Artykuł metodologiczny

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63091

⸱

11 listopada 2021

 ,  ,  , 
1Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Bambino Gesù Children's Hospital, IRCCS, 2Oncology Service, Children's Health Queensland Hospital and Health Service, 3Child Health Research Centre, The University of Queensland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Streszczenie

Migracja i inwazja komórek są specyficznymi cechami charakterystycznymi rozlanego glejaka linii środkowej (DMG) z mutacją H3K27M. Udało nam się już wymodelować te cechy za pomocą trójwymiarowych (3D) testów inwazji i migracji opartych na komórkach. W tym badaniu zoptymalizowaliśmy te testy 3D pod kątem immunocytochemii żywych komórek. Odczynnik do znakowania przeciwciał użyto do wykrycia w czasie rzeczywistym ekspresji cząsteczki adhezyjnej CD44 na błonie plazmatycznej migrujących i inwazyjnych komórek pierwotnej linii komórkowej DMG H3K27M pochodzącej od pacjenta. CD44 jest związany z fenotypem nowotworowych komórek macierzystych oraz migracją i inwazją komórek nowotworowych oraz bierze udział w bezpośrednich interakcjach z macierzą zewnątrzkomórkową ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Neurosfery (NS) z linii komórkowej DMG H3K27M osadzono w macierzy błony podstawnej (BMM) lub umieszczono na cienkiej warstwie powłoki BMM, w obecności przeciwciała anty-CD44 w połączeniu z odczynnikiem znakującym przeciwciała (ALR). Analizę obrazu immunocytochemicznego żywych komórek 3D przeprowadzono na przyrządzie do analizy żywych komórek w celu ilościowego pomiaru ogólnej ekspresji CD44, w szczególności na migrujących i atakujących komórkach. Metoda pozwala również na wizualizację w czasie rzeczywistym przerywanej ekspresji CD44 na błonie komórkowej migrujących i inwazyjnych komórek. Co więcej, test dostarczył również nowych informacji na temat potencjalnej roli CD44 w przejściu mezenchymalnym do ameboidalnym w komórkach DMG H3K27M.

Wprowadzenie

Zdolność komórek nowotworowych do unikania i rozprzestrzeniania się w otaczającej tkance jest cechą charakterystyczną raka1. W szczególności ruchliwość komórek nowotworowych jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych, niezależnie od tego, czy jest to guz z przerzutami, taki jak breast2 lub rak jelita grubego3, czy też typ miejscowo inwazyjny, taki jak glejak rozlany4,5.

Obrazowanie odgrywa centralną rolę w badaniu wielu aspektów fenotypów komórek nowotworowych; jednak obrazowanie żywych komórek jest zdecydowanie preferowane podczas badania dynamicznych procesów komórkowych, takich jak migracja i inwazja, gdy zmiany w morfologii i interakcji komórka-komórka6,7 występują i mogą być łatwiej zbadane w miarę upływu czasu. Do obrazowania żywych komórek można stosować różne systemy mikroskopii optycznej, od kontrastu fazowego po konfokalne mikroskopy fluorescencyjne, a akwizycję obrazu przeprowadza się w krótkim lub długim okresie czasu na mikroskopie odwróconym wyposażonym w komorę do kontroli temperatury i CO2 lub w systemach analizy obrazu o wysokiej zawartości, które mają wbudowane komory, lub alternatywnie w systemach obrazowania, które mogą znajdować się w inkubatorze bez konieczności zakłócania pracy komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Wybór zastosowanego systemu jest często podyktowany szeregiem czynników, takich jak wymagana rozdzielczość, długość całkowitego czasu pobierania i odstępy czasowe, rodzaj użytego naczynia i przepustowość testu (płytka jednokomorowa lub wielodołkowa), czułość użytych komórek (komórki cenne i/lub rzadkie) oraz fototoksyczność komórek, jeśli obecne są fluorofory.

