym czasie najbardziej stabilna37. Mniej czerwonych krwinek i zanieczyszczeń jest najbardziej optymalnych do obrazowania, ponieważ zakłócają one pozyskiwanie danych. Wybierając zwrot z inwestycji do obrazowania, ważne jest, aby wybrać arkusz nabłonka, którego krawędź nie została uszkodzona ani ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy uczestnikom badania i ich rodzinom za ich wkład. Doceniamy pomoc ze strony oddziału chorób układu oddechowego Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick w organizacji i zbieraniu próbek biologicznych pacjentów - specjalne podziękowania dla dr Johna Widgera, dr Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amandy Thompson i Rhondy Bell. Dziękujemy za pomoc Ivecie Slapetovej i Renee Whan z Zakładu Mikroskopii Świetlnej Kathariny Gaus w Centrum Analitycznym Marka Wainwrighta w UNSW Sydney. Praca ta jest wspierana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia i Sydney Children's Hospital Foundation. Autorzy pragną podziękować organizacji Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health za jej wkład i wsparcie. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health to wspólne przedsięwzięcie non-profit pomiędzy Siecią Szpitali Dziecięcych w Sydney, Dziecięcym Instytutem Badań Medycznych i Dziecięcym Instytutem Raka. Został ustanowiony przy wsparciu rządu Nowej Południowej Walii w celu koordynowania i integrowania badań pediatrycznych. Luminesce Alliance jest również stowarzyszony z Uniwersytetem w Sydney i Uniwersytetem Nowej Południowej Walii w Sydney. KMA jest wspierane przez stypendium Australijskiego Programu Szkoleń Badawczych. LKF jest wspierany przez Rotary Club of Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation oraz stypendia podyplomowe Uniwersytetu UNSW.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdeninaSigma-AldrichA278610 mg/ml
Zaawansowany DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanylo-glutaminaSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford InstrumentsSzybka liczba klatek na sekundę (>100 Hz) kamera naukowa
System filtrów próżniowych typu butelkowegoSigma-Aldrich
Hydrat ceftazydymuSigma-AldrichA698750 mg/ml
Mikroskop do hodowli komórkowychOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Soczewka obiektywowa o dużej odległości roboczej. NA0.45 WD 8.2-6.9
ToksynaSigma-AldrichC8052-1MG200 µ g/ml
Sitko do żelu Corning 40 UMSigma-AldrichCLS431750Wielkość porów 40 μ m
Corning Matrigel Matrix (bez czerwieni fenolu)Corning356231Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
System filtrów próżniowych butelkowych CorningSigma-AldrichCLS431098
Pojemnik do zamrażania komórek Corning CoolCell LXSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell Wkładki do hodowli komórek z membraną poliestrowąSigma-AldrichCLS3470Przepuszczalne wkłady podporowe. 6,5 mm Transwell z 0,4 μ Wkładka z membrany poliestrowej o porach m.
Szkiełka do komory do liczenia komórek CountessThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificAMQAX1000Automatyczny licznik komórek
Szczoteczki cytologiczneMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-Termo Fisher o wysokiej zawartości glukozyScientific11965-092
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikonMikroskop do obrazowania żywych komórek.
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, Stany ZjednoczoneThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amfoterycyna B)Thermo Fisher Scientific15290018250 &mikro; g/ml
Roztwór gentamycynySigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpadOprogramowanie do analizy naukowej
Greiner Fiolki Cryo.sSigma-AldrichV3135Fiolki kriogeniczne
Roztwór HEPESSigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
HydrokortyzonSigma-AldrichH08883,6 mg/ml
Inkubator NL Ti2 BLACK 2000Mikroskop PeConkomora środowiskowa. Umożliwia inkubację ciepłego powietrza i miejscowe gazowanie CO2 i O2
InsulinaSigma-AldrichI26432 mg/ml
Lab Armor 74220 706 Bezwodna kąpiel perełkowa 6LJohn Morris Group74220 706Wanna z koralikami
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Koraliki termiczne
MATLABMathWorksOprogramowanie komputerowe
Microsoft ExcelOprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych
mikroskopu NIH/3T3Kolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-1658Napromieniowane embrionalne komórki zasilające NIH-3T3 myszy
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Oprogramowanie do akwizycji obrazu
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP433310 000 jednostek penicyliny i 10  mg streptomycyny/ml
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichD8537
Zestaw organoidów do udrażniania dróg oddechowych PneumaCultStemCell Technologies5060Zestaw organoidów dróg oddechowych
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type I Roztwór kolagenu
ReagentPack Subculture OdczynnikiLonzaCC-5034
rhEGF (naskórkowy czynnik wzrostu, ludzki)Sigma-AldrichE964425 &mikro; g / ml
Y-27632 2HCl (inhibitor ROCK)SelleckchemS104910 mM
TobramycynaSigma-AldrichT4014100 mg / ml
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT81540,4%
UNO Stage Top InkubatorOkolabMicroscope. Umożliwia kondycjonowanie temperatury, wilgotności i CO2
CLS431098

Bibliografia

  1. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  2. Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
  3. Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763(2019).
  4. Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
  5. Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  6. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
  7. Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
  8. Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
  9. Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455(2021).
  10. Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
  12. Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
  13. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675(2014).
  14. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3(2017).
  15. Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  16. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  17. Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
  18. Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
  19. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  20. Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41(2018).
  21. Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340(2020).
  22. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  23. Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
  24. Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
  25. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
  26. Salathe, M. Regulation of mammalian ciliary beating. Annual Review of Physiology. 69, 401-422 (2007).
  27. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  28. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  29. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  30. Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  31. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  32. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  33. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  34. Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971(2017).
  35. Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
  36. Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
  37. Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
  38. Ratjen, F., et al. Cystic fibrosis. Nature Reviews Disease Primers. 1, 15010(2015).
  39. Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
  40. Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
  41. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki nabłonka nosamodele komórek dróg oddechowychinterfejs powietrze-cieczróżnicowanie organoidówmukowiscydozapierwotne zaburzenia rzęsekobrazowanie wysokiej prędkościkomora środowiskowamodulatory CFTR
Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.