Jeśli chodzi o obrazowanie fluorescencyjne w trybie na żywo, można to osiągnąć poprzez transdukcję komórek do ekspresji białek fluorescencyjnych albo w celu stabilnej ekspresji, albo jako system indukowalny8, przez transfekcję komórek przejściowych, lub za pomocą barwników komórkowych, które są teraz dostępne do znakowania żywych komórek7, do śledzenia żywych komórek, jak również do oznaczania organelli subkomórkowych9.

Ostatnio opracowano użyteczne podejście do immunocytochemii żywych komórek, gdzie przeciwciało rozpoznające wybrany marker powierzchniowy może być powiązane z odczynnikiem znakującym, a po dodaniu do pożywki, komórki wyrażające specyficzny marker mogą być łatwo zobrazowane w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania żywych komórek. Wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji markerów przy użyciu takiego systemu może być łatwo osiągnięta, gdy komórki są hodowane w dwuwymiarowych (2D) warunkach hodowli10.

W tym badaniu zoptymalizowaliśmy protokoły inwazji immunocytochemicznej żywych komórek 3D i migracji komórek pochodzących od pacjentów z rozlanym glejakiem linii środkowej (DMG) u dzieci11,12. DMG to wysoce agresywne nowotwory mózgu dotykające dzieci, w zdecydowanej większości związane z mutacją K27M w wariantach histonu H3. DMG powstają w pniu mózgu i obszarach linii środkowej ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i charakteryzują się wysoce naciekającym charakterem. Wykazano, że ta inwazyjna zdolność jest przynajmniej częściowo spowodowana przez niejednorodność wewnątrz guza i cechy rakopodobne komórek macierzystych komórek DMG7.

Aby zilustrować nasze testy, użyto odczynnika do znakowania przeciwciał (ALR) w połączeniu z przeciwciałem dla CD44. CD44 jest transbłonową glikoproteiną i cząsteczką adhezyjną ulegającą ekspresji na komórkach macierzystych i innych typach komórek, związaną z fenotypem komórek macierzystych raka oraz migracją i inwazją komórek nowotworowych13. Protokoły obejmują przygotowanie próbki, akwizycję obrazu w jasnym polu i trybie fluorescencyjnym oraz analizę na przyrządzie do analizy żywych komórek, który pozwolił na ilościowy pomiar w czasie rzeczywistym ogólnej ekspresji CD44 na błonie komórkowej DMG podczas inwazji i migracji 3D. Testy umożliwiły również wizualizację przerywanego sygnału fluorescencyjnego CD44 na poszczególnych komórkach podczas migracji i inwazji. Co ciekawe, zaobserwowano również działanie przeciwciała anty-CD44, które potencjalnie działając jako przeciwciało blokujące, również wydawało się zmniejszać migrację i inwazję komórek, a także indukować zmianę wzorca inwazji z zbiorowego fenotypu mezenchymalnego na bardziej monokomórkowy podobny do ameboidu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznych ds. badań na ludziach.

UWAGA: To badanie zostało przeprowadzone przy użyciu przyrządu do analizy żywych komórek Incucyte S3 i/lub SX5 (określanego jako instrument do analizy żywych komórek).

1. Generowanie sferoid guza o powtarzalnej wielkości

UWAGA: Protokół (sekcja 1) opisany przez Vinci et al. 20157,12, został użyty zgodnie z poniższymi zmianami, z pewnymi modyfikacjami:

  1. Zebrać zmutowane neurosfery DMG H3K27M (NS) i odwirować przy 170 x g przez 10 minut (min) w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Inkubować NS z 500 μl roztworu akutazy przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w celu ich rozdrobnienia.
  3. Zneutralizować roztwór akutazy za pomocą media7 i odwirować zawiesinę komórkową przy 355 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki TSM, a następnie policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek.
  5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek, aby uzyskać 2,5-5 x 103komórek/ml i wysiać 100 μl/studzienkę na 96-dołkowe płytki okrągłodenne o bardzo niskim przyczepie (ULA) (patrz tabela materiałów). Użyj odpowiedniej gęstości komórek, aby uzyskać pojedyncze NS o średnicy ~300 μm, 4 dni po wysianiu komórek (250-500 komórek/dołek dla bardzo agresywnych komórek glejaka).
  6. Wizualnie potwierdź tworzenie się NS za pomocą odwróconego mikroskopu 4 dni po wysianiu komórek.

2. Przygotowanie kompleksu ALR/przeciwciało i przygotowanie do testu inwazji

UWAGA: Do procedury znakowania przeciwciał stosuje się protokół znakowania przeciwciał barwników10 dla immunocytochemii żywych komórek z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej. W przypadku testu inwazji przestrzegany jest protokół opisany wcześniej przez Vinci et al. 201512.

  1. Weź pod uwagę liczbę dołków (np. 60 dołków), aby przeanalizować i obliczyć objętość potrzebną dla każdego odczynnika. Należy również uwzględnić studzienki do kontroli ujemnej (próbki z ALR, ale bez przeciwciał).
  2. Dodać 100 μl sterylnej wody do ALR w celu uwodnienia odczynnika (stężenie końcowe = 0,5 mg/ml). Odpipetować do wymieszania roztworu.
    UWAGA: Odczynnik jest wrażliwy na światło; Dlatego trzymaj się w ciemności. Podzielić pozostały odczynnik na porcje i przechowywać w temperaturze -80 °C (unikać zamrażania i rozmrażania).
  3. Wymieszać przeciwciało z ALR w pożywce TSM (lub pożywce odpowiedniej do wzrostu komórek dla wybranej linii komórkowej) na okrągłej płytce wielodołkowej lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem.
  4. Przygotować wystarczającą ilość pożywki, aby dozować 25 μl/studzienkę przy 3-krotnym końcowym stężeniu testowym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    UWAGA: Zalecany jest stosunek molowy przeciwciała do ALR 1:3, przy końcowym (1x) stężeniu badanego przeciwciała <1,5 μg/ml. Do eksperymentów w tym protokole stosuje się mysie przeciwciało anty-ludzkie CD44 (stężenie początkowe 86 μg/ml) przy końcowym stężeniu 0,1 μg/ml (3x stężenie = 0,3 μg/ml). Dodaj odczynniki w następującej kolejności: i) przeciwciało; ii) ALR; iii) Podłoże TSM. Wymieszać pipetując.
  5. Rozcieńczyć odczynnik supresorowy tła (BSR) w pożywce TSM (lub odpowiedniej pożywce do wzrostu komórek dla wybranej linii komórkowej) o stężeniu 1,5 mM (3x), aby uzyskać pod koniec testu końcowe stężenie 0,5 mM.
  6. Przeprowadzić test inwazji bezpośrednio w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem ULA, w której początkowo wysiano komórki. Przed rozpoczęciem sprawdź wizualnie NS za pomocą odwróconego mikroskopu.
  7. Delikatnie i powoli usunąć 75 μl/studzienkę pożywki, unikając dotykania dna studzienki, w której znajduje się NS. Sprawdź wizualnie obecność NS.
  8. Delikatnie dodaj 25 μl BSR do każdej studzienki.
  9. Delikatnie dodaj 25 μl kompleksu ALR/przeciwciało do każdej studzienki. Odczekać 2 lub 3 minuty, aby kompleks ALR/przeciwciało zmieszał się z pożywką.
  10. Sprawdź wzrokowo za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że każdy NS jest umieszczony centralnie na dnie studni. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Jeśli pojawi się bąbelek, usuń go za pomocą igły.
  11. Umieść talerz na lodzie i odczekaj 5 minut, aby spód talerza ostygł.
  12. Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki p200 dozuj 75 μl/studzienkę podstawowej matrycy membranowej (BMM), umieszczając końcówkę pipety na wewnętrznej ścianie studzienki i unikając dotykania dna studzienki. Unikać tworzenia się pęcherzyków i usunąć sterylną igłą istniejące.
    UWAGA: Upewnij się, że BMM został rozmrożony w temperaturze 4 °C z poprzedniej nocy.
  13. Pozostaw talerz na lodzie na 5 minut, aby BMM wymieszał się z podłożem. Sprawdź wzrokowo za pomocą odwróconego mikroskopu obecność NS i czy są one centralnie umieszczone w studni. W przeciwnym razie odwirować płytkę w temperaturze 4 °C przy 180 x g przez 5 minut.
  14. Przenieść płytkę do przyrządu do analizy żywych komórek (tabela materiałów) umieszczonego w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%.

3. Przygotowanie kompleksu ALR/przeciwciało i konfiguracja do testu migracji

UWAGA: Do procedury znakowania przeciwciał stosuje się protokół znakowania barwników10 dla immunocytochemii żywych komórek.

  1. Weź pod uwagę liczbę studzienek do analizy i oblicz objętość potrzebną dla każdego odczynnika. Należy również uwzględnić studzienki potrzebne do kontroli ujemnych. Przed rozpoczęciem sprawdź wizualnie NS za pomocą odwróconego mikroskopu.
  2. Używaj 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Wykonaj procedurę powlekania zgodnie z opisem Vinci et al., 201314. W tym badaniu BMM jest używany jako cienka powłoka.
  3. Gdy powłoka jest gotowa, usuń nadmiar powłoki BMM za pomocą końcówki p200, umieszczając końcówkę na krawędzi studzienki i unikając dotykania dna. W przypadku pracy z wieloma studzienkami należy użyć pipety wielokanałowej.
  4. Wytnij końcówkę p200, weź 50 μl pożywki komórkowej + NS z każdej wybranej studzienki i przenieś ją do powlekanej studzienki z płaskim dnem. Sprawdź wizualnie obecność i położenie NS w każdej studzience.
    UWAGA: Każdy NS musi być umieszczony centralnie w studni. Unikaj opierania się o końcówkę na krawędzi studzienki podczas przenoszenia, ale upuść podłoże centralnie do studzienki bez dotykania dna. W przypadku komórek masowo migrujących należy wziąć pod uwagę większą liczbę powtórzeń niż standardowe trzy kontrpróby. Dzieje się tak dlatego, że gdy NS znajduje się zbyt blisko krawędzi studni, migrujące komórki mogą pokryć mniejszy obszar studni.
  5. Ponownie uwodnić ALR zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.2-2.3).
    UWAGA: Odczynnik jest wrażliwy na światło. Patrz wyżej, aby zapoznać się z prawidłowymi procedurami obchodzenia się z produktem.
  6. Wymieszać przeciwciało z ALR w odpowiednim kompletnym pożywce do wzrostu komórek na okrągłej płytce wielodołkowej lub w bursztynowej probówce i chronić przed światłem. Przygotuj wystarczającą ilość, aby dozować 50 μl/studzienkę przy 3-krotnym stężeniu końcowym testu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
    UWAGA: Dodaj odczynniki w kolejności wskazanej powyżej (krok 2.4).
  7. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co opisano w kroku 2.5.
  8. Delikatnie dodaj 50 μl BSR do każdej studzienki.
  9. Delikatnie dodaj 50 μl ALR/przeciwciała do każdej studzienki. Odczekaj 2 lub 3 minuty, aby odczynniki się wymieszały i sprawdź wizualnie za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że większość powtórzonych NS znajduje się centralnie w studzience.
  10. Unikaj tworzenia się pęcherzyków i usuń wszelkie istniejące za pomocą igły. Delikatnie przenieść płytkę w przyrządzie do analizy żywych komórek umieszczonym w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%.

4. Ustawienia instrumentu do analizy żywych komórek do akwizycji obrazu

  1. Zeskanuj płytki za pomocą przyrządu do analizy żywych komórek (specyfikacje znajdują się w Tabeli materiałów) z interwałami skanowania, zaczynając od punktu zerowego (t0) testów inwazji i migracji ustawionych odpowiednio po kroku 2.14 i 3.10. do 96 godz.
    UWAGA: Upewnij się, że masz możliwość pozbycia się przyrządu do analizy żywych komórek natychmiast po rozpoczęciu testu inwazji i migracji. W zależności od typu nowotworu, komórki mogą rozpocząć inwazję lub migrację z NS już w ciągu 1 godziny od ustawienia testu.
  2. W oprogramowaniu przyrządu do analizy na żywo wybierz opcję Zaplanuj pozyskiwanie. Kliknij zakładkę + i wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem.
  3. W oknie oprogramowania Utwórz lub przywróć naczynie kliknij opcję Nowy.
  4. Wybierz konkretną aplikację w instrumencie do analizy żywych komórek dla pozyskiwania inwazji i migracji. Wybierz typ skanowania sferoidów, obiektyw 4x, Faza+Jasne pole i zielone kanały obrazu dla testu inwazji. Wybierz typ skanowania Klonowanie rozcieńczenia, obiektyw 4x oraz Fazę i Zielony dla testu migracji.
  5. Wybierz typ płyty i zdefiniuj studnie, które mają zostać zeskanowane, podświetlając je na mapie płyty.
  6. Ustaw częstotliwość skanowania (dla eksperymentów w tym protokole częstotliwość skanowania wynosiła 15 minut dla inwazji i 30 minut dla migracji).
  7. Kliknij Dodaj do harmonogramu i rozpocznij skanowanie.

5. Ustawienie instrumentu do analizy na żywo do analizy obrazu

  1. Wybierz zakładkę Utwórz nową definicję analizy.
  2. Wybierz aplikację Spheroid Invasion lub Basic Analyzer odpowiednio dla inwazji i migracji na karcie.
  3. Wybierz kanały odpowiednie dla inwazji i migracji (dla Inwazji: Faza+Brightfield-Zielony; dla Migracji: Faza-Zielona) w kanale obrazu.
  4. Wybierz kilka reprezentatywnych obrazów z 3-4 dołków, aby wyświetlić podgląd i doprecyzować ustawienia analizy.
  5. W przypadku testu inwazji, na karcie Definicja analizy, dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach Brightfield i Green z następującym ustawieniem, aby wygenerować precyzyjną segmentację między całą sferoidą a komórkami atakującymi (patrz Rysunek 5; niebieska maska):
    Segmentacja jasnego pola: Czułość całego sferoidu = 50; Czułość komórki atakującej = 100; Oczyść = default.
    Całe filtry sferoidalne: ustaw wszystkie parametry jako domyślne.
    Filtry atakujących komórek: ustaw wszystkie parametry jako domyślne.
    Zielona segmentacja: promień = 900.
  6. W przypadku testu migracji dostosuj ustawienia aplikacji w kanałach Faza i Zielony, aby wygenerować precyzyjną segmentację między Confluence i Green Cells (patrz Rysunek 5, żółte i różowe maski) z następującym ustawieniem:
    Faza: ustaw wszystkie parametry jako domyślne.
    Zielona segmentacja: promień = 300; Próg = 1000
    Czyszczenie: Wypełnienie otworu = 400; Filtry = default.
    Whole Well: ustaw wszystkie parametry jako domyślne.
  7. Sprawdź, czy ustawienia analizy są poprawne dla NS, klikając losowo kilka dołków. Segmentacja musi wyznaczać kontur sferoidy. Jeśli nie, odpowiednio dostosuj ustawienie.
  8. Wybierz studnie i punkty czasowe do analizy.
  9. Zapisz definicję analizy i kliknij przycisk Zakończ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół immunocytochemii Live-3D-Cell dla inwazji i migracji został podsumowany w prostym i powtarzalnym schemacie postępowania na Rysunku 1. Poprzez wysianie komórek DMG na okrągłe płytki 96-dołkowe typu ULA uzyskuje się sferoidy (NS) o powtarzalnej wielkości, które są wykorzystywane w opisanych etapach. Gdy NS osiągną optymalną wielkość ok. 300 µm (około 4 dni po wysianiu), rozpoczyna się analizy inwazji12 oraz migracji14. Dodanie kompleksu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Immunocytochemia żywych komórek 3D, którą przyjęliśmy do inwazji i migracji DMG u dzieci, może być łatwo dostosowana również do innych wysoce inwazyjnych typów komórek nowotworowych, w tym linii komórkowych raka piersi i jelita grubego.

W odróżnieniu od wcześniej wykonywanych testów immunocytochemicznych na żywych komórkach 2D10, podczas pracy w 3D sugeruje się zwrócenie uwagi na kilka krytycznych kroków. W szczególności w przypadku opisanego przez nas testu inwazji za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych istotnych powiązań ani nie są zaangażowani finansowo w żadną organizację lub podmiot mający interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w manuskrypcie.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Silvii Soddu i dr Giulii Federici (Jednostka Sieci Komórkowych i Molekularnych Celów Terapeutycznych, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rzym, Włochy) za dostęp do Systemu Obrazowania Żywych Komórek IncuCyte S3 we wstępnym przygotowaniu protokołu obrazowania. Ponadto dziękujemy Bernadett Kolozsvari za doradztwo techniczne. Badanie było wspierane przez grant Children with Cancer UK (16-234) oraz włoskie Ministerstwo Zdrowia Ricerca Corrente. M Vinci jest stypendystką organizacji Children with Cancer w Wielkiej Brytanii. R Ferretti jest stypendystą Fondazione Veronesi Fellowship (2018 i 2019). Autorzy dziękują Fondazione Heal za wsparcie oraz Fundacji Szpitala Dziecięcego za finansowanie Queensland Children's Tumor Bank.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 dobrze poddanych działaniu TC mikropłytekCorning3595rozmiar 96 studzienek, płytka polistyrenowa, płaskie dno
AccutaseEurocloneECB3056Drozwiązanie do dysocjacji neurosfery
Komora BurkeraMv medycznakomora do zliczania komórek
FFL16034 CD-44 (156-3C11)Technologia sygnalizacji komórkowej3570Mysi mAb IgG2a
Corning Matrigel MatrixCorning356237Podstawna matryca membranowa (BMM), bez czerwieni fenolowej, bez LDEV
Fabfluor-488 Barwnik do znakowania przeciwciałIncucyte4743Odczynnik do znakowania przeciwciał (ALR): Mysie przeciwciało IgG2a 488 do immunocytochemii żywych komórek
Incucyte S3 i/lub SX5 Instrument do analizy żywych komórekSartorius-Instrument Incucyte S3 i/lub SX5 jest używany do monitorowania i nadzoru komórek w czasie rzeczywistym, zdrowia i żywotności komórek, migracji i inwazji, a także do szerokiego zakresu testów fenotypowych opartych na komórkach.
odwrócony-dowolny mikroskop odwrócony
tło Opti-GreenIncucyte6500-0045Odczynnik tłumiący tło (BSR)
Pożywka dla komórek macierzystych nowotworu (TSM)-pożywka dla komórek wzrostu (patrz odniesienie w tekście, aby uzyskać szczegółowe informacje)
Ultra-niskie mocowanie Płytka wielodołkowaCorning Costar7007rozmiar 96 dołek, okrągłe dno jasny
Mikroskop Odczynnik tłumiący

Bibliografia

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
  3. Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
  4. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  5. Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
  6. Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763(2020).
  7. Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
  8. Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
  9. Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045(2015).
  10. Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
  11. Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
  12. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  13. Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64(2018).
  14. Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
  15. Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
  16. Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
  17. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  18. Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209(2020).
  19. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  20. Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
  21. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D testy kom rkoweobrazowanie ywych kom rekmigracja kom rekinwazja kom rekekspresja CD44test immunocytochemicznymezenchymalno ameboidalne przej cieinwazja neurosferznakowanie przeciwcia ami

Powiązane artykuły